Comunicação inter-celular durante a esporulação em Bacillus subtilis

Microbiologia Molecular

Comunicação inter-celular durante a esporulação em Bacillus subtilis

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Mónica Serrano, Rita Fior, Alexandre Neves, Adriano O. Henriques Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa. Avenida da República, Apartado 127, 2781-901, Oeiras Codex, Portugal. O ciclo celular vegetativo de Bacillus subtilis, um bastonete gram positivo caracteriza-se por uma divisão celular mediana, que origina duas células de dimensões equivalentes (Fig.1), seguida de um período de alongamento celular e nova divisão (Henriques et al., 1998). Em resposta a situações de carência nutricional extrema, B. subtilis inicia um processo de diferenciação celular que resulta na formação de um tipo celular de repouso, o endósporo (os sinais que controlam o início do processo de desenvolvimento, e os mecanismos moleculares da sua transdução foram revistos neste boletim por Real e Henriques, 2001). No início do processo, o cromossoma é replicado e organizado numa estrutura alongada conhecida como filamento axial, na qual as origens de replicação se localizam perto dos polos celulares (Errington, 2001). Enquanto que as células vegetativas são ditas no estágio 0 (Fig. 1, painel A), a formação do filamento axial caracteriza o estágio I da esporulação (este estágio não se encontra representado na figura 1). De seguida, o esporângio sofre uma divisão celular modificada, altamente assimétrica, que cria um pré-esporo polar, e uma célula-mãe de maiores dimensões (estágio morfológico II; Fig. 1, painel B). A divisão assimétrica no início da esporulação utiliza todos os produtos génicos que participam da divisão celular vegetativa mas ao contrário desta, o septo assimétrico bissecta o cromossoma destinado ao pré-esporo, onde ficam retidos cerca de 30% do DNA (revisto por Errington, 2001).

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Os restantes 70% da massa cromosomal são posteriormente translocados para o pré-esporo por uma translocase do DNA localizada na região central do septo de divisão (ver abaixo; Errington, 2001). Em estágios intermédios do desenvolvimento, o pré-esporo é envolvido pela célula-mãe (Fig. 1, painéis C a D), formando um protoplasto separado do citoplasma circundante por um duplo sistema membranar, com origem nas membranas do septo de divisão (estágio III; Fig.1, painel D). Neste estágio do desenvolvimento o pré-esporo deixa de estar em contacto com o meio circundante, e pode ser descrito como uma célula dentro de outra célula. Em estágios mais avançados (estágios IV-VI), ocorre a síntese das diferentes estruturas protectivas que rodeiam o endósporo e a sua maturação final (a Fig. 1, painel E, representa uma célula no estágio V). A mais interna, ou parede celular germinativa (PCG), é da responsabilidade exclusiva do programa genético do pré-esporo. Após a germinação do esporo, a PGC torna-se no molde para a síntese da parede celular da nova célula vegetativa. A PCG é envolvida por uma espessa camada de peptidoglicano modificado, denominada córtex, que é essencial para a aquisição e para a manutenção das propriedades de resistência térmica do esporo (ver a legenda da figura 1). A síntese do córtex é da responsabilidade conjunta do préesporo e da célula-mãe (Henriques e Moran, 2000). Por último, o córtex é protegido da acção da lisozima por uma dupla camada proteica

conhecida por manto (Fig. 1, painéis E e F), que também confere protecção contra agentes químicos e permite a interacção com os compostos capazes de desencadear o processo de germinação (Henriques e Moran, 2000). Com uma única excepção, as proteínas do manto são sintetizadas na célula-mãe e montadas ordenadamente em redor do esporo em desenvolvimento (Henriques e Moran, 2000; Serrano et al., 1999). No final do processo de diferenciação a célula-mãe, que representa uma linhagem celular terminal lisa, desse modo libertando o endósporo no meio circundante (Fig. 1, painel F). Este último, que representa uma linhagem celular germinativa, é um tipo celular de repouso, caracterizado pelas suas propriedades de resistência a insultos físico-químicos variados que rapidamente causariam a destruição das células vegetativas correspondentes (Stragier e Losick, 1996; Henriques e Moran, 2000). Apesar de a estrutura do endósporo ser concebida para resistir a condições ambientais adversas por longos períodos de tempo, este tem a propriedade de monitorizar e de responder a alterações favoráveis do ambiente germinando em minutos para originar novas células capazes de crescimento vegetativo (Henriques e Moran, 2000; Fig. 1). A célula-mãe e o pré-esporo exibem programas diferenciados de expressão génica, orquestrados pela activação sequencial de quatro novas subunidades sigma da polimerase do RNA, na ordem σF, σE , σG e σK (Stragier e Losick, 1996) (Fig.1). A activação sequencial destes reguladores transcricionais confere à holoenzima a capacidade para reconhecer diferentes classes de promotores. Isto acontece porque os diferentes factores sigma reconhecem sequências específicas centradas em torno das regiões –10 e –35

Microbiologia Molecular (relativamente ao início de transcrição), dos seus promotores alvo (Haldenwang, 1995). Os factores σF e σG são activos exclusivamente no pré-esporo: σF governa os acontecimentos anteriores ao envolvimento do pré-esporo pela célula-mãe (estágio III), sendo substituído por σG logo após a conclusão do processo de envolvimento (Fig. 1, painel D). De um modo correspondente, as fases iniciais do desenvolvimento na célula-mãe são orquestradas pelo factor σE , que é substituído pelo factor σK no esporângio pós-estágio III (Fig. 1, painel E). Este mecanismo de alteração da específicidade transcricional da polimerase do RNA é um elemento fundamental na regulação da expressão génica durante a esporulação, e comum em muitos microrganismos que exibem

complexos programas de diferenciação morfológica (Haldenwang, 1995; Stragier e Losick, 1996; Henriques e Moran, 2000).

consonância com o decurso da morfogénese celular (ver as secções seguintes).

A activação de cada um dos diferentes factores sigma é estritamente regulada em resposta a sinais morfológicos que assinalam a conclusão das sucessivas etapas da diferenciação. Além disso, a activação de um sigma particular depende sempre da actividade do factor precedente na cascata, e consequentemente de vias de sinalização que emanam do compartimento celular oposto (Stragier e Losick, 1996). Estes mecanismos regulatórios definem checkpoints, em consequência dos quais os programas de expressão genética do pré-esporo e da célulamãe são mantidos em registo, e em

Controlo temporal e compartimentação da expressão génica: uma análise ao nível do genoma.

Fig. 1

Ciclo Vegetativo A. Estágio 0

σA/σσHH

Germinação F. Endósporo livre

B. Estágio IIi

σF

Esporulação

C. Estágio IIii

E. Estágio V

D. Estágio III-IV

σσEE

σF

σσE

σG

σK

σG

Figura 1. A figura ilustra de uma forma resumida o ciclo vegetativo de Bacillus subtilis, em particular a fase de divisão celular mediana que resulta em duas células de dimensões equivalentes. A parte de baixo da figura ilustra as principais etapas morfológicas da esporulação (ver o texto). Os principais factores sigma activos em células vegetativas são σA e σH. A especificidade transcricional destes reguladores é alterada pelo estado fosforilado do regulador Spo0A que comanda a entrada na via da esporulação (Real e Henriques, 2001). A esporulação é largamente controlada a nível transcricional por uma cascata de factores sigma na ordem σF, σE, σG, e σK. Os factores σF e σE são sintetizados na forma de precursores inactivos no esporângio antes da divisão assimétrica que caracteriza o início da esporulação, sendo posteriormente activados especificamente no pré-esporo e na célula-mãe, respectivamente. Estes são substituídos em fases mais avançadas do desenvolvimento (após o envolvimento do pré-esporo pela célulamãe, ou Estágio III; painel D), pelos factores σG e σK, respectivamente. As principais estruturas protectivas do esporo começam a ser aparentes a partir do Estágio V (painel E). São estas o peptidoglicano do córtex (seta azul), e o manto proteico (seta vermelha). Estas estruturas são mais evidentes no painel F, que representa o endósporo livre, após lise da célula-mãe. As setas amarelas indicam a posição das membranas que rodeiam o pré-esporo. A barra (no painel C) representa 0.5 µm. Todos os painéis estão à escala, excepto o painel F, por razões de clareza (a barra representa 0.2 µm).

O controlo temporal da expressão génica durante a esporulação fica bem ilustrado mediante a análise do padrão de expressão de fusões de promotores específicos ao gene repórter lacZ. A esporulação pode ser induzida mediante a exaustão de nutrientes num meio de crescimento apropriado. Nestas condições, o início da esporulação (tempo 0) coincide com o início da fase estacionária (Fig. 2, painel A), e a formação de esporos é completada numa fracção considerável da cultura cerca de 8 a 10 horas mais tarde. A figura 2 (painel A) ilustra o padrão de expressão de fusões transcricionais de genes representantes dos regulões σF, σE , σG e σK ao gene lacZ, sendo bem evidente que estes definem classes temporais distintas de expressão génica. A transcrição do gene spoIIIG codificante para σG representa um caso especial. Apesar do promotor do gene spoIIIG ser reconhecido pela polimerase associada ao factor σF, a transcrição do gene spoIIIG é atrasada cerca de uma hora relativamente a outros membros do regulão σF (ver a secção sobre a regulção do factor σG ). O painel B da figura 2 ilustra o padrão de expressão dos 4107 genes codificantes para proteínas do genoma de B. subtilis, ao longo da esporulação, utilizando macroarrays de DNA (Steil et al., 2001). A figura revela que a expressão da maior parte dos genes de B. subtilis é fortemente reprimida quando as células entram em esporulação, e que durante o processo ocorre a indução de um número considerável de genes a tempos específicos. O controlo temporal da expressão destes genes é imposto pela cascata de factores

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Microbiologia Molecular spoIIIG transcription

σF σE σG σK

80 60 40 20 0 -2

0

2

4

6

8

0.1 10

Time (h) before and after T0

7

1

OD (600nm)

β-Galactosidase activity (% Maximum)

100

B Relative intensity

A

6 5 4 3 2 1 0 0 30

90

150

210

270

330

Time (min) after T 0

Figura 2. O painel A da figura ilustra a curva de crecimento de uma estirpe selvagem de B. subtilis e a produção da enzima β-galactosidase ao longo da esporulação por estirpes contendo fusões transcricionais de diferentes promotores activos durante o desenvolvimento ao gene reporter lacZ. A curva de crescimento de uma estirpe selvagem de B. subtilis é representada a cinzento. T0, ou o início da fase estacionária é definido como o ínicio da esporulação. A curva a laranja representa o perfil de acumulação da enzima β-galactosidase sintetizada a partir de um promotor dependente de σF. A azul o perfil de actividade da β -galactosidase obtido a partir de um promotor dependente de σE; a verde o perfil obtido a partir do promotor spoIIIG; a vermelho o perfil de actividade da β-galactosidase resultante de um promotor dependente de σG. Finalmente a azul o perfil de actividade da enzima quando a sua síntese é dirigida por um promotor dependente de σK. O painel B da figura representa o perfil de expressão de todos (4107) os genes codificantes para proteínas de B. subtilis, durante a esporulação. O gráfico resulta da combinação de várias experiências utilizando RNA colhido a tempos diferentes durante a esporulação para obter um cDNA marcado com vista à hibridação de um macroarray contendo todos os genes de B. subtilis. A análise do perfil temporal de genes individuais, em conjunto com a análise do perfil de expressão obtido para mutantes nos diferentes factores sigma, análise de promotores e estudos de localização da expressão de genes escolhidos (por imunofluorescência ou com recuro a fusões GFP), permitiu alargar significativamente o número de genes de esporulação em cada um dos regulões sigma (ver texto).

sigma (Fig. 2A). O estudo do perfil temporal de expressão à escala genómica utilizando macroarrays bem como a extensão destes estudos a mutantes deficientes na produção dos 4 factores sigma específicos da esporulação permitiu alargar consideravelmente o número de genes conhecidos envolvidos no processo da esporulação. A análise genética do processo nos últimos 30 anos levou à identificação de 152 genes, assim distribuídos: 19 no regulão σF , 58 no regulão σE , 34 no regulão σG e 49 no regulão σK (revisto por Piggot e Coote, 1976; Stragier e Losick, 1996). Os estudos com macroarrays em conjunto com a análise das sequências promotoras nos genes assim identificados (resultados não apresentados), permitiram elevar esse número para 308 genes, dos quais 39 no regulão σF, 121 σE -dependentes, 50 sob a direcção do factor σG , e 106 controlados por σK (Fawcett et al., 2000; Steil et al., 2001). A validação destes resultados implicou ainda a determinação do compartimento de expressão de genes escolhidos ao acaso por meio de imunofluorescência ou com recurso a fusões à proteina fluorescente verde (GFP). Se um determinado gene é incluído no regulão σF , então a sua expressão

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deve ser confinada ao pré-esporo, enquanto que a expressão de um gene supostamente pertencente ao regulão σE deve ser restringida à célula-mãe (ver a Fig. 3). A análise funcional destes novos genes de esporulação deverá contribuir para a elucidação de alguns dos circuitos regulatórios e processos morfogenéticos descritos nas secções seguintes.

O início do programa genético do pré-esporo: a activação do regulador σ F. O factor sigma σF é codificado juntamente com as suas proteínas regulatórias, SpoIIAA e SpoIIAB, pelo operão tricistrónico, spoIIA. Este operão é transcrito na célula prédivisional sob o controlo conjunto do factor σH e do regulador auxiliar Spo0A~P, que controla a entrada na esporulação (revisto por Real e Henriques, 2001). Consequentemente, após a divisão assimétrica do esporângio, as proteínas σF, SpoIIAA, e SpoIIAB distribuem-se entre a célula mãe e o pré-esporo (Fig. 4). Quando produzido, σF é mantido num complexo inactivo pelo anti-factor sigma SpoIIAB (Alper et al., 1994; Duncan e Losick, 1993;

Min et al., 1993). SpoIIAB é também uma cinase que fosforila o anti-antifactor sigma SpoIIAA num resíduo de serina, mantendo-o assim numa forma inactiva (Alper et al., 1994; Diederich et al., 1994; Magnin et al., A. Pré-esporo

σF

B. Célula-mãe

σE

Figura 3. A figura ilustra a expressão génica compartimentada durante a esporulação, utilizando iodeto de propídeo para marcar os ácidos nucleicos nos dois compartimentos esporangiais (vermelho), e um anticorpo conjugado à fluoresceína (verde) para revelar o compartimento de acumulação de uma proteína cuja síntese depende de um promotor σF (painel A), ou σE (painel B). A primeira acumula no préesporo, enquanto que a segunda acumula na célula-mãe. A seta indica a região de separação entre o pré-esporo e a célulamãe. A sobreposição das cores verde e vermelha tende a originar uma coloração amarela, dependendo do grau de acumulação da proteína em questão.

Microbiologia Molecular 1997; Min et al., 1993; Najafi et al., 1995). Após a divisão assimétrica, σF permanece inactivo na célula mãe, mas liberta-se de SpoIIAB no préesporo (Fig. 4B). A causa da activação é a presença no pré-esporo de SpoIIE, uma fosfatase (ver abaixo), que desfosforila SpoIIAA permitindo a sua ligação a SpoIIAB e libertando σF .A associação de σF ao núcleo (E) da polimerase do RNA resulta na transcrição do regulão σF pela holoenzima EσF. SpoIIAB contém um motivo de ligação a nucleótidos de adenosina, o qual pode influenciar a sua afinidade relativa para o ATP ou o ADP. O ATP estimula a formação do complexo SpoIIAB.σF , enquanto que o ADP estimula a ligação de SpoIIAB a SpoIIAA (Alper et al., 1994: Min et al., 1993). SpoIIAB forma um complexo com σF estabelecendo contactos com três regiões do factor sigma (Decatur et al., 1996). A proteína SpoIIAB é também uma cinase capaz de fosforilar SpoIIAA no resíduo de serina 58 (Najafi et al., 1995). A forma fosforilada da proteína SpoIIAA não tem capacidade de ligação ao factor anti-sigma SpoIIAB ficando este livre para se associar com o factor σF. Consequentemente, SpoIIAA é o inibidor de SpoIIAB mantendo-o num complexo inactivo (Duncan et al., 1996), ao mesmo tempo que SpoIIAB tem a capacidade de inibir SpoIIAA fosforilando-o. SpoIIAB forma um complexo 2:1 com o factor σF; interessantemente, existe sobreposição entre as regiões de SpoIIAB que contactam SpoIIAA ou σF (Campbell e Darst, 2000; Garsin et al., 1998). A terceira proteína com um papel fundamental na activação de σF é SpoIIE (Fig. 4). O gene spoIIE é também expresso na célula prédivisional e codifica para uma fosfatase de serina que associa com o septo e é responsável pela desfosforilação e consequente activação de SpoIIAA (Duncan et al., 1995; Arigoni et al., 1995; Arigoni et

al., 1996; Fig. 4). SpoIIE é uma proteína constituída por três domínios (Arigoni et al., 1995; Barak et al., 1996; Feucht et al., 1996). O domínio N-terminal contém 10 segmentos transmembranares e parece ser o responsável pela localização da fosfatase na membrana do septo de divisão assimétrica. O segundo domínio engloba a região central não conservada e de função desconhecida. O domínio C-terminal é citoplasmático e apresenta actividade fosfatásica (Arigoni et al., 1995; Barak et al., 1996; Feucht et al., 1996). A interacção de SpoIIAA com SpoIIAB leva à fosforilação da primeira e à dissociação do complexo, mas esta reacção é relativamente lenta quando comparada com a reacção de desforilação de SpoIIAA-P por SpoIIE (Magnin et al., 1997). Assim, no equilíbrio é favorecida a acumulação da forma não fosforilada de SpoIIAA, e aumentada a fracção de SpoIIAB complexada com SpoIIAA, permitindo a interacção de σF com a polimerase de RNA (Magnin et al., 1997; Fig. 4B). Segundo este modelo SpoIIAB é o responsável pela manutenção de σF no estado inactivo na célula pré-divisional e na célula mãe (Fig. 4). Resultados recentes indicam que SpoIIAB é uma proteína instável, sujeita na forma livre a

A. Célula pré-divisional AB. σF

pro- σE

AA~P

SpoIIGA

SpoIIE

proteólise, mediada pela protease ClpCP (Pan et al., 2001); a formação do complexo SpoIIAB.σF ou SpoIIAB.SpoIIAA protége SpoIIAB da prteólise. A selecção imposta por ClpCP para a presença de SpoIIAB num complexo, em conjunto com a acção da fosfatase (que favorece a formação do complexo SpoIIAA.SpoIIAB) no pré-esporo parece reforçar a activação do factor σF neste compartimento (Pan et al., 2001). Embora haja presentemente várias interpretações sobre o possível modo de acção de SpoIIE , a mais consistente parece ser a que decorre de estudos de localização de uma proteína de fusão SpoIIE-GFP. Nestes estudos SpoIIE localiza em estruturas de tipo anel nos dois locais potenciais de formação do septo assimétrico, perto dos polos da célula, e de um modo dependente da localização da proteína de divisão celular FtsZ (Levin et al., 1997). Após a formação do septo assimétrico a proteína é sequestrada do lado do pré-esporo, o que favorece a activação de σF neste compartimento (Lewis et al., 1998; Wu et al., 1997). Posteriormente ocorre o seu desaparecimento no polo correspondente à célula mãe, onde a formação de um segundo septo polar é inibida assim que σE (e o programa

B. Estágio IIi AB. σF

IIE

AA~P

IIGA

AA.AB σF

pro- σE σE

IIR

Figura 4. Estágio 0 a II da esporulação. As figuras 2A e 2B representam a transição do estágio 0 (célula vegetativas, A) para o estágio II da esporulação (B), caracterizado pela formação do septo de divisão polar. A formação do septo define o estágio Iii, enquanto que as demais fases do envolvimento do pré-esporo pela célula-mãe são designados Iii, e Iiii (não representados). São indicados os principais reguladores do processo, bem como os compartimentos celulares em que são activos. Os circulos na figura 4B representam proteínas membranares: a azul a fosfatase SpoIIE, a verde a protease SpoIIGA. A activação da fosfatase no pré-esporo permite a desfosforilação do anti-anti-sigma SpoIIAA, que assim liga preferencialmente ao anti-sigma SpoIIAB, libertando σF. A associação de σF com a polimerase permite a transcrição do gene spoIIR, cujo produto activa a protease membranar SpoIIGA do lado da célula-mãe, e consequente activação por proteólise do factor σE neste compartimento (ver o texto para mais pormenores). SpoIIAB permace ligado a σF na célula-mãe e na célula pré-divisional, evitando a actividade ectópica do factor σF. Note que nesta e nas figuras seguintes, as duas membranas que envolvem o pré-esporo, e que resultam da invaginação da membrana plasmática aquando da formação do septo de divisão, são representadas por um único traço.

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Microbiologia Molecular de expressão génica da célula-mãe) é activado (ver também abaixo). A associação da fosfatase SpoIIE com os locais potenciais de divisão é apoiada pela demonstração recente de uma interacção entre SpoIIE e a proteína FtsZ (Lucet et al., 2000). FtsZ é uma proteína com actividade GTPase, cuja polimerização numa estrutura em forma de anel no local de divisão celular é essencial para a formação do septo. Esta estrutura de FtsZ é responsável pelo recrutamento de outras proteínas essenciais à divisão celular (revisto por Errington, 2001). No caso de SpoIIE, FtsZ é essencial para a sua localização, sendo também necessário para uma normal actividade fosfatásica (Lucet et al., 2000). Adicionalmente, no mutante nulo SpoIIE, a formação do anel de FtsZ é deficiente, sugerindo que SpoIIE contribui para a mudança de um modo de divisão simétrica para um modo polar de divisão, que caracteriza o inicio da esporulação. SpoIIE parece ainda desempenhar um papel desconhecido na formação do septo, já que certos mutantes spoIIE possuem septos aberrantes (Feucht et al., 1996; Barák e Youngman, 1996). As concentração da actividade morfogenética e fosfatásica na proteína SpoIIE permite a coordenação entre a síntese correcta do septo de divisão e a expressão do regulão σF . A morfogénese do septo é pois um checkpoint para a activação do factor σF, e os circuitos regulatórios envolvem a proteína bifuncional SpoIIE (Lucet et al., 2000; Feucht et al., 1999). Apesar destas considerações, Arigoni et al. (1999) expressaram uma forma solúvel da fosfatase (sem o domínio membranar), e verificaram que embora atrasada, a activação do factor σF permanece restrita ao préesporo numa fracção considerável das células. Além disso,podem ser detectados níveis consideráveis de desfosforilação de SpoIIAA mesmo na ausência da divisão assimétrica (Feucht et al., 1999). Evidentemente, a formação do septo não é um requisito essencial para a activação compartimentada de σF. A formação

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do septo funciona pois como um checkpoint que aumenta a fidelidade do processo e permite atrasar a activação de σF no pré-esporo, logo seguida da activação de pro-σE na célula-mãe (ver abaixo), até à formação dos dois compartimentos esporangiais (Feucht et al., 1999).

Um sinal proveniente do pré-esporo controla a activação de σ E na célulamãe. σE é produzido sob a forma de um precursor inactivo, pro-σE , que contém na sua extremidade Nterminal uma sequência de 27 aminoácidos adicionais que dirigem a proteína para a membrana septal impedindo a sua interacção com a polimerase (Ju et al., 1997 e referências aí incluídas). O operão spoIIG que codifica para σE é, à semelhança do que acontece com o operão spoIIA, transcrito antes da formação do septo assimétrico (Kenney e Moran, 1987; Kenney et al., 1989; Satola et al., 1991). No entanto, a activação de σE só é possível após a divisão assimétrica do esporângio, isto porque é dependente de SpoIIR, o produto de um gene transcrito por σF no préesporo (Karow et al., 1995; Londoño-Vallejo et al., 1995) (Fig.4B). A região N-terminal da proteína SpoIIR contém um peptídeo sinal que dirige a secrecção de SpoIIR para o espaço entre as duas membranas que formam o septo (Hofmeister et al., 1995). Uma vez neste espaço SpoIIR actua de uma forma ainda desconhecida, de modo a activar a protease SpoIIGA, responsável pelo processamento de pro-σE . SpoIIGA é uma proteína com dois domínios: uma região Nterminal com 5 segmentos transmembranares e uma região Cterminal que contém uma sequência (DSG) presente em proteases de aspartato (Londono-Vallejo, 1997). Neste tipo de proteases a dimerização é normalmente essencial para a sua actividade; se for este o caso de

SpoIIGA, então uma possibilidade é que SpoIIR esteja envolvido directa ou indirectamente na dimerização de SpoIIGA a nível da membrana e sua consequente activação (Kroos et al., 1999). Além da natureza direccional da proteína-sinal SpoIIR, parecem haver outros mecanismos envolvidos na compartimentação da actividade de σE . Em apoio desta hipótese verificou-se que caso SpoIIR seja produzido antes da formação do septo assimétrico (colocando o gene spoIIR sob o controlo de um promotor activo na célula prédivisional), a activação de σE continua a realizar-se especificamente na célula-mãe e de uma forma independente de σF (Zhang et al., 1996). Um dos mecanismos envolvidos na compartimentação da actividade de σF parece ser dependente de uma translocase de DNA que se localiza no septo, SpoIIIE. Num mutante spoIIIE nulo apenas uma região centrada na origem de replicação (oriC) e correspondente a cerca de 30% do cromossoma destinado ao pré-esporo se encontra dentro deste compartimento (Wu e Errington, 1997). Esta deficiência faz com que σE se torne também activo no préesporo (Pogliano et al., 1997). Em consequência, a translocação da restante região do cromossoma parece ser necessária para a degradação de pro-σE e de SpoIIGA no pré-esporo. A degradação parece ser dependente de uma protease putativa codificada por um gene presente nos 70% do cromossoma que não são translocados no mutante spoIIIE (Pogliano et al., 1997). Mutações null em spoIIIE não apenas permitem a actividade de σE no préesporo, como a actividade de σF na célula-mãe (Pogliano et al., 1997). Este último fenótipo parece ser devido à persistência neste mutante de SpoIIE na célula mãe (Pogliano et al., 1997; Lewis et al., 1998). Genes codificados por σE são necessários para a degradação de SpoIIE na célula mãe e para prevenir a formação de um segundo septo no

Microbiologia Molecular polo distal da célula, determinando desta forma o destino final da célula mãe (Pogliano et al., 1997; Lewis et al., 1998). Assim, o sinal transmitido por SpoIIR garante que σE se torne activo apenas após σF, e de uma forma dependente da correcta construção do septo de divisão assimétrico. No entanto existem programas específicos de proteólise que reforçam a correcta compartimentalização dos factores σ, prevenindo a sua activação ectópica.

Sinais provenientes da célula-mãe controlam a síntese e a activação de σ G no pré-esporo. Após activação, σF dirige a transcrição de diversos genes, entre os quais se inclui o gene que codifica para o factor σG , spoIIIG (Masuda et al., 1988; Sun et al., 1989). No entanto, a activação do promotor do gene spoIIIG é atrasada cerca de uma hora relativamente à utilização de outros promotores reconhecidos pela polimerase EσF (Partridge e Errington, 1993) (Fig.2A). Este atraso resulta do facto da transcrição do gene spoIIIG depender de um sinal gerado na célula-mãe pela actividade transcricional do regulador σE (Partridge e Errington, 1993; Fig. 5A). Presumivelmente, a actividade do factor σE na célula-mãe resulta na produção de um ou mais produtos génicos que sinalizam a activação do promotor spoIIIG (Fig. 5A). A natureza do sinal produzido na célula-mãe não é conhecida, assim como não é conhecida a forma como este é transmitido ao pré-esporo. No entanto, este esquema regulatório envolvido na transcrição de spoIIIG, não parece ser essencial para a correcta activação do factor σG . Isto porque colocando a região codificante do gene spoIIIG s o b o controlo de um promotor dependente de σF mas independente de σE , e consequentemente transcrito cerca de uma hora antes, o produto σG é

A. Estágio IIiii σE

? spoIIIA

σ

F

B. Estágio III spoIIIG

AB

σ

G

σ

E

IIIJ IIIA

pro-σK spoIVF bofA

AB

σ

G

spoIVB

Figura 5. Estágio IIiii a III da esporulação. A figura representa a transição do estágio Iiii (imediatamente antes da conclusão do processo de envolvimento) para o estágio III, caracterizado pelo envolvimento total do pré-esporo pela célula mãe. São representados os principais reguladores do processo, bem como os compartimentos celulares em que são activos. A transcrição do gene spoIIIG no pré-esporo depende simultâneamente do regulador σF (cuja actividade é confinada ao pré-esporo) e de um sinal desconhecido gerado na célula-mãe pela actividade do factor σE. Supõe-se que a transcrição do gene spoIIIG ocorra muito perto do fim da sequência do envolvimento. Contudo, após a sua síntese, o factor σG é mantido numa forma inactiva, provavelmente devido a acção do factor SpoIIAB. A activação do regulador σG coincide com a conclusão do processo de envolvimento (painel B), e requer ainda a expressão do locus vegetativo spoIIIJ, que codifica para uma lipoproteína, e do operão spoIIIA, cuja transcrição ocorre na célula-mãe. Presume-se que os produtos do operão spoIIIA antagonizem a função do anti-sigma SpoIIAB. Em células selvagens o factor SpoIIAB tende a desaparecer do pré-esporo após o envolvimento, mas persiste neste compartimento em mutantes spoIIIA, os quais são deficientes na activação do factor σG. Os circulos representados na figura 5B representam proteínas membranares: a turqueza o tranportador SpoIIIA e a azul a lipoproteína SpoIIIJ.

activado exactamente no mesmo tempo que o produto sintetizado a partir do promotor selvagem (Serrano et al., 2001). A transcrição do gene spoIIIG resulta na acumulação de σG no pré-esporo, mas este é inicialmente mantido numa forma inactiva até à finalização do envolvimento (Estágio III). A activação do factor σG gera um rápido aumento na concentração celular da proteína, uma vez que a polimerase EσG utiliza eficientemente o promotor spoIIIG, de uma forma auto-catalítica (Sun et al., 1991). Por esta razão, σG é sujeito a vários níveis de regulação negativa que convergem para reduzir a sua actividade na célula-mãe do esporângio ou em condições nutricionais que não promovam a esporulação (Rather et al., 1990; Kirchman et al., 1993; Kellner et al., 1996). A evidência disponível sugere que nestas condições, o anti-sigma SpoIIAB regula negativamente a actividade do σG (Fig. 5B). Em primeiro lugar, mutantes spoIIAB exibem transcrição dependente de σG em condições nutricionais que não permitem a esporulação (Rather et al., 1990). Além disso, células modificadas para expressarem o gene spoIIIG antes do ínicio da

esporulação apresentam um fenótipo de lise que é suprimido pela coexpressão do gene spoIIAB (Kirchman et al., 1993). Finalmente, in vitro SpoIIAB liga eficientemente a σG , inibindo desta forma a sua interacção com a polimerase (Kellner et al., 1996). No entanto estas observações deixam-nos perante um paradoxo. Se após a divisão assimétrica, a formação do complexo entre SpoIIAB e SpoIIAA resulta na libertação de σF num estado activo, então como é que ao mesmo tempo SpoIIAB mantém σG inactivo até à finalização do envolvimento? Eventualmente podem existir outras formas de SpoIIAB que apresentam maior afinidade para σG do que para SpoIIAA. Se este sistema molecular operar in vivo uma parte das moléculas de SpoIIAB manterá σG inactivo até ao final do envolvimento, altura em que o anti-sigma é eliminado do pré-esporo. Em alternativa, a actividade de σG pode ser determinada em grande parte por proteínas ainda não identificadas. Um membro da família Lon de proteases dependentes de ATP, lonA, está também envolvido na regulação da actividade de σG em condições nutricionais que não permitem a esporulação (Schmidt et al., 1994). A

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Microbiologia Molecular evidência disponível sugere que LonA, uma protease dependente de ATP, e uma segunda protease relacionada, LonB, possuem um papel durante a esporulação no controlo da actividade de σF e σG (Serrano et al., 2001). Tal como a transcrição do gene spoIIIG, também a subsequente activação do regulador σG requer a actividade transcricional do factor σE na célula-mãe provavelmente porque este dirige a expressão do operão octa-cistrónico spoIIIA (Illing et al., 1991) (Fig. 5B). Todos os alelos spoIIIA caracterizados reduzem drasticamente a expressão de genes dependentes de σG e conferem um bloqueio morfológico no estágio III da esporulação indestinguível daquele causado pela inactivação do locus spoIIIG (Illing et al., 1990; Piggot e Coote, 1976). Uma hipótese atractiva é a de que os produtos do locus spoIIIA formarem um transportador. Esta hipótese é apoiada pelo perfil de hidropatia de alguns desses produtos (SpoIIIAC, SpoIIIAD e SpoIIIAE), característico de proteínas transmembranares, e também porque SpoIIIAA apresenta semelhanças com componentes de sistemas de secreção de tipo II (Serrano et al., 2000b). SpoIIIAA apresenta ainda um motivo de ligação ao ATP, o que não é inconsistente com uma função de transporte (Serrano et al., 2000b). Uma forma mutante de σG que liga com baixa afinidade a SpoIIAB in vitro, é activa in vivo independentemente do locus spoIIIA (Kellner et al., 1996). Estes factos levam a admitir que após o envolvimento e de uma forma dependente de SpoIIIA, ocorra a inactivação de SpoIIAB no préesporo, resultando na activação de σG (Fig. 5B). Os mecanismos da inactivação de SpoIIAB são ainda desconhecidos, no entanto os resultados acumulados até agora parecem indicar que spoIIIA na célula-mãe leva à activação de uma protease ou em alternativa a activação de um sistema transportador que promova a

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eliminação de SpoIIAB no préesporo. Outro locus que se revelou necessário à activação de σG é spoIIIJ (Errington et al., 1992; Fig. 5B). Supreendentemente este gene é transcrito apenas durante o crescimento vegetativo, e parece codificar para uma lipoproteína essencial para a actividade de σG , no entanto a sua forma de acção mantêm-se desconhecida (Errington et al., 1992). Deve-se no entanto salientar que muitos sistemas de transporte através de membranas estão associados a lipoproteínas que são essenciais ao seu funcionamento. Este facto deixa em aberto uma possivel interacção entre SpoIIIJ e o transportador putativo codificado pelo operão spoIIIA.

Um sinal dependente de σ G garante a activação no tempo correcto de σ K. Tal como no caso de σE , também o segundo factor σ específico da célula-mãe, σK , é sintetizado sob a forma de um precursor inactivo. O N-terminal de pro-σK inibe a sua ligação à polimerase de RNA e promove a sua associação tanto à membrana externa do pré-esporo, como à membrana citoplasmática

(Kroos et al., 1999; Zhang et al., 1996 e referências aí incluídas). O gene que codifica para pro-σK tem origem num rearranjo de DNA que ocorre apenas na célula mãe. Tanto o rearranjo como a transcrição do gene composto (sigK) ocorrem numa fase tardia da expressão do regulão σE , já que dependem da acumulação do regulador auxiliar SpoIIID (revisto por Stragier e Losick, 1996e por Kroos et al., 1999). A polimerase EσK parece também utilizar eficientemente o promotor do gene codificante para o factor σK . Estes dois factores convergem para que a síntese de pro-σK ocorra na célulamãe coincidentemente com a finalização do processo de envolvimento (revisto por Stragier e Losick, 1996). O processamento de pro-σK é regulado por um complexo de proteínas que localizam na membrana do pré-esporo (Fig.6). Uma das proteínas deste complexo, cujo gene está sob o controlo de σE , é SpoIVFB. Em E. coli, SpoIVFB apresenta seis segmentos transmembranares, no entanto esta topologia só é conseguida na presença de uma segunda proteína, SpoIVFA (Green e Cutting, 2000). SpoIVFB é a protease responsável pelo processamento de σK (Rudner et al., 1999). Esta protease pertence a

Estágio IV pro-σK

bofA IVFA

spoIVB

IVFB

G σ

σK Figura 6. A activação do factor σK ocorre no estágio IV da esporulação. São representados os principais reguladores do processo, bem como os compartimentos celulares em que são activos. Os circulos representados na figura indicam proteínas membranares: a azul escuro BofA, a azul claro SpoIVFA e a amarelo SpoIVFB. Após a conlusão do processo de envolvimento, σG é activado no pré-esporo resultando na transcrição do gene spoIVB. Este codifica uma proteína de secreção necessária para a activação de um complexo proteico na membrana externa do pré-esporo, que resulta na conversão proteolítica do precursor pro-σK à sua forma activa, σK. SpoIVFB é uma metaloprotease membranar responsável pela proteólise da pro-proteína pro-σK. SpoIVFB é mantido sob inibição pelo complexo SpoIVFA/BofA. Presume-se que SpoIVB antagonize a acção deste complexo, acoplando a activação do factor σK à conclusão do processo de envolvimento. σK dirige então a síntese das camadas protectivas do esporo, da maquinaria de germinação, e a maturação final do endósporo. Além disso, σK governa a lise da célula-mãe possibilitando a conclusão do processo de esporulação com a libertação do endósporo no meio circundante.

Microbiologia Molecular um novo grupo de metaloproteases que estão envolvidas em processos proteolíticos ao nível da membrana. Este grupo apresenta o motivo HEXXH característico das metaloproteases e um segundo motivo conservado contendo os aminoácidos NPDG, ambos localizados em segmentos transmembranares e ambos essenciais à sua função (Rudner et al., 1999; Lewis e Thomas, 1999). SpoIVFA além de ter uma função estabilizador sob SpoIVFB, é também o seu principal inibidor até à acção de um sinal proveniente do pré-esporo (Resnekov, 1999). A coexpressão em células vegetativas de B. subtilis de pro- σK e spoIVFB leva ao processamento de pro- σK . Se nestas mesmas células se coexpressar spoIVFA existe maior acumulação de SpoIVFB e de σK (Resnekov e Losick, 1998). A coexpressão de bofA inibe o processamento mas apenas na presença de spoIVFA (Resnekov e Losick, 1998). BofA é uma pequena proteína membranar que influencia o processamento de pro-σK , formando provavelmente um complexo com SpoIVFA e SpoIVFB na membrana externa do pré-esporo. Segundo o modelo proposto, SpoIVFA sozinho é capaz de inibir SpoIVFB, sendo o papel de BofA o de estabilizar SpoIVFA protegendo-o da degradação por proteases (Resnekov, 1999). SpoIVB é a proteína sinalizadora sintetizada no pré-esporo sob o controlo de σG (Fig. 6). Assim tal como no caso de SpoIIR, também SpoIVB contém no seu N-terminal um hipotético peptídeo sinal que lhe permite atravessar a membrana interna do pré-esporo (Cutting et al., 1990a). Estudos recentes mostram que esta proteína é uma protease de serina com capacidade autocatalítica, o que levou ao modelo de que no préesporo se gera uma cascata proteolítica na qual SpoIVB degrada SpoIVFA ou BofA levando à activação de SpoIVFB e consequente processamento de pro-σK (Wakeley et al., 2000a).

SpoIVB tem um segundo papel essencial na esporulação, estando provavelmente envolvido na formação da PCG e do córtex (Oke et al., 1997). Deste modo, SpoIVB é um exemplo adicional de uma proteína bi-funcional envolvida na morfogénese e no controlo da actividade de um factor σ, coordenando desta forma a morfogénese com a expressão génica, neste caso dependente de σK . Esta coordenação é fundamental uma vez que a actividade de σK na célula-mãe leva à formação das camadas protectivas do esporo (cortex e manto) cuja síntese deve ser evitada até à conclusão do movimento das membranas septais em redor do préesporo (Estágio III). Os elementos essenciais do checkpoint para a activação do factor σK foram identificados através do isolamento de mutações que permitiam expressão génica dependente de σK , num mutante spoIIIG, onde o factor σG e consequentemente a proteina SpoIVB não são produzidos (Cutting et al., 1990b; Lu et al., 1990). Os alelos inicialmente isolados (bof, para bypass of forespore) inactivavam o gene bofA, e a região 3´do gene spoIVFA, codificante para a região Cterminal da proteína SpoIVFA (Cutting et al., 1990b; Cutting et al., 1991). Numa estirpe bofA, ou numa estirpe que produza uma forma constitutivamente activa do regulador σK (por eliminação da sequência pro) a expressão do regulão σK é iniciada cerca de 1 hora mais cedo do que numa estirpe selvagem, e de uma forma independente da activação do factor σG no pré-esporo (Cutting et al., 1990b; Lu et al., 1990). Estas estirpes são capazes de esporular, mas os esporos resultantes exibem graves perturbações estruturais e não germinam eficientemente (Cutting et al., 1990b). Estas observações reforçam a ideia de que os mecanismos de checkpoint asseguram a fidelidade do processo morfogenético. Existem outros elementos que operam no checkpoint de activação do factor σK mas a sua discussão ultrapassa o âmbito deste

artigo (ver por exemplo Wakeley et al., 2000b, e as referências aí incluídas). σK é o último factor sigma a ser activado no programa da esporulação. Uma das suas funções é a transcrição de genes envolvidos na fase final de maturação do endosporo, e na lise da célula-mãe (Stragier e Losick, 1996; Henriques e Moran, 2000). O processo de diferenciação fica completado com a libertação do endósporo maduro no meio envolvente.

Considerações finais O estudo da regulação dos factores σ durante a esporulação em Bacillus subtilis tem revelado algumas das características fundamentais dos processos de desenvolvimento. Uma dessas características é a coordenação entre a expressão génica e a morfogénese. Em alguns casos, esta coordenação é mediada por proteínas bi-funcionais essenciais para a formação de uma estrutura celular e para a activação de um factor sigma, como é o caso de SpoIIE (formação do septo assimétrico e activação de σF) e SpoIVB (formação da parede celular germinativa e activação de σK ). Este tipo de coordenação é muito semelhante ao que acontece durante o processo de formação do flagelo em organismos como Escherichia coli e Salmonella typhimurium (Aizawa, 1996). A primeira fase deste processo envolve a formação de um corpo basal e de um gancho. Estas mesmas estruturas são necessárias para a secrecção para o meio exterior de um factor antisigma, e desta forma libertam o factor σ responsável pela transcrição dos genes que codificam para as restantes proteínas estruturais dos flagelos. Este é mais um exemplo onde a activação de um factor σ está directamente dependente da formação de uma estrutura morfológica. Neste sistema o corpo basal é uma estrutura especializada muito semelhante aos sistemas de secrecção

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Microbiologia Molecular do tipo III utilizados pelas bactérias patogénicas (exemplo: Yersinia sp) para colocar no interior da célula do hospedeiro os factores de virulência (Hueck, 1998). No caso da formação dos flagelos a primeira proteína a ser transportada para o exterior por este sistema de secrecção é, como já referido anteiormente, o anti-factor sigma. Consequentemente, dentro da célula o factor σ é activado e sintetizadas as proteínas estruturais do flagelo. Um mecanismo muito semelhante a este, poderá estar envolvido na activação do factor σG . Neste caso as proteínas codificadas pelo operão spoIIIA formariam um sistema de secrecção modificado, através das duas membranas que envolvem o pré-esporo. Este sistema poderia talvez promover a transferência de SpoIIAB para a célula mãe, desse modo permitindo a associação do factor σG à polimerase do RNA no pré-esporo. Estudos recentes demonstram que a posição de determinados genes no cromossoma é importante na regulação da expressão génica durante os primeiros estados da esporulação após a formação do septo assimétrico (Khvorova et al., 2000; Zupancic et al., 2001; Dworkin et al., 2001). Como a formação do septo assimétrico precede a translocação do cromossoma para dentro do pré-esporo, 70% do cromossoma é translocado para o pré-esporo apenas após a divisão. Esta ordem de eventos cria um intervalo de tempo em que apenas os genes localizados nos 30% do cromossoma em redor de oriC estão disponiveis no pré-esporo para serem expressos sob o controlo de σF. Um exemplo é o caso do gene spoIIAB, que se localiza na região mais distante do cromossoma em relação à origem. Devido à sua localização spoIIAB entra com algum atraso no pré-esporo, o que se traduz numa distribuição assimétrica de SpoIIAB facilitando a activação de σF no préesporo. Este modelo é suportado pelo facto da transposição do gene spoIIAB para locais no cromossoma perto da origem afectar a activação

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de σF (Dworkin et al., 2001). Um outro exemplo é o caso do gene spoIIR, que se localiza numa região próxima à origem, sendo por isso um dos primeiros genes a ser transcrito por σF. O produto deste gene é necessário para a activação de σE na célula-mãe (ver acima). A transposição deste gene para uma região do cromossoma distante da origem provoca um atraso no processamento e consequente activação de σE . Estas observações suportam a ideia de que a localização de spoIIR no cromossoma regula temporalmete a activação de σE , facilitando a activação da expressão compartimentalizada na célula-mãe logo após a activação de σF no préesporo (Khvorova et al., 2000; Zupancic et al., 2001). Outro tema importante no estudo da regulação dos factores σ em Bacillus subtilis é o programa diferencial de proteólise em cada um dos compartimentos. A existências de proteases responsáveis pela prevenção da activação de σF e σE no compartimento errado foi inferida a partir de estudos no mutante spoIIIE (ver acima). Estes estudos indicam que cada um dos compartimentos apresenta um sistema de proteólise especifica, que no caso da célula mãe leva à degradação dos activadores de σF e no caso do pré-esporo está envolvido na degradação directa de SpoIIGA e de pro-σE . No entanto, existem também proteases responsáveis pela regulação negativa dos factores σ uma vez estes se encontrem activos. Este é o caso de LonB, especificamente sintetizado no pré-esporo e responsável, pelo menos em certas condições, pela regulação negativa da actividade de σF. Não é de excluir que este tipo de regulação negativa seja também exercida sob σG . Existe evidência de que a actividade de σG é regulado por LonA na célula-mãe e no pré-esporo poderá existir uma protease, ainda não identificada, que actue com SpoIIAB de modo a impedir a activação de σG coincidente com a sua síntese.

Agradecimentos Os autores agradecem aos restantes membros do nosso Laboratório no ITQB, em particular à Dra. Lígia Martins, ao Gonçalo Real e à Luísa Côrte, todas as discussões e comentários que contribuiram para a forma final deste artigo, e aos colegas e colaboradores Leif Steil, e Sven Hoevel, no laboratório do Dr. Uwe Voelker (Department of Microbiology, Philipps-Universität, e Max-Planck-Institut für Terrestrische Mikrobiologie, Marburg, Alemanha), a inclusão das figuras que ilustram a utilização de macroarrays de DNA para a caracterização da expressão génica durante a esporulação em B. subtilis. A autora (M.S.) é suportada por uma bolsa de doutoramento (BD/18251/98) da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). Diferentes aspectos do trabalho aqui descrito e em curso no nosso Laboratório foram financiados pelos Projectos PCNA/C/BIO/13201/98 e POCTI/1999/BME/35109 da FCT.

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