DAS Elisa

PENDAHULUAN


Latar Belakang
Melon (Cucumis melo L.) merupakan tanaman hortikultura dari famili
Cucurbitaceae yang sangat digemari karena rasanya manis, memiliki aroma
yang khas dan menyegarkan. Melon memiliki nilai ekonomi dan harga jual yang
tinggi dibandingkan dengan buah-buahan lain yang sefamili dengannya seperti
semangka, blewah, waluh dan mentimun (Wahyu 1995). Upaya pengembangan melon
dihadapkan pada kendala yang besar yaitu adanya gangguan hama dan penyakit
yang menyebabkan produksi menurun bahkan terjadi kegagalan panen. Melon
biasanya terserang cendawan, bakteri dan virus yang dapat menyebabkan
penyakit. Golongan virus melon dapat terserang Zucchini yellow mosaic
potyvirus (ZYMV) (Zitter et al. 1984).
ZYMV merupakan virus penting yang menyerang tanaman Cucurbitaceae di
seluruh dunia dan memiliki pengaruh penting pada tanaman Cucurbitaceae
karena menurunkan hasil secara ekonomi (Lin et al. 2000; Simmons et al.
2011). Kerugian infeksi tergantung pada waktu infeksi dan dapat
mengakibatkan kerugian hasil mencapai 100% (Babadoost et al. 2012). Gejala
yang ditimbulkan ZYMV pada daun tanaman adalah mosaik dengan klorosis yang
dominan, nekrosis, pengurangan ukuran lamina daun, malformasi dan
blistering (Zitter et al. 1998).
ZYMV secara umum ditularkan melalui dua cara yaitu secara horisontal
melalui vektor kutudaun, dan secara vertikal melalui transmisi dari benih
generasi pertama yang terinfeksi ZYMV ke generasi selanjutnya (Simmons et
al. 2011; Tobias et al. 2003). ZYMV juga dapat ditularkan secara mekanik
dengan mudah melalui alat-alat pemotong yang telah terkontaminasi virus
tersebut (Providenti 1996; Zitter et al. 1998). Dampak dari adanya virus
dalam benih adalah pertumbuhan tanaman akan terhambat, dapat berpotensi
menghasilkan benih yang tidak sehat, dan apabila tanaman dapat tumbuh maka
berpotensi sebagai inokulum primer bagi tanaman lainnya di lapang.
Berbagai metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi patogen terbawa
benih adalah pemeriksaan benih kering, pemeriksaan secara perendaman,
pemeriksaan dengan cara inkubasi (metode kertas, metode agar, metode
inkubasi dengan media batu bata, pasir, tanah, dan metode growing on test)
(Sutopo 2004). Salah satu cara untuk mendeteksi benih yang membawa virus
adalah dengan metode growing on test. Pada metode ini benih ditumbuhkan
pada media tanam. Benih harus ditumbuhkan terlebih dahulu karena virus
tumbuhan tidak dapat hidup aktif di luar inangnya, tidak dapat ditumbuhkan
pada media agar cawan petri, tetapi harus dimasukkan dalam sel-sel hidup
(Bos 1990).
Uji serologi (serology test) merupakan salah satu metode pengujian
dalam menentukan patogen terbawa benih (kebanyakan dari golongan virus dan
bakteri) dengan protein atau DNA/RNA sebagai targetnya. Salah satunya
adalah ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) merupakan metode serologi
yang sensitif untuk mendeteksi/diagnosis suatu virus dimana antiserum
dikonjugasikan dengan enzim. Sehingga bila substrat enzim ditambahkan pada
kompleks antigen-antibodi dalam jumlah sedikit sekalipun tetap dapat
tervisualisasi. Pengujian dengan menggunakan metode ELISA ini dapat
membedakan patogen masih dalam kondisi hidup atau mati (karena hanya
patogen hidup yang terdeteksi), berbeda dengan metode PCR yang tidak dapat
membedakannya, sehingga patogen yang telah mati tetap akan terdeteksi. Pada
metode ELISA ini ada tidaknya patogen akan ditunjukkan dengan perubahan
warna hasil uji (biasanya menjadi warna kuning).
ELISA terdiri dari dua macam, yakni langsung (direct) dan tidak
langsung (indirect). Direct ELISA terjadi apabila konjugasi enzim pada
imunoglobulin anti virus. Sedangkan indirect ELISA terjadi apabila
konjugasi enzim pada molekul yang mendeteksi imunoglobulin antivirus
(Hampton et al. 1990). Untuk mengetahui lebih lanjut bagaimana prosedur
kerja metode DAS ELISA dalam menentukan patogen seedborne (virus) maka
dilakukanlah praktikum ini.

Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari prosedur uji serologi DAS
ELISA ZYMV pada tanaman melon.

METODE PRAKTIKUM


Tempat dan Waktu Praktikum
Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Pendidikan 1 dan Laboratorium
Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor (IPB) pada
tanggal 5-6 Mei 2015 pukul 13.00 s/d 16.00 WIB.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam praktikum adalah 0.1 g daun melon, antierum
1 dan antiserum 2 ZYMV, buffer yang digunakan (Coating buffer, PBS, PBST,
Sample extraction buffer, Conjugate bufffer, Substrate buffer, dan PNP (p-
nitrophenyl phosphate) sedangkan alat yang digunakan yaitu pelat mikrotiter
ELISA, pipet volumetric, vortex, washer, inkubator, ELISA reader, kamera
dan alat tulis.



Gambar 1 Alat-alat yang diguankan (a) pelat mikrotiter ELISA, (b) pipet
volumetric, (c) vortex, (d) washer, (e) inkubator, dan (f) ELISA
reader.



Langkah Kerja
Sebanyak 0.1 g daun melon digerus dalam 1 mL buffer coating. Antiserum
pertama dan buffer coating dimasukkan ke dalam microplate ELISA sebanyak
100 µL dan diinkubasi selama 2 jam suhu 37oC di dalam inkubator setelah
diinkubasi dilakukan pencucian dengan PBST sebanyak 4 kali dan pelat
mikrotiter ELISA dikeringkan. Masukkan sap ke dalam pelat mikrotiter ELISA
sebanyak 100 µL dan diinkubasi selama 1 malam pada suhu 4 oC. lalu sap
dibuang dan dicuci dengan 1x PBST sebanyak 8 kali, kemudian ditambahkan
antiserum kedua ke dalam pelat mikrotiter ELISA, diinkubasi selama 2 jam
pada suhu 37oC dan dicuci denga 1x PBST sebanyak 8 kali. Pewarnaan
dilakukan dengan menambahkan 1 mL buffer PNP sebanyak 100 µL, diinkubasi
kembali 30-60 menit pada suhu 37 oC pada kondisi gelap tanpa ada cahaya
lalu cek nilai absorbansi ELISA tiap 15 menit. Kuantifikasi hasil deteksi
dengan ELISA reader pada 405 nm. Uji dinyatakan positif jika nilai
absorbansi sampel 2x lipat nilai absorbansi K(-) atau tanaman sehat.
" "
" " "

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tabel 1 Peta ELISA
"1 "2 "3 "4 "5 "6 "7 "8 "9 "10 "11 "12 " "A " " B E " B E " " " " " 
" " " " " "B " " K (-) "K (-) " " " " " " " " " " "C " " K
(+) " K (+) " " " " " " " " " " "D " " 1 "2 " " " " " " 
" " " " "E " " 3 "4 " " " " " " " " " " "F " " 5 "6 " " 
" " " " " " " " "G " " 7 "8 " " " " " " " " " " "H " " 9
"10 " " " " " " " " " " "
Tabel 2 Hasil ELISA
"1 "2 "3 "4 "5 "6 "7 "8 "9 "10 "11 "12 " "A " "0.295 "0.330 " " " " " " "
" " " "B " "0.387 "0.343 " " " " " " " " " " "C " "0.597 "0.593 " " " " " "
" " " " "D " "0.290 "0.338 " " " " " " " " " " "E " "0.295 "0.368 " " " " "
" " " " " "F " "0.348 "0.334 " " " " " " " " " " "G " "0.356 "0.336 " " " "
" " " " " " "H " "0.320 "0.819 " " " " " " " " " " "Keterangan: Hasil
analisa sampel yang menunjukkan 2x nilai absorbansi K(-) bahwa
sampel tanaman melon positif (+) terinfeksi ZYMV (kolom berwarna
hijau)

Bedasarkan data yang diperoleh menggunakan deteksi serologi DAS ELISA
dari 10 sampel yang ada, terdapat 1 sampel yag positif terinfeksi ZYMV
(sampel 10). Data ini sesui dengan yag terlihat dari penampakan secara
visual (Gambar 2), dimana sampel yag terinfeksi memiliki warna kekuningan
sedangkan sampel yag tidak terinfeksi ZYMV berwarna putih. Warna kuning
yang terlihat disebabkan oleh perubahan substrat p-nitrofenil fosfat.
Substrat p-nitrofenil fosfat yang awalnya bening karena adanya enzim
alkalin fosfatase pada konjugat, maka sedikit demi sedikit berubah warna
menjadi kuning (Nickel et al. 2004) dan dalam jangka waktu 30 menit,
setelah mulai terjadinya reaksi enzimatik tersebut, intensitas warna kuning
sudah cukup teramati dengan mata telanjang.



Gambar 2 Sampel (ekstrak daun) melon hasil ELISA S10 (warna kuning
menunjukkan bahwa sampel terinfeksi ZYMV).

Kecepatan perubahan dan intensitas warna kuning yang terjadi pada
substrat sangat bergantung pada jumlah enzim (konjugat) yang berikatan
dengan antiserum AB, sedangkan jumlah antiserum yang ada bergantung pada
jumlah partikel AB yang terdapat pada cairan perasan tanaman melon
(menempel pada dinding sumuran pelat mikrotiter ELISA). Ketiadaan enzim
(konjugat) menyebabkan substrat tetap bening seperti terlihat pada sumuran
pelat mikrotiter ELISA yang diberi cairan perasan tanaman sehat (K+), dan
ini merupakan sinyal negatif atau menandakan tidak terdapatnya partikel AB
yang menempel pada dinding sumuran pelat mikrotiter (cairan perasan tanaman
melon.
Teknik Direct ELISA merupakan teknik sederhana yang digunakan untuk
mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen menggunakan suatu antibodi
spesifik (monoclonal) untuk mendeteksi keberadaan antigen yang ingin
diketahui pada sampel yang diuji. Namun, terdapat beberapa patogen yang
hanya dapat dideteksi mengguanakan teknik ini, seperti Jumanto et al.
(2001) menggunakan teknik ini untuk deteksi Rice tungro virus (RTV) pada
padi dan serangga vektornya, bahkan untuk seleksi ketahanan varietas padi
terhadap penyakit tungro.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil yang diperoleh dengan menggunakan deteksi serologi
DAS ELISA terhadap 10 sampel daun tanaman melon, terdapat 1 sampel yang
positif terinfeksi ZYMV.



DAFTAR PUSTAKA

Babadoost M. 2012. Viral diseases of cucurbits [Internet]. Champaign (US):
Department of Crop Sciences; [diunduh 2015 Mei 8]. http://
extension.cropsci.illinois.edu/fruitveg/pdfs/949_viral_diseases.pdf.
Bos L. 1990. Pengantar Virologi Tumbuhan (Terjemahan). Gadjah Mada
University Press.
Jumanto, Bahagiawati, Manzila I, Purwanti H, Suhendar MA, Iman M, Habib R,
Damayanti D, Syamsudin, Suyono. 2001. Produksi perangkat diagnostik dan
peningkatan efisiensi teknik deteksi dan identifikasi penyakit dan hama
tumbuhan. Laporan Hasil Penelitian APBN Tahun Anggaran 2001. BB-Biogen,
Bogor.
Hampton R, Ball E, Boer SD. 1990. Serological methods for detection and
identification of viral and bacterial plant patogens. A Laboratory
Manual: APS Press.
Lin SS, Hou RF, Yeh SD. 2000. Heteroduplex mobility and sequence analyses
for assesment of variability of Zucchini yellow mosaic virus.
Phytopathology 90(1):228-235.
Nickel O, Targon MLPN, Fajardo TVM, Machado MA, Trivillin Ap. 2004.
Polyclonal antibodies to the coat protein of Apple stem grooving virus
expressed in Escherichia coli: production and use in immunodiagnosis.
Fitopatol Bras. 29(5): 558-562.
Providenti R. 1996. Diseases Caused by Viruses. Di dalam: Zitter TA,
Hopkins DL, Thomas CE editor. Compendium of Cucurbit Diseases. New York
(US): APS Press.
Simmons HE, Holmes EC, Gildow FE, Bothe-Goralczyk MA, Stephenson AG. 2011.
Experimental verification of seed transmission of Zucchini yellow
mosaic virus. Plant Diseases 95(1):751-754.
Sutopo L. 2010. Teknologi Benih. Jakarta (ID): PT Raja Grafindo Persada.
Tobias I, Palkovics L. 2003. Characterization of Hungarian isolates of
Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV, potyvirus) transmitted by seeds of
Cucurbita pepo var. styriaca. Pest Management Sciences 59(1):493-497
Wahyu A. 1995. Pengaruh waktu inokulasivirus mosaik ketimun (CMV) terhadap
produksi melon (Cucumis melo L.) VARIETAS Sky Rocket [skripsi]. Bogor:
Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Zitter TA, Banik MT, Provvidenti R. 1984. Viruses Disease of Cucucrbits.
New York: Cooperative Extension Cornell University.
Zitter TA, Hopkins DL, Thomas CE. 1998. Compendium of Cucurbits Diseases.
St. Paul (US): APS Press.


-----------------------








































S10



f



e



d



c



b



a