Aspectos morfológicos produzidos pelo enalaprilato no miocárdio, diafragma e gastrocnêmio induzidos pelo isoproterenol
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ARTIGO ORIGINAL
Aspectos morfológicos produzidos pelo enalaprilato no miocárdio, diafragma e gastrocnêmio induzidos pelo isoproterenol Morphological aspects produced by isoproterenol-induced enalaprilat in the myocardium, diaphragm and gastrocnemius muscle of rats Celso Ferreira Filho1, Bráulio Luna Filho2, Cristofer André Caous3, Andrés Ricardo Pérez Riera4, Adriano Meneghini5, Celso Ferreira6
RESUMO
ABSTRACT
Objetivo: Avaliar o efeito do enalaprilato, inibidor da enzima conversora de angiotensina, no processo de reversão da hipertrofia, uma vez que a hipertrofia ventricular esquerda é um importante fator fisiológico preditivo que auxilia na prevenção de doenças cardíacas, visto que seus mecanismos indutores estão relacionados ao índice de massa corporal, hipertensão, hipercolesterolemia, tabagismo, diabetes e uso de medicação, que são empregados nos índices para modelos de avaliação de risco. Métodos: Um modelo histomorfométrico comparativo foi empregado para analisar os miócitos do ventrículo esquerdo, diafragma e gastrocnêmio. Oitenta ratos Wistar foram divididos em cinco grupos: controle, isoproterenol, enalaprilato, isoproterenol-enalaprilato (ISOE) e isoproterenol-água. O coração, o diafragma e o gastrocnêmio foram submetidos a uma análise histomorfométrica microscópica. Resultados: A proporção da massa tecidual úmida-seca verificouse aumentada entre os grupos controle e isoproterenol. Não houve diferença estatística significativa ou morfológica entre os demais grupos experimentais. Conclusão: Sugere-se que há forte evidência de que a hipertrofia ventricular esquerda seja primariamente induzida por ativadores neuro-humorais relacionados aos sistemas simpático e renina-angiotensina. O enalaprilato aumenta a taxa de regressão hipertrófica no ventrículo esquerdo, mas o mesmo fato não é observado no diafragma e gastrocnêmio.
Objective: To evaluate the mechanism of enalaprilat, an angiotensinconverting enzyme inhibitor, as a promoter of hypertrophy reversion in different types of myocytes, left ventricular hypertrophy is an important physiological predictive factor that helps preventing heart diseases, because its inducing mechanism is associated to body mass index, hypertension, hypercholesterolemia, smoking, diabetes mellitus and use of medication. These mechanisms are employed in indexes to assess risks. Methods: Left ventricle, diaphragm and gastrocnemius muscle of 80 male Wistar rats were divided into five distinct groups: control, isoproterenol, enalaprilat, isoproterenolenalaprilat group and isoproterenol-water. The heart, diaphragm and gastrocnemius muscles were submitted to histomorphometry of myocytes under light microscopy analysis. Results: The wet weightdry weight ratio was increased in the control and isoproterenol groups. Histomorphometric analysis showed ventricular hypertrophy in rats treated with isoproterenol. In addition, no significant statistical or morphological differences were observed among the other experimental groups. Conclusion: There is strong evidence that left ventricular hypertrophy can be stimulated primarily by neurohumoral activator agents and stretching mechanisms related to the sympathetic nervous and renin-angiotensin-aldosterone systems. Enalaprilat increases the hypertrophy regression in the left ventricle, but not in the diaphragm and the gastrocnemius muscles.
Descritores: Hipertrofia ventricular esquerda/induzida quimicamente; Isoproterenol; Enalaprilate; Diafragma/efeitos de drogras; Músculo gastrocnêmio/efeitos de drogras; Miócitos cardíacos/efeitos de drogas
Keywords: Hypertrophy, left ventricular/chemically induced; Isoproterenol; Enalaprilat; Diaphragm/drug effects; Gastrocnemius muscle/drug effects; Myocytes, cardiac/drug effects
Trabalho realizado na Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil. 1
MD, PhD, Professor Titular de Propedêutica Clínica da Faculdade de Medicina de Santo Amaro – UNISA, São Paulo (SP), Brasil; Professor da Disciplina de Cardiologia da Faculdade de Medicina do ABC – FMABC, Santo André (SP), Brasil.
2
MD, PhD, Disciplina de Cardiologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
3
MSc, PhD, Instituto do Cérebro do Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein – IIEP, São Paulo, (SP), Brasil.
4
Professor Colaborador da Disciplina de Cardiologia da Faculdade de Medicina do ABC – FMABC, Santo André (SP), Brasil.
5
Professor Colaborador da Disciplina de Cardiologia da Faculdade de Medicina do ABC – FMABC, Santo André (SP), Brasil.
6
Professor Titular da Disciplina de Cardiologia da Faculdade de Medicina do ABC – FMABC, Santo André (SP) Brasil; MD,PhD, Disciplina de Cardiologia da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
Autor correspondente: Cristofer Andre Caous – Avenida Albert Einstein, 627 – Morumbi – CEP 05651-901 – São Paulo (SP), Brasil – Tel.: 11 3747-1414 – e-mail:
[email protected] Data de submissão: 28/5/2007 – Data de aceite: 1º/10/2007
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Ferreira Filho C, Luna Filho B, Caous CA, Riera ARP, Meneghini A, Ferreira C
INTRODUÇÃO Está demonstrado que os aumentos crônicos no estresse diastólico-sistólico da parede levam à hipertrofia cardíaca. Em diferentes situações o coração pode sofrer diferentes tipos de sobrecarga de trabalho em razão de vários fatores, tais como esforço físico, situações estressantes, doenças cardíacas ou extracardíacas. A conseqüência clínica depende do desempenho cardíaco e de seus mecanismos compensatórios específicos ou globais relacionados à natureza, urgência e duração do processo de sobrecarga(1-2). A adaptação cardíaca depende da pré-carga, pós-carga, freqüência cardíaca, contratilidade e hipertrofia ventricular esquerda (HVE), assim como a plasticidade da matriz extracelular relacionada à síntese de proteínas fibrilares(3). A HVE é bem conhecida como um fator de risco prognóstico adverso e é um dos principais fatores de risco cardiovascular nas duas últimas décadas, e freqüentemente significa elevação da pressão arterial por longo período de tempo. De modo geral, está associada a outras lesões de órgãos terminais em humanos promovendo a deterioração progressiva da função ventricular(4-6). Em 1973, Katz(7) questionou se a hipertrofia do coração seria uma alteração compensatória ou prejudicial da função cardíaca, pois comprometia as proteínas contráteis e, conseqüentemente, o processo de acoplamento excitação–contração. Além disso, a HVE está intimamente correlacionada com a hipertensão arterial sistêmica, embora vários estudos controversos considerem a HVE secundária ao aumento crônico dos níveis de pressão arterial ou outros estudos que mostram que não há evidências de relação causa–efeito entre a intensidade da HVE e os valores de pressão arterial(8-10). Portanto, este estudo experimental sobre a HVE em ratos foi realizado com o uso de isoproterenol sem a indução de hipertensão arterial ou níveis pressóricos elevados. Esse fármaco é uma amina simpatomimética que age exclusivamente em beta-receptores, reduzindo a resistência vascular periférica e a pressão diastólica. As artérias coronárias se dilatam e aumentam o fluxo sangüíneo, mesmo na presença de diminuição da pressão arterial(11). O objetivo foi estudar de maneira experimental a hipertrofia induzida pelo isoproterenol e a reversão induzida pelo enalaprilato, por meio da avaliação histomorfométrica do comportamento nos três tipos de músculos: miócitos do miocárdio do ventrículo esquerdo, diafragma e músculo gastrocnêmio. MÉTODOS Manuseio dos animais O manuseio dos animais foi realizado em conformidade com as diretrizes éticas do Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São einstein. 2007; 5(4):321-325
Paulo. Os experimentos foram conduzidos em 80 ratos Wistar adultos machos (260 a 290 g) (Biotério Central – UNIFESP).
Procedimentos experimentais Após o período de adaptação de uma semana os animais foram selecionados aleatoriamente e, a seguir, divididos em cinco grupos de 16 animais cada, da seguinte maneira: Grupo-controle (CON): os animais foram tratados com injeções de 0,3 ml de azeite de oliva durante oito dias consecutivos. Após este período, os animais foram tratados com injeções de 0,3 ml de água destilada por mais 22 dias consecutivos. Grupo isoproterenol (ISO): os animais foram tratados com injeções de 0,3 ml de isoproterenol (Sigma-Co) em suspensão de azeite de oliva (0,3 mg/kg) durante oito dias consecutivos. Grupo isoproterenol-água (ISOW): os animais foram tratados com injeções de 0,3 ml de isoproterenol (SigmaCo) em suspensão de azeite de oliva (0,3 mg/kg) durante oito dias consecutivos. Após este período, os animais foram tratados com injeções de 0,3 ml de água destilada por mais 22 dias consecutivos. Grupo isoproterenol-enalaprilato (ISOE): os animais foram tratados com 0,3 ml de isoproterenol (Sigma-Co) em suspensão de azeite de oliva (0,3 mg/kg) durante oito dias consecutivos. Após este período, os animais foram tratados com injeções de 0,3 ml de enalaprilato (Lote L 072314 – Merck Sharp & Dohme) por mais 22 dias consecutivos. Grupo enalaprilato (ENA): os animais foram tratados com injeções de 0,3 ml de azeite de oliva durante oito dias consecutivos. Após este período, os animais foram tratados com injeções de 0,3 ml de enalaprilato (Lote L 072314 – Merck Sharp & Dohme) por mais 22 dias consecutivos. Em todos os grupos experimentais as injeções foram administradas por via subcutânea exatamente às 8 horas da manhã. Ao final do oitavo dia de administração no grupo isoproterenol (ISO) e ao final do 30o dia em outros grupos, após atingir o nível apropriado de anestesia com éter, verificado pelo movimento das vibrissas, tônus da cauda e resposta aos estímulos externos, os animais foram submetidos à toracotomia. Foram obtidos fragmentos de tecido cardíaco (átrios, ventrículo direito e ventrículo esquerdo com o septo interventricular), diafragma e músculo gastrocnêmio. Em oito animais de cada grupo experimental, os ventrículos esquerdos foram pesados com o uso de uma balança analítica Mettler EA 50 e, a seguir, esterilizados (esterilizador FANEM a 100ºC) durante 24 horas para serem desidratados. Além disso, uma segunda pesagem foi realizada para determinar o peso úmido e todas as amostras de tecidos foram retiradas do mesmo campo anatômico em cada animal. A amostra de diafragma foi colhida na posição medial esquerda, evitando, assim, a região do tendão. As amostras do músculo gastrocnêmio foram obtidas na porção posterior medial
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da pata traseira esquerda. As análises morfológicas dos miócitos foram realizadas sob microscopia óptica (sistema foto-microscópico Olympus Bx-50) com seções coradas em vermelho com picrosirius-hematoxilina. A mesma técnica de medição foi usada em todos os grupos. Foram medidos os diâmetros de dez miócitos de cada amostra de tecido.
Análise estatística São apresentados os dados como média ± desvio-padrão. As comparações entre os grupos foram realizadas por meio de ANOVA, seguido pelo teste de Tukey. Os valores foram considerados diferentes com p < 0,01.
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Resultados A proporção peso úmido/peso seco (Tabela 1) era maior entre os grupos controle (CON) e isoproterenol (ISO). A análise histomorfométrica revelou hipertrofia ventricular em ratos tratados com isoproterenol. Além disso, não foram observadas diferenças estatísticas ou morfológicas significativas (Figura 1) entre os outros grupos experimentais, de maneira que ISO > ISOW = ISOE > CON = ENA. A pressão arterial sistólica não foi afetada. A área da seção transversal dos miócitos foi medida por meio de histomorfometria quantitativa em seções equatoriais de tecido coradas com picrosirius-hematoxilina. A comparação de dados da análise histomorfométrica do
Tabela 1. Peso úmido/peso seco do ventrículo esquerdo nos grupos experimentais Controle (CON), Isoproterenol (ISO), Isoproterenol-água (ISOW), Isoproterenol-Enalaprilato (ISOE) e Enalaprilato (ENA) (n = 80) CON
ISO
ISOW
ISOE
ENA
Peso úmido
*0.53 ± 0.01
*0.75 ± 0.03
0.64 ± 0.02
0.65 ± 0.03
0.55 ± 0.02
Peso seco
*0.14 ± 0.01
*0.17 ± 0.01
0.14 ± 0.01
0.14 ± 0.01
0.13 ± 0.01
Valores apresentados como média ± desvio padrão; peso (g). Análise de variância com comparação entre as médias, Teste de Tukey – ISO > ISOW = CON = ENA. *Diferença estatística, p < 0,01
Figura 1. Fotomicrografias de seções transversais do ventrículo esquerdo de rato (A), diafragma (B) e músculo gastrocnêmio (C) em animais dos grupos-controle. Em D, E, F, as comparações histológicas entre os miócitos são mostradas como relacionadas aos aspectos de hipertrofia celular no ventrículo esquerdo, diafragma e músculo gastrocnêmio, respectivamente. Observe o aumento das dimensões dos cardiomiócitos e miócitos, mostrando o efeito do enalaprilato no processo de hipertrofia induzido pelo isoproterenol. As amostras de tecido foram seções coradas com picrosirius-hematoxilina. Barras = 80 μm
ventrículo esquerdo, diafragma e músculo gastrocnêmio (Tabela 2) revelou aumento dos diâmetros dos miócitos no grupo ISO em comparação com o grupo-controle. A seção transversal média dos cardiomiócitos do ventrículo esquerdo aumentou de 0,60 ± 0,04 para 1,39 ± 0,27 no eixo maior e de 0,33 ± 0,01 para 0,70 ± 0,08 no eixo menor.
O grupo ISOW apresentou uma diferença significativa apenas nas amostras de tecido do ventrículo esquerdo. De outro lado, as dimensões dos miócitos dos grupos ISOE e ISOW apresentaram diferenças significativas, quando comparadas, evidenciando reversão da hipertrofia no grupo ISOE. Quanto ao diafragma e músculo gastrocnêmio einstein. 2007; 5(4):321-325
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Ferreira Filho C, Luna Filho B, Caous CA, Riera ARP, Meneghini A, Ferreira C
Tabela 2. Análise histomorfométrica do ventrículo esquerdo (VE), diafragma (DI) e músculo gastrocnêmio (MG) nos grupos experimentais Controle (CON), Isoproterenol (ISO), Isoproterenol-água (ISOW), Isoproterenol-Enalaprilato (ISOE) e Enalaprilato (ENA) (n = 80)
VE DI MG
CON
ISO
ISOW
ISOE
ENA
eixo maior
*0.60 ± 0.04
*1.39 ± 0.27
*0.90 ± 0.08
0.45 ± 0.03
0.52 ± 0.03
eixo menor
*0.33 ± 0.01
*0.70 ± 0.08
*0.45 ± 0.08
0.32 ± 0.02
0.33 ± 0.01
eixo maior*
1.13±0.12
*0.93±0.29
1.19±0.17
1.05±0.17
1.06±0.07
eixo menor
*0.66±0.10
*0.73±0.12
0.66±0.09
0.57±0.07
0.55±0.03
eixo maior
*1.96±0.31
*2.44±0.30
1.82±0.07
1.75±0.31
1.66±0.03
eixo menor
*1.25±0.16
*1.67±0.18
1.25±0.19
1.12±0.19
1.19±0.13
Valores apresentados como média ± desvio padrão; eixo medido em cm. Análise de variância com comparação entre as médias, Teste de Tukey – ISO > ISOW = CON = ENA. *Diferença estatística, p < 0,01
dos grupos ISOE e ISOW, os diâmetros não mostraram diferenças estatisticamente significativas, sugerindo reversão ou reversão do processo de hipertrofia. Os diâmetros transversais dos miócitos ventriculares, assim como dos miócitos do músculo gastrocnêmio, estavam aumentados apenas no grupo experimental tratado com ISO. O modelo experimental ENA revelou uma reversão completa da hipertrofia dos cardiomiócitos induzida pelo isoproterenol; de outro lado, a reversão da hipertrofia dos miócitos do gastrocnêmio e do diafragma não ocorreu com a administração de enalaprilato.
DISCUSSÃO O objetivo deste estudo foi comparar as diferentes populações celulares analisadas concomitantemente (ventrículo esquerdo, diafragma e músculo gastrocnêmio) com base na hipertrofia dos miócitos. Para evitar a interpretação errônea dos dados, a variável hipertensão arterial e as amostras com a presença de edema intersticial do miocárdio foram excluídas da investigação. As análises de histometria do diafragma e músculo gastrocnêmio foram realizadas para padronizar o método. A análise do processo de hipertrofia foi investigada pelo modelo comprovado induzido pelo isoproterenol(12). Os músculos diafragma e gastrocnêmio foram estudados para verificar algumas semelhanças e diferenças inevitáveis relacionadas à HVE. A fisiologia do músculo gastrocnêmio difere das funções do miocárdio e diafragma em razão das atividades do estágio voluntário características da musculatura esquelética, que geralmente seguem o ritmo circadiano do animal. Os compostos de tecido miocárdico são basicamente miócitos e os elementos intersticiais; a diferenciação dos grupos ISOW e ISOE foi essencial, embora as proporções entre peso úmido/peso seco pareçam idênticas. Os processos hipertróficos ocorrem porque os receptores celulares são estimulados por meio da via da proteína G combinados com uma resposta genômica responsável pelo aumento volumétrico dos cardiomiócitos(13). O mecanismo de HVE pode ser entendido considerando einstein. 2007; 5(4):321-325
a ação biológica que produz um aumento do retorno venoso, ao mesmo tempo em que ocorrem aumento do débito cardíaco e, conseqüentemente, o estiramento das membranas dos miócitos(14). A implicação de um fator mecânico parece ser evidente para explicar a HVE, embora outras vias bioquímicas como o sistema reninaangiotensina possam ser ativadas pelo isoproterenol e bloqueadas com enalaprilato. Assim, um fator humoral pode estar envolvido na ação simpatomimética do isoproterenol no mecanismo adrenérgico(15-16). Além disso, o diafragma e o músculo esquelético não sofreram influência do estresse hemodinâmico. É admissível que a hipertrofia dos miócitos em ambas as estruturas, o diafragma e o gastrocnêmio, tenha sido induzida por mecanismos humorais específicos. Uma reversão completa ocorreu nas amostras de tecido do diafragma e gastrocnêmio analisadas, mas a reversão foi parcial no ventrículo esquerdo. Os benefícios clínicos dos inibidores da ECA no remodelamento cardíaco são geralmente aceitos e a hipertrofia cardíaca induzida pelo isoproterenol está associada a aumentos evidentes nos níveis plasmáticos de ANG II, mas não no ventrículo esquerdo; outros achados também mostraram que nem o sistema circulatório nem o sistema renina-angiotensina cardíaco têm uma função essencial no tropismo da estimulação dos receptores beta(17). Certamente os efeitos cronotrópicos do isoproterenol podem desempenhar uma função fisiológica na etiopatogênese da HVE, embora não tenha sido detectada qualquer interferência no diafragma e gastrocnêmio.
CONCLUSÃO O enalaprilato participou de uma rápida resposta de reversão da HVE, enquanto a reversão completa ocorreu somente nos músculos diafragma e gastrocnêmio no fim do período experimental sem a administração de enalaprilato. Além disso, esta conclusão baseia-se na análise histomorfométrica de maneira que outros fatores hipertróficos devem ser analisados como o perfil de expressão dos genes marcadores hipertróficos
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relacionados a um mecanismo de sinalização alternativo para o desenvolvimento de hipertrofia do miocárdio na prevenção de eventos cardiovasculares.
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AGRADECIMENTOS Esta pesquisa foi apoiada pelo Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP. Os autores agradecem a Karen Doerr, da Sommerville Library, pela ajuda na revisão do texto em inglês.
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