CRISPR/Cas9 in Arabidopsis e Riso

Davide Amadori

26/01/2016

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Editing Genico CRISPR/Cas9 in Riso ( Oriza Sativa ) ed Arabidopsis thaliana BIBLIOGRAFIA 1]

Demonstration of CRISPR/CAS9/sgRNA-Mediated Targeted Gene Modification in Arabidopsis, Tobacco, Sorghum and Rice. Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm F, Yang B, et al. (2013) Nucleic Acids Res doi:10.1093/nar/gkt780 2] Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Arabidopsis thaliana and Inheritance of Modified Genes in the T2 and T3 Generations. Jiang W, Yang B, Weeks DP (2014) PLoS ONE doi:10.1371/journal.pone.0099225 3] Agriculture: A New Breed of Edits. Ainsworth C. (2015) Nature doi:10.1038/528S15a

SOMMARIO FIGURA 1BIBLIOGRAFIA

le Arabidopsis sono state trasformate con un metodo biologico per silenziare un gene esogeno. BIBLIOGRAFIA ....................................................... 1 Il sequenziamento dei geni mutagenizzati nelle due 4] Demonstration of CRISPR/CAS9/sgRNA-Mediated Targeted Gene Modification in Arabidopsis, Tobacco, INTRODUZIONE..................................................... 1 permesso osservare e quantificare Sorghum and Rice. Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm F, Yang B, etspecie al. (2013)ha Nucleic Acids Resdidoi:10.1093/nar/gkt780 DISCUSSIONE ........................................................ 1 l’attività del sistema Cas9/sgRNA 5] Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Arabidopsis thaliana and Inheritanceevidenziandone of Modified CONCLUSIONI ....................................................... 4 eventuali criticità; test sono stati condotti anche Genes in the T2 and T3 Generations. Jiang W, Yang B, Weeks DP (2014) PLoS ONEi doi:10.1371/journal.pone.0099225 sulledoi:10.1038/528S15a generazioni T2 e T3 di Arabidopsis per 6] [1][2] Breed of Edits. Ainsworth C. (2015) Nature Agriculture: A New INTRODUZIONE mostrare l’ereditarietà delle mutazioni indotte da La tecnica di editing genetico CRISPR/Cas9 è stata Cas9/sgRNA. rapidamente adottata nella maggior parte degli DISCUSSIONE organismi modello, questa sfrutta la capacità delle CRISPR associated protein (Cas) di effettuare tagli a Strategie di rilevamento dell’attività di Cas9 e doppio filamento presso una piccola sequenza sgRNA in Arabidopsis [1][2] PAM (protospacer adjacent motif) nelle regioni Le piante di Arabidopsis sono state trasformate con complementari al single-guide RNA (sgRNA) Agrobacterium Tumefaciens (capace di infettare le complessato con la Cas. Il sistema CRISPR/Cas piante integrando un T-DNA nel loro genoma) derivato da Streptococcus pyogenes è attualmente mediante il metodo floral dip (immersione di fiori il più usato in quanto sfrutta una Cas (Cas9) che in ceppi trasformati per poi raccoglierne i semi da riconosce sequenze PAM lunghe solo due bp (GG) far germinare su terreno selettivo) con un costrutto tipicamente abbondanti nei geni, permettendo la recante, oltre ai geni per Cas9 e sgRNA, un gene per costruzione di molti sgRNA diversi. Per ottenere GFP recante un’inserzione di 20 bp che provoca un dunque il mutante ko del gene desiderato è frameshift nella trascrizione codificante una GFP sufficiente trasformare la cellula con il gene non funzionante out-of-frame (offGFP); essendo codificante Cas9 e quello codificante il sgRNA l’sgRNA complementare a questa inserzione, (tipicamente sotto un promotore forte come U6) l’attività di Cas9/sgRNA porta alla produzione di complementare alla sequenza di 20 bp nel gene di una GFP funzionante rilevabile mediante interesse; la successiva riparazione NHEJ (nonmicroscopia confocale. homologous end-joining system) può introdurre Per eliminare la possibilità che il sistema piccole delezioni o inserzioni dell’ordine di 3-17 bp. Cas9/sgRNA si attivi già nella cellula batterica Negli esperimenti presentati, la tecnologia ripristinando precocemente la GFP, sono state CRISPR/Cas9 è stata testata in Arabidopsis thaliana prodotte due linee di A. tumefaciens differenti: una e riso (Oriza sativa) secondo metodi di recante il vettore binario con il gene per Cas9 e trasformazione e di rilevamento differenti: in riso, sgRNA e l’altra con il vettore binario della offGFP è stato utilizzato un metodo di trasformazione (Fig. 1); in questo modo la mutazione può avvenire chimico (quindi indipendente da altri sistemi solo nelle piante trasformate con entrambi i vettori biologici) per silenziare un gene endogeno; mentre

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Quantificazione dell’attività di Cas9/sgRNA [2]

Figura 1. Trasformazione di Arabidopsis mediante due vettori binari portati da due linee separate di A. tumefaciens. mentre le piante trasformate con la sola offGFP possono fungere da controllo negativo. L’esame al microscopio confocale delle foglie prese dalle piante T1 mostra una presenza a mosaico della GFP funzionale che contrasta ampiamente con la fluorescenza diffusa della clorofilla (Fig. 2A), questo pattern è probabilmente dovuto al fatto che la mutagenesi indotta da Cas9/sgRNA è un processo stocastico che può avvenire in ogni momento dello sviluppo. Infatti, uno dei pregi della rigenerazione di una GFP funzionante è la capacità di determinare quando e dove avviene la mutagenesi indotta: ad esempio nelle cellule di guardia dello stoma si nota una fluorescenza più intensa rispetto ai tessuti circostanti (Fig. 2B), anche se questa è osservabile in piante trasformate con una GFP già funzionale e non è dovuta ad effetti del sistema CRISPR/Cas9.

La proporzione tra i geni off-GFP relativamente a quella dei GFP mutagenizzati si è ottenuta tramite amplificazione di una sequenza di 250bp comprendente il target di 20 bp per sgRNA (al cui interno è inoltre presente un sito di restrizione ApaLI). La digestione degli amplificati provenienti da un gene offGFP produrrebbe due segmenti da 125 bp ciascuno evidenziabili in una corsa elettroforetica (Fig. 2C) rilevando che tutte le 12 piante T1 positive per la GFP mostrano amplificati ApaLI-resistenti, con percentuali che vanno dal 37% ad oltre il 95% di geni GFP funzionanti/amplificato totale. L’esame di 12 piante T1 negative per il segnale GFP ha comunque rivelato la presenza di almeno un gene GFP mutagenizzato da Cas9/sgRNA mostrando che solo una frazione (circa un terzo) dei geni mutagenizzati da Cas9/sgRNA ripristina una sequenza codificante corretta per una GFP funzionale. Attività di Cas9/sgRNA nel protoplasto di riso [1] In riso il sistema è stato testato co-trasformando il protoplasto (cellule prive di parete cellulare, eliminata per digestione enzimatica) con due costrutti genici: uno contenente il gene per Cas9 e l’altro contenente un gene codificante un sgRNA chimerico con la sequenza di reclutamento della Cas9 al 3’ e una regione 5’ complementare ad una sequenza di 20 bp contenuta nel promotore del gene endogeno OsSWEET14 (Oriza sativa SWEET, appartenente ad una famiglia genica riscontrabile in ogni eucariote fotosintetico codificante proteine di membrana coinvolte nel trasporto di glucosio)

Figura 2. (A) Epidermide fogliare con fluorescenza di GFP (in verde) e clorofilla (in rosso). (B) Cellule di guardia dello stoma con intensa espressione di GFP mutagenizzata. (C) Efficienza della mutagenesi indotta da Cas9/sgRNA in 12 piante positive per il segnale GFP

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Figura 3. (A) Sequenze amplificate in Arabidopsis: in alto la sequenza corrispondente nel gene offGFP (in blu la sequenza target per sgRNA, in rosso il sito PAM, sottolineato il sito di restrizione per ApaLI) e i pattern di mutazione riscontrati dopo l’azione di Cas9/sgRNA (in rosso le delezioni, in verde le inserzioni). (B) Sequenza amplificata del gene OsSWEET14 (in nero la sequenza target per sgRNA, sottolineato il sito di restrizione per SexAI). (C) Sequenza di OsSWEET14 modificata da Cas9/sgRNA (notare la delezione di 9 bp) (Fig. 3B); tramite un metodo di trasformazione che sfrutta la capacità del polietilenglicole di rendere permeabile la membrana cellulare (la trasformazione avviene dunque incubando le cellule con i costrutti di DNA), fornendo un’ulteriore prova del fatto che la mutagenesi indotta da Cas9/sgRNA è indipendente da Agrobacterium.

cloni sfuggiti alla digestione con ApaLI, mentre le sequenze mutagenizzate con successo mostravano inserzioni o delezioni coerenti con quanto atteso dal sistema di riparazione NHEJ, producendo sei pattern di mutazione (Fig. 3A). Mentre in riso l’analisi di 8 cloni ha mostrato che 7 di questi recano una delezione di 9 bp in prossimità della regione target per Cas9/sgRNA (Fig. 3C)

La mutagenesi di OsSWEET14 indotta da Cas9/sgRNA è stata rilevata sequenziando la regione contenente il target per sgRNA.

Ereditarietà dei costrutti mutagenizzati [2]

Sequenziamento dei costrutti mutagenizzati [1][2] Per fornire la prova definitiva dell’avvenuta mutagenesi indotta da Cas9/sgRNA sono state sequenziati, dopo amplificazione, i geni target della sgRNA. Sia in Arabidopsis che in riso gli alleli target non mutati sono stati digeriti con enzimi di restrizione in grado di riconoscere siti contenuti nella sequenza complementare sgRNA, in modo che la PCR non fosse in grado di amplificare i segmenti digeriti per mancanza di un primer al 2° ciclo di amplificazione (in Arabidopsis è stata utilizzata la stessa ApaLI, mentre in riso si è ricorsi a SexAI, enzima che taglia presso sequenze ACCAGG). In Arabidopsis il sequenziamento ha mostrato che circa meta delle sequenze analizzate proveniva da

Tutte le Arabidopsis T1 sono state capaci di produrre semi mostrando che l’attività di Cas9/sgRNA non provoca difetti nella riproduzione delle piante. Tutte le progenie dalle 6 piante T1 non mostrano fluorescenza tranne quelle derivate dalla T1 #6, che invece mostrano una fluorescenza uniforme nelle foglie. Il sequenziamento del gene target nelle T2 ha mostrato che in 3 delle 6 progenie (tra cui quella di T1#6) è stata ereditata una sola copia della GFP mutagenizzata di cui solo quelle derivate da T1 #6 mostrano un gene GFP in cui è stata ripristinata una cornice di lettura corretta. Anche nelle progenie T3 derivate da questi 3 gruppi di piante T2 è stata rilevata la presenza di una copia del gene GFP mutagenizzato, mostrando le prove di un’ereditarietà stabile.

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CONCLUSIONI

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Grazie a queste esperienze, è possibile affermare che la tecnologia CRISPR/Cas9 può essere applicata con successo nelle specie vegetali anche per creare linee di discendenza mutagenizzate, essendo perfettamente compatibile con le tecniche di trasformazione genica già in uso nella produzione di organismi geneticamente modificati sia a scopo di ricerca che a fini commerciali. E’ infatti quest’ultimo campo di applicazione che può trarre i maggiori benefici di questa tecnologia: le tecniche convenzionali per la produzione di nuove cultivar richiedono (nel caso della produzione di OGM) l’inserimento di grandi porzioni di DNA esogeno proveniente anche da specie filogeneticamente distanti con scarso controllo dei punti di inserzione nel genoma ospite, mentre le tecniche di incrocio ed ibridazione sono frustrate sia dal tempo richiesto per ottenere nuove cultivar sia dalla comparsa di caratteri indesiderati, l’editing genico risponde dunque alle esigenze dei breeders fornendo uno strumento sicuro, rapido e preciso.

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Inoltre, dal momento che non vi è introgressione di geni esogeni (i costrutti recanti i geni Cas9 e sgRNA possono essere eliminati dopo avere espletato la loro funzione, oppure essere utilizzati come complessi ribonucleoproteici già funzionanti, come dimostrano studi recenti) le cultivar così ottenute non sono legalmente definibili OGM aggirando la diffidenza dei consumatori (almeno secondo le leggi USA, mentre in Unione Europea si definiscono OGM gli organismi il cui genoma è stato modificato secondo processi che non possono avvenire in natura, anche se in passato ci sono state eccezioni per mutagenesi indotta da radiazioni o mutageni chimici). Le eccezioni e le inefficienze riscontrate in queste esperienze forniscono un ottimo punto di partenza per studi più approfonditi, risultano inoltre molto promettenti le combinazioni tra la tecnologia CRISPR/Cas9 e le altre tecniche di indagine cui si prestano le piante, trattandosi di organismi il cui uso è molto flessibile; con possibili ricadute sugli altri campi della genetica.