Atividade da enzima Glutamato Oxaloacetato Transaminase (GOT) em Ruditapes philippinarum

Enzimologia Atividade da enzima Glutamato Oxaloacetato Transaminase (GOT) em Ruditapes philippinarum

Prof.ª Dr.ª Etelvina Figueira

Trabalho realizado por: Rodrigo Meneses, 73100

João Romão, 72466 Carolina Neto, 67961

Caso de estudo – Ruditapes philippinarum • Várias espécies marinhas são capazes de se adaptar a diferentes salinidades, ao regular a sua pressão osmótica (Jobling, 1994). • Organismos marinhos podem acumular arsénio que é tóxico (Ventura-Lima et al., 2011). Além disso, diversas salinidades podem alterar a resposta toxicológica de ameijoas ao arsénio, afetando o seu proteoma e metaboloma (Wu et al., 2013). • Clowes e Francesconi (2004) concluíram que alguns bivalves conseguem usar valores elevados de arsénio como um osmólito em salinidade alta

A salinidade e arsénio têm efeitos no metabolismo de Ruditapes?

Salinidades de 14 e 42 g/L simulam fenómenos de chuvas intensas e secas (em relação a 28 g/L)

O arsénio pode ser tóxico na sua forma inorgânica ou actuar como osmólito na sua forma orgânica

Efeitos na actividade enzimática da GOT

G1: sal 28 g/L G2: sal 14 g/L G3: sal 42 g/L G4: sal 28 g/L + 2 mg/L As

Quantificação da proteína – Método do Biureto 0,800 y = 0,0225x + 0,0138 R² = 0,9952

0,700

mgprot/mL

0,600

ΔAbs540

100 µL da amostra ou padrão em cuvettes (0, 5, 10, 20 e 30 mg/mL)

0,500

amostras

G1

G2

G3

G4

média

desvio

cv

0,400

C

8,19

11,25

11,74

6,90

9,52

2,35

0,25

14

5,25

9,79

9,08

8,41

8,13

2,00

0,25

42

9,65

16,23

13,52

9,70

12,28

3,20

0,26

As

8,36

20,72

11,74

13,88

13,68

5,22

0,38

0,300 0,200

1 mL de reagente de Biureto em cada cuvette; Uniformizar e deixar decorrer a reacção durante 10 min à temperatura ambiente

Ler absorvância a 540 nm; calibrar espectrofotómetro com a concentração 0 mg/mL

0,100 0,000 0

10

20 Concentração (mg/mL)

30

40

Determinação da actividade da GOT G1 2,7

3

2,5

2,5

2,3

C

2,1

14

1,9

1

2

3

500 µL amostra + 500 µL reagente (numa cuvete); uniformizar

4

5

6

7

8

C

1,5

14 42

0,5

As

1,5

2

1

42

1,7

As

0

9

1

2

3

4

Tempo (min)

5

2,5

3

2

C

1,5

14

1

42

0,5

As

0 3

4

Tempo (min)

5

6

Abs340

3,2

2

7

8

9

10

G4

3

1

6

Tempo (min)

G3

Abs340

Medição da absorvância a 340 nm, de 1 em 1 min, durante 7 min (excepto grupo 3 – 4 min).

Abs340

Abs340

Preparação do reagente

G2

2,8

C

2,6

14 42

2,4

As

2,2 1

2

3

4

5

Tempo (min)

6

7

8

Resultados – Grupo 3 U/mg prot 0,04793 U/g FW

1,1254

14

42

As

0,60201

0,1018

0,14379

10,9325

2,73312

3,37621

Actividade Específica 0,7 0,6 0,5

U/mg prot

C

Actividade Específica:

214

0,3

342

0,2

4 As

0,1

• Aumentou tanto com a diminuição como com o aumento de salinidade; • Aumentou com a adição de Arsénio. • Resposta maior para menor salinidade (14 g/L).

0

C1

2 14

42 3

As 4

Actividade Enzimática 12

Actividade Enzimática:

10

U/mg FW

• Aumentou tanto com a diminuição como com o aumento de salinidade; • Aumentou com a adição de Arsénio. • Resposta maior para menor salinidade (14 g/L).

1C

0,4

8

1C

6

2 14

4

3 42 4 As

2 0 1C

2 14

3 42

4 As

Resultados – Comparação entre grupos G1 C 0,067 1,102

U/mg prot U/g FW

G2

14 5,302 55,673

42 0,095 1,837

As 0,225 3,767

C U/mg prot 0,08932 U/g FW 2,00965

Actividade Específica

42 0 0

As 0,00194 0,08039

C U/mg prot 0,233 U/g FW 3,21543

214

2

3 42

1

4 As

1C

3

214

2

3 42

1

0

U/mg prot

3

U/mg prot

4

4 As

0 2 14

42 3

1C

Actividade Enzimática 40

1C

30

2 14

3 42 4 As

10 0

U/mg FW

50

20

14 2

42 3

C1

14 2

As 4

1C

0,4

2 14 3 42

0,2

As 4

4 As

C1

12

80

10 1C

60

2 14

40

3 42

20

2 14

42 3

As 4

Actividade Enzimática

100

4 As

0

42 3

0,6

Actividade Enzimática

60

As 0,11004 3,05466

0

4As

U/mg FW

C1

42 0,01657 0,32154

0,8

4 1C

14 0,67864 11,4148

Actividade Específica

5

5

U/mg prot

14 4,17941 81,8328

Actividade Específica

6

U/mg FW

G4

1

6

2 14

4

3 42

2

4 As

0

C1

2 14

42 3

4As

C

8

C1

2 14

42 3

As 4

Discussão • O aumento de salinidade (42 g/L) provocou respostas em sentidos diferentes entre grupos (2 aumento : 1 diminuição – falta de dados do grupo 2). • A diminuição de salinidade (28 g/L) provocou sempre um aumento na resposta, ou seja, um aumento tanto na actividade específica como na actividade enzimática. • O aumento da concentração de sal pode interferir com as ligações de hidrogénio que conferem à proteína a sua dimensão tridimensional (Cecie Starr et al, 2011) • A dissociação de NaCl em Na+ e Cl- pode levar a interações ião-dipolo entre Cl- e H+, mais fortes que as ligações de hidrogénio, causando portanto a desnaturação da molécula.

Ligação ião-dipolo

Ligação de hidrogénio

Discussão • A adição de arsénio provocou respostas em sentidos diferentes entre grupos (2 aumento : 2 diminuição). B. A. Fowler (1983) enumera vários mecanismos de inactivação de enzimas pelo arsénio:

Binding of inorganic arsenite (iAsIII) […] to cysteines in a protein. Shen et al., 2013 B. A. Fowler, 1983

Discussão • Vutukuru et al., 2007, verificaram a exposição de arsénio provocou um aumento de actividade de AST da carpa rohu (Lateo rohita), ao fim de 24 e 96 horas. É provável que o aumento da actividade enzimática tenha sido devido ao aumento da síntese desta enzima pelo fígado.

The toxic effect of arsenic trioxide (28.30 mg/L) on the AST activity of Labeo rohita at the end of 24 and 96 h exposure periods (P