Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)
Short communication Received: September 16, 2009 Accepted: October 1, 2009
Lat. Am. J. Pharm. 29 (3): 463-7 (2010)
Composição Química e Toxicidade de Óleos Essenciais de Espécies de Piper Frente a Larvas de Aedes aegypti L. (Diptera: Culicidae) José G.M. da COSTA 1*, Paula F. dos SANTOS 1, Samara A. BRITO 1, Fabíola F.G. RODRIGUES 1, Henrique D.M. COUTINHO 1, Marco A. BOTELHO 1 & Sidney G. de LIMA 2 1
Programa de Pós-Graduação em Bioprospecção Molecular, Departamento de Química Biológica, Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais, Universidade Regional do Cariri, Rua Cel. Antônio Luiz 1161, Pimenta, 63105-000 Crato-CE, Brasil. 2 Departamento de Química, Universidade Federal do Piauí, Campus Universitário Ministro Petrônio Portella, 64049-550, Bairro Ininga,Teresina-PI, Brasil.
RESUMO. Aedes aegypti L. é um dos vetores do dengue. No Brasil, tem ganhado muita atenção no setor da saúde pública, uma vez que esta doença tem se tornando mais agressiva na forma hemorrágica na população. Esse estudo teve como objetivo investigar o efeito de óleos essenciais de Piper aduncum, Piper marginatum e Piper nigrum contra larvas de Aedes aegypti. Em um esforço para encontrar uma maneira natural, eficaz e acessível para controlar esta doença endêmica, as atividades dos óleos essenciais, a partir das plantas, foram analisadas por comparação através da medida da CL50. Os óleos essenciais obtidos por hidrodestilação foram analisados por CG/EM. Os principais componentes identificados foram: β-pineno (32,7%) e E-cariofileno (17,1%) em P. aduncum; isoelemecina (21,7%) e apiol (20,1%) em P. marginatum e E-cariofileno (24,2%) e Óxido-cariofileno (20,1%) em P. nigrum. Os resultados mostram que Piper marginatum apresentou CL50 de 8,29 μg/mL e este trabalho é o primeiro relato de atividade larvicida de P. aduncum. Estes resultados sugerem que os óleos essenciais de espécies do gênero Piper são promissores como larvicidas contra larvas de A. aegypti. SUMMARY. “Chemical Composition and Toxicity of Essential Oils of Piper spp. Against Larvae of Aedes aegypti L. (Diptera: Culicidae)”. Aedes aegypti L. is one of the vectors of dengue fever. In Brazil it has gain much attention in the Public Health sector since this disease has becoming more aggressive in the hemorrhagic form in the population. This study aimed to investigate the effect of Piper aduncum, Piper marginatum and Piper nigrum essential oils against Aedes aegypti larvae. In an effort to find a natural effective and affordable way to control this endemic disease, the larvicidal activities of essential oils from the plants were analyzed for activity comparison by measurement of their LC50. The essential oils isolated by hydrodistillation were analyzed by GC/MS. The main components identified were: β-pinene (32.7%) and E-caryophyllene (17.1%) in P. aduncum; isoelemecin (21.7%) and apiole (20.1%) in P. marginatum and E-caryophyllene (24.2%) and caryophyllene oxide (20.1%) in P. nigrum. The results show that Piper marginatum presented the LC50 of 8.29 μg/mL and these are the first report about the larvicidal activity of P. aduncum. These results suggest that the essential oil of Piper species are promising as larvicide against A. aegypti larvae.
INTRODUÇÃO A dengue é considerada uma das infecções virais de maior preocupação mundial na saúde pública. A doença apresenta grande incidência nos países tropicais e subtropicais, estimando-se que cerca de 1,3 bilhões de pessoas estejam em risco de serem infectadas com o vírus 1, e que anualmente são registrados 50-100 milhões de casos de dengue clássica e cerca de 500 mil internações por febre hemorrágica, chegando a uma mortalidade de 5% nestes casos 2.
A doença, que é transmitida pelo mosquito Aedes aegypti, configura-se como um problema de saúde pública, tendo como fatores fundamentais que definem o padrão de transmissão: o crescimento populacional, migrações, viagens aéreas, urbanização inadequada, mal funcionamento dos sistemas de saúde e densidade populacional humana 2-4. Para o controle de larvas de Aedes aegypti, o principal larvicida utilizado no país é o organosfosforado Temefós. Entretanto, a resistência a
PALAVRAS CHAVE: Atividade biológica, CG/EM, Dengue, Piperaceae. KEY WORDS: Biological activity, Dengue fever, GC/MS, Piperaceae. *
Autor a quem correspondência deve ser enviada: E-mail:
[email protected]
ISSN 0326-2383
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COSTA J.G.M., dos SANTOS P.F., BRITO S.A., RODRIGUES F.G.G., COUTINHO H.D.M., BOTELHO M.A. & LIMA S.G. de
este produto já foi detectada em diversos países e regiões do Brasil 5. Devido a isso, é necessário o desenvolvimento de novas estratégias para o controle larval do mosquito de forma a impedir a resistência cruzada aos inseticidas atuais. Neste aspecto, a avaliação de produtos naturais coma atividade contra as larvas de Aedes aegypti têm sido muito importante 6. As plantas do gênero Piper (Piperaceae), incluindo mais de 1000 espécies distribuídos pantropicalmente, são popularmente conhecidas como pimenteiras ou falsos-jaborandis 7. Este gênero destaca-se pela produção de óleos essenciais, constituindo importante fonte de matériaprima para diferentes segmentos da indústria química, nas atividades de cosméticos e perfumaria, por exemplo. O óleo essencial in natura pode ainda apresentar propriedades citotóxica e inseticida, ampliando seu potencial biotecnológico 7,8. A espécie Piper aduncum, é conhecida por suas propriedades adstringente, antiofídica e diurética 9. P. marginatum é um arbusto com cerca de 1,5 m de altura, muito comum nas bordas das matas de vários biomas do Nordeste. É conhecida popularmente por pimenta do mato ou capeba cheirosa é usada na medicina popular para aliviar dores estomacais, como diurético e carminativo 10. Piper nigrum é a pimenta-doreino, espécie mais difundida no mundo representando importante atividade comercial e destaque no cenário econômico 11. Este trabalho relata a extração de óleos essenciais, suas composições químicas e a verificação do potencial larvicida frente à Aedes aegypti das espécies Piper aduncum, P. marginatum e P. nigrum. MATERIAL E MÉTODOS Espécies Vegetais Frutos de Piper anduncum, folhas de P. marginatum e sementes de P. nigrum, foram coletados no Parque de Exposições Pedro Felício Cavalcante, Crato-CE; no campus da Universidade Federal da Paraíba, em João Pessoa-PB ou adquiridos no mercado central do município do Crato-CE, respectivamente, entre os meses de agosto e setembro de 2007. Extração e Análise dos Óleos Essenciais As massas utilizadas na obtenção dos óleos foram respectivamente: 202 g de sementes secas (P. nigrum), 1.200 g de frutos frescos (P. aduncum) e 106 g folhas secas (P. marginatum), as quais foram submetidas a processos de hidro-
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destilação em equipamento tipo Clevenger. Em seguida as misturas óleo/água foram coletadas, secas com sulfato de sódio anidro (Na2SO4), filtradas e armazenadas sob refrigeração até as análises. As análises das composições químicas foram realizadas usando um espectrômetro Shimadzu CG-17A / EM QP5050A (sistema de CG/EM): DB-5HT coluna de capilaridade (30 m x 0,251 mm); gás de portador: hélio 1,7 mL/min; pressão da coluna 107,8 kPa; velocidade linear = 47,3 cm/seg; fluxo total 24 mL/min; fluxo de portador 24 mL/min; temperatura do injetor 270 °C; temperatura de detector 290 °C; temperatura da coluna 60 (2 min) - 180 °C (1 min) a 4 ºC/min, então 180 - 260 °C a 10 °C/min (10 min). Operando sob energia de ionização de 70 eV. A identificação dos componentes foi baseada na fragmentação espectral, usando padrões da biblioteca de computador Wiley 229, além de dois outros argumentos: os índices de retenção e comparação com dados de literatura 12,13. Ensaios de Toxicidade As larvas de Aedes aegypti foram fornecidas pela Fundação Nacional de Saúde do município de Crato-CE. Os bioensaios foram desenvolvidos em triplicata e em diferentes concentrações para diferentes espécies: P. aduncum (1.000; 500; 250; 100; 50; 25 µg/mL), P. marginatum (1.000; 500; 250; 125; 62,5; 31,2; 15,6; 7,8; 3,9 µg/mL) e P. nigrum (1.000; 500; 250; 125; 62,5 µg/mL), utilizando larvas dos mosquitos A. aegypti no terceiro estádio nas quais foram testados 30 larvas por cada análise14. Os óleos essenciais foram diluídos em água destilada utilizando Tween 80 (0,1%). Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur, as larvas foram separadas, colocadas em papel filtro para remoção do excesso de água e em seguida distribuídas, em número de dez, para cada uma das concentrações 15. Após 24 h de exposição nas diferentes concentrações o número de larvas mortas foi avaliado e a CL50 foi calculada usando-se o método de regressão linear. O ensaio foi acompanhado com controle positivo (Temefós, testado nas concentrações 1, 0.5 e 0.1 µg/mL) e negativo (água destilada e Tween 80 a 0,1%) 15. RESULTADOS E DISCUSSÃO Neste trabalho foram selecionadas as partes da planta que tiveram maior rendimento de óleo essencial, visto que os mesmos seriam utilizados para realização de testes. O rendimento de óleo
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essencial de P. aduncum foi de 0,12%. A análise por CG/EM permitiu a identificação de 22 constituintes químicos representando 91,3% do óleo essencial, sendo 13 monoterpenos e 9 sesquiterpenos. Foi possível identificar ainda que dos monoterpenos, 4 são oxigenados (1,8-cineol, linalol, terpinen-4-ol e α-terpineol), enquanto que dos sesquiterpenos apenas 2 (α-cadinol e T-cadinol). Os constituintes presentes em maior concentração no óleo essencial de P. aduncum foram β-pineno (32,7%), E-cariofileno (17,%), santolitrieno (6,0%) e limoneno (5,9%). A composição deste óleo essencial está mostrada na Tabela 1. A destilação das sementes de P. nigrum forneceu 1,8% de óleo essencial. Foram identificados 97,3% da sua constituição química, correspondendo a 17 compostos (Tabela 1). Deste total estão relatados: 42,5% de monoterpenos nãooxigenados; 3,2% de monoterpenos oxigenados; 31,5% de sesquiterpenos não-oxigenados e 20,1% de sesquiterpenos oxigenados. Neste óleo volátil foram encontrados em maior quantidade o E-cariofileno (24,2%), óxido de cariofileno (20,1%), sabineno (19,9 %) e limoneno (13,0%). O rendimento do óleo extraído das folhas de P. marginatum foi de 0,8%. Foram identificados 91,4% da sua constituição química, permitindo a identificação de 22 componentes, sendo apenas 2 da classe dos monoterpenos. Os constituintes majoritários são: iso-elemicina (21,7%), apiol (20,1 %), δ-guaieno (16,7%) e E-cariofileno (6,8 %), conforme mostrado na Tabela 1. A avaliação da composição do óleo essencial de P. aduncum mostra-se quantitativamente diferenciada quando comparada com o espécime coletada na Reserva da Ripasa, Ibaté – SP, por Navickiene et al. 16, que indicaram como componentes majoritários: linalol (41,0%), γ-terpineno (12,0%) e trans-ocimeno (11,1%), como pode ser observado na Tabela 1. Foi identificado e isolado do óleo essencial das folhas de Piper aduncum o dillapiol, com 95% de pureza. Esse fenilpropenóide ao ser testado contra larvas do Aedes aegypti mostrou-se potencialmente ativo 17. Óleos essenciais de quatro espécies de Piper (P. gaudichaudianum, P. humaytanum, P. permucronatum e P. hostmanianum) da Floresta Amazônica foram testados contra larvas do mosquito Aedes aegypti 18. A identificação da composição química desses óleos, quando comparada com os óleos analisados neste trabalho, mostra que apenas as substâncias majoritárias β-selineno, identificada em P. gaudichaudianum e P.
P. P. P. aduncum marginatum nigrum
Componentes
Santolitrieno Canfeno Sabineno β-pineno Mirceno α-felandreno δ-3-careno α-terpineno p-cimeno 1,8-cineol Limoneno β-ocimeno γ-terpineno Terpinoleno Linalol Terpine-4-ol α-terpineol δ-elemeno α-copaeno β-elemeno E-cariofileno α-humuleno Diidroaromadendro Biciclogermancreno β-selineno α-selineno Valeneno β-bisaboleno δ-guaieno Viridifloreno Germancreno A δ-cadineno α-cadineno Germancreno-D Óxido cariofileno Espatulenol Viridifloral α-cadinol Isoelemicina Eudesmol γ-cadinol Apiol cis-farnesol trans-farnesol Total de constituintes identificados
IK*
(%)
(%)
(%)
959 966 969 980 990 998 1008 1011 1020 1023 1024 1038 1046 1072 1093 1170 1178 1337 1375 1389 1418 1458 1461 1476 1481 1488 1496 1502 1504 1506 1510 1531 1533 1534 1577 1585 1593 1638 1654 1658 1667 1681 1706 1716
6,0 0,5 32,7 2,4 0,3 4,2 5,9 1,2 0,5 0,4 1,0 1,1 2,1 3,5 1,4 17,1 1,8 3,0 2,0 2,9 0,5 0,6 -
1,7 0,7 1,6 2,0 0,6 6,8 2,3 0,9 6,8 16,7 1,0 0,4 0,2 0,3 1,7 1,1 0,4 21,7 0,4 20,1 2,1 1,9
19,9 5,4 0,4 0,9 2,9 13,0 0,4 2,8 1,1 0,8 0,9 24,2 1,7 1,8 0,5 0,5 20,1 -
91,3
91,4
97,3
Tabela 1. Constituintes Químicos (%) identificados
nos óleos essenciais das espécies P. aduncum, P. marginatum e P. nigrum. *IK = índice kovats experimental. Alcanos foram utilizados como pontos de referencias no cálculo de índices Kovats relativos.
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COSTA J.G.M., dos SANTOS P.F., BRITO S.A., RODRIGUES F.G.G., COUTINHO H.D.M., BOTELHO M.A. & LIMA S.G. de
Espécies
CL50 (µg/mL) (IC 95%)
Cont. (-)
Cont. (+)
P. marginatum
P. aduncum
P. nigrum
Água/ Tween 80
Temefós
8,3 (6,4- 9,8)
30,2 (25,2-33,6)
75,8 (64,7-79,1)
ND
0,31 (0,1-0,4)
Tabela 2. Resultado dos ensaios larvicida dos óleos de Piper frente a larvas de Aedes aegypti. ND = Não detectá-
vel.
humaytanum, e o óxido de cariofileno, presente no P. humaytanum, também foram identificadas no P. nigrum e no P. marginatum, respectivamente. Observa-se ainda que os valores de CL50 para os óleos das espécies da Amazônia apresentaram atividade larvicida inferior as observadas nos óleos testados neste artigo. Enquanto a CL50 para o P. marginatum foi de 8,29 µg/mL, o P. permucronatum apresentou um menor valor para a CL50 de 36 µg/mL (Tabela 2). Todos os óleos testados apresentaram atividade larvicida contra Aedes aegypti, entretanto foi observado que as CL50 foram superiores à concentração diagnóstica para o Temefós calculada para as populações de Aedes aegypti na região sul do estado do Ceará (> 0,120 µg/mL) 5. O óleo com maior atividade larvicida foi o de P. marginatum apresentando CL50 de 8,29 µg/mL, seguido por P. aduncum com CL50 de 30,19 µg/mL. O óleo de P. nigrum quando comparado com a concentração de referência mostrou resultado considerável de 75,85 µg/mL. Este é o primeiro trabalho demonstrando o potencial larvicida de P. aduncum. Simas et al. 6, ao avaliarem a atividade do extrato etanólico de P. nigrum, obtiveram nos ensaios valores de CL50 de 0,098 µg/mL, muito inferiores aos observados no trabalho de Morais et al. 18 e neste trabalho. Isto aparentemente se deve ao fato de que extratos etanólicos são mais
facilmente miscíveis com água. Entretanto, esta mistura complexa precisa ser avaliada quanto à toxicidade contra organismos não – alvo antes de qualquer aplicação prática. Os óleos essenciais apresentam como componentes majoritários terpenos, substâncias que na literatura já apresentam dados interessantes sobre a sua atividade larvicida com pouco impacto na saúde humana, animal e no ambiente19,20, o que favorecer a sua aplicação em estudos de campo. CONCLUSÃO A composição química do óleo de P. aduncum prevalece a presença de monoterpenos, enquanto nas espécies P. marginatum e P. nigrum a presença de sesquiterpenos representa maioria dos constituintes. As três espécies testadas no ensaio contra larvas do mosquito da dengue se mostraram ativas. Entretanto para a espécie P. marginatum foi atribuído o maior efeito larvicida. Estes resultados encorajam tanto a pesquisa de novos produtos naturais com atividade contra larvas de Aedes aegypti quanto à investigação sobre toxicidade e quais os mecanismos de ação envolvidos para o controle larval do mosquito. Agradecimentos. Os autores agradecem o apoio financeiro dos órgãos financiadores CNPq e FUNCAP, e à Fundação Nacional de Saúde pela concessão das larvas de Aedes aegypti.
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