BIOMARCADORES BIOQUÍMICOS: UMA ALTERNATIVA PARA O MONITORAMENTO AMBIENTAL Ramos, M.L.N1,2; Campos Junior, J.J.F.1,2; Quintero, E.H.1 1-TECNOCEANIC – Núcleo de Pesquisa, Transferência Tecnológica e Desenvolvimento Sócio Ambiental. Rua Tuiuti 161/202, Centro, CEP 40.060-020. Salvador – Bahia. E-mail:
[email protected] 2-TECLIM/UFBA – Rede de Tecnologias Limpas, Escola Politécnica, UFBA. Palavras chave: Fosfatase ácida, Ambientes transicionais, Toxicidade, Tilápia.
Introdução Tanto ambientes marinhos e costeiros, como ambientes de transição (manguezais, lagunas costeiras e áreas estuarinas), estão cada vez mais expostos a processos de contaminação em diferentes graus e causados por uma grande variedade de substâncias tóxicas ou potencialmente tóxicas de diversas origens. Estas substâncias conhecidas como xenobióticos afetam diferentemente os organismos dependendo do balanço entre as taxas metabólicas e a taxa de assimilação e eliminação de ditas substâncias (1). Devido às diferenças na metabolização dos xenobióticos, existe a necessidade de se detectar e avaliar o impacto de poluentes nos organismos expostos, e não apenas as quantidades presentes no ambiente e nos animais; esta necessidade origina o estudo de desenvolvimento de biomarcadores que detectem os efeitos biológicos nos organismos aquáticos (2). A presença de contaminantes como os hidrocarbonetos têm causado danos bioquímicos e celulares às populações aquáticas, colocando em risco a todo o ecossistema. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação tóxica de hidrocarbonetos, através da ação da fosfatase ácida, (biomarcador bioquímico), provocada pela exposição de juvenis de Oreochromis niloticus à fração solúvel dos compostos.
Material e Métodos Foi avaliada a toxicidade produzida pelos seguintes compostos: Tolueno, Nafta Leve, Nafta Pesada e Nafta Bruta. Ensaios com produtos de origem petroquímicos prevêem um procedimento especial. O teste divide esses produtos em duas fases: a líquida, fração solúvel em água (parte hidrofílica); e a fração particulada suspensa (parte hidrofóbica). Estas fases representam as condições antecipadas as quais os organismos serão expostos caso o produto seja descarregado em um corpo de água. Cada produto testado foi homogeneizado a velocidade de 1500 rpm, por 15 minutos; em seguida, diluídos em frasco de Mariotti na proporção 1:9 em água doce, e agitados em incubador rotatório à velocidade de 150 rpm durante 20 horas. A fração solúvel em água (FSA) foi mantida sob agitação, para a retirada das alíquotas necessárias ao preparo das amostras. Montagem dos tratamentos Colocou-se 4 juvenis de tilápia (17,35 + 0,18 cm) por aquário contendo 8 L de água acrescida da fração solúvel, a 5%, 10% e 20%. Cada tratamento foi feito em triplicata com duração de 24 horas; foi determinado o oxigênio dissolvido, pH, amônia e temperatura (multiparâmetro Orion), tanto no início como no fim de cada tratamento. Análise da atividade lisossômica em fígado de juvenis de O. niloticus. Obtenção da fração lisossômica: finalizando o teste, o fígado de cada peixe, foi extraído e lavado com solução tamponada de sacarose 0,25M, pH 7,4. Os fragmentos foram re-suspendidos, na proporção de 1/10 p/v em solução tampão sem fosfato e homogeneizados a 250 rpm durante 2 minutos em aparelho tipo Potter-Elvejhem; em seguida foi isolada a fração rica em lisossomos por centrifugação fracionada, segundo a técnica proposta por (3). Determinação da atividade da fosfatase ácida Foi utilizada a técnica proposta por Andersch & Szcypinski (1947), a qual usa como substrato o p-nitrofenilfosfato que, pela ação da enzima transforma-se em p-nitrofenol e ácido fosfórico. Adicionando-se hidróxido de sódio, interrompe-se a reação e o p-nitrofenol liberado é transformado em ânion de cor amarela, que é determinada por fotometria a 405nm. A quantidade de p-nitrofenol liberado na unidade de tempo é diretamente proporcional à atividade da fosfatase ácida. Para calcular a atividade por volume a partir da extinção 405nm, foi aplicada a seguinte equação:
Atividade por Volume = E405 x 101 mU/mL [1] Posteriormente, foi calculada a atividade da fosfatase ácida da seguinte maneira: a atividade enzimática por volume (mU/mL) foi dividida pelo teor de proteínas totais (μg/mL). Análises estatísticas aplicadas aos testes de fosfatase ácida Após obter os dados da atividade da fosfatase ácida dos tratamentos e dos dados da atividade da fosfatase ácida mais adição da digitinona, procedeu-se o cálculo dos valores da fragilidade lisossômica à partir da porcentagem de quebra das membranas, obtidas com base na fórmula de Aboutt (Finney, 1971): % Net Risk = % MbQ no tratamento - % MbQ no controle x 100 100 - % MbQ no controle
Onde: MbQ = Membranas quebradas. Foi utilizada também, uma análise de variância (ANOVA) entre os diferentes tratamentos, além do teste de comparação múltipla de médias de Dunnett, mediante o programa computacional GraphPad Instat 3.0.
Resultados e Discussões Evidenciou-se um aumento na toxicidade dos produtos ao aumentar a concentração da FSA de cada um dos componentes analisados. Observou-se o maior impacto no tratamento realizado com tolueno devido a que os peixes colocados nos tratamentos a 10 e 20% morreram pouco após serem submetidos a tais condições; o oxigênio dissolvido diminuiu drasticamente, o que foi observado na mudança de comportamento dos peixes, mostrando-se excessivamente agitados, distorcendo o modo de nadar, ficando completamente virados; nesses poucos minutos ocorreu desaparecimento da cor e matéria lipídica do peixe, deixando a água com um aspecto leitoso. A nafta pesada mostrou ser mais tóxica que a nafta leve (p
