APLICAÇÃO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR VIA PCR PARA DETECÇÃO DE Salmonella almonella sp. EM FRIGORIFICO DE SUÍNOS Andiara Gonçalves 1, Dr.(ª). Dr. Juliana Vitoria Messias Bittencourt2, Renata Samulak Samula 3 1 2
Acadêmica de Tecnologia em Alimentos da UTFPR
Docente vinculada a coordenação de Engenharia Química e ao Programa de Pós-Graduação raduação em Engenharia de Produção da UTFPR 3
Mestranda do Programa de Pós-Graduação Pós Graduação em Engenharia de Produção UTFPR Campus Ponta Grossa Universidade Tecnológica Federal do Paraná - UTFPR Avenida Monteiro Lobato, s/n, km 04 - Jardim Carvalho Ponta Grossa - PR 84016-210, 84016 Brasil 1
[email protected],
[email protected] e
[email protected]
Resumo – A importância da detecção de Salmonella sp. é imprescindível, pois este microrganismo é considerado um dos principais causadores de DTA’s (Doenças (Doenças transmitidas por alimentos). alimentos Atualmente a técnica de detecção oficial é realizada por microbiologia convencional,, a qual necessita de um tempo relativamente longo para obtenção de um resultado. resultado A aplicação ação de técnicas da biologia molecular vem sendo difundida para detecção de patógenos, uma vez que esta otimiza tempo de analise. analise Objetivo deste trabalho é aplicar car a técnica da PCR para detecção da presença de Salmonella sp. em amostras coletadas em frigorifico da região dos Campos Gerais. Para tanto, tanto foram coletados amostras de cinco pontos aleatórios, escolhidos intencionalmente, do processo de abate de suínos e fabricação de embutidos. As amostras foram submetidas ao cultivo e isolamento de colônias,, extração de DNA e a amplificação deste via PCR. Em quatro amostras confirmou-se a presença de Salmonella sp. e observou a viabilidade da aplicação do diagnostico molecular para detecção de patógenos. Palavras-chave: Salmonella sp;; Frigorífico de Suínos; PCR. Abstract - The Salmonella sp. detection importance is essential, since this microorganism is considered a major cause of foodborne illness. Currently, ently, the detection technique is performed by conventional microbiology, which requires a relatively long time to obtain a result. The molecular biological techniques application has been used for pathogens detection, since this optimizes analysis time. Objective of this study is to apply the PCR technique to detect the Salmonella sp. presence in samples collected of slaughterhouse in the Campos Gerais region. For this purpose, samples were collected from five random points were chosen intentionally, in the slaughtering pigs process and sausage production. The samples were submitted to the cultivation and isolation of colonies, DNA extraction and amplification by PCR. In four samples, the Salmonella sp presence was confirmed and the viability of molecular diagnostics applied for the pathogens detection was observed. Keywords: Salmonella sp.; Pigs Slaughterhouse laughterhouse; PCR.
INTRODUÇÃO Atualmente a necessidade de se diagnosticar a presença de microrganismos patogênicos nos alimentos é indispensável vel para garantir a segurança alimentar [1] e [2]. As Doenças transmitidas por alimentos (DTA’s) têm grande variabilidade genética do organismo que lhe da origem. A alta incidência destas ocorre devido a características como: controle inadequado
de temperatura; manipulação incorreta dos alimentos; contaminação cruzada de alimentos crus ou processada [3]. Registros epidemiológicos oficiais apontam a Salmonella sp. como um dos principais microrganismos causadores de doenças bacterianas de origem alimentar no estado do Paraná, portanto, vale ressaltar a importância da verificação de presença deste nos alimentos [4]. A salmonela, pertencente à família Enterobactereacea, é um dos gêneros mais envolvidos nos surtos de toxinfecção alimentar, por apresentar-se de diversas formas na natureza e possuir um elevado número de reservatórios. São bacilos Gram-negativos não produtores de esporos, anaeróbios facultativos, produtores de gás a partir da glicose, capaz de utilizar citrato como única fonte de carbono. A maioria é móvel, através flagelos peritríquios. Comporta-se como patógeno intracelular facultativo, possui como habitat o trato intestinal de homens e animais. Por possuir capacidade de invasão celular, é associada sempre a problemas entéricos, septicêmicos e abortivos. A doença causada é a salmonelose [5], [6], [7] e [8]. De acordo com a Resolução - RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001, o resultado da determinação de Salmonella sp., deve ser expresso como Presença ou Ausência na alíquota analisada, para tanto tem-se necessidade da realização de analises microbiológica [9]. Visando atender a legislação, existem métodos convencionais microbiológicos de isolamento de Salmonella sp., esses métodos envolvem uma fase de enriquecimento em caldo nãoseletivo, enriquecimento seletivo seguido de meios diferenciais, identificação bioquímica e confirmação sorológica [10]. Estes testes podem apresentar variação de acordo com fatores ambientais e apresentar um alto risco de interpretações errôneas [11]. A metodologia convencional é aceita como padrão de referência, apesar de apresentar alto custo operacional e demandar um tempo relativamente longo para obtenção de um resultado [12]. Em contra partida, a biologia molecular, possibilita sua aplicação para determinação e caracterização de microrganismos patogênicos nos alimentos sendo uma forma inovadora, de alta sensibilidade e especificidade, tendo como umas das principais vantagens à redução do tempo da análise [13]. Objetivo deste trabalho é aplicar a técnica da PCR para detecção da presença de Salmonella sp. em amostras coletadas em frigorifico da região dos Campos Gerais. METODOLOGIA A amostragem foi realizada em um frigorifico da Região dos Campos Gerais no qual foi coletado amostras de cinco pontos, escolhidos intencionalmente, a partir de observações visuais durante o processo de abate de suínos e fabricação de embutidos. Sendo eles: cavidade abdominal de uma carcaça após a evisceração; mesa de evisceração; parede da câmara fria de resfriamento de carcaças; equipamento de preparo de massas para embutidos e mão de manipulador do setor de embutimento. Para coleta foi utilizada a técnica de esfregaço de superfície (swab) que consiste na fricção de um cotonete estéril sobre a superfície, no interior de um molde estéril com área de 25 cm², revertendo-se a direção entre as sucessivas passagens [14]. Os cotonetes foram então mergulhados em tubos contendo 9 mL de água deionizada peptonada tamponada 0,1% e em seguida, encaminhados ao laboratório de Microbiologia de Alimentos da UTFPR Campus Ponta Grossa para análise. As análises microbiológicas para identificar presença de Salmonella sp. foram realizadas seguindo a metodologia descrita por Vanderzant e Splittstoesser[15] (1992). Após o cultivo e isolamento das culturas, as colônias isoladas foram inoculadas em caldo nutriente e incubadas em estufa a 35ºC por 24 horas para então realizar a técnica da PCR.
Para extração do DNA utilizou-se a técnica de lise térmica descrita por Chapman[16] (2001), a qual sofreu adaptações. O protocolo utilizado consistiu em: transferência do inoculado em micro tubos seguido da centrifugação deste a 5000 rpm por 10 min, descarte do sobrenadante. Em seguida o pellet presente no micro tubo foi ressuspenso em 1 mL de água mili-q e centrifugado a 12000 rpm por 3 minutos, posteriormente realizou-se um novo descartar do sobrenadante e o pellet residual foi resuspenso em 200µL de água mili-q. Estes microtubos foram submetidos a aquecimento em banho seco a 95°C por 10 minutos seguido do resfriamento a 20°C por 30 minutos. Após o resfriamento reaqueceu as amostras a 65°C por 10 min e centrifugou-as a 12000 rpm por 10min, retirou o sobrenadante contendo o DNA. Para realização da PCR foi utilizada uma diluição do DNA em 20X. A reação seguiu as especificações descritas por Miranda, Monteiro e Bittencourt[17] (2011) conforme mostrado na tabela 1. Tabela 1- Concentração dos reagentes da reação de PCR Componentes Contrações DNA genômico Aprox. 20 ng Tampão PCR 10x 1x MgCl2 0,75 mM Oligonucleotídeo iniciador F 1 µM Oligonucleotídeo iniciador R 1 µM dNTP’s 0,2 mM Taq DNA polimerase 1,5 U Água deionizada estéril Volume necessário para completar 15 µl
A programação para a amplificação seguiu as seguintes etapas: pré-desnaturação a 93ºC por 5 minutos. Para que ocorra a replicação exponencial foi realizado 35 ciclos de desnaturação a 93ºC por 1 minuto, seguido de anelamento a 57°C por 30 segundos, com a extensão do fragmento a 72 ºC por 1 minuto. Para finalização da PCR foi adicionado um ciclo por 5 minutos numa temperatura de 72ºC, com o objetivo de realizar possíveis amplificações inacabadas. Para a visualização dos produtos resultantes da amplificação foi alíquotados 5µl do tampão de carreamento 1x (azul de bromofenol) e 5µl da reação de PCR. A mistura foi aplicada em gel de agarose 1,5% em tampão TBE (EDTA 0,5M (pH8), tris base, acido bórico,H2O Milli-Q estéril) à 80 v por 1hora e 30 minutos. O Esse gel foi corado com brometo de etídio para posterior visualização sob luz ultravioleta (UV) com intuito de analisar o tamanho do fragmento amplificado. RESULTADOS E DISCUSSÃO Das cinco amostras coletadas e analisadas pela técnica convencional, observou-se a presença de Salmonella sp em quatro delas: mesa de evisceração; parede da câmara fria de resfriamento de carcaças; equipamento de preparo de massas para embutidos e mão de manipulador do setor de embutimento. A partir desses resultados, as amostras positivas foram isoladas e incubadas em caldo nutriente para então a realização da extração do DNA bacteriano. Optou-se pela realização desta etapa de pré-enriquecimento, pois, assim como verificado por Souza et al. [18] (2008), ela favorece o crescimento da bactéria- alvo, possibilitando maior número de detecções, reduzindo possíveis resultados falsos negativos. Em relação à técnica de extração, o protocolo utilizado mostrou-se bastante eficiente para extração do DNA de Salmonella spp. pois obteve-se DNA em com qualidade suficiente para amplificação de bandas. Apesar de não se conseguir quantificar o DNA, esta foi
considerada mais econômica, pois seu tempo de execução é mais sucinto e a utilização de reagentes quase inexiste. Nesse sentido, Flores et al, [19] (2001), afirma que esta técnica otimiza o tempo de analise em 6 horas, reduz custo e principalmente reduz a probabilidade de contaminação, visto que esta metodologia não necessita de muita manipulação com a amostra, como a metodologia de fenol-cloroformio. Para Peres [20], 2007, este método de extração juntamente com a PCR é bom para confirmação de colônias suspeitas, uma vez que este substitui uma bateria de testes fenótipos mais demorados. Em relação à amplificação da região genômica, o resultado obtido conforme a Figura 1 foi considerada satisfatório, pois podemos observar a presença de Salmonella sp. nas amostras. Isso se torna possível, pois o oligonucleotideo iniciador do gene InvA, utilizado pode detectar com sucesso 630 estirpes de Salmonella spp conforme relatado por Maldonado[21] ,2008. Portanto podemos confirma e demonstra a viabilidade do protocolo utilizado. A técnica da PCR possibilita ainda reduzir os custos e o tempo de análise, [22; 23].
Figura 1- Resultado da amplificação CONCLUSÕES Este projeto de pesquisa demonstrou- se satisfatório, pois após diversos testes observouse a viabilidade da técnica para detecção de Salmonella sp. via diagnostico molecular.Para trabalhos futuros pode-se utilizar esta técnica para verificação de outros microrganismos como Listeria sp., Bacillus cereus, Staphylococcus aureus entre outros microrganismos de interesse alimentar. Vale ressaltar a necessidade de determinação de protocolos, pois uma vez determinados estes podem ser repetidos obtendo sempre um resultado satisfatório e eficiente. Pelo que foi pesquisado e realizado pode-se afirmar que o diagnóstico molecular é mais rápido na obtenção do resultado definitivo comparado as técnicas convencionais microbiológicas para o diagnóstico de salmoneloses. AGRADECIMENTOS Agradecemos em especial a Fundação Araucária pela bolsa concedida.
REFERÊNCIAS [1] ABREU, A. de. Esforço para inovação tecnológica: uma caracterização da indústria de alimentos município de Marília/SP. 2007. 189 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia da Produção) – Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 2007. [2] JIN, S.Q.; YIN, B.C.; YE, B.C. Multiplexed Bead-Based Mesofluidic System for Detection of Food-Borne Pathogenic Bacterium. Applied and Environmental Microbiology, v. 75, n. 21, p. 6647–6654, nov. 2009. [3] PIETROWSKI, G. A. M.; RANTHUM, M. Apostila de Microbiologia Aplicada: Aulas teóricas e práticas, 2009. [4] AMSON, G. V.; HARACEMIV, S. M. C.; MASSON, M. L. Levantamento de dados epidemiológicos relativos à ocorrências/surtos de doenças transmitidas por alimentos (DTA’s) no estado do Paraná-Brasil, no período de 1978 a 2000. Ciênc. Agrotec., Lavras, v. 30, n. 6, p.1139-1145, nov./dez. 2006. [5] MOREIRA, A. P. O. Pesquisa de Salmonella sp. em frangos de corte de um dia de idade da Região Metropolitana de Fortaleza-CE. 2002. 56 f., Dissertação (Mestrado em Ciências veterinárias) - Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, 2002. [6] ANDRADE, R.B. et al. Métodos diagnósticos para os patógenos alimentares: Campylobacter sp., Salmonella sp. e Listeria imonocytogenes. Arq. Inst. Biol., São Paulo,v. 77, n. 4, p.741-750, out/dez. 2010. [7] FRANCO, B. D.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Atheneu, 2002. [8] BORSOI, A. Inoculação Salmonella heidelberge e Salmonella enteritidis em pintos de corte para a avaliação da morfometria cecal, invasibilidade, persistência de excreção fecal e o uso de ácido orgânico e óleo essenciais no controle de Salmonella enteritidis. 2009. 107 f. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2009. [9] BRASIL. Ministério da Saúde. Secretária Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução nº 12, de 2 de janeiro de 2001. Dispõe sobre padrões microbiológicos. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil. Brasília (DF), 10 jan. 2001. Seção I, p. 48. [10] BRICIO, S. M. L.; VIANA, C. M.; RODRIGUES, D. P. Avaliação comparativa do uso do PCR/hibridização em microplaca e técnica convencional para detecção e recuperação de salmonella sp. a partir de carne bovina. Revista Braz. J. Food Technol. 2001. [11] GANDRA, E. A. et al. Técnicas moleculares aplicadas à microbiologia de alimentos. Acta Sci. Technol., Maringá, v. 30, n. 1, p.109-118, 2008. [12] GARCIA, A. S. Salmonelose. 2008. Disponível em: < http://qualittas.com.br/uploads/documentos/Salmonelose%20%20Ademir%20Soares%20Garc ia.pdf>. Acesso em: 16/08/2012.
[13] CASTELANI, L.; DUARTE, K.M.R. Métodos moleculares em microbiologia de alimentos. PUBVET, Londrina, v. 5, n. 2, ed. 149, Art. 1000, 2011. [14] SILVA, N; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos. 3ªEd. Editora: VARELA , 1997. [15] VANDERZANT, C; SPLITTSTOOSSER, RDF. Compendium of methods for themicrobiological examination of foods. 15a ed.; Wanhington, DC. APHA, 1992. 1219 p. [16] CHAPMAN. P.A; ELLEN, M.; ASHTON, R.; SHAFIQUE, W. Comparison of culture, PCR and immunoassays for detection Escherichia coli O157 following enrichment culture and immunomagnetic separation performed on naturally contaminated raw meat products. Food Microbiology, v. 68, p.11-20, 2001. [17] MIRANDA, R. R.; MONTEIRO, F. C.; BITTENCOURT, J V. M. Diagnóstico Molecular de Salmonella sp. In: XVI Seminário de Iniciação Cientifica da UTFPR, 2011, Ponta Grossa. [18] SOUZA, K. K. et al. Otimização da técnica da PCR para a detecção de Actinobacillus pleuropneumoniae. Cienc. Rural .v. 38, n.8, p. 2239-2244, 2008. [19] FLORES, M. L. et al. Métodos De Extração de DNA para a Detecção De Salmonella em Ovos de Galinhas, com e sem casca, através da Reação em Cadeia pela Polimerase. Cienc. Rural . v.31, n.2, p. 315-318, 2001. [20] PERES, N. D. Detecção de Listeria monocytogenes em Leite: Sensibilidade E Especificidade da Técnica De Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). 2007. 43 f. Dissertação (Mestre) - Curso de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2007. [21] MALDONADO, A. G. Ocorrência de Salmonella spp. em amostras de carcaças e muídos de frango obtidas em uma feira e um mercado municipal na zona oeste da cidade de São Paulo: análise crítica entre a técnica convencional em meios de cultivo e reação em cadeia pela polimerase - PCR. 2008. Dissertação (Medicina Veterinária Departamento de Pós- Graduação em Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária - Universidade de São Paulo). [22] VIANEZ JUNIOR, J. L. S. G. Bioinformática aplicada no desenho de indicadores para genes funcionais: degradação de herbicida 2,4-D: estudo de caso. 2007. 148 f. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007. [23] LAZCKA, O. et. al. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Food Control, v. 22, n. 7, p. 1205-1217, 2007.
