AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE COMPOSTOS BIOATIVOS FRENTE A Artemia salina.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DO PARÁ – UFOPA INSTITUTO DE BIODIVERSIDADE E FLORESTAS – IBEF LABORATÓRIO DE PRODUÇÃO & DESENVOLVIMENTO DE BIOATIVOS – P&DBio

LABORATÓRIO DE FITOQUÍMICA

AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE COMPOSTOS BIOATIVOS FRENTE A Artemia salina. José Cássio Figueira Costa. 1. INTRODUÇÃO. Os testes de toxicidade são elaborados com o objetivo de ponderar ou predizer os efeitos de substâncias tóxicas nos sistemas biológicos e dimensionar a toxicidade relativa das substâncias que são preponderantes na avaliação do ambiente (BAROSA et al, 2003). Suas técnicas envolvem uma série de dados que podem ser obtidos por meio de microrganismos e animais de laboratório ou seres humanos, visando classificar a toxicidade de uma substância química, ou seja, trata-se de bioensaios preliminares essenciais no estudo de substâncias com atividade biológica a fim de avaliar suas possíveis interações com o organismo (CAVALCANTE et al, 2000). Artemia salina Leach (Figura 1) é um microcrustáceo da classe Anostraca encontrado em águas salinas e salobras de todo o mundo, e é amplamente utilizado em bioensaios para determinação de atividade toxicológica pré-clínica de extratos, frações ou compostos isolados de plantas, por apresentar alta sensibilidade, capacidade de formar cistos dormentes, praticidade de manuseio e cultivo (BAROSA et al, 2003). É uma espécie de fácil manipulação em laboratório e baixo custo econômico (Calow, 1993). O método foi proposto inicialmente por Meyer e colaboradores (1982) e adaptado posteriormente por outros pesquisadores. A toxicidade para este crustáceo tem demonstrado uma boa correlação com atividades biológicas como antifúngica, viruscida e antimicrobiana (MacRAE et al.,1988), parasiticida (SAHPAZ et al., 1994), tripanossomicida (ZANI et al., 1995), entre outras. Há, também, correlação com a citotoxicidade em células tumorais humanos (MacLAUGHLIN, 1991). Os resultados de ensaios toxicológicos com A. salina

direcionam estudos fitoquímicos e proporciona perspectivas de encontrar compostos bioativos. Figura 1 – Artemia salina Leach

Por motivos éticos e financeiros, a utilização de ensaios in vitro é fortemente recomendada para a realização da fase preliminar de testes, com o intuito de predizer o potencial tóxico de uma substância, utilizando-se, posteriormente, um menor número de animais experimentais (FRESHNEY, 1994)

2. MATERIAL E MÉTODOS. 2.1. Preparo da solução salina. A salmoura artificial será preparada utilizando 46 g de NaCl (cloreto de sódio), 22 g de MgCl2.6H2O (cloreto de magnésio hexahidratado), 8 g de Na2SO4 (sulfato de sódio anidro), 2,6 g de CaCl2.2H2O (cloreto de cálcio dihidratado) ou CaCl2.6H2O (cloreto de cálcio hexahidratado), 1,4g de KCl (cloreto de potássio) dissolvidos em 2000 ml (dois litros) de água destilada. A solução apresentará um pH relativamente ácido, logo, utilize pequenas quantidade de Na2CO3 (carbonato de sódio) para ajustar o pH da salmoura em torno 8,0 – 9,0 (usar papel de tornassol para acompanhar a alcalinização da solução), para evitar a morte de larvas e dificuldades na eclosão dos cistos. 2.2. Eclosão dos cistos. Para incubação, inicialmente pesa-se 50 mg de cistos, os quais devem ser submersos na solução salina previamente aerada (saturada com O2) por 15 minutos por meio de bomba difusora de oxigênio (bomba de aeração). Alguns autores descrevem o um passo antes de adicionar os cistos na incubadora, a hidratação. Os cistos devem ser colocados em um béquer contendo o meio salino por 30 minutos antes de serem colocados

na “artemeira” (este passo é opcional, visto que ele apenas previne que os cistos adiram nas laterais da vidraria por ação da agitação constante por bolhas oriundas da bomba). A incubadora (“artemeira”) deve permanecer em ambiente iluminado com luz natural e/ ou luz artificial (lâmpada fluorescente – 12W) devido ao fototropismo positivo dos náuplios de Artemia spp., além disso, a temperatura ótima para eclosão dos cistos é de 25 – 31°C, sendo preconizado que 28°C é a temperatura ideal para desenvolvimento dos náuplios. A artemeira deve permanecer sob oxigenação constante por até 48 horas, sendo este o tempo necessário para que ocorra a eclosão de grande parte dos cistos. Para a eclosão e desenvolvimento dos náuplios, pode-se utilizar como “artemeira”, um béquer de 2 L ou um funil de separação de 1 – 2 L, sendo que o funil é mais prático para capturar e concentrar os náuplios. Há também artemeiras feitas artesanalmente com garrafas pet, o sistema é semelhante ao do funil.

Figura – Artemeira

2.3. Preparo de amostras. Para o preparo das amostras nas concentrações de interesse, deve-se inicialmente diluir o extrato ou óleo (não volátil) em um solvente orgânico (hexano, metanol, diclorometano ou etanol), originando assim, uma solução matriz. A partir da solução-mãe é realizado diluições seriadas com intuito de chegar às concentrações teste; os tubos com as soluções teste devem ser levados ao banho-maria (45 – 60ºC) para evaporação do solvente. Após evaporação completa do solvente, adiciona-se aos tubos de ensaio 3 – 5 gotas (1 gota ± 50 µL) de DMSO ou Tween 80 e agitar vagarosamente, adicionar em seguida 3 ml de solução salina e agitar em vortex até completa dissolução do extrato/ óleo.

Em caso de óleos essenciais, a solução matriz é constituída do óleo emulsionado em água (solução salina utilizada para eclosão dos cistos de Artemia). Deve ser observado que para este teste, o volume total em cada tubo de ensaio com os náuplios deve ser igual a 5 ml. Comumente em testes de toxidade são utilizados surfactantes (tensoativos) para diluir compostos apolares em água. Os tensoativos tem como finalidade alterar as propriedades superficiais (uma das fases é gasosa) e interfaciais (limite entre dois líquidos imiscíveis) de líquidos, ou seja, diminuir a tensão superficial. A emulsão formada pelo surfactante distribui homogeneamente os diversos compostos bioativos na água (solução tipo óleo/ extrato em água). Os tensoativos mais utilizados em sistemas emulsionados são Tween 20 ou 80, DMSO (dimetilsulfóxido) e DSS (dodecil sulfato de sódio).

Em testes de toxidade com Artemia, os surfactantes mais eficientes e menos tóxicos utilizados são Tween 80 e DMSO, ambos em concentrações menores que 5% (v/v). Em avaliações com o microcrustáceo, também são utilizados solventes orgânicos para melhor dissolução de extratos, embora sejam tóxicos, as quantidades utilizadas são mínimas, geralmente menores que 2,5% (para este teste 1 – 2 gotas: ± 50 – 100 µL), os quais podem ser etanol ou metanol. 2.4. Preparo dos controles (+) positivo e negativo (-). A solução comumente utilizada como controle positivo para o teste de toxidade frente a Artemia spp. é o dicromato de potássio (K₂Cr₂O₇), entretanto, pode-se utilizar o cromato de potássio (K₂CrO4), pois ambos são igualmente tóxicos a organismos marinhos.

Para manipulação da solução-estoque de cromato de potássio (KCO), é necessário que o usuário utilize equipamento de proteção individual (luvas, jaleco e óculos de proteção) devido a sua periculosidade. Para o preparo do controle positivo com solução KCO à 52 mM (0,052 mol/ L), será adicionado em um tubo de ensaio, uma alíquota de 2,5 ml de solução KCO + 1 ml de solução salina, totalizando 3,5 ml. Em seguida capture os náuplios de Artemia spp. (10 náuplios) e os coloque diretamente na solução controle; adicione solução salina até completar 5 ml de solução controle. LEMBRANDO: Ao capturar os náuplios com a pipeta, determinada quantidade de água será adicionado à solução controle. Utilize um tubo com apenas 5 ml de solução salina como referência. A solução KCO à 52 mM (0,052 mol/ L) será diluída, assumindo assim a concentração final de 26 mM (0,026 mol/ L). Os controles negativos serão compostos basicamente de tensoativo em solução com o meio salino (quantidade padrão utilizada nas concentrações teste) e a salmoura. Ambos os controles têm como finalidade destacar que tanto a salmoura, quanto o tensoativo em solução salina, não promoveram a morte dos náuplios em teste. 2.5. Preparo do teste. Concentre os náuplios de Artemia em um pequeno béquer ou placa de petri e por meio de uma pipeta plástica ou pasteur, capture 10 larvas do microcrustáceo e adicione-os nos tubos teste e controles (10 náuplios por tubo). Em seguida complete o volume da solução de cada tubo para 5 ml (utilize um tubo com 5 ml de salmoura como padrão). Em seguida, armazene os tubos em lugar protegido e sem grandes variações de temperatura. A contagem de larvas vivas deverá ser realizada em 24 (toxidade aguda) e 48 (toxidade crônica) horas. Para conta-las, agite o tubo de ensaio e aguarde 15 segundos. Os náuplios que sedimentarem estão mortos, pois as larvas de Artemia são seres ativos, estão em constante movimento. É necessário que o pesquisador tenha um olhar clínico, visto que algumas larvas continuam vivas e com movimentos atenuados ao ponto de sedimentarem no fundo tubo de ensaio. Caso tenha dificuldade em visualização, verter o meio salino em placa de petri e realizar a contagem utilizado um estereoscópio (lupa).

2.6. Análise estatística. Para a obtenção da CL50 (Concentração Letal a 50% dos organismos teste), os dados podem ser analisados através do método de Trimmed Spearman – Karber (HAMILTON, et al., 1997). Para verificar a existência de diferenças significativas entre os períodos de exposição, as médias e desvio padrão, será utilizado teste t de Student a um nível de 5% de significância, e para a analisar a diferença entre a toxidade das concentrações teste, deve-se realizar uma análise de variância (ANOVA) seguida de teste de Tukey.

3. REFERÊNCIAL TEÓRICO. 

BAROSA, J., FERREIRA, A., FONSECA, B. e SOUZA, I. Teste de toxicidade de cobre para Artemia salina – Poluição e ecotoxicologia marinha. 2003.

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CAVALCANTE, M. F. Síntese de 1,3,5–Triazinas substituídas e avaliação da toxicidade frente Artemia Salina. Química Nova 23 (1) 20-22, 2000.



McLAUGHLIN, J. L. Crown gall tumours on potato discs and brine shrimp lethality: two simple bioassays for higher plant screening and fractions. In: DEY P. M.; HARBONE J. B. (ed.): Methods in Plant Biochemistry. New York: Academic Press, 1-32, 1991.



ZANI, C. L.; CHAVES, P. P. G.; QUEIROZ, R.; DE OLIVEIRA, A. B.; CARDOSO, J. E.; ANJOS, A. M. G.; GRANDI, T. S. M. Brine shrimp lethality assay as a prescreening system for anti-Trypanosoma cruzi activity. Phytomedicine, 2: 47-50, 1995.



SAHPAZ, S.; BORIS, C. H.; LOIEAU, P. M.; CORTES, D.; HACQUEMILLER, R.; LAURENS, A.; CAVÉ, A. Cytotoxic and antiparasitic activity from Annona senegalensis seeds. Planta Medica, 60 (1) 538-40, 1994.



MacRAE, W. D.; HUDSON, J. B.; TOWERS, G. H. N. Studies on the pharmacological

activity

of

amazonian

Euphorbiaceae.

Journal

of

Ethnopharmacology, 22: 143-72, 1988. 

FRESHNEY, R. I. In: Culture of animals Cells: A Manual of Basic Technique. New York: Wiley-Liss, 3ª Ed., p. 486, 1994.



CALOW, P. Marine and estuarine invertebrate toxicity tests. In: HOFFMAN, D. et al. Handbook in cytotoxicology. Oxford: Blackwell Scientific Publication. 1: 1-5, 1993.



MEYER, B. N. et al. Brine shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Médica, 45 (1) 31-34, 1982.