ASPECTOS MOLECULARES Y BIOQUÍMICOS DEL CÁNCER DE COLON EN UN MODELO MURINO Anne Santerre (
[email protected]) Josefina Casas-Solís (
[email protected]) María del Rosario Huizar-López (
[email protected]) Luz Patricia Castro-Félix (
[email protected]) Cesar Antonio Irecta-Najera (
[email protected]). Laboratorio de Biomarcadores moleculares y Genética Molecular Departamento de Biología Celular y Molecular, CUCBA, UDG. Generalidades del cáncer El cáncer es un problema de salud pública ya que, aun si el índice de supervivencia de muchos tipos de cáncer ha mejorado en los últimos años, este padecimiento ocupa el segundo lugar como causa de muerte en Estados Unidos, y el tercer lugar en México, después de problemas del corazón y la diabetes. Bajo el término genérico “cáncer” se engloba un conjunto de enfermedades relacionadas con crecimiento y proliferación celular desordenados (alternación del ciclo celular, alteración de vías de señalización, pérdida de la apoptosis y de la senescencia). Así, un cáncer inicia con la aparición de células cancerosas que presentan numerosos cambios fenotípicos y genotípicos. El cáncer es un proceso multi-etapas y cada etapa tiene una duración variable dependiendo de factores genéticos, del estilo de vida del paciente y de su exposición a factores de riesgo. Los principales factores de riesgo que influyen en la oncogénesis son: dieta, edad avanzada, uso de tabaco, consumo de alcohol, sedentarismo y obesidad, menopausia, exposición a la luz ultravioleta o a otra radiación, exposición accidental a pesticidas o a compuestos carcinogénicos. Evitar o reducir estos factores permite disminuir las posibilidades de padecer cáncer. Además, infecciones virales como el virus del papiloma humano (VPH), el virus de la hepatitis B o C (HepB y HepC), o el virus de la inmuno deficiencia humana (VIH) pueden aumentar el riesgo de padecer cáncer cérvico uterino, cáncer de hígado y sarcoma de Kaposi, respectivamente. El cáncer, se presenta en diferentes formas en la población y se puede clasificar como: esporádico (80%), familiar (15%, cuando aún no se ha definido un patrón de herencia), hereditario (5%, cuando afectó a la gónada y por lo tanto a cada célula del individuo). Las
principales mutaciones que afectan al DNA y pueden favorecer la tumorogénesis son: mutaciones génicas o puntuales (sustitución, deleción, inserción), translocaciones, inestabilidad génomica, amplificación génica y factores epigenéticos, especialmente la hipo o hiper metilación). Una mutación génica es una alteración en la secuencia nucleotídica que afecta un gen o alelo. Un alelo es una de las distintas variantes en que se presenta un gen en una población. Un alelo silvestre es la variante más común de un gen. Los alelos son las distintas formas que resultan de mutaciones de un gen silvestre. El heredar una alteración en un gen (mutación recesiva) involucrado en un cáncer no significa que la persona se verá afectada, pero si indica una mayor posibilidad de padecer la enfermedad, ya que una mutación en el alelo silvestre del mismo gen puede afectar el fenotipo celular. Por lo anterior es importante cuidar el estilo de vida y evitarla exposición a los factores de riesgo. Según el tejido o la(s) célula(s) afectadas, el cáncer se etiqueta como: hiperplasia (incremento en el número de células), metaplasia (sustitución de un tipo de célula por otra), displasia (desarrollo anormal de un tejido). Además, se puede clasificar en: carcinoma (tipo de cáncer que se origina en las células epiteliales), sarcoma (tumor que se origina en tejidos conectivos: cartílagos, grasa, músculos, huesos), leucemia (afecta células de
la
sangre
y
medula
ósea)
o
linfoma
(cáncer
del
sistema
linfático)(www.aecc.es/sobreelcancer/elcancer/paginas/tipodecancer.aspx). El término carcinoma, engloba cualquiera de los diversos tipos de tumores cancerosos que se forman en el tejido epitelial, el tejido que compone las capas externas de la superficie del cuerpo y recubre el tracto digestivo y otras estructuras, ejemplos de este tipo de cáncer incluyen cáncer de seno, pulmón y próstata. Es importante además distinguir los tumores benignos y malignos. Una célula que pierde el control de su ciclo celular puede formar un tumor benigno. Los tumores benignos no son cancerosos y generalmente no son graves si se tratan rápidamente (eliminación quirúrgica); raramente ponen en riesgo la vida del paciente. Los tumores malignos son cancerosos ya que se caracterizan por la presencia de células con varias anomalías que permiten su división incontrolada y desordenada; como resultado se forma una masa de tejido (tumor=clona de células con acumulación de mutaciones que favorece su sobrevivencia) que puede destruir el tejido a su alrededor. Estas células pueden también perder su capacidad de adhesión al resto del clon y entrar en el torrente sanguíneo o en el
sistema linfático y provocar metástasis (diseminación desde el sitio primario del cáncer hacia otros órganos). Genética del cáncer La oncogénesis (proceso por el cual se produce el cáncer) es un proceso de etapas múltiples que implica el descontrol del ciclo celular. Los principales eventos moleculares que pueden afectar al ciclo celular son los involucrados en la reparación del DNA, en el control del ciclo celular, de la apoptosis (muerte celular programada), de la proliferación y de la diferenciación celular, así como la autosuficiencia de señales de crecimiento, la comunicación célula-célula, la promoción de la angiogénesis (formación de nuevos vasos sanguíneos), la invasión y la metástasis. A continuación se comparan diferentes aspectos que diferencian las células normales de las cancerosas. -
Reparación de los daños del DNA: en células normales se observa la expresión de genes que se encargan de reparar el DNA dañado; sin embargo, las células cancerosas presentan una alteración en la capacidad de reparar al DNA dañado.
-
División celular: las células normales son capaces de regular la proliferación y controlar las fases del ciclo celular, mientras que en las células cancerosas los genes que controlan estas fases se encuentran mutados lo que conduce a una proliferación descontrolada.
-
Apoptosis (muerte celular programada): en tejidos sanos, la apoptosis permite eliminar las células dañadas y limitar el número de estas células; sin embargo, en células cancerosas los genes que promueven la apoptosis están dañados por lo que estas células no se auto-eliminan.
-
Las células sanas presentan la capacidad de diferenciarse y mantenerse unidas con las células vecinas; esta capacidad se pierde así como la cohesión celular en tejido tumoral.
En células tumorales, dos categorías principales de genes de clase II están involucradas: los protooncogenes y los genes supresores de tumores (GST). Los protooncogenes son genes normales cuyos productos influencian/controlan el ciclo celular, favorecen su progresión adecuada y controlan la muerte celular por senescencia o apoptosis. Cuando un protooncogen sufre una mutación se denomina oncogen. La mutación provoca una ganancia de función es decir que su expresión es de tipo dominante (se sobre-expresan
sobre el alelo silvestre) por lo que una mutación en un solo alelo es suficiente para su expresión y el producto génico contribuye al desarrollo del cáncer. En las células cancerosas uno o más protooncogenes están mutados. Los GST son genes cuyos productos normalmente regulan el ciclo celular y pueden iniciar el proceso de apoptosis de las células dañadas o bloquear el progreso del ciclo celular. Cuando estos genes están mutados o inactivos, sus productos son incapaces de llevar a las células dañadas a apoptosis. Casi todos los tipos de cáncer humano involucran la pérdida o mutación de uno o más GST lo que favorece la replicación de estas células de manera incontrolable. Cabe mencionar que estas mutaciones son de tipo recesivo: se necesita de la mutación en ambos alelos para que se afecte el fenotipo celular. Los GST descritos hasta el momento codifican para enzimas que participan en la reparación del DNA, así como para moléculas de transducción de señales, factores de la transcripción, proteínas que participan en el control del progreso del ciclo celular o regulan la apoptosis. Ejemplos de protooncogenes y GST: -
El protoncogen RAS (involucrado en más del 40% de los tumores humanos) codifica para moléculas de transducción de señales que regulan el crecimiento y la división celular.
-
El GST p53 (implicado en 50% de los cáncer), codifica una proteína nuclear que actúa como factor de transcripción que en células silvestres reprime o estimula la transcripción de otros genes (50 o más). Las células que carecen de p53 tienen una tasa de mutación más alta, y acumulan más mutaciones y aberraciones cromosómicas que conducen al cáncer.
-
El producto del GST PRB1, controla la etapa G1/S del ciclo celular; su pérdida o mutación contribuye al desarrollo de cáncer de mama, de hueso, óseo, de pulmón y de vejiga.
Cáncer colorrectal (CCR) Al igual que los otros tipos de cáncer, el cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad multifactorial y multietapa y una de las principales causas de muerte por cáncer en países industrializados. En México, es el cuarto tipo de cáncer que causa mortalidad. Su etiología es compleja; incluye factores ambientales y genéticos. La mayoría de los pacientes con CCR
presentan síntomas claros durante semanas o meses antes de la hospitalización, pero generalmente se diagnostican en fases avanzadas de la enfermedad. Los síntomas más comunes son: sangrado rectal, cambios persistentes en los hábitos intestinales y anemia. En tumores avanzados se produce pérdida de peso, nauseas, anorexia y dolor abdominal. Los síntomas precoces pueden ser poco severos y confundirse con otros padecimientos; en algunos pacientes los síntomas aparecen cuando el cáncer se encuentra muy desarrollado y los tratamientos en estas fases son menos eficaces. Los factores de riesgo del CCR incluyen la calidad y cantidad de la dieta. La ingesta de carne roja y la falta de frutas y vegetales, aumentan el riesgo de CCR. La ingesta de más de dos bebidas alcohólicas por día, duplica el riesgo de CCR. También el tabaquismo prolongado se asocia con este riesgo. Los factores genéticos incluyen predisposición hereditaria, síndromes de poliposis familiar, síndromes no polipósicos familiares, otras causas familiares y no familiares. Es muy importante limitar la exposición a los factores de riesgo. De igual manera, el diagnóstico temprano y la detección oportuna de las lesiones benignas permiten establecer un tratamiento exitoso. Las pruebas clásicas para determinar el estadio de desarrollo de un cáncer (estradificación) son: examen físico, estudio de imágenes, pruebas de laboratorio, informes patológicos, informes de cirugías. Según la etapa del cáncer el médico calcula el pronóstico de la persona y propone un tratamiento que incluye una combinación de: cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, terapia biológica (consultar las hojas informativas en www.cancer.gov) (American CancerSociety. CancerFacts and Figures 2011, Atlanta: American CancerSociety, 2011). Cambios moleculares en el cáncer colorrectal En el CCR existen importantes cambios moleculares y desregulación del ciclo celular. Entre los cambios más importantes se han reportado a las mutaciones en el GST APC. La proteína APC es importante en la degradación de la beta-catenina, un complejo transcripcional que activa el crecimiento celular a través de ciclina D1 o c-myc. Las mutaciones del gen APC son muy frecuentes en CCR esporádico y también se han identificado mutaciones en el gen de la β-catenina. En los tumores y pólipos colorrectales se produce un desequilibrio en la metilación del DNA, con hipometilación general que puede originar la activación de los oncogenes además de hipermetilación regional que
puede inactivar genes supresores tumorales. Las mutaciones del gen K-ras se encuentran en pólipos de mayor tamaño, lo que sugiere que ocurre después de la mutación de APC que activa la señalización de MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) implicada en la proliferación celular. Las deleciones en el brazo corto del cromosoma 18 son un acontecimiento tardío asociado al desarrollo del cáncer; probablemente afectan a los componentes codificados por DPC4 (Deleted in Pancreatic Cancer 4) un gen implicado en la vía de señalización del factor transformador del crecimiento TGF-β y DCC (Deleted in Colon Cancer) gen frecuentemente ausente en el cáncer de colon. Las pérdidas en el brazo largo del cromosoma 17 y las mutaciones de p53, otro GST, son acontecimientos tardíos habituales en el cáncer de colon. Mecanismo de carcinogénesis del colon Uno de los modelos genéticos mejor conocido de carcinogénesis del colon es el modelo de Vogelstein, que se basa en el origen y desarrollo del carcinoma colorrectal a partir de un adenoma. Los mecanismos de carcinogénesis pueden estar relacionados con diversas alteraciones genéticas y por lo tanto, dar lugar a tres grupos de carcinomas: 1) los asociados con la inestabilidad cromosómica (mutaciones, pérdidas alélicas y pérdida de heterocigocidad, amplificaciones cromosómicas y translocaciones), como es el caso de la mayoría de los carcinomas esporádicos y hereditarios asociados con poliposis; 2) los asociados con inestabilidad intragénica o microsatelital (microsatélites hMSH2 y hMLH1), como en el 15% de los carcinomas esporádicos y carcinomas hereditarios no asociados con poliposis y 3) la combinación de ambos factores.
Epitelio Hiperproliferativ o
Epitelio normal
Mutación APC
Adenom a
MutaciónMutación K-ras
Fig. 1. Modelo simplificado de carcinogénesis de colon. Poliaminas y cáncer
Adenom a grande
Carcinom a de colon
p53
Las poliaminas son aminas alifáticas imprescindibles para la vida en todos los organismos conocidos. Las principales PAs biológicamente activas son: putrescina (PU), espermidina (SPD) y espermina (SPM). Las PAs regulan múltiples procesos vitales para el mantenimiento, el crecimiento, la división, desarrollo y diferenciación celular; son necesarias para la replicación, la transcripción y la traducción, así como la permeabilidad. A pH fisiológico poseen cargas positivas, responsables de sus interacciones con múltiples proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares cargados negativamente, de forma inespecífica en algunos casos o totalmente específica en otros. Mediante estas interacciones las PAs ejercen muchas de sus funciones regulando por ejemplo, la actividad de muchas proteínas o la expresión de determinados genes. La ODC es la enzima que cataliza la descarboxilación del aminoácido L-ornitina y lo convierte en PU. Es fundamental para la viabilidad celular en casi todas las especies conocidas, prueba de ello es que el gen ODC está presente en toda la escala filogenética desde bacterias hasta el hombre y su secuencia es altamente conservada. Los niveles de PAs, así como la actividad de la ODC son esenciales para la proliferación celular en estados normales, y existe una correlación entre la regulación de la proliferación celular y su metabolismo. En general los tejidos con escaso crecimiento poseen niveles bajos de PAs, mientras que aquellos con gran potencial proliferativo poseen una mayor concentración. Por ejemplo, en células transformadas, con crecimiento descontrolado y en la mayoría de los crecimientos neoplásicos se ha encontrado una abundante presencia de PAs. Los niveles de PAs y ODC se encuentran estrechamente relacionados con las mutaciones que sufre el gen APC, que codifica una proteína que regula la translocación de βcatenina al núcleo donde regula la expresión de MYC y ciclina D. Las mutaciones de APC son evidentes en algunas neoplasias como el cáncer de colon y linfoma, ya que producen una descompensación en el metabolismo de las PAs, incrementando su producción intracelular y su excreción. Por lo anterior el análisis de los niveles de PAs, así como la medición de la actividad de la ODC han sido propuestos como biomarcadores del desarrollo tumoral. Carcinogénesis experimental en CCR Los modelos reproducibles permiten al investigador estudiar la enfermedad y evaluar variables como dieta, anatomía del colon, factores microbiológicos y parámetros
inmunológicos. Existe una gran variedad de agentes químicos para la inducción de CCR en modelos animales. Dentro de los agentes químicos más utilizados se encuentran el azoximetano (AOM), el 1-2, dimetilhidrazina (DMH) y el metilazoxymetanol (MAM). La comprensión de los mecanismos que originan las lesiones pre-neoplásicas o precancerosas en el colon y recto es fundamental. Cambios histológicos del colon durante la carcinogénesis experimental por agentes químicos Los Focos de Criptas Aberrantes (FCA), fueron identificados inicialmente en colon de ratones tratados con AOM. A cuatro años de su primera descripción en ratones, los FCA se identificaron en colon y recto de seres humanos. De esta forma, los FCA son considerados como lesiones pre-neoplásicas y corresponden con lo que patólogos han diagnosticado preferentemente como hiperplasia focal. Entre sus características distintivas se encuentran: 1) mostrar un mayor tamaño que las criptas normales que los rodean, 2) poseer un espacio pericriptal más grande que los separa de las criptas normales; 3) a menudo se observa un epitelio engrosado; 4) generalmente poseen aberturas ovales en vez de circulares; 5) frecuentemente se observan al microscopio como elevaciones de la mucosa y en ocasiones en depresiones de la misma, que no se encuentran en el mismo plano focal que las criptas normales. Varios estudios muestran que el número de FCA, en particular los FCA displásicos, aumenta progresivamente desde sujetos normales a pacientes con adenoma, hasta llegar al cáncer. Además se encontró una importante correlación entre el número de FCA, su tamaño y el número de adenomas. Los resultados anteriores sugieren que los FCA, particularmente los FCA displásicos, son lesiones precursoras de adenomas y cáncer, tanto en modelos murino como en pacientes. Consumo de probióticos y su potencial terapeútico La palabra probiótico es de origen griego y significa “a favor de la vida”. La FAO definió a los probióticos como microorganismos vivos, que al ser suministrados en dosis adecuada, confieren un beneficio de salud al receptor, a través de su acción directa o indirecta sobre la modulación de la microbiota endógena así como sobre el sistema inmune del hospedero. Los microorganismos más utilizados como probióticos son de los géneros Lactobacillus y
Bifidobacterias. Existen numerosos reportes que en el tracto digestivo, las bacterias acido lácticas, estimulan la respuesta inmune del hospedero e inducen la muerte de células tumorales a través de la apoptosis. Sin embargo, son necesarios más estudios para entender sus mecanismos de acción. La clave en el tratamiento del cáncer es la prevención así que, en el marco de las actividades de investigación del CA-482 y del Doctorado en Ciencias Biomédicas (PNP, CUCS-CUCBA), se llevo a cabo el proyecto de tesis doctoral “Estudio del efecto protector e inmunomodulador de Lactobacillus casei en un modelo murino de cáncer colorrectal y su asociación con los niveles de poliaminas en orina (Cesar Antonio Irecta-Najera, 2013). Se desarrolló un modelo experimental para la evaluación del efecto protector e inmunomodulador de L. casei, así como la posible asociación de las poliaminas con el desarrollo del cáncer de colon en un modelo murino. El modelo consistió en ratones de la cepa BALB/C (hembras) con una edad de 12 semanas que se mantuvieron a temperatura de 22 a 24°C y humedad constante, con fotoperíodo controlado de 12 x 12 horas luz/ oscuridad, y se alimentaron con una dieta comercial que cubrió los requerimientos nutricionales básicos. Diseño experimental El diseño experimental incluyó seis grupos de ratones BALB/C (n=10): 1) grupo control sano; 2) grupo control tratado con Lactobacillus casei (1x106 UFC / organismo, administración oral dos veces por semana, por 31 semanas); 3) grupo tratado con DMH (20 mg/Kg de peso/24 semanas/inyección subcutánea semanal); 4) grupo pre-tratado con Lactobacilluscasei, 2 semanas antes y durante la inducción del cáncer; 5) grupo tratado con DMH y con Lactobacillus casei durante la inducción del cáncer; 6) grupo tratado con DMH y con Lactobacillus casei a partir de la semana 16 de inducción de cáncer con DMH. Durante la fase experimental se recolectó la orina de los ratones, para la determinación de los niveles de PAs. Periódicamente, animales de cada grupo experimental fueron anestesiados con pentobarbital y sacrificados para obtener, porciones distales de colon para la evaluación histológica y el análisis de la expresión de la ODC a nivel transcripcional y traduccional. Preparación de la cepa probióticaL. casei y administración
La cepa probiótica de L. casei fue obtenida del American Type Culture Collection (ATCC® 393) y se cultivó en caldo MRS (Man, Rogosa y Sharpe, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA). Para su administración oral mediante una cánula, 2 veces a la semana durante 31 semanas, se ajustó a una dosis de 106 UFC/50µL por ratón. Inducción del cáncer El cáncer se indujo con el compuesto químico 1-2, dimetilhidrazina (DMH). El DMH se preparó, en solución salina, al momento del experimento y se inyectó subcutáneamente (200 µL) a una dosis sub letal de 20 mg/Kg de peso corporal en la porción ventral de cada ratón. La inyección se repitió semanalmente durante 24 semanas. Se tomaron las medidas de seguridad necesarias para el uso de este carcinógeno. Evaluación de las criptas aberrantes en cortes de tejido colónico Se diseccionó la porción distal del colón y el tejido fue lavado con solución salina fisiológica (0.85% NaCl) y fijado durante 24 horas con formalina amortiguadora al 10%. El tejido se preparó para la parafinización a través de la deshidratación en una serie de concentraciones del alcohol etílico y xileno al 80, 90 ,9 y 100%. Se preservó el tejido en bloques de parafina (Mc Cormick scientific paraplast, USA), posteriormente se realizaron cortes de 5 micras de espesor usando un micrótomo teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) según el protocolo clásico. Un cm2 de cada sección colónica fue analizado bajo microscopio de luz visible para el conteo de los FCA en cada mm2 de cada sección. Determinación de PAs por HPLC Las muestras de orina fueron tratadas con ácido tricloroacético 0.05 M en HCl 0.5 N, en una proporción 1:2 con respecto al volumen de orina. La separación de las PAs se realizó mediante el principio de intercambio iónico combinado con el sistema de fase reversa. La detección se realizó por fluorescencia, mediante derivatización post-columna con ortoftalaldehído. Los compuestos fueron identificados según el tiempo de retención al ser comparados con estándares comerciales de concentraciones conocidas de putrescina, espermidina, y espermina (PU, SPD y SPM, respectivamente). Se utilizó un software de
análisis de datos para cromatografía (Galaxie versión 1.9 SP2b, Varian GL Sciences Inc, USA). Identificación de ODC por Western Blot Los tejidos colónicos obtenidos por disección después del sacrificio se utilizaron para el análisis proteico de la ODC por western blot. Se utilizaron el anticuerpo monoclonal primario de la ODC N-15 (Sigma Aldrich) y el anticuerpo contra β-actina (Sigma Aldrich) asi como
el
anticuerpo
secundario
contra
ratón
anti
IgG-
conjugado
con
HRP
(HorseradishPeroxidase, Sigma Aldrich) y para la detección de las proteínas método de detección quimioluminiscente ECL de GE Healthcare; finalmente se observaron y cuantifican las bandas de interés. Resultados y discusión El estudio histopatológico de la pared distal del colon indica que los ratones tratados con el carcinógeno desarrollaron lesiones pre-neoplásicas y que estas evolucionan en adenocarcinoma. Se confirmó que el número de FCA se relaciona con el proceso de carcinogénesis. El estudio histopatológico demostró además que este modelo murino presenta las mismas características histológicas que las descritas en pacientes con carcinogénesis esporádica del colon. Una vez establecido el modelo murino de CCR se valoró el efecto de la administración de la cepa probiótica L. casei sobre su desarrollo. Se observó una disminución significativa en el número de lesiones pre-neoplásicas (FCA) en los ratones que recibieron al lactobacilo de manera preventiva en comparación con el grupo tratado con el carcinógeno, lo que sugiere que este probiótico juega un papel protector contra el desarrollo del CCR en ratones BALB/C. Es importante destacar que no encontramos una reducción significativa en el número de FCA en los grupos de administración a la par y de manera tardía del probiótico. Por lo anterior, la ingesta preventiva de L. casei es un factor clave para lograr un efecto protector contra la sustancia carcinogénica (DMH). La disminución en el número de lesiones pre neoplásicas (FCA) podría deberse a la capacidad que tienen algunas cepas probióticas de unirse y degradar compuestos potencialmente mutagénicos en el tracto del colon. Los resultados que obtuvimos con respecto a la disminución de FCA en el grupo L.
casei preventivo en comparación con el grupo de administración tardía, sugieren que es necesaria la presencia de L. casei en el colon antes de la administración del carcinógeno, para prevenir o disminuir el número de mutaciones que las sales de metil-diazonio generan en las células epiteliales del colon, estas sales son responsables de la acumulación en las células de mutaciones en los genes APC, K-ras y P53 que llevan a la formación de lesiones neoplásicas. Esta hipótesis se tendrá que comprobar en futuros proyectos. Además, se midieron los niveles de las PAs en la orina de los ratones a lo largo del periodo experimental (31 semanas) con la finalidad de evaluar su utilidad como marcardor del desarrollo neoplásico, así como el efecto protector de L. casei. Se encontramos niveles elevados de PAs durante la inducción de CCR; la concentración de PU se incrementó en las semanas 6 y 31. La espermidina se elevó significativamente solamente en la semana 6, y mostró una tendencia a una mayor concentración en el grupo DMH en comparación con el grupo control sano en la semana 31. Por lo tanto, se destaca que de las tres PAs evaluadas, la PU es la que proporciona una mayor información sobre el desarrollo del CCR. Cabe mencionar que su determinación en orina es fácil y no es dañina para el organismo. La evaluación de los niveles de estas tres PAs en el grupo de ratones sanos permitió además definir valores de referencia útiles tanto para el presente proyecto como para futuros estudios en el mismo modelo. Los datos experimentales indican que la expresión de la ODC aumentó signifcativamente en el colon de los ratones tratados con DMH en comparación con los ratones control sanos, lo que confirma que la actividad de la ODC y el contenido de PAs juegan un papel importante en el desarrollo tumoral. En resumen los datos de FCA, PU y ODC indican que la administración temprana de L. casei previene el desarrollo tumoral; no así la administración tardía. Se desconoce el vínculo directo entre el metabolismo de las PAs y el efecto de las bacterias probióticas en el colon. De acuerdo con nuestros resultados proponemos que la disminución tanto de los niveles de PAs en orina, como de la ODC en el colon, son consecuencia de una disminución en el. tejido hiperplásico, debido a que estas aminas biológicas son esenciales y se incrementan en eventos hiperproliferativos como el cáncer. Es probable que la disminución de tejido hiperplásico en los ratones a los que se les administró preventivamente L. casei se relacione con un efecto protector de la bacteria contra el CCR; ya sea por la degradación de
carcinógenos, y/o por la excreción de enzimas con carácter antimutagénico (manuscrito en proceso de revisión). Conclusiones Los datos experimentales en ratones BALB/C
muestran que la administración
preventiva de L. casei ejerce un efecto protector contra el CCR inducido por la DMH, ya que disminuye la aparición de lesiones pre-neoplásicas (FCA) con respecto a los ratones que solo recibieron el carcinógeno. El metabolismo de las poliaminas se relacionó con el desarrollo neoplásico debido a que se incrementó en ratones tratados con DMH. El indicador más sensible de la alteración de este metabolismo en ratones BALB/C fue la putrescina urinaria. Se encontraron niveles elevados de ODC en ratones que recibieron el carcinógeno con respecto a los ratones sanos. La administración preventiva de L. casei normalizó la excreción de PAs urinarias además de la expresión de la ODC en colon. Estudios complementarios permitirán evaluar varias citocinas pro e anti-inflamatorias así como la expresión de las células T CD4, T CD8, NK y T-reguladoras (T-Reg) con la finalidad de investigar si el grupo de ratones que recibió L. casei de forma preventiva se benefició con un efecto inmunomodulador de este probiótico. Referencias Bird, R.P. 1995. Role of aberrant crypt foci in understanding the pathogenesis of colon cancer. Cancer Lett. 93(1): 55-71. Campo Alegria, L., y A. B. Garcia Garrido, Guía de prevención y manejo del cáncer colorrectal en Atención Primaria. Fisiopatología y patogenia del cancer 2009, Madrid: You & US. Casero, R.A., Jr. and L.J. Marton. 2007.Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases. Nat Rev Drug Discov. 6(5): 373-90. Corpet, D.E. and S. Tache. 2002. Most effective colon cancer chemopreventive agents in rats: a systematic review of aberrant crypt foci and tumor data, ranked by potency. Nutr Cancer 43(1): 1-21. Galdeano, C.M., A. de Moreno de LeBlanc, G. Vinderola, M.E. Bonet, and G. Perdigon, 2007. Proposed model: mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria. Clin Vaccine Immunol. 14(5): 485-92.
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