Classificação de frutos, emergência de plântulas e isolamento de DNA genômico de Erythrina crista-galli L. (FABACEAE)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Sementes

TESE

Classificação de frutos, emergência de plântulas e isolamento de DNA genômico de Erythrina crista-galli L. (FABACEAE)

Luciano Moura de Mello

Pelotas Junho, 2014

Luciano Moura de Mello

Classificação de frutos, emergência de plântulas e isolamento de DNA genômico de Erythrina crista-galli L. (FABACEAE)

Tese apresentada à Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel” da Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação do Prof. Dr. Francisco Amaral Villela, como requisito parcial do Programa de PósGraduação em Ciência e Tecnologia de Sementes da Universidade Federal de Pelotas, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Pelotas Junho, 2014

Classificação de frutos, emergência de plântulas e isolamento de DNA genômico de Erythrina crista-galli L. (FABACEAE)

Luciano Moura de Mello

Comitê de Orientação: Orientador: Prof. Dr. Francisco Amaral Villela (FAEM/UFPEL) Co-Orientadoras: Prof. Dra. Lia Rejane Silveira Reiniger (UFSM) Dra. Monalize Salete Mota (UFPEL)

Comissão examinadora:

_________________________________ Prof. Dra. Lia Rejane Silveira Reiniger (UFSM) __________________________ Dr. Géri Eduardo Meneghello (FAEM/UFPEL) _______________________ Dra. Monalize Salete Mota (UFPEL) ________________________ Dr. Luiz Eduardo Panozzo (UFPEL) ______________________________ Prof. Dr. Francisco Amaral Villela (FAEM/UFPEL, Orientador)

Dedico mais este trabalho aos meus pais, Ruben e Cacilda, a quem devo o que sou hoje, e a meus filhos, Luísa, João Pedro e Bernardo.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Ruben e Cacilda, por cada minuto dedicado a me prestar o apoio de que precisava, durante todos estes anos e por cada palavra encorajadora.

A minha esposa, Alexandra, pelo apoio e companheirismo de sempre. À minha filha Luísa e meus filhos João Pedro e Bernardo, por cada animador sorriso e pela compreensão da distância que este período exigiu de nós.

A meus orientadores, Prof. Dr. Francisco Villela (UFPEL), Profª. Dra. Lia Reiniger (UFSM) e Dra. Monalize Mota (UFPEL) pela confiança no trabalho que estava sendo desenvolvido e pela amizade.

Um agradecimento especial é feito ao Prof. Dr. Géri Eduardo Meneghello, pelas contribuições ao trabalho, pelas frequentes revisões e orientações.

Aos colegas: Eng. Florestal Leonardo Severo da Costa (Doutorando, UFSM) pelas primeiras “aulas” com a extração do DNA e os marcadores moleculares e por ter me conduzido nesta etapa tão importante do trabalho. Ao Eng. Florestal (Mestrando, UFSM) Caetano Miguel Lemos Serrote (Mocuba, Moçambique) também meus agradecimentos por tua contribuição ao trabalho. Ao Biólogo Rafael Matielo (Mestrando, UNIPAMPA - São Gabriel) meus agradecimentos pelo apoio nos trabalhos com o PCR e RAPD. Sem vocês eu talvez ainda estivesse lendo livros para entender o que tão disposta, humilde e habilidosamente me ensinaram. Sucesso em suas caminhadas acadêmicas e profissionais!

Agradeço ao Biólogo (Doutorando, UFSM) Geraldo Salgado o apoio na confirmação taxonômica dos insetos neste trabalho.

À Bióloga Pâmela Mugica (URCAMP), pelo empréstimo de equipamento de GPS que possibilitou marcar as matrizes. Obrigado pela confiança e parceria.

À Universidade Federal de Pelotas, em especial à Faculdade Eliseu Maciel, pela honra de ter sido mais um de seus alunos.

À Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) por me permitir lá realizar disciplinas como aluno-especial e utilizar seus laboratórios e à Universidade Federal do Pampa (São Gabriel), pelo apoio em equipamentos e laboratórios, sem os quais meu trabalho não seria possível.

Por fim, ao Criador, agradeço da mesma forma que fiz no trabalho anterior, minha Dissertação: “pela oportunidade que tem me dado de ser, todos os dias, menos ignorante do que fui no anterior... mas ainda (e para sempre) um humilde aprendiz...” e adiciono nesta: agradeço ao Criador pelo magnífico laboratório que criou: um planeta cheio de pequenos mistérios a solucionar, o que tem tornado minha vida uma empolgante aventura!

“Aqueles que querem respostas nítidas, definidas e globais para os problemas da vida devem procurá-las em outros domínios que não a natureza. Duvido mesmo que uma busca honesta revele as respostas, seja lá onde for. Hei de celebrar a múltipla variedade da natureza e deixar a quimera das certezas para os políticos e os pregadores.” Stephen Jay Gould em Darwin e os grandes enigmas da vida. 1ª Ed. São Paulo. Martins Fontes, 1987. p. 226)

MELLO, Luciano Moura de. Classificação de frutos, emergência de plântulas e isolamento de DNA genômico de Erythrina crista-galli L. (FABACEAE)

94f. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Sementes. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

RESUMO - Erythrina crista-galli L. (FABACEAE), conhecida no Rio Grande do Sul por corticeira-do-banhado, é uma árvore natural do Brasil, Uruguai, Paraguai, leste da Bolívia e Argentina. É encontrada em várzeas pantanosas ou alagadiças, muito frequente nas formações de florestas de galerias e é cultivada para fins ornamentais e de restauração de ambientes naturais. Esta espécie sofre significativos danos causados por insetos nas suas sementes e se desconhecem metodologias eficientes de isolamento de DNA genômico aplicados à espécie. O trabalho foi desenvolvido na região da campanha gaúcha, envolvendo o município de Bagé, Aceguá, Dom Pedrito e Hulha Negra. Foram realizados ensaios de emergência entre areia com sementes obtidas de diferentes tipos de frutos, a fim de avaliar o potencial de emergência destes tipos, o nível de dano e sua influência na emergência das sementes. O trabalho ainda testou dois protocolos de isolamento de DNA e três fontes de material (folhas frescas congeladas, folhas secas e câmbio vascular congelado) e foi utilizada a técnica do RAPD para avaliar o protocolo testado utilizando-se cinco primers. Resultados dos testes mostraram que sementes provenientes de todos os tipos de frutos podem emergir mesmo com diferenças acentuadas no teor de umidade ou com diferentes níveis de danos causados por insetos. Plantas jovens provenientes de sementes danificadas por insetos, entretanto, apresentam menor vigor e porte durante o período estudado. Obteve-se sucesso no isolamento do DNA proveniente de folhas secas, entretanto os protocolos não se mostraram muito eficientes na remoção de polissacarídeos das amostras de trabalho. Os volumes de polissacarídeos das amostras, presentes em níveis superiores em relação à curva padrão do espectrofotômetro, parecem ter influenciado na amplificação dos fragmentos de DNA com marcadores RAPD, o que requer otimização do protocolo testado a fim de melhorar a qualidade do DNA isolado. Palavras-chave: Espécies Florestais. Corticeira-do-banhado. Isolamento de DNA.

MELLO, Luciano Moura de. Classification of fruits, seedling emergence and isolation of genomic DNA from Erythrina crista-galli L. (Fabaceae) 94f. Thesis - PosGraduate Program in Science and Technology of Seeds. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.

ABSTRACT - Erythrina crista-galli L. (Fabaceae), known in Rio Grande do Sul by corticeira-do-banhado, is a natural tree of Brazil, Uruguay, Paraguay, eastern Bolivia and Argentina. It is found in marshy or swampy lowlands, very frequent in formations of galleries forests and is cultivated for ornamental purposes and restoration of natural environments. This species undergoes significant insect damage in their seeds and unaware efficient methodologies for isolating genomic DNA applied to the species. The work was developed in the region of the state campaign, involving the city of Bagé, Aceguá, Dom Pedrito and Hulha Negra, RS. Emergence tests between sand grains obtained from different types of fruit were performed to assess the potential of these types of emergency, the damage level and its effect on the emergence of seeds. The work also tested two protocols for DNA isolation and three sources of material (frozen fresh leaves, dried leaves and vascular cambium frozen) and the RAPD technique was used to evaluate the protocol tested using five primers. Test results showed that seeds from all kinds of fruits can emerge even with marked differences in moisture content or with different levels of insect damage. Young plants from seeds damaged by insects, however, have less vigor and size during the study period. Success was obtained in isolating DNA from dried leaves, however protocols were not very effective in removing samples of polysaccharides work. The volumes of samples of polysaccharides present in higher levels in relation to the standard curve of the spectrophotometer, seem to have influenced the amplification of DNA fragments with molecular markers, which requires optimization of the protocol tested in order to improve the quality of the isolated DNA. Keywords: Forest species. Corticeira-do-banhado. DNA isolation.

LISTA DE FIGURAS Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.

Figura 5.

Figura 6.

Figura 7.

Figura 8.

Figura 9.

Figura 10.

Figura 11.

Figura 12.

Figura 13.

Aspectos morfológicos do caule (A), da planta durante os meses de inverno (B), das flores e folhas (C) e (D) de Erythrina crista-galli

20

Aspectos morfológicos de racemos (A), flor (B), frutos (C) e duas vagens abertas com sementes (D) de Erythrina crista-galli L..........

23

Detalhe das anteras - setas (A), grãos de pólen (B) e grão de pólen germinado coletado das anteras (C) de Erythrina crista-galli..

24

Esquema da inflorescência (racemo) de Erythrina crista-galli e biologia do florescimento..................................................................

26

Localização da matriz da qual foram utilizadas sementes para o teste de superação de dormência (a). Os fragmentos amostrados para os demais testes, com número de indivíduos em cada fragmento e de matrizes selecionadas para o estudo, mostrando algumas imagens do georreferenciamento de matrizes (b) .............

36

Tipos de frutos de Erythrina crista-galli: (a) Tipo 1; (b) Tipo 2; (c) Tipo 3, e (d) Tipo 4............................................................................

37

Sementes de Erythrina crista-galli submetidas a superação da dormência (corte do tegumento) (a) e disposição das sementes para o teste de emergência (b) ........................................................

38

Detalhe da forma de avaliação da altura de plântulas durante o experimento (do colo (a) à (b) gema apical)......................................

40

Tipos de danos em sementes: (a) dano causado por Pityophthorus sp. (Coleoptera: Curculionidae, Subfamília Scolytinae), a seta indica orifício da broca; (b) destruição de grande parte da semente e (c) dano causado por Terastia sp. (Lepidoptera: Crambidae)........................................................................................

41

Desempenho de crescimento de plantas jovens obtidas de frutos do Tipo 4............................................................................................

44

Imagens de cotilédones hipógeos danificados em sementes T4 emersas.............................................................................................

45

Desempenho de crescimento de plantas jovens obtidas de frutos do Tipo 3 ...........................................................................................

46

Teor de água de sementes em função do tipo de fruto...................................................................................................

47

Figura 14.

Figura 15.

Figura 16.

Figura 17.

Figura 18.

Figura 19.

Figura 20.

Figura 21.

Figura 22.

Figura 23.

Figura 24.

Figura 25.

Coleóptero causador de danos em sementes de Erythrina cristagalli. (a) Pityophthorus sp. (Coleoptera: Curculionidae, Subfamília Scolytinae). (b) Semente danificada e brocas em diferentes fases de desenvolvimento podem ser encontradas. Fotografias: Lívia Dorneles Audino (UFLA, MG), 2011.................................................

50

Insetos causadores de danos em flores e sementes de Erythrina crista-galli (a) Atta sp. (Hymenoptera: Formicidae) danificando estruturas florais. (b1 a b5) Terastia sp. (Lepidoptera: Crambidae) dentro de frutos, danificando sementes. (b5) Terastia sp. (Lepidoptera: Crambidae) atacada por hiperparasitoides (Hymenoptera, Macrocentrus sp. (Braconidae: Macrocentrinae), dentro da semente (setas indicam estágios larvais dos parasitoides)......................................................................................

50

Espécimes 1 e 2 da Fam. Zopheridae e subfamília Colydiinae podem ser encontrados dentro dos frutos mas não foram observados danificando sementes. Fotografias: Lívia Dorneles Audino (UFLA, MG), 2011.................................................................

51

Danos causados por lagartas de Lepidoptera em botões florais de Erythrina crista-galli...........................................................................

52

Danos causados por lagartas de Lepidoptera em frutos e sementes Erythrina crista-galli..........................................................

52

Fragmento 1 (Aceguá): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento.......................................................

57

Fragmento 2 (Serrilhada): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento.......................................................

58

Fragmento 3 (Olhos d’água): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento...................................................

58

Fragmento 4 (Dom Pedrito): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento.......................................................

59

Fragmento 5 (Candiota): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento.......................................................

59

Fragmento 6 (Hulha Negra): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento ......................................................

60

Matriz isolada, mostrando a produção de flores em dezembro de 2013. BR 293. Seta indica a direção do município de Dom Pedrito, a aproximadamente 65km do local....................................

60

Figura 26.

Pesagem, maceração e preparação das amostras foliares nos microtubos de centrífuga ...............................................................

62

Microtubos contendo as amostras foliares com clorofórmio:álcool isoamílico (CIA), após a centrifugação..............................................

62

Figura 28.

Pellet de amostra e microtubos durante a etapa da secagem..........

63

Figura 29.

Fases da coleta de câmbio das matrizes: georreferenciamento da matriz e uso da Sonda Pressler, acondicionamento do bastão de câmbio nos microtubos de centrífuga, desinfecção do orifício com solução comercial de sulfato de cobre e proteção do orifício com pasta de silicone................................................................................

64

Etapas da análise da qualidade e concentração das soluções de DNA genômico isoladas a partir de amostras foliares de Erythrina crista-galli L. em espectrofotômetro UV-Vis NanoDrop® ND-1000. Pipetagem da solução e análise da solução pelo “software”............

68

Curvas de absorvância das soluções de DNA das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 1 (Aceguá), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995)....................................

72

Curvas de absorvância das soluções de DNA das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 2 (Serrilhada), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995)....................................

72

Curvas de absorvância das soluções de DNA das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 3 (Olhos d’ água), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995)............................

73

Curvas de absorvância das soluções de DNA das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 4 (Dom Pedrito), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995)....................................

74

Curvas de absorvância das soluções de DNA das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 5 (Candiota), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995)....................................

75

Curvas de absorvância das soluções de DNA das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 6 (Hulha Negra), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995)....................................

75

Curvas de absorvância das soluções de DNA isoladas da amostra foliar de Erythrina crista-galli (matriz isolada), pelo método modificado de Nienhui et al. (1995)..................................................

76

Figura 27.

Figura 30.

Figura 31.

Figura 32.

Figura 33.

Figura 34.

Figura 35.

Figura 36.

Figura 37.

Figura 38.

Figura 39.

Figura 40.

Figura 41.

Figura 42.

Concentrações de DNA das amostras foliares de Erythrina cristagalli obtidas com o protocolo de extração de Nienhuis et al. (1995), com modificações..............................................................................

76

Quadro comparativo do desempenho entre o protocolo modificado de Nienhuis et al., (1995) e o kit de isolamento. As amostras foliares de Erythrina crista-galli foram analisadas nos comprimentos de onda 230, 260 e 280 nm.......................................

77

Avaliação da quantidade específica de DNA (em ng/µL) extraída por meio dos protocolos testados (em vermelho os resultados com o kit comercial PROMEGA® e em azul os resultados do protocolo modificado de Nienhuis et al., (1995)................................................

78

(a) Curva de absorvância da média de soluções de DNA obtidas de 11 amostras de câmbio de Erythrina crista-galli [(1.5) (1.5) (2.1) (2.1) (3.3) (4.1) (4.2) (5.1) (5.2) (6.1) (6.1)], utilizando o protocolo modificado de Nienhuis et al., (1995); (b) curva de absorvância da média de soluções de DNA obtidas de 08 amostras [(1.5) (1.5) (2.1) (2.1) (4.1) (5.1) (6.1) (6.1)], tendo como fonte de material folhas frescas de Erythrina crista-galli, mantidas congeladas, utilizando o mesmo protocolo............................................................

80

Produto de amplificação de RAPD gerados com oligonucleotídios testados em matrizes de Erythrina crista-galli L. de diferentes fragmentos em Bagé, Dom Pedrito, Hulha Negra e Aceguá, RS. Mostra-se na figura os resultados dos primers que apresentaram amplificação: continuação do primer 14 (3 matrizes), primer 15 (as 13 amostras testadas) e primer 16 (7 amostras). Foto: Rafael Matielo, UNIPAMPA, São Gabriel, RS..............................................

81

LISTA DE TABELAS Tabela 1.

Fenologia de Erythrina crista-galli em Santa Maria, RS, no período de março de 2002 a fevereiro de 2003 (Costa & Moraes, 2008)....... 23

Tabela 2.

Dados relativos ao florescimento e frutificação de Erythrina cristagalli..................................................................................................... 25

Tabela 3.

Resultados dos métodos de superação de dormência utilizando corte do tegumento, ácido sulfúrico e escarificação mecânica em sementes de Erythrina crista-galli L...................................................

43

Tabela 4.

Média de alturas, número de folhas simples e de folhas compostas entre plantas jovens de Erythrina crista-galli de diferentes tipos de sementes .......................................................................................... 46

Tabela 5.

Dados de frutos e sementes coletados de acordo com o tipo de fruto de Erythrina crista-galli.............................................................. 49

Tabela 6.

Resultados dos testes de vigor: emergência, índice de velocidade de emergência (IVE) e tempo médio de emergência (TME) dos tipos de sementes estudados............................................................ 53

Tabela 7.

Matrizes utilizadas no teste de protocolos e fontes de material genético de Erythrina crista-galli .......................................................

65

Comparação das frações 260/280 e 260/230 entre as extrações realizadas com o protocolo modificado de Nienhuis et al., (1995) e Kit Wizard® Genomic DNA, PROMEGA®). Os valores assinalados foram excluídos do cálculo da média das razões por conter valores muito discrepantes.............................................................................

79

Tabela 8.

SUMÁRIO Dedicatória Agradecimentos Resumo Abstrat Lista de Figuras Lista de Tabelas

1. Introdução geral .................................................................................................15 2. Revisão de Literatura 2.1. Erythrina crista-galli L. 2.1.1. Aspectos taxonômicos, botânicos e ecológicos ....................................18 2.1.2. Biologia floral, polinização e frutificação ..............................................22 2.1.3. Aspectos da maturidade fisiológica e germinação de sementes...........24 2.1.4. Armazenamento de sementes de Erythrina crista-galli .........................27 2.1.5. Aspectos da proteção legal da espécie ................................................28 2.1.6. Usos e aplicações de Erythrina crista-galli............................................29 2.2. A fragmentação de ecossistemas: aspectos gerais, seus efeitos na diversidade genética e nos danos causados por insetos à estruturas reprodutivas de plantas ................................................................................................................29 2.3. O uso da biologia molecular na avaliação da diversidade em espécies florestais ..................................................................................................................32 2.4. Variabilidade genética, estrutura de populações e qualidade fisiológica ..........33

3. Capítulo I: Classificação de frutos e emergência de plântulas de Erythrina crista-galli L. Introdução ......................................................................................................35 Material e métodos ........................................................................................36 Resultados e discussão .................................................................................43 Conclusões ....................................................................................................54 4. Capítulo II: Protocolo de isolamento de DNA genômico Erythrina crista-galli L. Introdução ......................................................................................................55 Material e métodos ........................................................................................57 Resultados e discussão .................................................................................71 Conclusões ....................................................................................................82 5. Considerações finais ..........................................................................................83

Referências bibliográficas

15

1. INTRODUÇÃO GERAL

O mundo moderno trouxe consigo diversos problemas ambientais que têm afetado acentuadamente os ecossistemas e sua capacidade de auto-regeneração. Dentre os principais problemas ambientais está a fragmentação de ecossistemas: a divisão do todo (ecossistema original) em partes, o que acarreta, entre outros fatores, que as espécies de fauna e flora sejam cada vez mais representadas por pequenas e isoladas populações (MMA, 2003). Sabe-se que não há uniformidade no mundo físico. Entretanto, os eventos de fragmentação dos ecossistemas naturais tornam ainda mais abrupta a transição entre os ecossistemas. Contudo, eventos de fragmentação devem sempre recair sobre seu conceito fundamental: a divisão de um todo, contínuo ou com zonas de transição indefinidas em partes sem ou com restritas comunicações (MMA, 2003). Harrison (1988) defende que há categorias de alterações em ambientes florestais: (1) redução na área total de florestas; (2) conversão de florestas em cultivos e monoculturas e (3) fragmentação associada a isolamento de manchas pela atividade agrícola, industrial ou urbana. Sobre essas ideias, destaca-se que os ambientes fragmentados não necessariamente precisam estar classificados como ambientes florestais, mas como qualquer categoria de formas de vegetação, como o cerrado ou os campos que não deixam de sofrer tais impactos não possuindo uma formação florestal típica, como as formações tropicais. A redução de hábitats favoráveis às populações de determinada espécie também reduz a sobrevivência e por consequência o número de indivíduos que compõe a população (MMA, 2003), especialmente a reprodutivamente viável para assegurar a manutenção daquela espécie. Populações com reduzido número de indivíduos deverão sofrer alterações expressivas na sua diversidade genética e possivelmente a eliminação de genes que estavam presentes na população original, por deriva genética, além disso, muitos destes genes poderão estar relacionados justamente com características de estrutura de sementes, vigor de plântulas, resistência a doenças, resistência a condições adversas do meio durante a fase de plântula, entre outras.

16 A redução da diversidade local não implica, necessariamente, em extinção regional da espécie, mas no decréssimo de diversidade propriamente dita (MMA, 2003), especialmente se esta redução da diversidade está relacionada com fatores de resistência e resiliência aos impactos sofridos pela população. A semente é o principal meio de multiplicação de inúmeras espécies silvestres e a avaliação da diversidade genética dentro e entre fragmentos com distintos tamanhos populacionais, bem como a associação destas informações com a capacidade reprodutiva e o vigor de plântulas nestes fragmentos, pode nos abastecer de informações de extrema importância para conservação ambiental e a produção de mudas de espécies florestais. Erythrina crista-galli L., (FABACEAE), conhecida como corticeira-do-banhado, é uma espécie arbórea, nativa do Brasil com grande potencial de uso na arborização de parques e jardins por suas características ornamentais, além de reconhecida importância

na

recomposição

de

ambientes

degradados.

Sua

ocorrência

normalmente está relacionada a ambientes abertos com solos higromórficos e florestas ciliares mas pode adaptar-se a ambientes mais secos, explorando as características de planta pioneira. A corticeira-do-banhado desenvolve também importantes interações ecológicas com diferentes grupos animais e vegetais (polinizadores e epífitas), constituindo-se em elemento de destacado valor ecológico nos sistemas naturais onde ocorre. Ainda que a conservação da corticeira-do-banhado esteja legalmente assegurada no Rio Grande do Sul, o avanço de áreas agrícolas, especialmente orizícolas e atualmente a cultura da soja, progridem sobre áreas úmidas com a ocupação banhados e orlas de matas ciliares até os limites mínimos definidos pela legislação, quando não a sua supressão, tornam a redução do número de indivíduos nestes ambientes uma preocupação constante. Os ambientes originais de distribuição da espécie vêm, assim, sofrendo pressões que culminam, sobretudo com a perda de continuidade dos hábitats. Essa perda de continuidade em ambientes lineares (florestas ciliares) e a redução de grandes áreas úmidas em pequenos remanescentes pode representar redução significativa da diversidade, diminuição da qualidade fisiológica relativa à germinação e prejuízos aos esforços de produção de mudas da espécie. O uso de marcadores moleculares tem sido amplamente utilizado na determinação da variabilidade genética de populações naturais, conforme RABBANI

17 et al., 2012: Jenipapo (Genipa americana); KUBIAK et al., 2009: Erva-mate (Ilex paraguariensis); MOURA, 2005: Candeia (Eremanthus erythropappus); SANTANA et

al., 2008: Orelha-de-negro (Enterolobium contortisiliquum); OLIVEIRA, 2007: Araçazeiro (Euterpe oleracea); GONÇALVES et al., 2010: Faveira (Dimorphandra mollis); TELLES et al., 2003: Araticunzeiro (Annona crassiflora), entre outros. Este trabalho objetiva propor uma metodologia de classificação de frutos relacionada à coleta de sementes e abordar aspectos de danos sofridos por sementes que também podem ser aplicados à produção de mudas de Erythrina crista-galli. Objetiva ainda testar dois protocolos de extração de DNA genômico e diferentes fontes de material genéticos com a finalidade de subsidiar a avaliação da diversidade genética com o uso de marcadores moleculares (Random Amplified Polymorphic DNA). Tais dados estão organizados em dois capítulos e poderão auxiliar na coleta de sementes para a produção de mudas bem como o desenvolvimento de trabalhos que permitam a identificação de indivíduos ou estruturas populacionais mínimas de Erythrina crista-galli para ações de manejo de populações naturais, a coleta de sementes visando a produção de mudas e a recuperação de áreas degradadas. No Capítulo I buscou-se relacionar o índice de dano e os resultados dos testes de emergência de plântulas formadas de sementes provenientes de diferentes tipos de frutos, envolvendo assim, de maneira geral, as seguintes etapas: - proposição de um sistema simples de classificação de frutos, em quatro tipos, definidos em função

do estado

de maturação,

buscando

basear-se

em

características claramente distinguíveis em nível de campo; - busca de relações entre estes tipos de frutos com a emergência em areia, percentuais e agentes causadores de danos e posteriormente na produção inicial de mudas, a altura, número de folhas simples e compostas de plântulas em função do tipo do fruto. No Capítulo II foram estudados métodos de extração de DNA genômico, basicamente nas seguintes etapas: - avaliação de três diferentes fontes de material genético e dois diferentes métodos para a extração de DNA de Erythrina crista-galli L. e - verificação dos métodos de isolamento de DNA genômico utilizando cinco primers RAPD utilizados com maior sucesso em outra congênere de Erythrina cristagalli.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Erythrina crista-galli L. 2.1.1. Aspectos taxonômicos, botânicos e ecológicos

Joly (1998) considera que Erythrina crista-galli L. é pertencente à família Leguminosae, subfamília Faboideae. Entretanto, Cronquist (1981) e Longhi (1995) enquadram o gênero Erythrina, bem como os demais gêneros pertencentes à subfamília Faboideae, como componentes da família Fabaceae. Não há consenso da comunidade científica sobre as duas classificações, no entanto, utilizou-se a classificação de Cronquist (1981) pelo maior consenso dos autores em torno desta classificação, sendo a família tratada como Fabaceae, conforme já apresentado anteriormente. O gênero Erythrina ocorre em regiões tropicais e subtropicais do mundo, possuindo, segundo Ferreira & Assumpção (1978), cerca de 104 espécies, das quais 51 são americanas, 32 africanas, 18 asiáticas e 3 australianas. Em trabalho recente de revisão do gênero para a Argentina Lozano & Zapater (2010), defendem a existência de 120 espécies de árvores e arbustos no gênero. A espécie é geralmente encontrada em ambientes ensolarados, estando presentes tanto em clareiras quanto nas bordas das florestas. Sua dispersão é maior nas formações secundárias, como capoeiras, sendo encontradas com menor frequência no interior da mata densa (GANDOLFI & RODRIGUES, 1996). Pertencendo ao grupo ecológico das pioneiras (IBGE, 1986; RODERJAN et al., 2002; LORENZI, 1992), é classificada como higrófita por Corrêa (1984); IBGE (1986); Reitz et al., (1988); Lorenzi (1992) e Paz & Bassagoda (2002). A dormência tegumentar foi verificada nesta espécie por Silva et al. (2006) e Mello (2011), e é muito frequente em leguminosas do grupo ecológico das pioneiras (BACKES & IRGANG, 2002). Apesar de produzir anualmente boa quantidade de sementes, estas sofrem predação por insetos, diminuindo seu potencial de regeneração natural (MACHADO & FERREIRA, 1978; LORENZI, 1992, MELLO et al., 2013). A planta floresce predominantemente durante os meses de setembro a dezembro, sendo a época de

19 floração intimamente ligada ao fator climático temperatura. A maturação dos frutos é verificada de janeiro a março (LORENZI, 1992; BRANDÃO, 2002). O tronco rugoso e corticoso é frequentemente ocupado por plantas epífitas, o que amplia sua importância ecológica. Erythrina é um gênero inteiramente ornitófilo e seus polinizadores são principalmente aves Passeriformes, beija-flores (BRUNEAU, 1996; ETCHEVERRY & TRUCCO ALEMAN, 2005; LOZANO & ZAPATER, 2010) mas ainda existem importantes registros de polinização entomófila (LOZANO & ZAPATER, 2010), especialmente abelhas (GALETTO et al., 2000) atraídas pelas flores vermelhas e com grande quantidade de néctar. Brandão (2002) também cita a corticeira-do-banhado como importante espécie apícola. Apesar de apresentar-se naturalmente em locais com solos úmidos e alagados (componente da vegetação higrófita), adapta-se muito bem a ambientes relativamente secos, podendo ser usada amplamente no paisagismo urbano (GRATIERI-SOSSELLA, 2005). Por suas características ornamentais é utilizada em praças, jardins e na arborização urbana, sendo muito importante para a restauração ambiental (SILVA et al.,2006). Erythrina crista-galli é conhecida no Rio Grande do Sul como corticeira-dobanhado, na Argentina e Uruguai por "seibo común", "gallito", "seibo entrerriano", "árbol de coral", conforme Lozano & Zapater (2010). A planta adulta mede de 6 a 10 metros de altura (LOZANO & ZAPATER, 2010) e possui caule com poucos e fortes acúleos (às vezes ausentes em plantas adultas), proporcionalmente grosso (60 cm de diâmetro ou mais). Caule tortuoso e suberoso (Figura 1) de coloração acastanhada, ramos cilíndricos, longos; as folhas apresentam pecíolos longos com ou sem acúleos, pinadas, compostas por três folíolos peciolados rígidos, verde-escura dependendo da idade da planta, e brilhante na parte superior, glabros, um pouco mais claros e frequentemente glaucos na parte inferior, sendo que na base de cada folíolo lateral existe uma glândula e na base do folíolo terminal duas glândulas (CORRÊA, 1984). A copa é irregular, principalmente no período do inverno, quando é observado o ramo arqueado, dilatado na base e pontiagudo nas extremidades com folhagem decídua (SANTOS & TEIXEIRA, 2001). Os pedúnculos florais podem se apresentar solitários ou fasciculados, não bracteados, com flores de coloração que vai de rósea, em ambientes quentes, a vermelho vivo em locais mais frios (LORENZI, 1992; BRANDÃO, 2002). Na região

20 sul do Brasil as flores são vermelhas, fato que leva Lorenzi (1992) a tratá-la como raça geográfica.

A

B

C

D

Figura 1. Aspectos morfológicos do caule (A), da planta durante meses de inverno (B) e das flores e folhas (C) e (D) de Erythrina crista-galli L. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2011.

Erythrina crista-galli L., espécie arbórea natural do Brasil, Uruguai e Argentina, tem ocorrência em nosso país, em várzeas pantanosas ou alagadiças desde o Maranhão até o Rio Grande do Sul (LORENZI, 1992). Segundo Lozano & Zapater (2010) é naturalmente encontrada ainda no Paraguai e leste da Bolívia. Em Minas Gerais, ocorre sobre terrenos aluviais nas bacias do rio Grande e do rio São Francisco (BRANDÃO, 2002). No Rio Grande do Sul tem larga área de ocorrência, sendo encontrada desde as Florestas pluviais da Encosta Atlântica, em Torres e Osório, até áreas do Sudeste ou escudo Rio-grandense, bacia do rio Ibicuí, bacia do rio Jacuí, Depressão Central, e na região do Planalto, na Floresta de Araucárias e

21 Campanha sul-rio-grandense. Faz parte da vegetação higrófita das planícies litorâneas e lacustres da restinga, especialmente na zona lacustre dos banhados do Taim, no Rio Grande do Sul. No parque do Espinilho, na região do Sudoeste, a corticeira-do-banhado é muito frequente na formação das florestas de galerias (REITZ et al., 1988). Em levantamento de recursos naturais e fitogeográficos do Rio Grande do Sul, realizado pelo IBGE (1986), a presença de Erythrina crista-galli foi listada para todas as regiões fitoecológicas, que são: planalto sul riograndense: em florestas de galeria; nas savanas em formações gramíneo-lenhosas; em estepes ao longo das drenagens que apresentam deposições recentes periodicamente inundáveis, as galerias são descontínuas e abertas, formadas por E. crista-galli (TEIXEIRA et al., 1986); na savana estépica gramíneo-lenhosa (IBGE, 1986; GIRARDI-DEIRO et al, 2002) nos locais de relevo ondulado e solo profundo, as florestas de galeria, em forma de aléias ao longo das drenagens são dominadas por Erythrina crista-galli (TEIXEIRA et al., 1986); Em floresta estacional semidecidual; em floresta aluvial em áreas frequentemente inundáveis e de drenagem lenta; em floresta ombrófila mista (IBGE, 1986) e em formações pioneiras de influência fluvial (IBGE, 1986; RODERJAN et al., 2002). Denominam-se “capões” os fragmentos florestais de tamanhos diversos, distribuídos esparsamente nas áreas campestres (MARCHIORI, 2002), sendo a principal apresentação da corticeira na paisagem além daquelas típicas ocupações em áreas úmidas e orlas de florestas de galeria. A distribuição de plantas em escala global define os principais elementos florísticos, ou seja, conjunto de táxons que apresentam áreas de ocorrência ou centros de riqueza semelhantes e que, supostamente, foram submetidas a eventos paleogeográficos similares. A família Fabaceae, incluindo o gênero Erythrina, são representantes da flora nativa do Rio Grande do Sul, relatado por Waechter (2002) no elemento pantropical, que engloba a flora tropical amplamente distribuída, ao menos em regiões tropicais e subtropicais americanas, africanas e asiáticas. Em regiões fronteiriças entre o Brasil e o Uruguai, Paz & Bassagoda (2002) ao estudarem plantas que compõem os bosques principalmente árvores e arbustos, encontraram 54 famílias, sendo a Fabaceae a que possui maior número de gêneros, com 21 gêneros e 49 espécies. Dentre as espécies hidrófitas, os mesmos autores

22 citam o “ceibo” (E. crista-galli), como a mais freqüente, em contato direto com a água ou em solos saturados. Relatam ainda para a Província Uruguaiense a presença endêmica de E. crista-galli var. leucochlora. Um tipo de comunidade lenhosa uruguaia formada por agrupamentos de árvores ou arbustos, denominada “matorral”, constituindo comunidades, recebem nomes de acordo com a espécie dominante. Na Argentina, a ocorrência de E. cristagalli var. leucochloa é descartada por Lozano & Zapater (2010), citada para Uruguai também por Fortunato (2008). Para agrupamentos de espécies hidrófitas onde predominam as corticeirasdo-banhado, Paz & Bassagoda (2002) referem ao “ceibal” como conjunto de ceibos ou comunidades compostas de E. crista-galli L.

2.1.2 Biologia floral, polinização e frutificação

As flores de E. crista-galli são dispostas em racemos ou cachos terminais possuem cálice campanulado envolvendo o estandarte longo-ovado, enrolado e curvo. Esta espécie possui inflorescência do tipo racemo (Figura 2A), com cinco pétalas de cor vermelha, uma grande oval, duas pétalas alongadas em forma de quilha que se fundem envolvendo os estames e pétalas reduzidas. Flores andrógenas, com nove estames fundidos e um separado. Possui nectário com pronunciada produção de néctar ao fundo do cálice e tem seu ovário como súpero (TREVISANI, 2010). O fruto é uma vagem pedunculada (Figura 2.D) medindo até 15 cm de comprimento, aguda nas extremidades, contendo 6-12 sementes oblongas de cor castanha, hilo lateral branco, similar a feijões comuns (LORENZI, 1992). Em estudo buscando determinar a maturidade fisiológica das sementes, Lazarotto et al. (2011) verificaram que as árvores matrizes apresentavam, em média, 64 flores por inflorescência, formando 11 frutos por inflorescência (17% das flores) nos quais formavam-se, aproximadamente, 14 sementes, sendo que destas, em média dez foram abortadas (71%) e apenas quatro (29%) completavam sua maturação.

23

a

b

c d

Figura 2. Aspectos morfológicos de racemos (A), flor (B), frutos (C) e duas vagens abertas com sementes (D) de E. crista-galli L. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2014. No Brasil, as flores de Erythrina são visitadas por insetos (principalmente abelhas) e aves (beija-flores e Passeriformes), ambos apresentando comportamento de possíveis polinizadores (VITALI-VEIGA & MACHADO, 2000; RAGUSA-NETO, 2002; ALMEIDA & ALVES, 2003; MENDONÇA & ANJOS, 2006). Em estudo realizado em florestas cultivadas e naturais da Argentina e Uruguai, em latitudes próximas ao Rio Grande do Sul, Galetto et al. (2000), registraram as abelhas Apis mellifera e Xylocopa sp. como os principais polinizadores de E. crista-galli, além de quatro espécies de beija-flores. A fenologia da corticeira-do-banhado na região de Santa Maria, RS, apresentada por Costa & Moraes (2008) pode ser observada na Tabela 1.

Tabela 1. Fenologia de Erythrina crista-galli em Santa Maria, RS, no período de março de 2002 a fevereiro de 2003 (adaptado de Costa & Moraes, 2008). Fenofases Floração Frutificação Queda foliar Brotação

Jan

Fev

Mar

Abr

Mai

Jun

Jul

Ago

Set

Out

Nov

Dez

Verifica-se que no mês de março (Tabela 1), segundo os autores, há a ocorrência de um período curto de floração, no entanto, os autores não observaram a formação de frutos dela decorrentes. Observações de campo dão conta da formação de frutos neste período, contudo, em muito menor número por planta. Os grãos de pólen de Erythrina crista-galli podem ser vistos na Figura 3. Durante a obtenção das imagens observou-se que as anteras liberaram grãos de pólen pré-germinados.

24

1µm

a

b

1µm

c

Figura 3. Detalhe das anteras - setas (A), grãos de pólen (B) e grão de pólen germinado coletados das anteras (C) de Erythrina crista-galli L. Barras equivalem a 1µm. Fotos: Luciano Moura de Mello, Santa Maria, 2014.

2.1.3. Aspectos da maturidade fisiológica e germinação de sementes de E. crista-galli L.

Nas Regras para Análise de Sementes (Brasil, 2009) não são encontradas informações sobre as condições para avaliação da germinação de sementes do gênero Erythrina, dificultando a condução dos testes e a propagação do gênero através desse método, que também é dificultado por problemas fitossanitários relacionados às sementes (GRATIERI-SOSSELLA, 2005). O Manual de procedimentos de análise de sementes florestais (LIMA JUNIOR, 2011), da ABRATES, traz informações sobre diversas espécies. No caso, por exemplo, das temperaturas recomendadas para o teste de germinação, chega a citar 97 espécies, mas não há referência sobre Erythrina crista-galli. Em 2013, o MAPA lançou as Instruções para a Análise de Sementes de Espécies Florestais. Neste documento já constam informações sobre a tomada de amostras de Erythrina crista-galli bem como outras quatro espécies deste gênero, assim como fornece informações sobre o número de sementes e repetições, temperaturas, substratos, contagens e informações sobre a superação se dormência para a realização dos testes de germinação com a espécie, constituindo o documento oficial mais consistente em informações sobre Erythrina (MAPA, 2013). A cerca do ponto de maturidade fisiológica, ajustando os períodos de coleta à máxima qualidade das sementes, alguns esforços tem sido feitos mas sem um indicador eficiente baseado na antese das flores (Tabela 2).

25 Tabela 2. Dados relativos ao florescimento e frutificação de Erythrina crista-galli L. (diversos autores). Aspecto Informação Referência Florescimento

Outubro a dezembro Setembro a dezembro

Costa e Moraes (2008) Lorenzi (1992); Brandão (2002)

Período de frutificação

Novembro a janeiro

Costa e Moraes (2008)

Percentual de frutificação

6% 1,78%

Carpanezzi et al. (2001) Mello (2011)

Número de flores/racemo

65,4 ±5,52 64 40 54

Costa e Moraes (2008) Lazarotto el al. (2011) Gratieri-Sossella (2005) Mello (2011)

Tempo de antese

5 dias

Costa e Moraes (2008)

Período da antese

Entre 7 e 11h da manhã

Costa e Moraes (2008)

Sentido da antese

Da região proximal para a distal dos racemos

Mello (2011)

Carpanezzi et al. (2001), defende que em populações naturais bem conservadas, somente 6% das flores da corticeira-do-banhado desenvolvem sementes, além do que a antese progride (Figura 4) da região proximal do ramo para a região distal (terminal). Mello (2011) não conseguiu determinar o ponto de maturação fisiológica desta espécie ao empregar como referência a antese floral. Dentre 337 botões florais marcados foram observados altos valores de abortos florais e predação por insetos, de modo que somente seis botões florais completaram o desenvolvimento com a frutificação

(1,78%),

os

quais

produziram

39

sementes

(média

de

6,5

sementes/fruto), sendo 08 sementes intactas, 03 chochas e 28 danificadas. Segundo Lazarotto et al. (2011), a baixa produção de frutos por inflorescência decorre da autogamia, frequente em muitos locais de coleta brasileiros nos quais se pode observar eventos de fragmentação das florestas originais. Assim, Lazarotto et al. (2011) defende que a autogamia pode justificar a baixa produção de frutos e sementes em plantas isoladas ou em pequenos fragmentos. As sementes de E. crista-galli L., desenvolvem a dormência após a maturação fisiológica, com germinação muito baixa na décima semana após a antese e o ponto de maturidade fisiológica (LAZAROTTO et al., 2011), nas condições de Santa Maria (RS), ocorre aproximadamente na oitava semana após a antese, sendo este o momento ideal de coleta das sementes, pois o comprimento dos frutos, largura,

26 comprimento, espessura, massa fresca e seca das sementes atingem seus valores máximos.

5 dias Região distal

3 dias

2 dias

Sentido da antese

3 dias

Número médio de flores/racemo: 56 Total de dias com flores em antese no racemo: 10-15 dias com média de 5 dias/flor Número médio de frutos formados por racemo: 7 (ilustrados em vermelho)

1 dia

1 dia Região proximal

Figura 4. Esquema da inflorescência (racemo) de E. crista-galli e biologia do florescimento (CARPANEZZI et al., 2001; MELLO, 2011; COSTA e MORAES, 2008; LAZAROTTO el al., 2011 e GRATIERI-SOSSELLA, 2005).

As sementes de E. crista-galli possuem dormência tegumentar acentuada, com o grupo testemunha apresentando germinação entre 2% e 13% (SILVA et al., 2006). Os métodos de superação de dormência tegumentar testados demonstraram alta germinação das sementes quando submetidas à escarificação química com ácido sulfúrico comercial padrão (ACS, d=1,84 g/cm³, por 30 minutos) alcançando valores até 95% e menor desempenho, com escarificação térmica (máximo de 43%). O método mais eficiente para a superação da dormência é a escarificação mecânica com lixa de madeira, na extremidade oposta à micrópila, sendo posteriormente submetidas ao processo de assepsia (MELLO, 2011). Tal método, entretanto, não apresentou diferença em relação ao uso de ácido sulfúrico, conforme defenderam Silva et al. (2006).

27 Por outro lado, Mello (2011) descreve ainda que para os testes de germinação o substrato mais adequado foi entre papel, sob o fotoperíodo de 8 horas e a temperatura fixa de 30ºC, sendo a esta mesma temperatura apresentado o maior índice de velocidade de germinação de sementes de Erythrina crista-galli L. No entanto, outras metodologias de superação de dormência foram testadas com sucesso, como por exemplo, o uso de cortes no tegumento como foi feito por Escobar et al. (2010). A metodologia proposta por estes autores foi a selecionada para este trabalho, tendo sido realizado teste específico para comprovar a aplicabilidade de tal procedimento com a espécie escolhida.

2.1.4. Armazenamento de sementes de Erythrina crista-galli

Poucos os trabalhos relatam aspectos do armazenamento de sementes de E. crista-galli. Silva et al. (2003) a fim de estudar o armazenamento de sementes desta espécie formou dois lotes de sementes: o primeiro lote obtido de duas árvores em março de 2002 (2800 sementes/kg e teor de água de 12,1%); e o segundo lote, coletado de quatro árvores em abril de 2000 (3300 sementes/kg e teor de água de 8,6%). O primeiro lote ficou armazenado durante 120 dias em sacos de papel em sala de laboratório em temperatura ambiente, e o segundo lote ficou armazenado por 27 meses em câmara fria, acondicionado em saco de papel. Estes procedimentos

de

armazenamentos

mostraram-se

eficazes,

possibilitando

germinação em torno de 95% com prévios tratamentos de escarificação ácida. Assim os autores presumem que a espécie seja classificada como ortodoxa e necessite de recursos pouco dispendiosos para seu armazenamento durante um período de tempo de até mais de 2 anos (SILVA et al., 2003). Complementarmente, esses autores afirmam que as sementes comportam-se como “não-recalcitrantes”, embora não seja possível afirmar que não possa ser classificada como intermediário. Tal informação corrobora com o trabalho de Neill (1993), afirmando que as sementes da maioria das espécies de Erythrina podem ser armazenadas com sucesso por muitos anos, em câmara com cerca de 5°C e 30 a 40% de umidade relativa.

28 2.1.5. Aspectos da proteção legal de Erythrina crista-galli L. A espécie é “imune ao corte” no estado do Rio Grande do Sul, segundo a Lei Estadual 9.519/92, que protege as corticeiras em todos os casos, exigindo imediata reposição da planta em caso de sua eliminação. O Artigo 33 da referida Lei Estadual, estabelece que fica proibido, em todo o território do estado, o corte de espécies nativas de figueiras do gênero Ficus e de corticeiras do gênero Erythrina. Estabelece ainda (Artigo 34) que o corte das espécies somente poderá ser autorizado pelo órgão florestal estadual, em caráter excepcional, se a medida for imprescindível à execução de obras de relevante utilidade pública ou interesse social do estado e as espécies não forem passíveis de transplante sem risco a sua sobrevivência (Art. 34 com redação dada pela Lei n.º 11.026, de 05 de novembro de 1997). Ainda assim, na hipótese prevista no "caput" do artigo 34, o responsável pela obra ficará obrigado a replantar 15 (quinze) exemplares para cada espécie cortada, de preferência em local próximo àquele em que ocorreu o corte ou a critério do órgão florestal do estado (parágrafo único acrescentado pela Lei n.º 11.026, de 05 de novembro de 1997). A Lei estabelece ainda que a infração ao disposto no artigo 33 importará na apreensão e perda do produto; já a infração ao disposto no artigo 34 importará na perda e apreensão do produto, bem como em multa ao infrator, correspondente ao valor de 100 (cem) a 300 (trezentas) UPFs-RS1, sem que a aplicação destas multas, prejudiquem as sanções penais e administrativas dispostas em Lei Federal, ficando, o infrator obrigado a promover a recomposição do ambiente, através da execução de projeto, previamente aprovado pelo órgão florestal competente. Apesar

da

importância

da

espécie,

particularmente

afirmada

pela

regulamentação legal de sua proteção no estado do Rio Grande do Sul, estudos sobre a tecnologia de suas sementes e produção de mudas parecem ser necessários bem como não são raros, os casos de supressão de exemplares desta espécie a fim de ampliar as áreas agriculturáveis nas baixadas úmidas e margens de zonas de drenagens.

1

Unidade Padrão Fiscal: valor no ano de 2013 (RS): R$ 14,545 (Fonte: Secretaria da Fazenda do estado do Rio Grande do Sul. ) Acesso em 11 de março de 201.

29 2.1.6 Usos e aplicações de Erythrina crista-galli L.

A

crescente

procura

de

sementes

de

espécies

arbóreas

nativas,

principalmente na Região Centro-Sul do Brasil, deve-se ao seu uso cada vez mais intenso em programas de recuperação ambiental e de conservação de recursos hídricos (FIGLIOLIA & PIÑA-RODRIGUES, 1995). As Eritrinas encontradas no Brasil são ornamentais e adequadas para o paisagismo e recuperação ambiental (MAIXNER & FERREIRA, 1977/78; BACKES & IRGANG, 2002; BRANDÃO et al., 2002). Os usos tradicionais das diversas partes da árvore incluem artefatos rurais e musicais, medicamentos e material para tingimento (DEMAIO et al., 2002; ECHEVERRI, 2005) bem como boias artesanais para pesca. Atualmente seu cultivo tem maior interesse na restauração ambiental e para fins ornamentais (LONGHI, 1995; LORENZI, 1998; DEMAIO et al., 2002) podendo ser usado na recuperação de áreas degradadas (sendo uma planta pioneira), com uso restrito no adensamento florestal em função da sua baixa adaptação a ambientes muito sombreados nas fases jovens e na arborização pública, em parques e jardins.

2.2. A fragmentação de ecossistemas: aspectos gerais, seus efeitos na diversidade genética e nos danos causados por insetos à estruturas reprodutivas de plantas

A fragmentação dos habitats motivadas por ações antrópicas, conforme se verifica na grande maioria dos ecossistemas terrestres, propicia além da extinção das espécies, o declínio das populações até níveis em que não consigam mais recuperar a sua capacidade de resiliência, uma vez que as tornam muito vulneráveis à depressão endogâmica e à mudança genética (RICKLEFS, 2003). A conservação de uma espécie sob ponto de vista da qualidade genética requer o conhecimento da distribuição da variabilidade entre e dentro de suas populações naturais (LACERDA & KAGEYAMA, 2003), bem como são fundamentais para a determinação de áreas de coleta de sementes para os programas de conservação. Diante disso, são imprescindíveis estudos genéticos em nível populacional das espécies que compõem tais ecossistemas, de modo que sejam estabelecidas

30 estratégias de conservação genética, sobretudo em áreas perturbadas, procurando reunir subsídios que contribuam para a conservação in situ. Erythrina crista-galli apresenta-se distribuída pela paisagem da campanha, principalmente em solos úmidos mas pode ser encontrada em ambientes mais secos. As áreas úmidas nesta região são intensamente utilizadas para a cultura do arroz e mais recentemente da soja. O uso destas áreas, com forte pressão sobre as áreas florestadas, tem sido praticado à custa da redução das matas ciliares, supressão de indivíduos em formações isoladas e fragmentação de ambientes, o que pode estar causando problemas a estas populações com acentuada endogamia e diminuição da qualidade genética. A redução da qualidade genética está relacionada ao modo de troca do material genético numa população, entre outros fatores. No caso da espécie estudada, tipicamente de fecundação autocompatível, a participação de insetos (abelhas e outros) e aves (beija-flores) são importante como polinizadores. Em estudo realizado em florestas cultivadas e naturais da Argentina e Uruguai, em latitudes próximas ao Rio Grande do Sul, Galetto et al. (2000), registraram as abelhas Apis mellifera e Xylocopa sp. como os principais polinizadores de E. cristagalli, além de quatro espécies de beija-flores. A fragmentação de hábitats pode ter como consequência indireta a diminuição da qualidade fisiológica de espécies florestais, uma vez que as razões diretas podem estar associadas ao fato de que pequenos fragmentos simplesmente não suportarem populações significativas de polinizadores. Em populações de Cardiopetalum calophyllum Schletdl. fragmentos de diferentes tamanhos influenciam o sucesso reprodutivo da espécie visto que fragmentos menores apresentam menor sucesso reprodutivo e menor abundância de polinizadores, avaliando o sucesso reprodutivo pela taxa de produção de frutos e sementes (ELIAS, 2010). A fertilidade de C. calophyllum é muito reduzida em fragmentos com áreas menores do que 10ha, resultados associados com a menor quantidade de visitantes florais nos pequenos fragmentos. Não só a capacidade de produção de frutos e sementes pode estar relacionada à fragmentação de ecossistemas como aspecto relevante mas também à quantidade de frutos e sementes danificadas por insetos. Estudo desenvolvido por Mello et al. (2013) cita a ação de insetos como causadores de danos em frutos e sementes de E. crista-galli no Brasil. Simberloff (1993) demostrou que ação de

31 predadores de sementes e frutos está relacionada com o tamanho do fragmento, sendo neste caso maior a quantidade de sementes danificadas nos fragmentos de menores dimensões. Além disso, a predação de sementes pode reduzir a produção de novas plantas no ecossistemas e afetar o crescimento populacional (LOUDA, 1982; JULES, 1998), além do que, a ação dos insetos pode causar o aborto de frutos antes que as sementes não predadas estejam maduras (GREIG, 1993). Ao estudar a predação de sementes em Erythrina falcata Benth. (Fabaceae) Pereira (2012) abordou a biologia dos insetos predadores e estratégias de compensação da planta e identificou cinco espécies de insetos predando as sementes de E. falcata, sendo que três pertencem à ordem Lepidoptera, família Crambidae, (Agathodes designalis, Liopasia ochracealis e Terastia meticulosalis) e dois Coleoptera, (Cathartus quadricollis - Silvanidae e Paratenetus sp. Tenebrionidae) e uma espécie de himenóptero (Macrocentrus sp. - Braconidae) que é parasitoide das larvas de lepidópteros. Pereira (2012) também verificou que as larvas de lepidópteros se alimentam apenas de sementes verdes e os coleópteros somente de sementes maduras, mas que já estavam com o endosperma acessível. Esta ocorrência os torna predadores secundários, dependentes da ação primária das larvas de lepidópteros. O mesmo autor demostrou que a predação de sementes variou de um mínimo 50% ao máximo de 83% das sementes entre as plantas amostradas. De forma semelhante, muitos autores citam a relação de espécies de insetos com danos sofridos por plantas, especialmente em sementes de espécies florestais: Bartimachi et al. (2008): predação pós dispersão em sementes do angico Anadenanthera falcata (Leguminosae-Mimosoideae); Baskin & Baskin (1977): predação de sementes de Cassia marilandica por Coleoptera (Bruchidae); Figueiredo et al. (2008): predação e parasitismo em sementes de Parkia platycephala; Grenha et al. (2008): predação de sementes de Allagoptera arenaria (Arecaceae) por Coleoptera; Nascimento (2009): predação pré-dispersão de sementes de Albizzia lebbeck; Pereira & Moura (2009): Bruchineos e Lepidópteros associados

a

predação

de

sementes

de

Cassia

leptophylla

(Fabaceae,

Caesalpinioideae); Sari et al. (2002): insetos associados com sementes de Lonchocarpus muehlbergianus (Fabaceae), entre outros. Todos os autores indicam a participação significativa da ação de insetos sobre a redução da viabilidade de sementes das espécies estudadas o que tornam ainda mais significativa a afirmação

32 de Elias (2010) de que tais eventos possam estar relacionados não só com a quantidade de sementes produzidas em pequenos fragmentos como também à qualidade destas sementes.

2.3. O uso da biologia molecular na avaliação da diversidade genética em espécies florestais

O entendimento da hereditariedade, do código genético e da molécula de DNA tem facilitado a resposta a questões pelo homem, que utilizava os marcadores morfológicos com significativa limitação. Estes marcadores morfológicos ou fenotípicos mostram-se, na maioria das vezes, a dificuldade de relacionar características visíveis com caracteres de importância econômica (GUIMARÃES & MOREIRA, 1999). Com o passar do tempo, técnicas genéticas que envolviam a manipulação do DNA foram aprimoradas no sentido de desvendar os mecanismos presentes nos complexos sistemas dos seres vivos (MARTINELLI, 2001). Uma dessas técnicas se refere aos marcadores moleculares, definidos por Ferreira & Grattapaglia (1998) como “todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso, como no caso de isoenzimas, ou de um segmento específico de DNA (correspondendo a regiões expressas ou não do genoma)”. A sequência de nucleotídeos e a função de um marcador molecular podem ou não ser conhecidas. Ao se verificar o seu comportamento de acordo com as leis básicas de herança de Mendel, um marcador molecular pode ser adicionalmente definido como marcador genético (MELO, 2010). Estudos genéticos em populações naturais de espécies arbóreas tropicais baseados em marcadores genéticos, segundo Melo (2010), iniciaram-se na Malásia (GAN et al., 1981), porém tiveram grande avanço nas florestas neotropicais do Panamá (HAMRICK & LOVELESS, 1986), da Costa Rica (BAWA & O’ MALLEY, 1987) e do Brasil (HERRIT, 1991; MORAES, 1993; PAIVA et al., 1994). Estes marcadores apresentam diversas aplicações na conservação genética dos recursos florestais, por meio da mensuração da diversidade genética, estimativa da taxa de fluxo gênico ou migração, caracterização do sistema de reprodução, análise de paternidade, avaliação da eficiência do pomar de sementes, estudos

33 filogenéticos e taxonômicos, podendo ser mensuradas diferenças genéticas em populações naturais e manejadas (GLAUBTIZ & MORAN, 2000). Outra importante aplicação do uso de marcadores é a determinação de áreas mínimas para a coleta de material para a multiplicação de plantas e mesmo a conservação in situ de populações (MMA, 2003). Os marcadores de DNA apresentam vantagens na determinação da variabilidade de populações uma vez que podem ser obtidos em grande número e não sofrem influência de fatores ambientais (MELO, 2010). Os marcadores moleculares baseados em PCR (Polymerase Chain Reaction), desde a sua origem, verdadeiramente promoveu uma revolução na ciência, tanto na biologia quanto nas áreas aplicadas, envolvendo diagnósticos e melhoramento genético de plantas e animais domésticos (FERREIRA & GRATTAPLAGLIA, 1998). E essa revolução se deve à facilidade, rapidez, versatilidade e sensibilidade da PCR, que

a

torna

particularmente

poderosa

para

estudos

genético-moleculares

envolvendo grande número de indivíduos de qualquer organismo vivo (GALETTI JR et al., 2008). As informações obtidas por meio dos marcadores moleculares baseados em DNA podem ser utilizados para compreender a dinâmica dos alelos nas populações de uma determinada espécie, fornecendo subsídios para o melhor entendimento dos processos micro-evolutivos, que estão atuando na diferenciação destas populações (REIS, 1996; AVISE, 2000). Estas informações, aliadas aos conhecimentos da história de vida e de características ecológicas da espécie, permitem conhecer parte da sua biologia, bem como da sua interação com outras espécies do bioma – e mesmo com o meio ambiente, no qual ela está inserida (TELLES et al., 2003). Segundo Galetti Jr et al. (2008), os parâmetros mais utilizados para estimar a diversidade genética em populações naturais e as alterações decorrentes da ação antrópica, são: número médio de alelos por loco, heterozigosidade esperada ou diversidade gênica; heterozigosidade observada e índice de fixação (BERG & HAMRICK, 1997).

2.4. Variabilidade genética, estrutura de populações e qualidade fisiológica

Marcadores moleculares permitiriam, de forma inicial, o estudo da diversidade genética entre fragmentos de E. crista-galli relativamente isolados e de diferentes

34 tamanhos. Em áreas naturais as populações se distribuem de forma a explorar ao máximo as áreas nas quais os conjuntos de fatores mais beneficiem as espécies. Nestas “manchas” ou “áreas preferenciais”, o potencial biótico de cada indivíduos é maximizado e deve ser nas manchas com maior número de indivíduos que a variabilidade máxima é expressa na grande população, muitas vezes dispersa por outras manchas (MMA, 2006) em um dado intervalo de tempo. Assim, pode-se dizer, que variabilidade genética dos indivíduos em uma população estrutura-se tanto no espaço (nos quais a distribuição é parte integrante) quanto no tempo. A distribuição espacial dos genótipos em populações é parte integrante dos processos genéticos populacionais (EPPERSON & ALLARD, 1989) e assim deve ser considerado (e por isso conhecido) em ações de conservação. A preservação da diversidade genética se tornou objetivo da maioria dos programas de conservação e conhecer a distribuição desta diversidade dentro e entre populações naturais, segundo Cavallari (2004), é o primeiro passo. O conhecimento do modo como a variação genética de uma espécie está distribuída em suas populações é essencial para a sua manutenção (REIS, 1999), como também, de acordo com Lacerda et al. (2001), para o estabelecimento de formas de exploração econômica. Melo (2010), reforça a ideia de que a manutenção da diversidade genética é um dos principais focos da biologia da conservação, já que é ela que fornece o potencial adaptativo/evolutivo de uma espécie. Por esse motivo, o conhecimento da composição alélica de uma espécie, e de como ela está organizada (estruturada) em suas populações, é fundamental para as ações de manejo e conservação.

3. CAPÍTULO I

Classificação de frutos e emergência de plântulas de Erythrina crista-galli L.

INTRODUÇÃO

Esforços têm sido realizados visando a encontrar características distinguíveis em nível de campo que possam auxiliar o coletor de sementes na determinação dos mais adequados parâmetros para indicar a maturidade fisiológica das sementes (LAZAROTTO et al., 2011). O resultado deste trabalho demostraram que a antese não constitui um parâmetro eficiente, visto o comportamento do florescimento nos racemos. Nos racemos, as flores entram em antese total durante até 10 dias consecutivos, iniciando-se pela região proximal para a distal das inflorescências. Além disso, o alto número de flores abortadas, frutos e sementes predadas por uma grande diversidade de insetos, inviabiliza o esforço de marcar botões florais na busca de um indicador de maturidade das sementes com a finalidade de definir período de coleta (MELLO, 2011). A natureza do processo reprodutivo da espécie não parece, portanto, favorecer o método de avaliação da maturidade fisiológica com base na antese, especialmente para coletores de sementes com o objetivo de produção de mudas. Entretanto, a prática de utilizar frutos deiscentes ou em fase de início de deiscência, mostra-se problemática em função da maior influência de danificação causada por coleópteros, que inviabilizam (na maioria das vezes) ou ainda reduzem significativamente a viabilidade e mesmo a produção de sementes. Neste contexto, esta etapa do trabalho teve por objetivo propor uma classificação de frutos, facilmente identificáveis em nível de campo e caracterizar estes tipos com relação ao índice de dano, causadores de dano, teor de água, vigor de sementes em condições naturais in vivo e indicadores de qualidade na produção inicial de mudas.

MATERIAL E MÉTODOS

Localização de fragmentos e matrizes de Erythrina crista-galli L. Foram utilizadas 33 matrizes de Erythrina crista-galli L. localizadas em seis fragmentos distintos e uma amostra de planta isolada, sendo todas estas unidades amostrais relativamente isolados de outros indivíduos (mínimo de isolamento de 300m) e com números variáveis de indivíduos por fragmento amostrado (Figura 5).

Argentina Rio Grande do Sul, Brasil

a Área de matriz para teste de superação de dormência Uruguai

Área de matrizes

b

Figura 5. (a) Localização da matriz da qual foram utilizadas sementes para o teste de superação de dormência. (b) Os fragmentos amostrados para os demais testes, com número de indivíduos em cada fragmento e de matrizes selecionadas para o estudo, mostrando algumas imagens do georreferenciamento de matrizes. A área urbanizada no centro-norte da imagem representa o município de Bagé, RS (imagens do GPS TrackMaker®).

37 Todas as matrizes citadas foram georreferenciadas utilizando aparelho GPS Garmim® ETrex 10.

Classificação de frutos e sementes Os frutos de Erythrina crista-galli L. foram coletados de matrizes do Fragmento 1 e classificados previamente em quatro tipos (Figura 6) em função do estado de fenológico, ficando assim determinados: TIPO 1. Frutos imaturos (totalmente verdes); TIPO 2. Frutos de maturação intermediária (coloração marrom-esverdeado); TIPO 3. Frutos maduros semi-lenhosos e não-deiscentes e TIPO 4. Frutos maduros, lenhosos e deiscentes.

a

b

c

d

Figura 6. Tipos de frutos de Erythrina crista-galli: (a) Tipo 1; (b) Tipo 2; (c) Tipo 3, e (d) Tipo 4. Fotos: Luciano Moura de Mello, Santa Maria, 2014. As sementes foram classificadas em “sementes T1” (ou tipo 1) aquelas provenientes de frutos do tipo 1, e da mesma forma para sementes provenientes de frutos dos tipos 2 (T2), 3 (T3) e 4 (T4), que passam a ser denominadas sementes “T2”, “T3” e “T4”, respectivamente. Coleta, beneficiamento e semeadura para os testes de emergência Para a realização dos testes de emergência foram utilizadas aquelas sementes provenientes de diferentes tipos de frutos a fim de verificar seu potencial fisiológico, sendo o experimento conduzido entre areia peneirada para fornecer dados de vigor das sementes.

38 Os frutos foram coletados de diferentes matrizes e separados por grupos (Figura 6). Todas as sementes utilizadas foram coletadas nos dias 22 e 23 de janeiro de 2014, sendo classificadas e acondicionadas em sacos de papel e mantidas em temperatura ambiente até o dia da semeadura (27 de janeiro). O teste foi conduzido com avaliação realizada diariamente, por 21 dias. O delineamento experimental utilizado no teste de emergência foi o inteiramente casualizado com quatro repetições de 20 sementes e avaliações diárias segundo os tratamentos descritos abaixo: T1.IE

(sementes intactas escarificadas)

T1.I

(sementes intactas)

T2.I

(sementes intactas)

T3.D

(sementes danificadas por insetos, Figura 9.a)

T3.I

(sementes intactas escarificada)

T4.I

(sementes intactas)

T4.IE

(sementes intactas escarificadas)

T1.D

(sementes danificadas por insetos, Figura 9.a)

As semeaduras foram realizadas em bandejas plásticas com 6 cm de altura total. Nas bandejas foi colocado 4 cm de areia peneirada e sobre as sementes foram adicionados mais 1,5cm de areia peneirada.

cm

a

b

Figura 7. Sementes de Erythrina crista-galli submetidas a superação da dormência (corte do tegumento) (a) e disposição das sementes para o teste de emergência (b). Fotos: Luciano Moura de Mello, Santa Maria, 2014.

39 Para o tratamento para a superação de dormência tegumentar foi realizado teste preliminar, buscando-se verificar a eficiência do procedimento corte do tegumento citado para Erythrina crista-galli. Utilizou-se o corte do tegumento (Figura 7) com estilete esterilizado em álcool 70%, sem prévia assepsia das sementes. Todos os ensaios permaneceram à sombra e à temperatura ambiente. Utilizaram-se sementes T2, com 5 repetições de 32 sementes (delineamento inteiramente casualizado - DIC). Para este teste as sementes foram coletadas de uma matriz adulta localizada na cidade de Rosário do Sul (Lat -30,24239, Long 5492427).

Determinação do teor de água das sementes em função do tipo de fruto O teor de água nas sementes foi determinado utilizando-se o método da estufa a 105±3°C, durante 24h, de acordo com as RAS (BRASIL, 2009). Foram usadas para as avaliações duas amostras de sementes de frutos do tipo T1, T2, T3 e T4 intactas e danificadas, das quais obteve-se a média para indicar o teor de água em cada grupo. Foram utilizadas para a determinação os seguintes pesos totais de amostras2 em cada grupo: Intactas

Danificadas

T1: 27,3g

T1: 13,2g

T2: 36,4g

T2: 16,5g

T3: 45,4g

T3: 15,3g

T4: 32,5g

T4: 14,7g

Altura, número de folhas simples e compostas de plantas jovens em função do tipo do fruto e do dano em sementes Foi avaliado o crescimento de plantas jovens (altura) além do número de folhas simples e compostas originárias de sementes coletadas de frutos Tipo 3 e 4, escarificadas e danificadas. A altura de plantas jovens foi avaliada diariamente durante 21 dias. As alturas foram avaliadas a partir do 7º dia e expressos em mm/dia. Cada tratamento envolveu as três primeiras plântulas emergidas nos testes de emergência e as médias do desempenho destas três plântulas compuseram o dado de avaliação final. Os demais parâmetros foram avaliados no final do período 2

Tendo-se como base os valores de peso de 1000 sementes de Mello (2011).

40 de 30 dias. Para a altura de plântulas mediu-se a dimensão em centímetros, do colo à gema apical (Figura 8). O índice foliar, correspondente ao parâmetro de quantificação do total de folhas das plantas jovens, foi determinado considerando-se: (1) o arredondamento para uma casa decinal após a vírgula no número médio de folhas simples e compostas em cada tratamento e (2) a multiplicação pelo número inteiro “3” para cada folha composta (trifoliada) do grupo avaliado (Fonte: o autor). IF= NFS + (NFC x 3) / ∑F, sendo IF: índice foliar; NFS: número de folhas simples NFC: número de folhas compostas ∑F: Somatório do número de folhas (simples e compostas)

a

b

Figura 8. Detalhe da forma de avaliação da altura de plântulas de Erythrina cristagalli durante o experimento (medição do colo (a) à (b) gema apical). Fotos: Luciano Moura de Mello, Santa Maria, 2014. Índice de dano por insetos Foi avaliado o índice de dano das sementes, considerando-se como danificada toda a semente (não chocha) com pelo menos um orifício causado por inseto (Figura 4). O índice de dano foi determinado pela divisão do número de sementes danificadas pelo total de número total de sementes coletadas, expresso em porcentagem. Somente foram utilizadas para os testes de emergência as sementes com danos semelhantes aos mostrados na Figura 9 (a).

41

a

b

c

Figura 9. Exemplos de danos em sementes de Erythrina crista-galli: (a) dano causado por Pityophthorus sp. (Coleoptera: Curculionidae, Subfamília Scolytinae), as setas indicam orifícios do inseto. (b) destruição de grande parte da semente por Lepdoptera e (c) dano causado por Terastia sp. (Lepidoptera: Crambidae). Fotos: Luciano Moura de Mello, Santa Maria, 2014.

Tempo Médio de Emergência (TME) Foi determinado pelo critério estabelecido por Edmond & Drapala (1958). Utilizou-se o material do teste de emergência, contabilizando diariamente o número de plântulas emersas após a instalação do teste. Esse índice representa a média ponderada do tempo necessário para a emergência, tendo como fator de ponderação a emergência diária, calculado pela equação: Tm = E1T1+ E2T2 + ... EnTn E1+ E2 + ...+ En sendo que: Tm - é o tempo médio, em dias, necessário para atingir a emergência máxima; E1, E2 e En é o número de sementes emersas e nos tempos T1, T2 e Tn, respectivamente.

Índice de Velocidade de Emergência (IVE) Foram realizadas contagens diárias durante o teste de emergência, sendo contadas as plântulas normais emersas. O cálculo do IVE foi realizado conforme a fórmula de Maguire (1962), sugerida por Nakagawa (1999), utilizando-se a seguite fórmula: IVE = E1/ N1 + E2/ N2 +...+ En/ Nn, sendo que:

42 E1, E2, ..., En = nº plântulas emersas, computadas na primeira, segunda, ... e última contagem. N1, N2, ..., Nn = nº de dias de semeadura à primeira, segunda, ... e última contagem. Quanto maior o valor de IVE, maior a emergência média diária, indicando o potencial qualitativo do tratamento.

Procedimento estatístico Foi utilizado para o experimento o delineamento inteiramente casualizado e utilizado o software SASM-Agri® para a análise de variância e a comparação de médias pelo teste de Tukey em nível de 5% de probabilidade de erro.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados dos testes de superação de dormência usando corte do tegumento com estilete foram satisfatórios em relação a outros tratamentos já testados (Tabela 3). Neste trabalho, utilizou-se esta técnica pela simplicidade, segurança e confiabilidade em relação às demais.

Tabela 3. Resultados dos métodos de superação de dormência utilizando corte do tegumento, ácido sulfúrico e escarificação mecânica em sementes de Erythrina crista-galli L. Metodologia

Germinação média (%)

Corte do tegumento com estilete

86

Ácido sulfúrico (30 min)

83

Escarificação mecânica (lixa)

80

Germinação Efetiva (%) 83 88 95 70 95 65

Referência Nunes et al., 2010 Silva et al., 2006 Mello, 2011 Nunes et al., 2010 Mello, 2011

A germinação média por corte do tegumento com estilete, realizada neste trabalho, foi de 85,5%, relativamente superior às demais metodologias. Todos os demais resultados comparativos citados na tabela acima foram realizados em semelhantes condições de condução (tipos de corte, tempos de exposição ao ácido sulfúrico ou estratégias de escarificação). Mesmo que a média dos resultados para o ácido sulfúrico e escarificação mecânica tenham sido influenciados negativamente pelo trabalho de Mello (2011), visto que Silva et al. (2006) e Nunes et al. (2010) obtiveram melhores desempenhos na germinação, a média dos resultados com a técnica de corte do tegumento apresenta vantagem em relação a segurança de procedimentos quando comparada com a metodologia que utiliza ácido e a superior agilidade em relação à técnica da escarificação mecânica utilizando lixas de madeira. Assim, a metodologia do corte do tegumento com estilete pode constituir eficiente, barato e seguro método de superação de dormência de sementes de Erythrina crista-galli.

44 Altura, número de folhas simples e compostas de plantas jovens em função do tipo do fruto e do dano em sementes A classificação de frutos de Erythrina crista-galli em quatro grupos em função do estágio de maturação apresenta utilidade na separação de grupos de sementes. O crescimento de plantas jovens originárias de sementes coletadas de frutos dos tipo 3 e 4 apresentaram diferença no crescimento na avaliação até os 21 dias (Figura 10). As curvas de altura de plântulas em função do tempo foram representadas por funções quadráticas. Em média, sementes coletadas de frutos do Tipo 4, após serem escarificadas, tiveram melhor desempenho, apresentando crescimento médio diário de 10,7mm/dia (Tabela 4). 25

Altura da plântula (Cm)

20

15 y = -0,0407x2 + 2,0503x + 1,6059 R² = 0,9826

10

5 y = -0,0119x2 + 0,6598x + 0,5374 R² = 0,99 0 Dias de estudo 7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

Figura 10. Desempenho de crescimento de plantas jovens de Erythrina cristagalli (Frutos do tipo 4), intactas escarificadas (azul) e danificadas (vermelho). Sementes deste mesmo tipo de fruto, danificadas por insetos (sem tratamento para a superação de dormência) (Figura 6 e 7) apresentaram crescimento médio de 3,86mm/dia e intactas, também sem tratamento, tiveram crescimento

de

4,95mm/dia. Na Figura 11 podem ser observados alguns tipos de danos visíveis nos cotilédones de plântulas emergidas. Embora na parte externa da semente houvesse

45 um ou dois orifícios, no máximo, os danos internos em cotilédones podem ser significativos e explicar o menor desenvolvimento das plântulas.

Figura 11. Imagens de cotilédones hipógeos danificados em sementes de Erythrina crista-galli T4 emersas. Fotos: Luciano Moura de Mello, Santa Maria, 2014. A menor quantidade de substâncias de reserva nos cotilédones danificados pode gerar plantas menos vigorosas, mas desde que não haja prejuízo direto ao embrião as sementes devem germinar em condições de pouca exigência energética da semente. Observou-se ainda que as sementes desta espécie classificam-se com relação à posição dos cotilédones como hipógea (os cotilédones permanecem aproximadamente à mesma altura de semeadura). Com relação à exposição dos cotilédones

comporta-se

como

criptocotiledonar,

quando

os

cotilédones

permanecem no interior da semente e quanto à função dos cotilédones, é classificada como estrutura de reserva (LIMA JUNIOR, 2011). No entanto, podem desempenhar a função fotossintética quando eventualmente expostos à luz (definição não existente nas classificações dadas por LIMA JUNIOR, 2011). Sementes do tipo 3 (provenientes de frutos maduros não-deiscentes), intactas e escarificadas apresentaram altura de plântulas variável no tempo representadas por funções quadráticas, sendo o crescimento diário de 7,1mm/dia enquanto que sementes danificadas, de frutos tipo 3, cresceram 6,1mm/dia (Figura 12).

46

Altura da plântula (Cm)

20

15 y = -0,0418x2 + 1,5542x + 1,2191 R² = 0,9853 10 y = -0,0429x2 + 1,6522x - 1,9908 R² = 0,9848 5

0 Dias de estudo 7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

Figura 12. Desempenho de plantas jovens de Erythrina crista-galli (Frutos do Tipo 3), intactas escarificadas (azul) e danificadas (vermelho).

Sementes do T3.IE têm maior crescimento médio diário do que sementes do T3.D por coleópteros e a diferença de altura entre plantas provenientes de sementes intactas escarificadas, dos tipos 3 e 4, até o 21º dia é de 6,2cm.

Tabela 4. Média de altura, número de folhas simples e de folhas compostas entre plantas jovens de Erythrina crista-galli de diferentes tipos de sementes. Altura de plântulas (cm)

Número de folhas simples

Número de folhas compostas

Índice foliar *

14, 2ab

1,7d

1,9c

7,4b

T1.I

13,3b

1,7de

1,9d

7,5b

T2.I

17,3ab

2,1a

2,3b

9a

T3.D

12,5b

2,1a

2,7a

10,2a

T3.IE

15,9ab

1,6e

2,9a

9,7ab

T4.IE

22,1a

1,9c

2,7a

10a

T4.I

10,4c

1,9c

2,4b

9,1ab

T4.D

8,2c

2,0b

2,7a

10,1a

28,9

10,6

14,1

12,8

T1.IE

CV (%)

Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna, não diferem entre si pelo Teste de Tukey, a 5%.

47 O número de folhas simples e compostas de plantas jovens em função do tipo de fruto e do dano em sementes, além dos valores médios de alturas estão indicados na Tabela 4. Os grupos de sementes não apresentaram diferenças significativas no que diz respeito ao índice foliar, exceto o grupo T1, sugerindo que suas condições e origens pouco interferem na produção da massa foliar pelas plantas jovens, até o 21º dia. Sementes de Erythrina crista-galli formadas de frutos de coloração marromesverdeado e de frutos totalmente verdes merecem estudos no sentido de desenvolver protocolo de beneficiamento que permita melhorar o desempenho para maximizar os esforços de coleta e produção de mudas em áreas com elevada incidência de danos por insetos brocadores.

Determinação do teor de água das sementes em função do tipo de fruto O teor de água das sementes mostrou-se variável tanto em função do tipo de fruto quanto da existência ou não de dano nas sementes.

Intacta

Danificada

80 70

Teor de água (%)

60

59,3 56,2

50

53,8

50,6

40

36,1

32,4

30 20

14,1 9,52

10 0 Semente T1

Semente T2

Semente T3

Semente T4

Figura 13. Teor de água de sementes intactas e danificadas de Erythrina crista-galli em função do tipo de fruto. Frutos verdes de Erythrina crista-galli possuem sementes com menores índices de danos causados por coleópteros, altos teores de água e de emergência, mesmo sem aplicação de tratamentos para a superação de dormência e podem ser

48 opção no caso de coleta de sementes restrita às áreas sujeitas a grandes danos causados por insetos. Sementes de Erythrina crista-galli com teor de água de até 59,3% apresentam capacidade de emergência de plântulas entre areia e todos os tipos de sementes danificadas apresentaram maior quantidade de água, exceto nas sementes do tipo 4 (Figura 13). Possivelmente estes dados indiquem que a deiscência dos frutos esteja associada à formação efetiva da impermeabilidade do tegumento da semente (razão de sua dormência), após a qual os danos passam a ser os maiores contribuintes para o aumento da umidade ao passo que outros tipos de frutos e sementes, tais danos contribuem para a redução da quantidade de água por desidratação. O teor de água das sementes testadas, que variou de 9,52 a 59,3%, não impediu a emergência das plântulas formadas por sementes intactas ou danificadas, entretanto, as variações do desempenho entre os tipos de semente nos testes de emergência foram significativamente diferentes.

Índices de dano em sementes Foi avaliado o índice de dano das sementes, considerando-se como danificada toda a semente (não chocha) que apresentava pelo menos um orifício causado por inseto (Figura 9.a e Tabela 5). Mello (2011) verificou, utilizando frutos de E. crista-galli que estariam classificados como do tipo 4, que os índices de sementes danificadas em relação ao total, excluindo-se as sementes chochas que também contabilizou, constituiriam 49,3% de dano em um lote de sementes. Um número relativamente próximo daquele também foi encontrado nesse trabalho (56,7%). Variações estacionais, espaciais e nas matrizes podem estar relacionadas com as diferenças encontradas. Frutos T4 fornecem o maior número de sementes intactas por fruto enquanto que T3 apresenta o maior número de sementes danificadas e, consequentente, o maior percentual de sementes danificadas por fruto. Frutos T1 apresentam menor percentual de sementes danificadas, com 0,79 sementes danificadas por fruto e com percentuais médios de 49% de germinação, mesmo sem tratamento para a superação de dormência.

49 Tabela 5. Dados em frutos e sementes coletados, de acordo com o tipo de fruto de Erythrina crista-galli L. Tipo 4

Tipo 3

Tipo 2

Tipo 1

TOTAL

Total de frutos utilizados

118

110

140

89

457

Total de sementes coletadas

658

366

342

263

1629

Sementes intactas

285

113

197

193

788

2,42

1,02

1,41

2,17

-

373

253

145

70

841

3,16

3,3

1,04

0,79

-

Sementes por fruto (total)

5,58

3,33

2,44

2,96

3,6

% de dano

56,7

69,1

42,4

26, 6

51,6

Sementes intactas/fruto Sementes danificadas Sementes danificadas/fruto

O tratamento para superação de dormência, neste caso, incrementa em 10% estes valores. Estudos com esse tipo de fruto podem ser promissores no uso de sementes para a produção de mudas uma vez que o número de sementes intactas por fruto só é maior em sementes do T4. Estratégias de beneficiamento podem maximizar o desempenho na germinação de sementes coletadas de frutos verdes ao passo que estas possuem baixos índices de sementes danificadas por fruto, considerando que os principais critérios adotados durante a coleta de frutos e seleção das sementes pelo produtor de mudas são (a) a quantidade de sementes intactas por frutos (o que economiza o tempo no trabalho de coleta) e (b) os percentuais de germinação destas sementes, que viabilizam a produção de mudas.

Agentes de danos em flores e sementes de Erythrina crista-galli Foram observados importantes agentes causadores de danos em flores e sementes de corticeira-do-banhado (Figuras 14, 15, 16, 17 E 18), sendo o agente mais frequente o coleóptero Pityophthorus sp. (Coleoptera: Curculionidae, Subfamília Scolytinae), um Scolytinae espermófago3 responsável por grande parte dos danos em sementes desta espécie.

3

Espécies que alimentam-se de sementes e parte do endocarpo de frutos (FLECHTMANN, 1995).

50

Figura 14. Coleóptero causador de danos em sementes de E. crista-galli. (a) Pityophthorus sp. (Coleoptera: Curculionidae, Subfamília Scolytinae). (b) Semente danificada, mostrando que numa mesma semente brocas em diferentes fases de desenvolvimento podem ser encontradas (setas) (MELLO, 2011). Estes foram os únicos coleópteros relacionados à perfuração de sementes. Mello (2011) verificou que em uma única semente analisada puderam ser encontrados até 22 destes animais, em diferentes estágios de desenvolvimento (Figura 14. b).

a

b1

b2

b3

b4

b5

Figura 15. Insetos causadores de danos em flores e sementes de Erythrina cristagalli (a) Atta sp. (Hymenoptera: Formicidae) danificando estruturas florais. (b1 a b5) Terastia sp. (Lepidoptera: Crambidae) encontrada dentro de frutos, danificando sementes. (b5) Terastia sp. (Lepidoptera: Crambidae) atacada por hiperparasitoides (Hymenoptera, Macrocentrus sp. (Braconidae: Macrocentrinae), dentro da semente (setas indicam estágios larvais dos parasitoides) Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2014.

51

Costa Lima (1953) afirma que os Colydiinae (Figura 16) podem ser espécies predadoras de larvas e pupas de Cerambicídeos e de Curculionídeos ou ainda micetófagos.

Figura 16. Espécimes 1. e 2. da Fam. Zopheridae e subfamília Colydiinae podem ser encontrados dentro dos frutos mas não foram observados danificando sementes. (MELLO, 2011). Como os Colydiinae foram encontrados dentro de vagens mas não dentro de sementes, sugere-se que sejam predadores de Pityophthorus sp. (um Curculionidae) ou então se alimentem de fungos que se desenvolvem em frutos justamente por conta das lesões causadas pelas brocas ou por lepidópteros. Os danos causados por lepidópteros são mais efetivos do que de coleópteros, por que destroem grande parte da semente (embrião e substâncias de reserva), inviabilizando completamente a semente. O trabalho demonstrou que sementes danificadas por coleópteros, com um orifício de entrada ainda podem germinar. Os danos também podem ocasionar a perda da viabilidade da semente mas quando atingem em pequenas proporções a áreas dos cotilédones, produzem plântulas normais. Quando botões florais (Figura 18), frutos ou sementes (Figura 18 e 19) são predados por lepidópteros como Leucanella viridescens viridior (Lepidoptera: Saturniidae) e Hypocrisias sp. (Lepidoptera: Arctiidae, Tribo Phaegopterini), identificadas por MELLO (2011), o comprometimento de significativas partes dos órgãos causa perda completa das estruturas reprodutivas e sementes.

52

Figura 17. Danos causados por lagartas de Lepidoptera em botões florais (A-C), de E. crista-galli. Nota-se o comprometimento severo das estruturas reprodutivas mesmo antes da antese das flores (MELLO, 2011).

Figura 18. Danos causados por lagartas de Lepidoptera em frutos (D-F) e sementes (G-I) de E. crista-galli. (MELLO, 2011). Vigor de sementes de Erythrina crista-galli L. Os testes revelaram que sementes do T4 e T3, escarificadas e sem danos não diferem entre si, apresentando valores de 90 e 88% (Tabela 6) enquanto as sementes do T1 (escarificadas ou não) apresentaram emergência significativamente reduzida em relação aos demais tratamentos.

53 Tabela 6. Resultados dos testes de vigor: emergência, índice de velocidade de emergência (IVE) e tempo médio de emergência (TME) dos tipos de sementes de Erythrina crista-galli, aos 21 dias: Emergência (%)

TME (dias)

IVE

T1.IE

59c

13b

4,1bcd

T1.I

49c

14b

3,3cd

T2.I

59c

13b

4,0bcd

T3.D

79ab

11b

6,3b

T3.IE

88a

13b

5,8bc

T4.D T4.I

64bc 24d

12b 13b

4,6bc 1,6d

T4.IE

90a

6a

12,7a

28,9

21,32

63,0

CV (%)

Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna, não diferem entre si pelo Teste de Tukey, a 5%.

Os resultados dos testes de emergência em areia comparados aos resultados das sementes do T4 estão muito acima dos apresentados por Mello (2011) para os testes de germinação também realizados em areia (53% com fotoperíodo de 8 horas, no último teste citado). O lote de sementes e forma de escarificação selecionada para aquele trabalho pode estar relacionada às diferenças nestes resultados. A escarificação enquanto meio de superação de dormência em sementes T3 não apresentou diferença para sementes danificadas do T3 (que por sua vez também não diferem estatisticamente das sementes danificadas do T4, conservando capacidade de emergência em areia nas condições testadas). Sementes do T4IE, normalmente utilizadas para a produção de mudas, apresentam percentual de emergência 30% superior em relação às T1IE, entretanto apresentam também altos percentuais de danificação, de aproximadamente 50%, em relação aos 20% de danos em sementes T1. O uso de sementes do T1, mesmo sem beneficiamento, já anula a perda de rendimento na produção de mudas e constitui uma classe de sementes de potencial expectativa para o uso por produtores de mudas desta espécie florestal.

CONCLUSÕES

A proposta de classificação de frutos de Erythrina crista-galli em quatro grupos em função do estágio de maturação apresenta utilidade na separação de grupos de sementes.

Frutos verdes de Erythrina crista-galli possuem sementes com menores índices de danos causados por coleópteros, altos teores de água e capacidade de emergência, mesmo sem aplicação de tratamentos para a superação de dormência.

O uso de sementes obtidas de frutos verdes e intermediários merecem estudos no sentido de desenvolver protocolo de beneficiamento que permita melhorar o desempenho para maximizar os esforços de coleta e produção de mudas em áreas com elevada incidência de danos por insetos brocadores.

Pityophthorus sp. (Coleoptera: Fam. Curculionidae, subfamília Scolytinae) é o maior causador de dano em sementes de Erythrina crista-galli, entretanto, danos causados por Lepdoptera podem inviabilizar completamente as sementes afetadas, enquanto que as sementes danificadas por Coleoptera podem apresentar emergência.

4. CAPÍTULO II Protocolo de isolamento de DNA genômico de Erythrina crista-galli L. INTRODUÇÃO

Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos no sentido de otimizar o uso de marcadores moleculares baseados em DNA para avaliação da diversidade genética em espécies florestais brasileiras. Dificuldades metodológicas, entretanto, podem ser encontradas tendo-se em vista a estratégia de extração do material genético a analisar, sobretudo visando garantir a extração de quantidades e qualidade necessárias. O isolamento de DNA é uma etapa fundamental para a aplicação de técnicas de avaliação da diversidade genética baseada em marcadores moleculares e não há na literatura indicação de técnica para a realização desta etapa para Erythrina cristagalli. Há, no entanto, outras fontes de informação acerca de procedimentos realizados com outras espécies do gênero Erythrina e que servirão de base para a exploração da aplicabilidade e da proposição de procedimento que atenda a essa necessidade. Os marcadores baseados em RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA ou DNA polimórfico amplificado ao acaso) possuem limitações com relação à sua repetibilidade, contudo, pode fornecer informações iniciais e significativas respostas nos estudos com espécies nativas na fase exploratória do estudo genético. Estes marcadores são caracterizados por sua dominância. Alelos de um mesmo loco são revelados simplesmente pela presença ou ausência de uma banda, resultado da amplificação de um fragmento de determinado tamanho no gel. Não é possível com essa técnica saber se o loco amplificado está em homozigose ou heterozigose em relação a seus genes. Sendo assim, marcadores dominantes, ao contrário

dos

codominantes,

não

permitem

a

distinção

entre

genótipos

homozigóticos e heterozigóticos. Não foram localizados na literatura trabalhos com marcadores moleculares em Erythrina crista-galli que possam auxiliar na interpretação de sua diversidade e especialmente no entendimento da relação entre diversidade genética e qualidade fisiológica de sementes.

56 Utilizaram-se como fonte de material vegetal para o isolamento de DNA, folhas secas, folhas frescas congeladas e câmbio vascular congelado. Inicialmente utilizaram-se folhas secas em função dos resultados dos trabalhos de Thomson e Henry (1993) e Tai e Tanksley (1990). Os primeiros autores testaram quatro métodos de secagem das amostras foliares de pêssego (Prunus persica): secagem à temperatura ambiente, secagem a 42 °C ou a 65 °C e secagem em forno microondas. Os autores verificaram que as soluções de DNA isoladas a partir das amostras foliares secas à temperatura ambiente apresentaram resultados de pureza e rendimento equivalentes às soluções de DNA isoladas a partir das amostras frescas. Tai e Tanksley (1990) também compararam a extração de DNA de tomate (Solanum lycopersicum) a partir de amostras foliares frescas e secas em estufa à 45 °C, por 24 h. Estes autores constataram, igualmente que as soluções de DNA extraídas das amostras secas foram de qualidade equivalente àquelas isoladas de amostras frescas. Devido à importância dos estudos baseados em marcadores moleculares em uma futura avaliação da diversidade genética entre e dentro de fragmentos, este capítulo teve o objetivo de estabelecer um protocolo eficiente de isolamento de DNA para Erythrina crista-galli, com base em três fontes de material e testar, com marcadores RAPD, a eficiência do método de isolamento.

MATERIAL E MÉTODOS

Fonte do material vegetal Os fragmentos estudados, fontes do material para análise da diversidade genética, estão localizados na região do município de Bagé, Aceguá, Hulha Negra e Dom Pedrito (Figura 5, pág.36). Estes fragmentos florestais possuem as seguintes características gerais e estrutural de suas matrizes (Figuras 19 a 24). Os critérios para a seleção de fragmentos foram a distância mínima de 8km entre os fragmentos e o isolamento mínimo de 350m entre o fragmento e qualquer outro indivíduo da espécie, seja em formações florestais ciliares, outras formações ou mesmo qualquer outro indivíduo isolado, permitindo a avaliação dentro e entre os fragmentos a fim de considerar o necessário isolamento.

FRAGMENTO 1 (Aceguá) Fragmento contendo 90 matrizes de Erythrina crista-galli; 10 selecionadas para o trabalho (11,1% de amostragem). Área de campo limpo, sem arbustos destacados, pastagens de gado, junto a curso de água de pequeno volume, vegetação ciliar composta quase que exclusivamente por Erythrina crista-galli. Setas indicam a matriz nº 10 Fragmento ao lado da BR 153, próximo a Aceguá, RS ( à direita no mapa). As setas indicam a posição da matriz nº 10.

Figura 19. Fragmento 1 (Aceguá): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento, com a seta indicando a posição da matriz nº 10 de Erythrina crista-galli. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2013.

58 FRAGMENTO 2 (Serrilhada) Fragmento contendo 17 matrizes de Erythrina crista-galli; 5 selecionadas para o trabalho (29,4% de amostragem). Área de campo limpo, sem arbustos destacados e com pastagens de gado, junto a curso de água intermitente. Vegetação ciliar composta em grande parte por Erythrina crista-galli. Fragmento localizado junto da estrada Bagé-Serrilhada onde se acham outras espécies arbóreas nativas distribuídas especialmente nas áreas marginais à estrada (na imagem, à direita). As setas indicam a posição da matriz nº 1.

Figura 20. Fragmento 2 (Serrilhada): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento com a seta indicando a posição da matriz nº 1, de Erythrina crista-galli. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2013.

FRAGMENTO 3 (Olhos d´água) Fragmento contendo 9 matrizes de Erythrina crista-galli; 5 selecionadas para o trabalho (55,6% de amostragem). Área de campo limpo, poucos arbustos destacados, com pastagens de gado, junto a um reservatório de água no lado leste (açude), vegetação arbórea composta quase que exclusivamente por Erythrina crista-galli. Fragmento junto à estrada do interior do município de Bagé, na região de Olhos d’água (à esquerda na foto). As setas indicam a posição da matriz nº 5.

Figura 21. Fragmento 3 (Olhos d’água): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento . Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2013.

59 FRAGMENTO 4 (Dom Pedrito) Fragmento contendo 17 matrizes de Erythrina crista-galli; 5 selecionadas para o trabalho (29,4% de amostragem). Área de campo “sujo”, com muitos arbustos e árvores em diferentes estágio de desenvolvimento e com vegetação heterogênea. Há conexão com a vegetação ciliar do Arroio Piray, entretanto sem exemplares de E. crista-galli a menos de 350m do fragmento. Divisa entre os municípios de Bagé e Dom Pedrito (BR 293 à sudoeste do fragmento). Setas indicam a posição da matriz nº 4.

Figura 22. Fragmento 4 (Dom Pedrito): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento com a seta indicando a posição da matriz nº 4, de Erythrina crista-galli. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2013. FRAGMENTO 5 (Candiota) Fragmento contendo 9 matrizes de Erythrina crista-galli; 4 selecionadas para o trabalho (44,4% de amostragem). Área de campo sujo e matrizes em formação ciliar esparsa do Arroio Jaguarão. Formação arbustiva (campo sujo) nas áreas de campo adjacentes. BR 293 ao norte do fragmento (ponte), próximo ao município de Candiota (a leste). Vegetação ciliar se adensa na direção Sul do fragmento. As setas indicam a posição da matriz nº 3.

Figura 23. Fragmento 5 (Candiota): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2013.

60 FRAGMENTO 6 (Hulha Negra) Fragmento contendo 11 matrizes de Erythrina crista-galli; 3 selecionadas para o trabalho (27,3% de amostragem). Área de campo limpo, poucos arbustos na área campestre, poucas árvores nas bordas de um pequeno curso de água intermitente. A vegetação arbustiva é composta por Eryngium sp. (Caraguatás) no leito do curso intermitente e que se adensa na direção sudeste acompanhando a área delimitada. BR 293 (a sudoeste). As setas indicam a posição da matriz nº 2.

Figura 24. Fragmento 6 (Hulha Negra): a. mapa de distribuição espacial e b. vista panorâmica do fragmento com a seta indicando a posição da matriz nº 2, de Erythrina crista-galli. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2013.

Figura 25. Matriz de Erythrina crista-galli isolada, mostrando a produção de flores, em dezembro de 2013. Na fotografia a BR 293. Seta indica a direção do município de Dom Pedrito, a aproximadamente 65km do local. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2013.

Realizou-se o isolamento de DNA genômico baseado em dois métodos, um método descrito por Nienhuis et al. (1995), com modificações e a segunda metodologia com um kit comercial (PROMEGA®) a fim de verificar diferenças quantitativas e qualitativas no material genético isolado.

61 Como fonte de material utilizaram-se folhas secas conservadas à temperatura ambiente, folhas frescas conservadas em embalagens plásticas e armazenadas em freezer e câmbio armazenado em microtubos de centrífuga e mantidos em freezer. A seleção desta primeira estratégia de coleta de material para o isolamento de DNA genômico deve-se à simplicidade do método, aos resultados de trabalhos anteriores e da fonte de material em relação a folhas frescas que necessitariam de resfriamento ou início imediato do isolamento, entretanto, por se tratar de espécie decídua, foi ainda testado o método de isolamento via câmbio vascular a fim de permitir que a informação de sua eficiência estivesse disponível no caso da necessidade de aquisição de material nos meses de inverno.

Isolamento do DNA de folhas secas, folhas frescas e câmbio Isolamento de DNA a partir de folhas secas Para o isolamento de DNA genômico das folhas secas foram utilizados, aproximadamente, 150mg de folhas jovens. As folhas foram coletadas nos dias 14 e 15 de outubro 2013, sendo colhidas das plantas-matrizes e acondicionadas em embalagens plásticas contendo sílica gel. Após 24 horas, as folhas foram reclassificadas e 10 unidades, quando disponíveis, foram acondicionadas em embalagens de papel e armazenadas em ambiente seco e à temperatura ambiente. Os trabalhos de isolamento de DNA genômico foram realizados no Laboratório de Marcadores Moleculares do Núcleo de Biotecnologia e Melhoramento do Departamento de Fitotecnia, do Centro de Ciências Rurais da Universidade Federal de Santa Maria, em Santa Maria, RS. As amostras permaneceram 170 dias nas condições já apresentadas. As amostras foliares (150mg de limbo foliar e pecíolos) foram maceradas em almofariz com auxílio de nitrogênio líquido (Figura 27) e posteriormente o macerado foi transferido para microtubos de centrífuga contendo 700 µL de tampão CTAB [Cetil trimetil brometo de amônio 2%; Cloreto de sódio (NaCl) 1,4mM; Tris 1mM pH 8,0; Polivinilpirrolidona (PVP) 1%)]. As amostras foram incubadas em banho-maria a 65ºC por 60 minutos, agitando-as a cada 15 minutos para homogeneização do material.

62

a

b

c

d

Figura 26. Pesagem (a), maceração utilizando nitrogênio líquido (b) e (c) e preparação das amostras foliares de Erythrina crista-galli nos microtubos de centrífuga após a maceração (d). Fotos: Luciano Moura de Mello, UFSM, 2014. Após o período de incubação, foi adicionado 1 volume do solvente orgânico clorofórmio : álcool isoamílico, 24:1 (CIA), sendo, imediatamente, centrifugado por 30 segundos a 10.000 x g.

Figura 27. Microtubos contendo as amostras foliares de Erythrina crista-galli com clorofórmio:álcool isoamílico (CIA), após a centrifugação. Seta indica o sobrenadante utilizado. Fotos: Luciano Moura de Mello, UFSM, 2014.

63 O sobrenadante foi transferido para novos microtubos de centrífuga de 2mL. A seguir, foram adicionados 400µL de isopropanol gelado a -20 ºC e misturados suavemente por inversão dos tubos. As amostras foram armazenadas em freezer à temperatura de -20ºC por 1h para precipitação do DNA, sendo, na sequência centrifugadas a 18.000xg por 60 segundos para formação do sedimentado. O sobrenadante foi descartado, cuidadosamente, para não promover o descarte acidental do pellet (Figura 29). Os pellets foram lavados com 1mL de etanol 70% por 5min. A fase aquosa foi descartada e os pellets foram secos à temperatura ambiente, por aproximadamente 45 min. O DNA extraído foi ressuspendido em 200µL de TE Buffer (1µM de TRIS + 0,1µM ETDA) e foram adicionados 2µL de RNAse A (10mg.mL-1), sendo as amostras incubadas a 37ºC, por 60 min. Posteriormente, foram adicionados 200µL de isopropanol gelado (a -20ºC), os quais foram misturados, suavemente, por inversão dos tubos, sendo, na sequência centrifugados a 18.000xg por 60 segundos, para formação do sedimentado (pellet).

a

b

Figura 28. Pellet de amostra - seta (a) e microtubos durante a etapa da secagem (b) sobre papel absorvente. Fotos: Luciano Moura de Mello, UFSM, 2014. A fase aquosa foi descartada e o pellet foi novamente lavado com 1mL de etanol 70% por 5 min. As amostras foram submetidas a um spin, por 30 segundos, para sedimentação do pellet. A fase aquosa foi descartada e os pellets, secos à temperatura ambiente por, aproximadamente 60 min.

64 Por fim, o DNA extraído foi ressuspendido em 100µL do tampão de eluição TE Buffer (1µM de TRIS + 0,1µM ETDA). As soluções de DNA foram armazenadas em freezer, a -20ºC até o dia da quantificação de DNA das amostras e PCR.

Isolamento de DNA genômico a partir de câmbio vascular As amostras de câmbio foram coletadas das matrizes no mesmo período de coletas de folhas secas, já citado utilizando-se uma Sonda de Pressler (Figura 29).

a

b

c

d

Figura 29. Fases da coleta de câmbio das matrizes de Erythrina crista-galli: (a) georreferenciamento da matriz e uso da Sonda Pressler (ou Trado de Incremento), (b) acondicionamento do bastão de câmbio (seta) nos microtubos de centrífuga, (c) desinfecção do orifício com solução comercial de sulfato de cobre e (d) proteção do orifício com pasta de silicone. Fotos: Luciano Moura de Mello, Bagé, 2013. As amostras de câmbio foram coletadas sempre que possível à altura média do peito e imediatamente após a coleta foram armazenadas em microtubos de centrífuga previamente contendo 7000 µL de tampão CTAB [Cetil trimetil brometo de

65 amônio 2%] e conservadas durante a fase de campo em caixa térmica contendo gelo. Durante as coletas de câmbio foram tomados os cuidados de promover a desinfecção do orifício com 10mL de solução comercial de sulfato de Cobre e a posterior proteção do orifício com pasta de silicone (Figura 29, (c) e (d)) para dificultar a entrada de microorganismos e permitir a cicatrização do ferimento. Tabela 7. Matrizes utilizadas no teste de protocolos e fontes de material genético de E. crista-galli. A numeração que identifica as matrizes foi tomada pela ordem da coleta no campo, tendo todas as matrizes posições georreferenciadas para posterior identificação a campo. Fragmento 1 2 3 4 5 6 Isolada

1.1 2.1 3.1 4.1 5.1 6.1

1.4 2.2 3.3 4.2 5.2 6.2

Amostras Folha seca Folha fresca 1.5 1.7 1.9 1.10 1.5 (2x) 2.3 2.5 2.1 (2x) 3.4 3.5 3.3 4.5 4.1 4.2 5.3 5.1 5.2 6.3 6.1 (2x) X (única) -

Câmbio vascular 1.5 (2x) 2.1 (2x) 4.1 5.1 6.1 (2x) -

Após a maceração as amostras de câmbio foram repesadas para fins de homogeneização e obtiveram-se 230mg de macerado final de câmbio em cada amostra, sendo a diferença entre o peso inicial e final atribuído a perdas durante a maceração e ao material fino aderido ao almofariz. Estimou-se, pela média dos pesos iniciais e finais de amostras levadas à maceração, que cerca de 20% do volume do material usado inicialmente tenha sido perdido após o processo na maceração de câmbio utilizando-se nitrogênio líquido. De todas as amostras de câmbio obteve-se pelo menos 300µL de sobrenadante. No caso do isolamento de DNA de câmbio, o material após ser pesado (280mg), foi pré-macerado em almofariz e somente depois foi adicionado o nitrogênio líquido para a maceração fina do material, seguindo-se posteriormente a pesagem do material que efetivamente compôs a amostra, seguindo-se o mesmo protocolo já referenciado para os isolamentos de material genético de folhas secas.

66 Isolamento de DNA genômico a partir de folhas frescas As folhas frescas foram coletadas nos mesmos dias das folhas secas e das amostras de câmbio. Assim que coletadas, as amostras de folhas frescas foram acondicionadas em sacos plásticos contendo duas colheres de sopa de sílica gel (48mm). Estas embalagens permaneceram em freezer a -20ºC, por 170 dias, até o dia do isolamento do DNA genômico. Para a extração do DNA de folhas frescas utilizou-se 150mg de material, tendo sido desenvolvido o mesmo protocolo de extração anteriormente referenciado para as folhas secas e câmbio vascular. As amostras utilizadas nos testes de extração dos distintos materiais (n=24) estão apresentadas na Tabela 7. Durante a etapa de retirada do sobrenadante (após a adição de CIA) e centrifugação, observou-se que as amostras de folhas frescas resultaram em menores quantidades de sobrenadante comparativamente às amostras de câmbio. De todas as amostras de folhas frescas obteve-se pelo menos 300µL de sobrenadante, exceto as amostras 1.5, 4.1 e 5.1 das quais se obtiveram, apenas 50µL. Protocolo de isolamento de DNA genômico padrão PROMEGA® Foi realizado teste de extração com o Kit Wizard® Genomic DNA (Ref. A1123) do material foliar em Erythrina crista-galli a fim de comparar com o desempenho do protocolo de modificado de Nienhuis et al. (1995). Para essa avaliação foram utilizados 40mg de folhas jovens (secas) para a extração de DNA, conforme especificações do teste. As folhas foram colhidas e acondicionadas nas mesmas condições do teste anterior. As extrações de DNA foram realizadas no Laboratório de Marcadores Moleculares do Núcleo de Biotecnologia e Melhoramento do Departamento de Fitotecnia, Centro de Ciências Rurais da UFSM, localizado em Santa Maria, RS. Foram utilizadas amostras foliares de sete matrizes (1.5; 2.1; 3.3; 4.2; 5.2; 6.1 e X), sorteadas uma amostra dentro de cada fragmento mais a matriz isolada (X), a fim de comparar o desempenho dos métodos de extração (Tabela 7). As amostras foliares foram maceradas em almofariz com auxílio de nitrogênio líquido e posteriormente o macerado foi transferido para microtubos de centrífuga. Foram adicionados 600µL de solução de lise nuclear (Nuclei Lysis Solution). O

67 material foi incubado a 65ºC por 15 minutos em banho-maria. Após este período de incubação, as amostras receberam 3µL de solução de RNase (RNase Solution), sendo realizadas lentas inversões para homogeneizar os reagentes. A mistura foi incubada a 37ºC por 15 minutos e, posteriormente deixada por 5 minutos à temperatura ambiente. Foi adicionada a solução para a precipitação de proteínas (Protein Precipitation Solution) e a mistura foi submetida a vortex por 20 segundos para homogeneização. Posteriormente o material foi centrifugado por 5 minutos a 18.000xg (e não por 3 minutos a 16.000xg conforme estabelecia o protocolo uma vez que estes procedimentos não produziram inicialmente os efeitos esperados), tendo sido feita, após a centrifugação, a separação do sobrenadante contendo o DNA para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5ml, já contendo 600µL de isopropanol. Foram realizadas lentas inversões no material e centrifugação por 5 minutos a 18.000xg, à temperatura ambiente. O isopropanol foi descartado e foram adicionados 600µL de álcool 70% para a lavagem do DNA (pellet). Após lentas inversões o álcool também foi descartado, deixando-se os tubos secarem sobre papel absorvente limpo, durante 15 minutos. A fim de fazer a reidratação do DNA foram adicionados 100µL de DNA Rehydratation Solution, com incubação de 60 minutos a 65ºC. Posteriormente o produto foi submetido à quantificação e qualificação por meio de um espectrofotômetro a fim de comparar as técnicas de extração.

Análise da qualidade e concentração das soluções de DNA genômico A análise da qualidade e concentração das amostras de DNA genômico obtidas a partir do emprego dos diferentes protocolos foi realizada por meio de um espectrofotômetro de UV-Vis NanoDrop® ND-1000 (Figura 31). Neste equipamento utilizou-se 2µL da solução de DNA. O software do equipamento baseia-se na equação de Lambert-Beer para correlacionar a absorvância com a concentração da amostra, de acordo com a Equação 1 (SCIENTIFIC, 2008b): A = E . b . c (1) Sendo “A” representa a absorvância, representada em unidades de absorvância (A); “E” o coeficiente de absortividade molar dependente do comprimento de onda (ou

68 coeficiente de extinção), em unidades de mol-cm.L-1; “b” é o comprimento do caminho, em cm; e “c” a concentração do analito, em mol L -1 ou molaridade (M). No caso particular da quantificação de ácidos nucleicos, a equação de Lambert-Beer é modificada (Equação 2) para usar o coeficiente de extinção específico para DNA em ng-cm μL-1 (SCIENTIFIC, 2008b): c = (A .e) b ⁄ (2) Sendo “c” corresponde à concentração de DNA em ng.μL-1; “A” a absorvância a 260 nm (comprimento de onda correspondente ao pico de absorvância de DNA); “e”, o coeficiente de extinção (para DNA é igual a 50 ng-cm.μL-1); e “b”, a altura da coluna criada no espectrofotômetro (neste caso corresponde a 1 cm). Logo, o aparelho mede a absorvância a 260 nm, obtém-se um valor, que, multiplicado pelo coeficiente de extinção, indica a concentração de DNA na amostra, em ng.μL-1 (SCIENTIFIC, 2008b). A Figura 31 mostra etapas da qualificação do DNA utilizando-se o espectrofotômetro de UV-Vis NanoDrop® ND-1000. Para a análise da qualidade das amostras, foi utilizada a razão A260/A230 e A260/A280. O software do equipamento utiliza as leituras da absorvância nos comprimentos de onda de 230, 260 e 280 nm para calcular, automaticamente, as razões.

a

b

Figura 30. Etapas da análise da qualidade e concentração das soluções de DNA genômico isoladas a partir de amostras foliares de Erythrina crista-galli L. em espectrofotômetro UV-Vis NanoDrop® ND-1000. Pipetagem da solução (a) e análise da solução pelo software do equipamento (b), com o gráfico correspondente ao no monitor ao fundo. Fotos: Luciano Moura de Mello, Santa Maria, Departamento de Veterinária da UFSM, 2014.

69 Para elaborar uma curva padrão de absorvância esperada para uma solução de DNA livre de contaminantes, foram utilizados dados disponíveis no Manual do Usuário do equipamento (SCIENTIFIC, 2008b). Reações de RAPD Seguiu-se o protocolo de reação estabelecido por Melo (2010). Após serem realizadas as extrações do DNA se deu início as reações de RAPD. Foram utilizadas as seguintes amostras para as reações de RAPD (n=13): (1.1) (1.4) (1.5) (1.9) (2.2) (2.3) (2.5) (3.1) (4.1) (4.5) (5.3) (6.3) (X) A seleção das amostras utilizadas neste teste foi realizada em função da melhor qualidade e maior quantidade de DNA extraída dos fragmentos e, exceto a amostra (1.5), que provinha de amostra de DNA extraído por meio do Kit Wizard® Genomic DNA, todas as demais foram tomadas a partir de folhas secas utilizando-se o protocolo modificado de Nienhuis et al. (1995). O mix de reagentes para cada matriz foi composto por 2,92 µL de água ultra pura; 1,30 µL de tampão 10X; 1µL de cloreto de magnésio (25mM); 1,04 µL de dNTPs; 1,04 µL de BSA (Soro Albumina Bovina); 0,2 µL da enzima Taq polimerase; 2,5 µL do oligonucleotídeo e 3 µL do DNA de trabalho (MELO, 2010). O DNA de trabalho originalmente continha diferentes concentrações entre as amostras e foi desta forma utilizado na reação de PCR. Posteriormente foi feito novo teste equalizado para que todas apresentassem 20ng/µL antes da realização do PCR. Foram testados cinco iniciadores (oligonucleotídeos) da marca SIGMA® em cada um dos indivíduos estudados/população, selecionados por apresentarem melhor desempenho nas reações de RAPD em Erythrina velutina Willd. (MELO, 2010):

Iniciadores

Sequência 5’ – 3’

05

TTC GAG CCA G

14

GGC ACT GAG G

15

GGT CGG AGA A

16

TCG GAC GTG A

18

GGA GGA GAG G

70 O programa de amplificação do DNA consistiu de uma temperatura inicial de 94°C por 5 minutos, seguido de 45 ciclos que envolvem temperaturas de 94°C por 1minuto, 36°C por 2 minutos e 72°C por 1 minuto. A amplificação ocorreu em termociclador Mastercycler (EPPENDORF®), utilizando microtubos de 200 mL, contendo 13 mL do mix (MELO, 2010). Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese, realizada a 110 V, em gel de agarose a 1%. A corrida eletroforética foi realizada em cuba horizontal, contendo tampão TBE (Tris-Borato-EDTA) 0,5X em quantidade suficiente para assegurar a submersão do gel. Em seguida, as amostras foram carregadas em tampão de carregamento contendo Gel Red e os produtos da amplificação visualizados sob luz ultravioleta.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Análise da qualidade e concentração das soluções de DNA genômico obtidas de folhas secas, pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995) e por meio de Kit comercial (Wizard® Genomic DNA)

As avaliações resultaram em diferenças entre o DNA extraído das amostras, não só dentro dos fragmentos como entre os dois protocolos testados. No fragmento 1 (região de Aceguá) observa-se que as matrizes apresentaram, mesmo seguindose o mesmo protocolo e a mesma fonte de coleta de DNA, pronunciadas diferenças na quantidade e na qualidade do material genético (Figura 31). A principal constatação na interpretação das concentrações fornecidas pelo NANODROP® é feita pela leitura a 260 nm, que corresponde ao pico de absorvância de ácidos nucléicos, em que uma unidade de absorvância corresponde a 50 μg/mL (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). Para estimativas da pureza do DNA extraído devem ser realizadas também as leituras de absorvância nos comprimentos de onda de 230 e 280 nm, correspondentes aos picos de absorção de polissacarídeos e proteínas, respectivamente (PAGE et al., 2010). Por fim, procede-se ao cálculo das razões A260/A230 e A260/A280. Não foram observadas a campo diferenças fenotípicas ou ambientais marcantes entre as matrizes que pudesse explicar, numa análise preliminar, as variações entre os resultados dos testes de isolamento de DNA. Mesmo assim, a matriz 1.4 no comprimento de onda representativo do DNA apresentou altos valores quando comparativamente com a matriz 1.5. A melhor qualidade (pureza) do material (por semelhança à curva padrão dada pelo equipamento Nano-Drop®) foi representada pela amostra 1.1. Todas as amostras apresentaram altos valores de polissacarídeos (230 nm). As leituras representativas de proteínas (280 nm) foram satisfatórias para todas as amostras do fragmento estudado.

72 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 220

230

240

250

Curva Padrão DNA

260 1.1

270

280

1.4

290 1.5

300

310

320

330

1.7 1.9 1.10 Comprimento de onda (nm)

Figura 31. Curvas de absorvância das soluções de DNA das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 1 (Aceguá), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995). No fragmento 2 (Figura 32) as diferenças entre as matrizes também foi expressiva entre os grupos de matrizes 2.1-2.3 e 2.2-2.5 entretanto ficaram muito abaixo dos valores padrão (dados pelo NanoDrop®). 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 220

230

240

250

260

Curva Padrão DNA

270 2.1

280

290 2.2

300 310 320 330 Comprimento de onda (nm) 2.3 2.5

Figura 32. Curvas de absorvância das soluções de DNA isoladas das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 2 (Serrilhada), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995).

73 Entretanto, a quantidade e qualidade de material genético extraído mostrouse suficiente para a realização de análises envolvendo DNA de Erythrina crista-galli, exceto 2.1 que ficou abaixo do limite esperado de 30ng/mL. O fragmento 3 (Figura 33) apresentava o material foliar aparentemente melhor preservado

(embora

estivesse

submetido

às

mesmas

condições

de

armazenamento), entretanto as quantidades de DNA extraídas foram baixas com o protocolo modificado de Nienhuis et al. (1995). As quantidades e a qualidade do material genético isolados por esse método não permitiriam a realização de reações de PCR. A causa da variação significativa entre as amostras do mesmo fragmento, bem como de distintos fragmentos não é conhecida uma vez que todas foram coletadas no mesmo período e estiveram sob as mesmas condições de armazenamento pelos 170 dias de secagem até a data das extrações. 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 220

230

240

250

260

Curva Padrão DNA

270

280

3.1

290 3.3

300 310 320 330 Comprimento de onda (nm) 3.4 3.5

Figura 33. Curvas de absorvância das soluções de DNA isoladas das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 3 (Olhos d’água), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995).

Os dados do fragmento 4 (Figura 34), assim como do fragmento 3, chamaram a atenção pelo resultado dos isolamentos segundo a metodologia por motivos distintos: o material do fragmento 3 apresentava excelente estado visual de conservação porém mostrou resultados insatisfatórios. Todavia, os materiais utilizados

para

extrações

provenientes

do

fragmento

4

eram

compostos

74 exclusivamente por brotações formadas por ramos e folhas extremamente jovens que, depois do período de secagem, constituía material ressecado de difícil seleção para o uso e, portanto, não se esperava encontrar suficiente recurso para a análise. 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 220

230

240

250

260

Curva Padrão DNA

270

280

290

4.1

300 310 320 330 Comprimento de onda (nm) 4.2 4.5

Figura 34. Curvas de absorvância das soluções de DNA isoladas das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 4 (Dom Pedrito), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995). No entanto, a quantidade de DNA (ainda que com expressiva contagem de polissacarídeos) foi suficientemente alta para a realização de testes envolvendo DNA da espécie considerando a quantidade esperada. As amostras do fragmento 5 (Figura 35) mostraram baixa quantidade de ácidos nucleicos extraídos, onde apenas uma amostra (5.3) atingiu a quantidade necessária de DNA para as análises seguintes. Este fragmento apresenta matrizes em um ambiente fortemente impactado pela descontinuidade do ambiente ciliar esperado para as bordas de curso de água e somente a matriz 5.3 efetivamente encontra-se em uma área de margem relativamente bem conservada.

75 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 220

230

240

250

260

270

Curva Padrão DNA

280 5.1

290

300 310 320 330 Comprimento de onda (nm) 5.2 5.3

Figura 35. Curvas de absorvância das soluções de DNA isoladas das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 5 (Candiota), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995). Os valores de absorvância do fragmento 6 (Figura 36) mostraram que praticamente não existe material genético a ser avaliado na amostra 6.1 ao passo que a amostra 6.3 apresenta não só a quantidade mostrou-se suficiente como também a relativa qualidade do material. 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 220

230

240

250

260

Curva Padrão DNA

270

280 6.1

290 6.2

300

310 320 330 Comprimento de onda (nm) 6.3

Figura 36. Curvas de absorvância das soluções de DNA isoladas das amostras foliares de Erythrina crista-galli do fragmento 6 (Hulha Negra), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995). Com relação à matriz isolada a quantidade e qualidade do material genético extraído foi relativamente satisfatória (Figura 37).

76 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 220

230

240

250

260

270

280

290

300 310 320 330 Comprimento de onda (nm) Isolada

Curva Padrão DNA

Figura 37. Curvas de absorvância das soluções de DNA isoladas da amostra foliar de Erythrina crista-galli (matriz isolada), pelo método modificado de Nienhuis et al. (1995). Avaliando-se os resultados especificamente da quantidade de material quantificado no comprimento de onda correspondente a 260nm (Figura 38) observase que há significativas diferenças entre as amostras, variando desde o máximo extraído na matriz 1.4, com 422,31 nm.mL-1 a 0,83 nm.mL-1, na matriz 6.1.

Identificação das matrizes e fragmentos

Isolada 6,3 6,2 6,1 5,3 5,2 5,1 4,5 4,2 4,1 3,5 3,4 3,3 3,1 2,5 2,3 2,2 2,1 1,10 1,9 1,7 1,5 1,4 1,1

0

30

60

90

120

150

180

210

240

270

300

330

360

390

420

Concentração (em ng/µL)

Figura 38. Concentrações de DNA das amostras foliares de Erythrina crista-galli L. obtidas com o protocolo de extração de Nienhuis et al. (1995), com modificações.

77 Nove das 24 matrizes selecionadas para os testes apresentaram valores inferiores a 30 nm.mL-1 e a qualidade do material extraído pelo protocolo de Nienhuis et al. (1995) mostrou altos valores de polissacarídeos nas amostras das matrizes 1.1, 1.4, 1,7 e 4.2. Todas as outras amostras apresentaram valores compatíveis com a curva padrão, tanto para polissacarídeos quanto para proteínas, eficientemente extraídas das amostras por meio do protocolo testado. Mazza & Bitencourt (2000) explicam que contaminantes, como os compostos polifenólicos e terpenóides, liberados durante a lise celular, principalmente de tecidos de folhas maduras, aderem irreversivelmente ao DNA, inibindo a digestão com endonucleases de restrição e/ou a amplificação através de PCR. O rompimento da célula também libera polissacarídeos, os quais são de difícil separação do DNA e inibem muitas diferentes DNA polimerases e enzimas de restrição (LODHI et al., 1994). O tipo de protocolo usado também mostrou acentuada diferença nos testes (Figura 39). Além do teste comercial (Wizard® Genomic DNA, PROMEGA®) ter desenvolvimento em laboratório mais prático, rápido e como menores fontes de erro (simplicidade de procedimentos e reagentes prontos), também mostrou-se mais eficiente no isolamento de DNA. (nm)

(nm)

(nm)

Figura 39. Quadro comparativo do desempenho entre o protocolo modificado de Nienhuis et al., (1995) e o kit de isolamento. As amostras foliares de Erythrina crista-galli foram analisadas nos comprimentos de onda a 230, 260 e 280nm.

78 A Figura 40 mostra quão significativas são as diferenças de desempenho entre os protocolos na análise comparativa. Entretanto, observa-se que o protocolo modificado não foi suficientemente útil no isolamento em qualidade do DNA, entretanto a quantidade mostrou-se suficientes para os trabalhos, para a maioria das amostras. Não procedeu-se a comparação da amostra 4.2 em função de não ter sido possível fazer a leitura no equipamento de quantificação.

Concentração de DNA genômico (ng/uL)

1500

1342,66

1200 941,43 900

731,46 581,84

600

520,14

290,57

300 57,76

24,84

3,03

8,3

0,83

62,94

0 1.5P 1.5 Kit 2.1P 2.1 Kit 3.3P 3.3 Kit 5.1P 5.1 Kit 6.1 P 6.2 Kit

XP

X Kit

Figura 40. Avaliação da quantidade específica de DNA (em ng/µL) extraída de amostras de folhas secas de Erythrina crista-galli por meio dos protocolos testados (em vermelho os resultados com o kit comercial PROMEGA ® e em azul os resultados do protocolo modificado de Nienhuis et al., (1995).

Pureza do material extraído pelos protocolos de Nienhuis et al. (1995) e Kit Wizard® Genomic DNA, PROMEGA® Foram utilizadas duas razões para a avaliação da qualidade do DNA extraído pelos protocolos testados em folhas secas (Tabela 8). A razão A260/A230 pode ser considerada uma medida da pureza das amostras. Para esta variável os valores esperados encontram-se na faixa de 1,6 1,9 (PAGE, 2010), sendo que um valor menor ou igual a 1,6 e maior que 1,9 indicará a presença de polissacarídeos.

79 Tabela 8. Comparação das frações 260/280 e 260/230 entre as extrações realizadas de amostras de folhas secas de Erythrina crista-galli com o protocolo modificado de Nienhuis et al. (1995) e Kit Wizard® Genomic DNA, PROMEGA®). Kit Wizard® Genomic DNA Nienhuis et al., (1995) Amostras A260/A280 A260/A230 A260/A280 A260/A230 1.5 1,24 0,46 1,64 0,94 2.1 1,30 0,87 1,32 0,69 3.3 1,50 0,55 4,25 0,59 5.1 1,38 0,52 1,83 0,73 6.1 1,51 0,47 -15,16 0,34 X 1,38 0,80 1,76 1,28 Média 1,39 0,61 1,64 0,76 Os valores assinalados foram excluídos do cálculo da média das razões por conter valores muito discrepantes.

A avaliação da fração A260/A230 demonstra que ambos os protocolos foram ineficientes em remover polissacarídeos das amostras, situando-se sempre os resultados abaixo do mínimo esperado como indicador de qualidade, entretanto, a média dos resultados das amostras teve melhor condição no protocolo modificado de Nienhuis et al. (1995). Para a razão A260/A280, o valor esperado deve situar-se entre 1,8 e 2,0 e valores inferiores ou superiores a estes limites indicam contaminação por proteínas (SCIENTIFIC, 2008a). Para esta razão, um único valor esteve dentro do ideal, que foi o valor da matriz 5.1 no protocolo modificado de Nienhuis et al. (1995), tendo sido também neste protocolo que a média mostrou melhores resultados para a razão A260/A280.

Análise da qualidade e concentração das soluções de DNA genômico obtidas de folhas frescas e câmbio, pelo método de Nienhuis et al., (1995), com modificações Da análise dos resultados do isolamento de DNA de câmbio de E. crista-galli verificou-se que a metodologia não é adequada para este tipo de material. Nenhuma das amostras apresentou, na quantificação, valores dentro dos mínimos para a realização de análises de diversidade genética. Para demostrar a ineficiência do protocolo elaborou-se um gráfico com a média dos valores extraídos pelas 11 amostras testadas: (1.5) (1.5) (2.1) (2.1) (3.3) (4.1) (4.2) (5.1) (5.2) (6.1) (6.1). O teste de isolamento de DNA genômico a partir do

80 câmbio foi realizado duas vezes (das quais resultam a soma de 11 amostras testadas): na primeira tentativa de isolamento os resultados foram insatisfatórios e, portanto, optou-se por repetir a extração introduzindo novas e mantendo-se algumas amostras já testadas a fim de certificar-se que erros no protocolo pudessem ter causado o resultado tão inferior do encontrado com folhas secas. Como todos os resultados apresentaram-se uniformemente aquém do esperado e a fim de facilitar a visualização deste resultado, optou-se por demostrar, por meio da média, os resultados do isolamento utilizando o câmbio vascular de E. crista-galli (Figura 41). 0,4

1 -1

-1

0,3

(Valor esperado em 260 nm: 12,2ng.µL )

(Valor esperado em 260 nm: 12,2ng.µL ) 0,8 0,6

0,2 0,4 0,1

0,2

0

0 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320

220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320

a

b

Figura 41. (a) Curva de absorvância da média de soluções de DNA obtidas de 11 amostras de câmbio de Erythrina crista-galli [(1.5) (1.5) (2.1) (2.1) (3.3) (4.1) (4.2) (5.1) (5.2) (6.1) (6.1)], utilizando o protocolo modificado de Nienhuis et al., (1995); (b) curva de absorvância da média de soluções de DNA obtidas de 08 amostras [(1.5) (1.5) (2.1) (2.1) (4.1) (5.1) (6.1) (6.1)], tendo como fonte de material folhas frescas de Erythrina cristagalli, mantidas congeladas, utilizando o mesmo protocolo. O isolamento de DNA genômico a partir de folhas frescas congeladas e conservadas em embalagem plástica contendo sílica gel igualmente não constituiu uma fonte promissora de material utilizando-se o protocolo modificado de Nienhuis et al. (1995), conforme se observa na Figura 41 (b).

Reação de PCR Das reações de PCR foram obtidos os seguintes produtos da amplificação utilizando-se iniciadores RAPD (Figura 42). A figura mostra os resultados obtidos sem a equalização da concentração de DNA entre as amostras. Os resultados das amostras equalizadas para a concentração de DNA não apresentaram bandas.

81 Todas as amostras utilizadas nos testes com iniciadores RAPD provinham de folhas secas pelo método de Nienhuis et al., (1995) e somente foi aproveitado o DNA extraído da amostra foliar (1.5), obtido por meio do Kit Wizard® Genomic DNA que continha adequada quantidade e qualidade dos materiais. Da análise dos produtos de amplificação (Figura 42) observa-se que a metodologia de isolamento do DNA genômico, utilizando-se neste teste marcadores RAPD, mostrou-se eficiente, entretanto a contaminação com polissacarídeos não permitiu outras análises, como a diversidade genética entre e dentro dos fragmentos estudados, o que requer otimização do protocolo bem como outras modificações metodológicas. Primers 14 (GGC ACT GAG G)

15 (GGT CGG AGA A)

16 (TCG GAC GTG A)

(5.3) (6.3) (X) (1.1) (1.4) (1.5) (1.9) (2.2) (2.3) (2.5) (3.1) (4.1) (4.5) (5.3) (6.3) (X) (1.1) (1.4) (1.5) (1.9) (2.2) (2.3) (2.5)

Figura 42. Produto de amplificação de RAPD gerados com oligonucleotídios testados em matrizes de Erythrina crista-galli L. de diferentes fragmentos em Bagé, Dom Pedrito, Hulha Negra e Aceguá, RS. Mostra-se na figura os resultados dos primers que apresentaram amplificação: continuação do primer 14 (3 matrizes), primer 15 (as 13 amostras testadas) e primer 16 (7 amostras). Foto: Rafael Matielo, UNIPAMPA, São Gabriel, RS.

CONCLUSÕES

A análise da qualidade e concentração das soluções de DNA genômico de folhas secas de Erythrina crista-galli, pelos método de Nienhuis et al.(1995) e por meio do Kit Wizard® Genomic DNA resultam em diferenças pronunciadas, dentro dos fragmentos e entre os dois protocolos.

Não é possível determinar em campo diferenças fenotípicas ou ambientais marcantes entre matrizes de Erythrina crista-galli que permitam explicar rapidamente as diferenças verificadas nas extrações.

A análise visual de folhas secas de Erythrina crista-galli utilizados no isolamento de DNA genômico não permite predizer a qualidade do DNA extraído, porém brotações jovens e secas podem constituir-se em fonte adequada de material.

Levando em conta a homogeneidade da composição dos fragmentos e o número de matrizes de Erythrina crista-galli não é possível estabelecer a relação dos fragmentos com a quantidade ou a qualidade do DNA genômico isolado de amostras.

Folhas secas de Erythrina crista-galli, mantidas em sacos de papel, à temperatura ambiente por até 170 dias após a coleta, constituem-se em material adequado como fonte para o isolamento de DNA.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Erythrina crista-galli L. é uma relevante espécie florestal, com importância na arborização urbana, ações paisagísticas e especialmente pelo seu potencial de uso em áreas de preservação permanente na recomposição de áreas naturalmente atingidas pela ação humana. A classificação de frutos e sementes e os resultados das avaliações de emergência são informações importantes na maximização dos esforços de coleta e produção de mudas da espécie. A técnica do corte com estilete no tegumento constitui-se num método eficiente de superação de dormência de sementes de Erythrina crista-galli, promovendo significativos índices de emergência com baixos riscos para a saúde do operador ou risco ambiental comparativamente ao uso de ácido sulfúrico, bem como é mais prático do que o uso de lixas de madeira. As sementes de Erythrina crista-galli provenientes de frutos verdes ou intermediários apresentam menor desempenho na emergência de plântulas em relação às sementes de frutos maduros, lenhosos e deiscentes e de frutos maduros semi-lenhosos e não-deiscentes. Entretanto configuram potenciais materiais para a produção de mudas se as matrizes disponíveis estão em áreas de maior ação de insetos causadores de danos. Estas sementes podem ser imediatamente utilizadas sem a necessidade de superação de dormência bem como merecem estudos no sentido de desenvolver protocolo de beneficiamento que lhes possibilite melhorar o desempenho no armazenamento, podendo gerar sementes vigososas e com reduzidas perdas por danos. O conhecimento da diversidade de insetos causadores de danos nas estruturas reprodutivas de Erythrina crista-galli, em especial as sementes, permitirá desenvolver estratégias de coleta baseadas em frutos verdes, principalmente no caso de coleta de sementes restrita a áreas sujeitas a potenciais elevados de danos causados por insetos. Insetos brocadores (Pityophthorus sp., Coleoptera: Fam. Curculionidae, subfamília Scolytinae) causam significativa incidência de danos em sementes de Erythrina crista-galli, contudo, dependendo do grau de ação do inseto e das estruturas afetadas, as sementes podem germinar. As sementes danificadas

84 produzem plântulas menos vigorosas e com menor porte e sementes atacadas por Lepdoptera, por outro lado, tornam-se completamente inviabilizadas. As possibilidades de manejo de sementes verdes podem incluir estratégias tanto de produção imediata de mudas com menores índices de danos, o que anteciparia o ciclo e maximizaria os esforços de produção de mudas, na conservação dos materiais coletados, tanto na forma de sementes estocadas quanto na conservação de embriões, utilizando a crioconservação e posteriormente a cultura destes embriões. Para a seleção de matrizes, entretanto, são necessários estudos sobre a contribuição da população (diversidade genética) para a qualidade fisiológica das sementes. Para tal, a utilização de folhas secas, mantidas em embalagens de papel à temperatura ambiente constitui eficiente fonte para o isolamento de DNA genômico. O isolamento do DNA genômico de Erythrina crista-galli com uso do protocolo de Nienhuis et al. (1995) mostra-se eficiente, entretanto há necessidade de novos estudos a fim de otimizar o protocolo para que eficientemente sejam removidos os polissacarídeos das amostras e, com isso, possam ser desencadeados estudos sobre a diversidade genética de diferentes fragmentos. Finalmente, um protocolo eficiente de isolamento do DNA genômico possibilitará a avaliação da diversidade genética de diferentes populações de Erythrina crista-galli e poderá fornecer importantes dados sobre a relação desta diversidade com a qualidade fisiológica das sementes.

6. Referências

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