Estabelecimento e Enraizamento In Vitro de Pereira ‘Rocha’ (Pyrus communis L.) - Trabalho de Fim de Curso de Engenharia Agronómica

UNIVERSIDADE TÉCNICA DE LISBOA

Instituto Superior de Agronomia

Estabelecimento e Enraizamento In Vitro de Pereira ‘Rocha’ (Pyrus communis L.)

Relatório do Trabalho de Fim de Curso de Engenharia Agronómica

Claudia Patrícia Henriques Santinho Coelho

Orientadora: Maria Teresa Franco de Barros Agra Coelho

Lisboa 1999

UNIVERSIDADE TÉCNICA DE LISBOA

Instituto Superior de Agronomia

Estabelecimento e Enraizamento in vitro de pereira ‘Rocha’ (Pyrus communis L.)

Relatório do Trabalho de Fim de Curso de Engenharia Agronómica

Claudia Patrícia Henriques Santinho Coelho

Orientador: Maria Teresa Franco de Barros Agra Coelho

Lisboa 1999

O Instituto Superior de Agronomia não se responsabiliza pelas ideias expressas neste relatório.

Agradecimentos À Professora Maria Teresa Barros, agradeço o apoio constante, disponibilidade e excelente orientação ao longo de todo o trabalho. À Engenheira Ilda Freire pela excelente ajuda prestada na aprendizagem das técnicas laboratoriais, bem como pelas sugestões e apoio prestado na execução de certas tarefas laboratoriais. À Bióloga Cecília Baptista pelo apoio no desempenho de algumas tarefas laboratoriais. Às funcionárias Maria da Graça, Raquel e Nídia, da Secção de Horticultura, pela ajuda e simpatia com que me trataram. À Direcção Regional de Agricultura do Ribatejo e Oeste, pela cedência de ramos de clones seleccionados de pereira ´Rocha’ usados no estabelecimento de novas culturas in vitro. A todos os colegas e amigos que me apoiaram ao longo do trabalho e do curso, em especial a Rita, a Luísa e a Mariana. Aos meus pais pela amizade, encorajamento e compreensão, e por me terem permitido chegar ao fim do curso.

Este trabalho foi realizado no âmbito dos projectos PAMAF nº 6073 e PRAXIS 3/3.2/HORT/2143/95. i

Resumo Neste trabalho procedeu-se a ensaios de iniciação e estabelecimento in vitro de culturas de pereiras ‘Rocha’ e ‘Williams’, bem como de enraizamento in vitro de rebentos micropropagados e de discos caulinares de rebentos micropropagados de ‘Rocha’. Na fase de estabelecimento utilizaram-se, como explantados, estacas uninodais obtidas de ramos em crescimento de árvores adultas no campo. Estudou-se o efeito do meio salino e da concentração de BAP, e ainda, no ensaio com ‘Rocha’, o efeito do clone. A taxa de contaminação foi inferior a 7 % e a 26 % em ‘Rocha’ e ‘Williams’, respectivamente. O meio QL aumentou o peso fresco e o peso seco dos rebentos provenientes dos explantados de ‘Rocha’ e o número de rebentos por explantado de ‘Williams’, relativamente ao meio MS. A concentração de BAP mais elevada (2 mg/ L) originou o maior número de rebentos por explantado em ambas as cultivares. O clone de ‘Rocha’ influenciou o número de rebentos por explantado e o seu peso fresco e peso seco. No enraizamento in vitro de rebentos micropropagados utilizou-se quer material de origem juvenil (Ensaio 1), quer de origem adulta (Ensaio 2). Foram ensaiadas diferentes modalidades de exposição ao IBA que diferiram na duração do período de escuro e/ou de permanência num meio de indução com 10 M de IBA. Nos ensaios com discos caulinares usou-se material de origem juvenil e testou-se quer a modalidade de exposição ao IBA (Ensaio 4), quer a concentração de IBA (de 2,5 a 20 M) no meio de indução (Ensaio 3). Nos ensaios realizados obteve-se um enraizamento máximo de 50 % para os rebentos e de 12 % para os discos caulinares. A modalidade 5D (5 dias no escuro com IBA) originou um maior desenvolvimento da parte aérea dos rebentos e callus de menor dimensão mas, em contrapartida, uma menor percentagem de enraizamento que as modalidades 5D+5D (5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal) e 42D (6 semanas com IBA, os primeiros 5 dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal). O aumento da duração do período de escuro de 5 para 10 dias (modalidade 10D) foi desfavorável ao desenvolvimento da parte aérea e da parte radicular dos rebentos. Em discos caulinares, a maior percentagem de enraizamento foi obtida com 10 M de IBA. O aumento da concentração de IBA aumentou a frequência de callus, enquanto a modalidade de exposição ao IBA influenciou o tipo de callus formado (‘gelatinoso’ ou ‘filamentoso’). Palavras chave: cultura in vitro; pereira ‘Rocha’; estabelecimento in vitro; enraizamento in vitro; discos caulinares.

ii

Abstract The aim of this work was to study the initiation and establishment of in vitro cultures of ‘Rocha’ and ‘Williams’ pear cultivars, as well as the in vitro rooting of micropropagated shoots and of stem discs from micropropagated shoots of ‘Rocha’. For initiation and establishment, uninodal cuttings from growing shoots of adult trees in the field were used. The effects of salt medium, BAP concentration and ‘Rocha’ clone were studied. The percent contamination was less than 7 % and 26 % in ‘Rocha’ and ‘Williams’, respectively. The medium containing QL mineral salts increased the fresh and dry weights of the shoots developed from ‘Rocha’ explants, as well as the number of shoots per explant of ‘Williams’, as compared to MS salt medium. The highest BAP concentration (2 mg/ L) yielded the highest number of shoots per explant in both cultivars. ‘Rocha’ clone had a significant effect on the number of shoots per explant and on the fresh and dry weights of those shoots. For in vitro rooting of micropropagated shoots, either juvenile shoots (Experiment 1) or shoots of adult origin (Experiment 2) were used. In these experiments different conditions of exposure to IBA were assayed which were defined by the duration of the darkness period and/or of the period during which the shoots were kept on an induction medium containing 10 M IBA. In the experiments with stem discs, only discs from shoots of juvenile origin were used. The above conditions of exposure to IBA were assayed (Experiment 4) as well as the effect of increased IBA concentrations (from 2,5 to 20 M) in the induction medium (Experiment 3). A maximum of 50 % rooted shoots and 12 % rooted stem discs was achieved in the in vitro rooting assays. Treatment 5D (5 days with IBA in the dark) resulted in the highest shoot development and the least callus formation but gave a lower rooting percent than treatments 5D+5D (5 days with IBA in the dark + 5 days with IBA under a normal photoperiod) and 42D (six weeks with IBA, the first 5 days in darkness and the rest under normal photoperiod). The increase in the dark period duration from 5 to 10 days (treatment 10D) was detrimental to shoot and root development. In the experiments with stem discs the highest rooting percent was achieved using 10 M IBA in the induction medium. An increase in IBA concentration increased the frequency of callus formation while the exposure treatment affected the type of callus formed (‘smooth’ or ‘filamentous’).

Key words: in vitro culture; ‘Rocha’ pear; in vitro establishment; in vitro rooting; stem discs.

iii

Abreviaturas ACC

Ácido carboxílico 1-amino ciclopropano

BAP

6-benzilaminopurina

DIECA

Dietil-ditiocarbamato de sódio tri-hidratado

DRARO

Direcção Regional de Agricultura do Ribatejo e Oeste

EDTA

Tetra-acetato de etilenodiamina

g.l.

Graus de liberdade

IAA

Ácido 3-indolacético

IBA

Ácido 3-indolbutírico

ISA

Instituto Superior de Agronomia

MS

Meio de Murashige e Skoog (1962)

NAA

Ácido -naftalenoacético

PAR

Radiação fotossinteticamente activa

PVP

Polivinilpirrolidona

QL

Meio de Quoirin e Lepoivre (Quoirin et al., 1977)

SAM

S-adenosil metionina

iv

ÍNDICE Pág. Lista de Quadros

viii

Lista de Figuras

xi

I. INTRODUÇÃO

1

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

4

1. A cultura in vitro de tecidos vegetais

4

1.1. Aspectos gerais

4

1.2. Aplicações a fruteiras lenhosas

5

2. Iniciação e estabelecimento in vitro de culturas a partir de material vegetal adulto

7

2.1. Origem do material vegetal

7

2.2. Desinfecção do material inicial

9

2.3. Composição do meio de cultura

10

2.4. Condições ambientais de cultura

11

2.5. Problemas de oxidações

11

3. Enraizamento in vitro de rebentos e de discos caulinares 3.1. Enraizamento in vitro de rebentos

12 12

3.1.1. Aspectos gerais

12

3.1.2. Factores que influenciam a rizogénese em rebentos

13

3.1.2.1. Características fisiológicas e morfológicas dos rebentos utilizados

13

3.1.2.2. Tipo de tratamento auxínico

15

3.1.2.3. Presença ou ausência de luz

18

3.1.2.4. Sais minerais e fontes de carbono

20

3.1.2.5. Outras substâncias

21

3.2. Enraizamento in vitro de discos caulinares

24

3.2.1. Aspectos gerais

24

3.2.2. Metodologia de enraizamento in vitro de discos caulinares

24

3.2.3. Factores que influenciam a rizogénese em discos caulinares

25

III. INICIAÇÃO E ESTABELECIMENTO IN VITRO DE CULTURAS DE

28

PEREIRAS ‘ROCHA’ E ‘WILLIAMS’ 1. Introdução

28

2. Materiais e Métodos

29

2.1. Esterilização do material de laboratório

29

2.2. Preparação, esterilização e distribuição dos meios de cultura

29 v

2.3. Instalação in vitro de estacas uninodais

30

2.3.1. Material vegetal

30

2.3.2. Desinfecção do material vegetal

30

2.3.3. Meios de cultura ensaiados

30

2.3.4. Condições ambientais de cultura

32

2.3.5. Recolha de dados e análise de resultados

32

3. Resultados 3.1. Estabelecimento in vitro de culturas de pereira ‘Rocha’

34 34

3.1.1. Percentagem de explantados contaminados, oxidados, viáveis e inviáveis

34

3.1.2. Desenvolvimento dos explantados e número de rebentos por explantado

34

3.1.3. Peso fresco e peso seco dos rebentos

40

3.2. Estabelecimento in vitro de culturas de pereira ‘Williams’

42

3.2.1. Percentagem de explantados contaminados, oxidados, viáveis e inviáveis

42

3.2.2. Desenvolvimento dos explantados e número de rebentos por explantado

42

3.2.3. Peso fresco e peso seco dos rebentos

46

4. Discussão

48

IV. ENRAIZAMENTO IN VITRO DE REBENTOS E DE DISCOS CAULINARES

50

DE PEREIRA ‘ROCHA’ 1. Introdução

50

2. Materiais e Métodos

51

2.1. Esterilização do material de laboratório

51

2.2. Preparação, esterilização e distribuição dos meios de cultura

51

2.3. Condições ambientais de cultura

52

2.4. Enraizamento in vitro de rebentos

52

2.4.1. Material vegetal

52

2.4.2. Composição do meio de indução do enraizamento

52

2.4.3. Modalidades de enraizamento ensaiadas

53

2.4.4. Recolha de dados e análise de resultados

54

2.5. Enraizamento in vitro de discos caulinares

56

2.5.1. Material vegetal

56

2.5.2. Plaqueamento dos discos caulinares

56

2.5.3. Modalidades de enraizamento ensaiadas

57

2.5.4. Recolha de dados e análise de resultados

59

3. Resultados 3.1. Enraizamento in vitro de rebentos

60 60 vi

3.2. Enraizamento in vitro de discos caulinares 4. Discussão

68 73

4.1. Enraizamento in vitro de rebentos

73

4.2. Enraizamento in vitro de discos caulinares

76

V. CONCLUSÕES

78

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

80

vii

Lista de Quadros Pág. Capítulo III - Iniciação e estabelecimento in vitro de culturas de pereiras ‘Rocha’ e ‘Williams’ Quadro 1 - Formulação dos meios de cultura utilizados no estabelecimento in vitro de estacas uninodais de pereiras ‘Rocha’ e ‘Williams’.

31

Quadro 2 - Percentagem de explantados contaminados, oxidados, inviáveis e viáveis, relativamente ao número inicial de explantados em cada uma das modalidades, avaliada ao fim de quatro semanas de instalação dos clones de ‘Rocha’ C3A4, R307/ 51 e T32.

35

Quadro 3 - Resumo da análise estatística relativa aos efeitos da composição salina do meio de cultura, da concentração de BAP e do clone na classe de desenvolvimento dos rebentos e no número de rebentos por explantado de ‘Rocha’ formados durante a fase de estabelecimento in vitro

38

Quadro 4 - Médias da classe de desenvolvimento obtidas no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Rocha’, referentes aos factores clone, composição salina do meio de cultura e concentração de BAP.

38

Quadro 5 - Médias do número de rebentos por explantado referentes à interacção Sais.BAP e ao factor clone, obtidas no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Rocha’.

40

Quadro 6 - Resumo da análise estatística relativa aos efeitos da composição salina do meio de cultura, da concentração de BAP e do clone, no peso fresco e peso seco dos rebentos de ‘Rocha’ formados durante a fase de estabelecimento in vitro.

41

Quadro 7 - Médias do peso fresco e do peso seco dos rebentos ao fim de quatro semanas de instalação dos explantados de ‘Rocha’, referentes aos factores clone, composição salina do meio de cultura e concentração de BAP.

41

Quadro 8 - Percentagem de explantados contaminados, oxidados, inviáveis e viáveis, relativamente ao número inicial de explantados em cada uma das modalidades, avaliada ao fim de seis semanas de instalação de ‘Williams’.

42

Quadro 9 - Resumo da análise estatística relativa aos efeitos da composição salina do meio de cultura e da concentração de BAP na classe de desenvolvimento dos rebentos e no número de rebentos por explantado de ‘Williams’ formados durante a fase de estabelecimento in vitro.

44

Quadro 10 - Médias do número de rebentos por explantado e da classe de desenvolvimento, relativas aos factores composição salina do meio de cultura e concentração de BAP, obtidas no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Williams’.

44

Quadro 11 - Resumo da análise estatística relativa aos efeitos da composição salina do meio de cultura e da concentração de BAP no peso fresco e peso seco dos rebentos de ‘Williams’ formados durante a fase de estabelecimento in vitro.

46

viii

Capítulo IV - Enraizamento in vitro de rebentos e de discos caulinares de pereira ‘Rocha’ Quadro 1 - Formulação do meio base utilizado nos ensaios de enraizamento in vitro.

53

Quadro 2 - Modalidades dos ensaios de enraizamento in vitro de rebentos, de acordo com a duração do período de ausência de luz e de exposição ao IBA.

54

Quadro 3 - Modalidades dos ensaios de enraizamento in vitro de discos caulinares de acordo com os níveis de IBA utilizados e a duração do período de ausência de luz e de exposição à auxina.

58

Quadro 4 - Número de rebentos do clone PR4 instalados e número de rebentos sobreviventes, número de rebentos com callus friável e número e percentagem de rebentos enraizados, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

62

Quadro 5 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA no peso fresco e peso seco da parte aérea dos rebentos (PFA e PSA), do callus (PFC e PSC) e das raízes (PFR e PSR), e no comprimento das raízes (COMPR), ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

62

Quadro 6 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA na presença de raízes, na dimensão do callus e no número de raízes por rebento, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

63

Quadro 7 - Médias do peso fresco e peso seco da parte aérea dos rebentos (PFA e PSA), do callus (PFC e PSC) e das raízes (PFR e PSR) para cada modalidade, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

63

Quadro 8 - Médias do número de raízes por rebento, do comprimento total das raízes por rebento e da dimensão do callus para cada modalidade, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

64

Quadro 9 - Número de rebentos do clone R1934 instalados e número de rebentos sobreviventes, número de rebentos com callus friável e número e percentagem de rebentos enraizados, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2).

66

Quadro 10 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA na presença de raízes, na dimensão do callus e no número de raízes por rebento, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2).

67

Quadro 11 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA no comprimento das raízes (COMPR), ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2).

67

Quadro 12 - Médias do número de raízes por rebento, do comprimento total das raízes por rebento e da dimensão do callus para cada modalidade, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2).

68

Quadro 13 - Número e percentagem de discos enraizados e número médio de raízes por disco, ao fim de quatro semanas in vitro (Ensaio 3).

70 ix

Quadro 14 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da concentração de IBA no tipo e na dimensão do callus formado durante a fase de enraizamento in vitro de discos caulinares (Ensaio 3).

70

Quadro 15 - Número e percentagem de discos enraizados e número médio de raízes por disco, ao fim de quatro semanas in vitro (Ensaio 4).

72

Quadro 16 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA no tipo e na dimensão do callus formado durante a fase de enraizamento in vitro de discos caulinares (Ensaio 4).

72

x

Lista de Figuras Pág. Capítulo III - Iniciação e estabelecimento in vitro de culturas de pereiras ‘Rocha’ e ‘Williams’ Figura 1 - Aspecto dos explantados de ‘Rocha’ (clones C3A4, R307/ 51 e T32) treze dias após a instalação in vitro em meio com sais MS ou QL contendo 0,5 mg/L, 1 mg/L ou 2 mg/L de BAP.

36

Figura 2 - Aspecto dos explantados de ‘Rocha’ - clones C3A4 (A), R307/ 51 (B) e T32 (C) após quatro semanas de instalação in vitro em meio com sais MS ou QL contendo 0,5 mg/L, 1 mg/L ou 2 mg/L de BAP.

37

Figura 3 - Influência do clone de ‘Rocha’ (A), da composição salina (B) e da concentração de BAP (C) na frequência de explantados por classe de desenvolvimento no final da fase de estabelecimento in vitro (1- ‘gomo inchado’; 2- ‘gomo em início de desenvolvimento’; 3‘rebento com desenvolvimento’).

39

Figura 4 - Aspecto dos explantados de ‘Williams’ após seis semanas de instalação in vitro em meio com sais MS ou QL contendo 0,5 mg/L, 1 mg/L ou 2 mg/L de BAP.

43

Figura 5 - Influência da composição salina (A) e da concentração de BAP (B) na frequência de explantados por classe de desenvolvimento, no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Williams’ (1- ‘gomo inchado’; 2- ‘gomo em início de desenvolvimento’; 3- ‘rebento com desenvolvimento’).

45

Figura 6 - Médias do peso fresco e do peso seco dos rebentos referentes aos factores composição salina (A) e concentração de BAP (B), obtidas no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Williams’.

47

Capítulo IV - Enraizamento in vitro de rebentos e de discos caulinares de pereira ‘Rocha’ Figura 1 - Disposição dos discos caulinares numa placa de Petri de 9 cm de diâmetro contendo 25 ml de meio de enraizamento com IBA (De notar que os discos foram distribuidos por cinco linhas e quatro colunas para uma fácil referência).

57

Figura 2 - Rebentos do clone PR4 em meio de indução com 10 M de IBA, 10 dias após a instalação do ensaio (5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA) (Ensaio 1).

61

Figura 3 - Aspecto dos rebentos do clone PR4 sujeitos às diferentes modalidades de exposição ao IBA, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 42D- 42 dias com IBA, os 5 primeiros dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal) (Ensaio 1).

61

Figura 4 - Influência da modalidade de exposição ao IBA (5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 42D- 42 dias com IBA, os 5 primeiros dias no escuro e os restantes sob

64

xi

fotoperíodo normal) sobre a frequência de rebentos por classe de dimensão do callus (1reduzida; 2- moderada; 3- elevada), ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1). Figura 5 - Rebentos do clone R1934 em meio de indução com 10 M de IBA, 10 dias após a instalação do ensaio (5D- 5 dias no escuro com IBA; 10D- 10 dias no escuro com IBA) (Ensaio 2).

65

Figura 6 - Aspecto dos rebentos do clone R1934 sujeitos às diferentes modalidades de exposição ao IBA, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (5D- 5 dias no escuro com IBA; 10D- 10 dias no escuro com IBA) (Ensaio 2).

66

Figura 7 - Influência da modalidade de exposição ao IBA (5D- 5 dias no escuro com IBA; 10D10 dias no escuro com IBA) sobre a frequência de rebentos por classe de dimensão do callus (1reduzida; 2- moderada; 3- elevada), ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2).

68

Figura 8 - Aspecto dos discos caulinares ao fim de quatro semanas in vitro (De notar a diferença entre callus ‘gelatinoso’, de cor creme (A) e callus ‘filamentoso’, de cor branca (B)).

69

Figura 9 - Influência da concentração de IBA sobre a frequência de discos caulinares por tipo de callus (‘gelatinoso’ ou ‘filamentoso’) e sua presença nos discos, ao fim de quatro semanas in vitro (Ensaio 3).

71

Figura 10 - Influência da modalidade de exposição ao IBA sobre a frequência de discos caulinares por tipo de callus (‘gelatinoso’ ou ‘filamentoso’) e sua presença nos discos, ao fim de quatro semanas in vitro (Ensaio 4).

72

xii

I. INTRODUÇÃO A pereira ‘Rocha’ foi obtida casualmente no concelho de Sintra há aproximadamente 150 anos (IMAIAA, 1999). A árvore-mãe desta cultivar, que produzia frutos de excelente qualidade, terá surgido numa propriedade designada por ‘Fazenda do Rocha’ pertencente a Pedro António Rocha, razão pela qual se tornou conhecida pelo nome de ‘Rocha’ (Castilho, 1937; Silva, 1991 e 1996). A cultura desta nova cultivar estendeu-se inicialmente aos concelhos de Mafra e Lourinhã, e posteriormente a toda a Região do Oeste (concelhos de Torres Vedras, Cadaval, Bombarral, Óbidos, Peniche, Caldas da Rainha e Alcobaça) (Silva, 1991 e 1996). Hoje em dia, a ‘Rocha’ é a cultivar de pereira predominante em Portugal ocupando cerca de 75 % dos pomares de pereira nacionais. Destes pomares, 97 % encontram-se distribuidos por toda a Região Centro do País (IMAIAA, 1999). A pêra ‘Rocha’ é muito apreciada pelas suas qualidades organolépticas, resistência ao transporte e boa aptidão para a conservação (Castilho, 1937). Esta cultivar não é muito exigente em frio invernal. As suas necessidades de frio ficam preenchidas com cerca de 550 horas abaixo de 7 ºC, a partir de 15 de Fevereiro (Silva, 1996). Em 1992, aproximadamente 60 % dos pomares de pereiras apresentavam baixas densidades de cultivo, inferiores a 800 árvores/ ha (INE, 1993). Tratava-se de pomares de sequeiro com sistema de condução em vaso (Silva, 1996). Sendo a fruticultura uma actividade cada vez mais virada para uma economia de mercado, tornou-se imperioso reconverter os pomares tradicionais em plantações mais intensivas conduzidas com maior rigor técnico e aproveitando melhor o terreno (Silva, 1991). O aumento das densidades de plantação implica a necessidade de um maior número de plantas produzidas e um aumento da eficiência dos sistemas de propagação vegetativa (Silva, 1996). Tendo como objectivo a selecção dos melhores clones de ‘Rocha’, encontram-se em curso no País ensaios comparativos de diversos clones oriundos das principais zonas de produção. Os clones resultantes dessa selecção deverão ser rapidamente propagados e instalados em pomares comerciais, podendo ser vantajoso recorrer à sua propagação in vitro. De facto, a produção de plantas micropropagadas tem interesse para a instalação de pomares de elevada densidade (Al-Maarri et al., 1994) por ser um processo de 1

multiplicação mais rápido e menos exigente em espaço do que os métodos de propagação convencionais (Pierik, 1987). A propagação convencional de pereira é realizada por enxertia em porta-enxertos francos (Pyrus communis L.) ou em marmeleiros (Cydonia oblonga L.) propagados por estacaria (Marino, 1984; Baviera et al., 1989; Al-Maarri et al., 1994). A obtenção de pereiras por este método demora pelo menos 2 anos em viveiro, o que exige uma grande disponibilidade em mão-de-obra e espaço (Al-Maarri et al., 1994). Quando a enxertia é efectuada em marmeleiros, as árvores resultantes são de menor dimensão, mais homogéneas e entram em produção mais cedo do que as enxertadas em franco (Baviera et al., 1989). No entanto, tem-se verificado casos de incompatibilidade entre o marmeleiro e certas cultivares de pereira (Marino, 1984; Baviera et al., 1989; Sansavini, 1994), bem como uma tolerância insatisfatória do marmeleiro a solos calcários (Baviera et al., 1989). Além disso, as pereiras, bem como outras árvores de fruto, apresentam-se frequentemente infectadas por vírus e patogénios afins que são transmissíveis pelos métodos convencionais de propagação (Rebelo e Corvo, 1996). De um modo geral, as árvores infectadas por tais microrganismos não apresentam uma sintomatologia evidente, mas os mesmos podem causar perda de produtividade e diminuição da qualidade dos frutos (Corvo e Duarte, 1993; Corvo et al., 1995). A propagação in vitro de clones seleccionados associada a um esquema de saneamento de vírus e patogénios afins permite a disponibilização de material vegetativo de qualidade em boas condições fitossanitárias.

Este relatório começa com uma revisão bibliográfica sobre os temas em análise, a que se seguem dois capítulos (III e IV) relativos à parte experimental realizada. As referências bibliográficas sobre micropropagação referem-se quase exclusivamente a cultivares estrangeiras do género Pyrus, uma vez que para a pereira ‘Rocha’ foi encontrada reduzida informação. No capítulo III apresenta-se um ensaio em que se avaliou a influência do meio de cultura (composição salina e concentração de BAP) sobre o estabelecimento in vitro de pereira ‘Rocha’ a partir de estacas uninodais provenientes de rebentos colhidos durante o período de crescimento activo. Para fins comparativos, realizou-se ainda um ensaio semelhante com pereira ‘Williams’.

2

Atendendo a que a fase de enraizamento é geralmente considerada limitante no processo de micropropagação, apresenta-se no capítulo IV diversos ensaios em pereira ‘Rocha’ sobre o enraizamento in vitro de rebentos micropropagados e de discos caulinares retirados de rebentos micropropagados. Nestes ensaios avaliou-se o efeito de diferentes modalidades de indução do enraizamento in vitro de rebentos e de discos caulinares, e de diferentes concentrações de auxina na rizogénese de discos caulinares. Nos ensaios de enraizamento de rebentos recorreu-se a culturas in vitro de material juvenil e adulto, enquanto nos ensaios com discos caulinares apenas se utilizou material juvenil, pois não foi possível dispor de material adulto em quantidade suficiente.

O trabalho realizado insere-se no âmbito de dois projectos em curso, o projecto PAMAF n.º 6073 intitulado ‘Micropropagação de pereira Rocha e macieira Bravo Esmolfe com vista à multiplicação alargada de clones promissores e ao melhoramento genético’ e o projecto PRAXIS 3/3.2/HORT/2143/95 intitulado ‘Saneamento e melhoramento de fruteiras portuguesas por métodos biotecnológicos’.

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II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1. A cultura in vitro de tecidos vegetais 1.1. Aspectos gerais Em 1838 estabeleceu-se a base para a cultura de células e tecidos vegetais com a teoria de Schwann e Schleiden. Esta teoria postula que as células vegetais possuem capacidade de autonomia e totipotência, podendo regenerar uma nova planta (Pierik, 1987; Gonçalves, 1992). As primeiras tentativas de cultivar células e tecidos vegetais, realizadas por Haberlandt em 1902, não foram bem sucedidas. No entanto, entre 1907 e 1909, alguns investigadores conseguiram cultivar tecidos animais in vitro. Em 1939, Nobécourt, Gautheret e White conseguiram obter a primeira cultura prolongada de callus, iniciando-se então a chamada cultura in vitro de tecidos vegetais (Pierik, 1987; Gonçalves, 1992). As plantas são constituidas por diferentes orgãos que, por sua vez, são constituidos por vários tipos de tecidos. Assim, é possível realizar diversos tipos de cultura in vitro como a cultura de gomos axilares e apicais, de meristemas, embriões, células, protoplastos, callus, anteras, secções de folhas, caules ou raízes, e outras (Pierik, 1987; Gonçalves, 1992). De acordo com Pierik (1987) e Kwapata (1999), o termo in vitro é utilizado para descrever um ambiente de cultura estéril e artificial. O estabelecimento e o desenvolvimento de culturas in vitro são influenciados por diversos factores, entre os quais a constituição genética da planta-mãe, os constituintes minerais e orgânicos do meio de cultura (água, macro e micronutrientes, hidratos de carbono, reguladores de crescimento e vitaminas), e os factores físicos de crescimento (luz, temperatura, pH do meio, concentrações de O2 e CO2) (Pierik, 1987). Na cultura in vitro, estes factores têm de ser regulados artificialmente. As plantas cultivadas in vitro não são completamente autotróficas (Pierik, 1987), logo é necessário adicionar ao meio de cultura açúcares, como fonte de carbono e energia. Segundo Debergh e Read (1991), o processo de micropropagação inclui cinco fases: fase 0 - preparação das plantas-mãe para a obtenção de material são; fase 1 - iniciação e estabelecimento de culturas em condições assépticas; fase 2 - multiplicação do material em 4

cultura; fase 3 - alongamento dos rebentos e indução da rizogénese; fase 4 - aclimatização das plantas. Para que a micropropagação de qualquer espécie seja comercialmente viável é essencial que o material vegetal possua capacidade de multiplicação, de formação de raízes e de sobrevivência uma vez transferido para o solo (Rossi et al., 1991), e que o processo seja económico em comparação com o método tradicional (Pierik, 1987).

1.2. Aplicações a fruteiras lenhosas A cultura de tecidos in vitro tem numerosas aplicações em fruticultura, como a micropropagação, a obtenção e multiplicação de material isento de vírus e patogénios afins, o melhoramento genético através da transformação genética, da selecção de mutações in vitro ou da produção de híbridos somáticos por fusão de protoplastos, a regeneração de plantas a partir de protoplastos ou callus, a conservação in vitro de germoplasma, e o fornecimento de material para estudos fisiológicos e bioquímicos (Singha, 1986; Hutchinson e Zimmerman, 1987; Pierik, 1987; Gonçalves, 1992). Um dos principais objectivos da cultura de tecidos é a produção de material vegetal livre de infecções internas e/ ou externas, causadas por vírus, micoplasmas, bactérias e/ ou fungos (Pierik, 1987). As infecções referidas são facilmente transmitidas pelos processos convencionais de propagação vegetativa, o que implica uma diminuição do vigor e longevidade das plantas, da produção e da qualidade dos frutos (Corvo e Duarte, 1993). Alguns métodos de produção de material vegetal isento de vírus e de patogénios afins são a termoterapia, a cultura de meristemas (Corvo e Duarte, 1993), a utilização de rebentos adventícios seguida de cultura de meristemas, a microenxertia em porta-enxertos livres de vírus, e a cultura de callus ou de protoplastos (Pierik, 1987). É de referir que a cultura de meristemas também permite obter plantas livres de bactérias e fungos (Pierik, 1987; Corvo e Duarte, 1993). A micropropagação representa provavelmente a aplicação mais significativa da cultura de tecidos. Em fruteiras lenhosas permite multiplicar árvores que não podem ser propagadas por semente ou por métodos convencionais de propagação vegetativa, obter plantas de genótipos superiores em maiores quantidades e mais rapidamente, obter plantas autoenraizadas (Zimmerman, 1991) dispensando a operação de enxertia e os gastos associados à mesma, rejuvenescer árvores adultas por meio da microenxertia in vitro ou do 5

aproveitamento da rebentação adventícia, multiplicar material vegetal isento de agentes patogénicos, e disponibilizar novas cultivares para comercialização (Singha, 1986; Hutchinson e Zimmerman, 1987; Pierik, 1987; Gonçalves, 1992; Kwapata, 1999). Recorrendo a árvores autoenraizadas para estabelecer novos pomares evita-se a disseminação de doenças virais resultantes da utilização de porta-enxertos infectados, os problemas de incompatibilidade fisiológica entre o porta-enxerto e o garfo são eliminados, e há a possibilidade de produzir rapidamente um elevado número de árvores que, em geral, são mais altas e vigorosas e atingem maior produção individual devido a copas de maior dimensão, embora este tipo de árvores não se adapte a compassos estreitos e entre mais tarde em produção (Lane, 1979; Hutchinson e Zimmerman, 1987; Kader et al., 1991; Zimmerman, 1991; Sansavini, 1994). No entanto, a produtividade do pomar constituido por este tipo de árvores ainda está por investigar, assim como a integridade genética das árvores micropropagadas (Shen e Mullins, 1984). Por outro lado, há que considerar que as espécies lenhosas são bastante mais difíceis de propagar in vitro do que as espécies herbáceas (Pierik, 1987; Gonçalves, 1992). Este facto deve-se, entre outras causas, a uma reduzida capacidade de regeneração, à maior dificuldade de desinfecção do material inicial devido a um maior grau de contaminação por agentes patogénicos endógenos, à maior dificuldade em induzir o rejuvenescimento do material vegetal, à ocorrência de períodos de dormência fisiológica, a uma maior tendência para a exsudação de substâncias tóxicas (fenóis e polifenóis), à maior variabilidade genética, e a dificuldades no estabelecimento em cultivo de explantados provenientes de material com características fisiológicas adultas. Certos sistemas de propagação in vitro possibilitam a ocorrência de instabilidade genética

(Pierik,

1987;

Gonçalves,

1992),

aspecto

bastante

desfavorável

à

micropropagação. De facto, para que o uso de plantas micropropagadas se generalize, é essencial que as mesmas sejam fenotipicamente idênticas ao clone original e tão estáveis, do ponto de vista genético, como as plantas produzidas pelos métodos convencionais de propagação (Hutchinson e Zimmerman, 1987). A probabilidade de ocorrência de mutações aumenta com o número de subculturas, o uso de certos reguladores de crescimento (2,4-D, NAA e citocininas sintéticas) e o método de propagação utilizado (Pierik, 1987). A expressão das mutações depende das

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condições ambientais. Para identificar os mutantes pode recorrer-se a métodos citológicos ou à electroforese para analisar padrões de isoenzimas (Pierik, 1987). Segundo Pierik (1987) e Zimmerman (1991), a estabilidade genética de uma dada planta é conseguida através da cultura de meristemas e do aproveitamento da rebentação axilar. A embriogénese somática e a rebentação adventícia são métodos que não garantem a integridade genética das plantas obtidas. Embora permita obter plantas isentas de vírus a partir de plantas-mãe contaminadas, a cultura de meristemas não é muito utilizada porque é um processo moroso e não permite taxas de sobrevivência razoáveis (Pierik, 1987).

2. Iniciação e estabelecimento in vitro de culturas a partir de material vegetal adulto 2.1. Origem do material vegetal Para o estabelecimento de culturas in vitro pode recorrer-se a explantados (meristemas, ápices meristemáticos, estacas apicais ou estacas nodais) provenientes de plantas mantidas sob condições controladas em estufas ou câmaras de crescimento (Singha, 1982; Al-Maarri et al., 1986, 1987; Hirabayashi et al., 1987; Webster e Jones, 1989; Rossi et al., 1991; Al-Maarri et al., 1994) ou de plantas ao ar livre (Lane, 1979; Bhowani et al., 1984; Marino, 1984; Banno et al., 1989; Stimart e Harbage, 1989; Dolcet-Sanjuan et al., 1990; Kader et al., 1991; Rodríguez et al., 1991; Wang et al., 1994; Yeo e Reed, 1995; Shibli et al., 1997). A instalação de culturas em condições assépticas é especialmente problemática quando o material vegetal provem de plantas ao ar livre (Pierik, 1987). Para que a cultura in vitro seja bem sucedida o material vegetal deve ser obtido a partir de plantas sãs e em condições fisiológicas adequadas. A idade das plantas-mãe e o seu estado fisiológico vão influenciar o desenvolvimento in vitro dos explantados. De facto, a capacidade regenerativa é menor em plantas adultas. Assim, é preferível utilizar plantas, ou partes de plantas, jovens como fonte de material vegetal de partida para a instalação in vitro (Pierik, 1987). Também os gomos obtidos a partir de plantas dormentes (Outono e princípio do Inverno) são mais difíceis de

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cultivar in vitro do que os obtidos a partir de plantas que quebraram a dormência fisiológica (Wang et al., 1994). Quando se recorre a explantados obtidos de plantas ao ar livre a probabilidade de contaminação diminui se se utilizar tecidos isolados do interior das plantas ou tecidos protegidos de alguma outra forma. Assim, quando se utiliza material do campo deve-se dar preferência a gomos não dormentes com escamas, armazenar ramos a baixa temperatura que serão usados consoante a necessidade, proteger as partes da planta que interessam com protecções plásticas, e utilizar rebentos formados há pouco tempo quando a colheita é realizada durante o período de crescimento vegetativo (Pierik, 1987). Em diversos estudos realizados com Pyrus spp. utilizou-se como material vegetal ramos colhidos na fase de repouso vegetativo (ramos de Inverno) (Shen e Mullins, 1984; Baviera, 1989; Dolcet-Sanjuan et al., 1990; Kader et al., 1991; Rossi et al., 1991; Vasilakakis, 1991; Wang, 1992; Yeo e Reed, 1995), ou ramos em crescimento activo (Lane, 1979; Singha, 1982; Hirabayashi et al., 1987; Banno et al., 1989; Al-Maarri et al., 1994). O material colhido durante o período de repouso vegetativo pode sofrer um tratamento de frio antes da sua utilização (Jacoboni e Standardi, 1982; Shen e Mullins, 1984; Baviera et al., 1989; Vasilakakis, 1991; Wang, 1992) ou pode ser colocado em água com o objectivo de forçar o abrolhamento dos gomos (Marino, 1984; Dolcet-Sanjuan et al., 1990; Kader et al., 1991; Rodríguez et al., 1991; Yeo e Reed, 1995; Shibli et al., 1997). A escolha do processo a utilizar depende de já ter sido ou não ultrapassada a fase de dormência fisiológica. Antes da forçagem dos ramos em repouso vegetativo pode-se recorrer a um tratamento com fungicida (Marino, 1984; Baviera et al., 1989) ou a uma lavagem dos ramos com água e detergente, após o que são imersos em água corrente durante 30 minutos (Yeo e Reed, 1995). A forçagem pode ser conseguida através da permanência dos ramos numa solução nutritiva em câmara de crescimento (Marino, 1984) ou em estufa (Yeo e Reed, 1995), da colocação dos ramos em água a temperatura controlada ou não (Dolcet-Sanjuan et al., 1990; Rodríguez et al., 1991; Vasilakakis, 1991; Shibli et al., 1997) ou de enxertia (Shen e Mullins, 1984).

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2.2. Desinfecção do material inicial O material vegetal a utilizar possui, de um modo geral, microrganismos à superfície que têm de ser eliminados por desinfecção superficial dos tecidos (Pierik, 1987) para que o crescimento dos explantados em cultura não seja afectado. Quando as contaminações são endógenas, como sucede com contaminações bacterianas, não é possível eliminá-las com nenhuma técnica de esterilização superficial. Segundo Pierik (1987) e Gonçalves (1992), este problema pode ser solucionado recorrendo à cultura de meristemas ou à adição de antibióticos ao meio de cultura. No entanto, o melhor modo de combater este problema é a utilização de plantas-mãe não contaminadas, pois a cultura de meristemas é um processo complicado e moroso e o uso de antibióticos é, na maioria dos casos, ineficaz e dispendioso. Stimart e Harbage (1989), utilizando gomos axilares de Pyrus calleryana, não realizaram qualquer desinfecção superficial do material vegetal, apenas removeram as escamas dos gomos antes de os colocarem no meio de cultura. No entanto, a maioria dos investigadores efectua uma desinfecção superficial do material vegetal inicial que, quando se trata de ramos colhidos durante o período de crescimento vegetativo, é realizada após a remoção das folhas dos ramos. A acção dos agentes desinfectantes é assim facilitada, pois penetram pelas feridas deixadas pela remoção dos pecíolos (Pierik, 1987). Em pereira e macieira, Debergh e Read (1991), Kader et al. (1991) e Yeo e Reed (1995) removeram as folhas dos ramos, colocando-os depois em água corrente durante um período de 5 minutos a 2 horas antes da desinfecção. De um modo geral, a desinfecção do material inicial é realizada por imersão com agitação numa solução de hipoclorito de sódio, à qual se pode adicionar Tween 20, durante 10 a 20 minutos, seguida de lavagens sucessivas com água destilada e esterilizada (Singha, 1982; Shen e Mullins, 1984; Baviera et al., 1989; Dolcet-Sanjuan et al., 1990; Rossi et al., 1991; Baraldi et al., 1993; Yeo e Reed, 1995; Shibli et al., 1997). Banno et al. (1989), Rodríguez et al. (1991), Vasilakakis (1991) e Al-Maarri et al. (1994) recorreram à pré-esterilização dos explantados com etanol antes da desinfecção com hipoclorito de sódio. A adição de um agente molhante como o Tween 20 permite diminuir a tensão superficial e, consequentemente, favorecer o contacto do desinfectante com o material vegetal. A agitação parece permitir o contacto dos explantados e contaminantes com a 9

solução esterilizante por remoção das bolhas de ar (Hutchinson e Zimmerman, 1987; Pierik, 1987).

2.3. Composição do meio de cultura Na fase de estabelecimento de Pyrus spp., os explantados são quase sempre colocados em meios com sais inorgânicos de MS. A fonte de carbono mais utilizada é a sacarose na concentração de 30 g/L. As vitaminas são usadas em combinações e concentrações variáveis, dependendo dos autores (Al-Maarri et al., 1994; Wang et al., 1994; Shibli et al., 1997). O agente solidificante utilizado é o agar, em concentrações que variam entre 5 g/L e 7 g/L. O regulador de crescimento mais usado é a citocinina BAP, geralmente na concentração de 0,5 mg/L (Shen e Mullins, 1984; Shibli et al., 1997) ou de 1 mg/L (Lane, 1979; Bhojwani et al., 1984; Dolcet-Sanjuan et al., 1990; Yeo e Reed, 1995), isoladamente ou em combinações com auxinas e/ ou giberelinas (Banno et al., 1989; Baviera et al., 1989; Al-Maarri et al., 1994; Wang et al., 1994). As citocininas vão inibir a dominância apical e estimular o desenvolvimento dos gomos axilares (Pierik, 1987). Pierik (1987) e Wang et al. (1994) referem que a adição de carvão activado ao meio de cultura pode promover a embriogénese somática, o crescimento in vitro e a organogénese dos tecidos vegetais em espécies lenhosas. O carvão activado absorve substâncias existentes no meio de cultura e na atmosfera, como compostos fenólicos, 5-hidroximetilfurfural (produzido pela autoclavagem da sacarose), impurezas do agar e etileno, que prejudicam o desenvolvimento das culturas (Weatherhead et al., 1979; Pierik, 1987). No entanto, a acção do carvão activado também pode ser prejudicial para as culturas in vitro, pois pode absorver compostos orgânicos como auxinas, citocininas ou vitaminas existentes no meio de cultura (Pierik, 1987). No estabelecimento de Pyrus spp., o pH do meio de cultura tem variado entre 5,2 e 5,8 (Lane, 1979; Singha, 1982; Al-Maarri et al., 1986; Hirabayashi et al., 1987; DolcetSanjuan et al., 1990).

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2.4. Condições ambientais de cultura As culturas de Pyrus spp. são geralmente mantidas a uma temperatura próxima de 25 ºC. No entanto, Rossi et al. (1991) referem uma temperatura de 20 ºC e Lane (1979) e Hirabayashi et al. (1987) de 28 ºC. O fotoperíodo e a intensidade luminosa mais comumente usados têm sido 16 horas e 25 a 60 mol.m-2.s-1 de PAR, respectivamente.

2.5. Problemas de oxidações O acastanhamento dos tecidos dos explantados estabelecidos in vitro é um problema que afecta com frequência a micropropagação de plantas lenhosas (Pierik, 1987; Debergh e Read, 1991; Wang et al., 1994). Durante a preparação dos explantados e a instalação em cultura, os compostos fenólicos presentes nos tecidos vegetais são oxidados pelas polifenoloxidases, tendo como consequência o acastanhamento das superfícies cortadas e do meio de cultura, o que pode conduzir à morte dos explantados (Debergh e Read, 1991; Wang et al., 1994). Para diminuir a incidência de oxidações pode recorrer-se a subculturas frequentes (Banno et al., 1989; Kader et al., 1991; Shibli et al., 1997) com o objectivo de evitar a acumulação de fenóis no meio (Pierik, 1987), à adição de substâncias antioxidantes ao meio de cultura, como o carvão activado (Weatherhead, 1979; Pierik, 1987; Wang et al., 1994), o PVP (Pierik, 1987; Wang et al., 1994), e a cisteína-HCl (Pierik, 1987; Kader et al., 1991), à imersão dos explantados em soluções antioxidantes como DIECA a 2g/L (Pierik, 1987), e/ou à redução da concentração de sais no meio de cultura (Pierik, 1987). Wang et al. (1994) constataram que as variações sazonais influenciaram significativamente o acastanhamento de ápices caulinares de pereira ‘Jinhua’ (Pyrus bretschneideri) estabelecidos in vitro. As percentagens de acastanhamento menores surgiram no material vegetal resultante da forçagem de ramos colhidos entre Novembro e Fevereiro, enquanto que as mais elevadas surgiram durante o período de crescimento (Abril a Agosto). A redução do acastanhamento foi obtida colocando os explantados num meio de cultura com carvão activado durante 6 dias antes da transferência para o meio de estabelecimento, mantendo os explantados no escuro à temperatura de 5 ºC durante 6 a 8 dias antes da passagem para 24 ºC à luz e retirando os explantados da planta-mãe após a entrada desta em dormência ou após ter permanecido no escuro durante 4 semanas. 11

3. Enraizamento in vitro de rebentos e de discos caulinares 3.1. Enraizamento in vitro de rebentos 3.1.1. Aspectos gerais O enraizamento é uma etapa essencial para a propagação vegetativa das plantas (Collet et al., 1994). No entanto, a maioria das espécies lenhosas apresenta uma reduzida capacidade de formação de raízes (Damiano et al., 1991). O processo de rizogénese engloba diferentes fases. Damiano et al. (1991) dividemno em três fases: indução, expressão e alongamento das raízes. De Klerk et al. (1995) consideram também três fases: (1) 0-24 horas: desdiferenciação, durante a qual as células desenvolvem competência para responder ao sinal da rizogénese; (2) 24 - 72/ 96 horas: indução, em que as células ficam determinadas para formar raízes e (3) após 72/ 96 horas: diferenciação morfológica, em que as raízes se desenvolvem. No entanto, Moncousin (1991b) divide a rizogénese adventícia em seis fases distintas: inexistência de alterações citológicas visíveis, dilatação do núcleo das células que irão formar o primórdio, ocorrência de divisões periclinais do câmbio, presença de um grupo de células com determinadas características morfogenéticas, aparecimento do meristema radical ainda incluído nos tecidos do rebento (meristemóide) e emergência da primeira raiz. Collet et al. (1994) referem que para promover a rizogénese é fundamental a presença de auxinas (endógenas ou exógenas) e de células que reajam a estímulos químicos como os reguladores de crescimento. Essas células originam então primórdios radiculares após a sua multiplicação. A formação de raízes adventícias está intimamente relacionada com a razão citocinina/ auxina. De facto, concentrações de citocininas demasiado elevadas inibem o enraizamento tanto em monocotiledóneas como em dicotiledóneas (Pierik, 1987). As exigências hormonais são diferentes e específicas em cada fase do processo de rizogénese (De Klerk et al., 1995). É durante a fase de indução do enraizamento que a correcta razão citocinina/ auxina é mais importante. Quando aplicadas em excesso durante esta fase, as citocininas inibem fortemente a formação de raízes (De Klerk e Brugge, 1992; De Klerk et al., 1993). Assim, durante a fase de indução é essencial a aplicação de um nível elevado de auxinas e baixo de citocininas (De Klerk et al., 1995). 12

Por vezes, a simples presença de citocininas residuais nos rebentos transferidos para o meio de enraizamento parece inibir a rizogénese (De Klerk e Brugge, 1992). Por outro lado, concentrações elevadas de auxina durante a fase de multiplicação dos rebentos conduzem a uma menor sensibilidade hormonal e reduzem a capacidade de formação de raízes (De Klerk e Brugge, 1992).

3.1.2. Factores que influenciam a rizogénese em rebentos O sucesso do enraizamento depende do clone (Al-Maarri et al.,1987; De Klerk et al., 1990; Kader et al., 1991), da cultivar (Zimmerman, 1984; Kader et al., 1991; Collet et al., 1994), do estado fisiológico dos rebentos quando são retirados do meio de multiplicação (Zimmerman e Fordham, 1985; De Klerk et al., 1990), do número de subculturas (Sriskandarajah et al., 1982; Zimmerman e Fordham, 1985; Webster e Jones, 1989), da composição do meio de cultura e do tipo de tratamento auxínico utilizado (De Klerk et al., 1990), e das condições ambientais durante o enraizamento, nomeadamente da temperatura e do fotoperíodo (Sriskandarajah et al., 1982; Zimmerman e Fordham, 1985), entre outros factores.

3.1.2.1. Características fisiológicas e morfológicas dos rebentos utilizados Em Pyrus spp. e Malus spp., vários autores verificaram que a percentagem de enraizamento dos rebentos aumentou com o número de subculturas anteriores ao enraizamento (Sriskandarajah et al., 1982; Bhojwani et al., 1984; Zimmerman e Fordham, 1985; Banno et al., 1989; Webster e Jones, 1989; Al-Maarri et al., 1994). Este comportamento poderá indicar um rejuvenescimento devido a subculturas repetidas, aumentando assim a capacidade de regeneração dos rebentos (Sriskandarajah et al., 1982; Damiano et al., 1991). De facto, Bhojwani et al. (1984) e Banno et al. (1989) verificaram que rebentos obtidos a partir de semente enraizaram mais facilmente do que aqueles obtidos a partir de material adulto. Denissen et al. (1992) referem que percentagens de enraizamento baixas e flutuações no enraizamento de uma subcultura para outra podem dever-se a um rejuvenescimento insuficiente dos rebentos. De acordo com Baviera et al. (1989) e Moncousin (1991c), os rebentos com maior número de folhas e com folhas bem desenvolvidas enraizam melhor e produzem um maior

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número de raízes por rebento. No entanto, Druart (1994) menciona que as folhas e o ápice apenas contribuem para uma emergência mais rápida das raízes e para o seu alongamento. O comprimento mais favorável dos rebentos utilizados em ensaios de enraizamento in vitro de Pyrus spp. e de Malus spp. varia entre 0,5 e 3 cm, dependendo dos autores (Lane, 1979; Baviera et al., 1989; Webster e Jones, 1989; Al-Maarri et al., 1986 e 1994; Kader et al., 1991). Em Pyrus calleryana, Rossi et al. (1991) testaram três comprimentos de rebentos (1 a 2, 2 a 3, 3 a 5 cm) em meios com sais de MS com concentração reduzida a 1/2 ou a 1/4. A melhor indução do enraizamento foi observada em rebentos de 2 a 3 cm (comprimentos superiores não melhoraram o enraizamento). Não houve diferenças significativas na percentagem de enraizamento de rebentos com 3 a 5 cm instalados em meio MS/2 relativamente aos instalados em meio MS/4. Rebentos mais pequenos enraizaram melhor em meio MS/2. Alguns investigadores efectuaram cortes longitudinais na base de rebentos de macieira antes de os colocarem no meio de cultura, tendo como resultado o aumento da percentagem de enraizamento e do número de raízes por rebento (Sriskandarajah e Mullins, 1981; Puente e Marín, 1992). Esses resultados podem dever-se a uma capacidade superior de absorção dos nutrientes e reguladores de crescimento existentes no meio, motivada pela eliminação de possíveis barreiras anatómicas (vasos de esclerênquima) presentes no caule dos rebentos (Pierik, 1987). No entanto, o aumento da área de corte implica um aumento da produção e libertação de etileno e de produtos derivados da oxidação dos fenóis (Pierik, 1987). Em macieira, verificou-se que quando se recorreu ao estiolamento dos rebentos antes da fase de enraizamento, a percentagem de rebentos enraizados teve tendência para aumentar (James, 1983; Zimmerman, 1984; Webster e Jones, 1989). Contudo, em pereira, Dolcet-Sanjuan et al. (1990) referem que o estiolamento exerceu um efeito prejudicial sobre a formação das raízes.

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3.1.2.2. Tipo de tratamento auxínico A indução da rizogénese pode ser conseguida por imersão da parte basal dos rebentos numa solução ou formulação em pó com uma concentração auxínica elevada, ou por permanência num meio de cultura com auxinas, após o que os rebentos são geralmente transferidos para um meio de cultura desprovido de auxinas. As auxinas são essenciais para o enraizamento. No entanto, são consideradas favoráveis apenas durante a fase de iniciação radicular (Banno et al., 1989). A permanência dos rebentos em meio com auxinas depois desta fase inibe, na maioria dos casos, a expressão e o alongamento das raízes (De Klerk et al., 1990; Druart, 1996). James e Thurbon (1979) verificaram que rebentos de macieira (porta-enxerto M9) deixados em meio com auxina apresentavam maior quantidade de callus na superfície de corte, visto que as auxinas promovem divisões celulares contínuas, e menos raízes. Welander (1983) e Pierik (1987) referem que concentrações baixas de auxinas (até 5 M) promovem a formação de raízes adventícias em rebentos de macieira (porta-enxerto M26), enquanto que concentrações elevadas promovem a formação de callus. Em rebentos de Pyrus calleryana, a presença de callus pode prejudicar a formação e o desenvolvimento das raízes (Berardi et al., 1991). No entanto, Yeo e Reed (1995) obtiveram a maior percentagem de enraizamento com rebentos de Pyrus communis ‘Old Home’ x ‘Farmingdale 230’ que apresentavam mais callus. Tem-se também verificado que a presença de callus na base dos rebentos prejudica a capacidade de sobrevivência das plantas durante a aclimatização (Welander, 1983). A sensibilidade às auxinas exógenas, das quais as mais usadas são o IBA e o NAA, depende da concentração utilizada, da duração do tratamento, do genótipo e do estado ontogénico (juvenil versus adulto) do material vegetal. Este facto que pode estar relacionado com diferentes níveis de auxinas endógenas, como o IAA, e/ ou diferenças no metabolismo das auxinas (Welander, 1983). De acordo com Baraldi et al. (1993), as diferenças na absorção e no metabolismo das auxinas exógenas podem afectar a capacidade de enraizamento e o desenvolvimento das raízes em rebentos de pereira. Pode concluir-se que na maioria dos ensaios realizados em pereira e macieira o IBA foi a auxina mais eficaz na indução da rizogénese in vitro, pois permitiu obter melhores percentagens de enraizamento e formação de callus de menor dimensão, em comparação com o NAA (Marino, 1984; Zimmerman e Fordham, 1985; Baviera et al., 1989; Kader et 15

al., 1991; Rodríguez et al., 1991). Com o NAA também se obtiveram boas percentagens de rebentos enraizados, mas esta auxina favorece a formação de callus. De facto, em macieira, a formação de callus foi muito estimulada pelo NAA, menos pelo IBA e apenas ligeiramente pelo IAA (De Klerk et al., 1997). As raízes induzidas pelo IBA são mais compridas e fibrosas, enquanto que com o NAA formam-se raízes mais curtas, grossas e mais numerosas (Lane, 1979; Hutchinson e Zimmerman, 1987), ou seja, mais adequadas para o desenvolvimento posterior dos rebentos. Em macieira, De Klerk et al. (1997) verificaram que o crescimento das raízes e folhas foi menor nos rebentos instalados em meio com NAA do que nos instalados em meio com IBA. Com o NAA e, por vezes, com o IBA as folhas ficaram amarelas ou castanhas, não se verificando este aspecto da parte aérea quando os rebentos foram colocados a enraizar em meio com IAA. Contudo, o IAA foi a menos eficiente das três auxinas na indução da rizogénese. Estes resultados contrastam com os de Baviera et al. (1989) que observaram a formação de um número de raízes por rebento mais elevado em meio de enraizamento com IAA na cultivar de pereira ‘Conférence’. De Klerk et al. (1997) observaram ainda que a utilização de concentrações de IBA superiores a 10 M ou de NAA superiores a 3 M resultou numa forte inibição do enraizamento em Malus spp., particularmente acentuada para o NAA. Essa inibição não aconteceu com o IAA, auxina com a qual se conseguiram resultados óptimos com concentrações de 10 a 300 M. Em pereira e macieira, Marino (1984) e Kader et al. (1991) verificaram que quando instalaram os rebentos em meio de enraizamento com 10 M de IBA, o comprimento das raízes diminuiu enquanto que o número de raízes por rebento aumentou, em comparação com rebentos instalados em meios de enraizamento com concentrações de IBA inferiores. O enraizamento de um elevado número de rebentos de Pyrus serotina, P. amygdaliformis, P. communis, P. calleryana e P. betulifolia tem sido conseguido utilizando IBA numa concentração de 10 M durante cinco (Banno et al., 1989), sete (Dolcet-Sanjuan et al., 1990; Dolcet-Sanjuan, 1991; Baraldi et al., 1993; Yeo e Reed, 1995) ou dez (Marino, 1984; Rodríguez et al., 1991) dias no escuro. Dolcet-Sanjuan et al. (1990) e Rodríguez et al. (1991) verificaram que a permanência dos rebentos em meio com 30 M de IBA durante 10 dias no escuro induziu a formação de um número elevado de raízes.

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Lane (1979) manteve rebentos da cultivar de pereira ‘Williams’ em meio com IBA durante três semanas e constatou que 10 M de IBA causaram toxicidade, o que não aconteceu com 1 M. Banno et al. (1989) referem que concentrações de IBA superiores a 10 M tendem a induzir a formação de raízes deformadas e callus na base de rebentos de Pyrus serotina. Em Pyrus amigdaliformis e P. communis, segundo Dolcet-Sanjuan et al. (1990), a intensidade de formação de callus e o comprimento médio das raízes aumentaram com a concentração (0,3 a 32 M) e o tempo de exposição (7, 14 e 28 dias) ao IBA. Em macieira, James e Thurbon (1979) verificaram que a formação abundante de callus, devido à permanência dos rebentos em meio de enraizamento com IBA, pôde ser evitada por redução do período de tratamento. No que diz respeito ao NAA, obtiveram-se resultados positivos em Pyrus pyrifolia, P. communis, P. calleryana e P. betulifolia com 10 M (Bhojwani et al., 1984; Shen e Mullins, 1984) durante dez (Rodríguez et al.,1991) ou sete (Yeo e Reed, 1995) dias no escuro. Dolcet-Sanjuan et al. (1990) referem a aparente ineficácia dos tratamentos com 10 a 32 M de NAA durante sete dias no escuro, enquanto que Rodríguez et al. (1991) mencionam o efeito positivo de 5 a 30 M de NAA durante dez dias no escuro. Em Pyrus communis, Marino (1984) verificou que as percentagens de enraizamento mais elevadas e as raízes de melhor qualidade foram obtidas em meios com 1,1 M de NAA ou IBA durante dez dias no escuro. Berardi et al. (1991) obtiveram resultados semelhantes com 2,7 e 5,4 M de NAA durante três dias no escuro, em Pyrus calleryana. Com o aumento da concentração de NAA (de 0 a 5,4 M), a percentagem de enraizamento, o número de raízes por rebento, a quantidade de callus formado e a espessura das raízes aumentaram, enquanto que o comprimento das raízes diminuiu, em ensaios realizados com Pyrus communis (Al-Maarri et al., 1986 e 1994). No que se refere à indução da rizogénese por imersão da base dos rebentos numa solução auxínica, verificou-se que a utilização de 10 mM de IBA (Dolcet-Sanjuan et al., 1990; Dolcet-Sanjuan, 1991) ou de NAA (Yeo e Reed, 1995) durante 15 segundos, de 5 M de IBA durante 60 segundos (Rodríguez et al., 1991) e de 493 ou 985 M de IBA durante 30 minutos (Marino, 1984) originaram resultados bastante positivos. Após o tratamento de indução, os rebentos foram colocados num meio sem hormonas.

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O momento de aplicação da auxina também influencia a capacidade de enraizamento dos rebentos. De facto, a auxina deve ser aplicada imediatamente após o corte dos rebentos porque a absorção e translocação da hormona, bem como a capacidade de regeneração de raízes, vão diminuindo à medida que o intervalo de tempo entre o corte e a aplicação da auxina vai aumentando (Jarvis e Shareed, 1986).

3.1.2.3. Presença ou ausência de luz O tratamento de escuro pode ser considerado como um dos factores mais importantes na indução de primórdios radiculares em rebentos de Pyrus spp. (Banno et al., 1989). Estes autores verificaram que quanto mais longo for o período de permanência no escuro (0 a 7 dias), maior será a percentagem de rebentos enraizados, embora a percentagem de sobrevivência dos rebentos possa diminuir. Assim, consideraram que um período de cinco dias no escuro foi o mais adequado para o enraizamento, pois permitiu obter o maior número de raízes por rebento e o maior comprimento das raízes. Em Pyrus spp. e Malus spp., Druart et al. (1982) e Marino (1984) verificaram que os rebentos sujeitos a um período de permanência no escuro apresentaram uma percentagem de enraizamento superior aos que permaneceram sempre sob um fotoperíodo de 16 horas. Apresentaram também um número de raízes por rebento mais elevado e um comprimento menor das raízes. No entanto, o efeito do regime de luz na indução de raízes adventícias (Bertazza et al., 1995) e o tempo de permanência no escuro necessário para aumentar a percentagem de enraizamento variam com a espécie e a cultivar. Em pereira, há ainda outros autores que mencionam os efeitos positivos do escurecimento na indução da rizogénese, como Hirabayashi et al. (1987) e Berardi et al. (1991). O mesmo se verificou em porta-enxertos de macieira (James, 1983; Welander, 1983), cultivares de macieira (Druart et al., 1982; Jacoboni e Standardi, 1982), pessegueiro (Antonelli e Chiariotti, 1988), ameixeira (Ranjit et al., 1988) e amendoeira (Damiano et al., 1991). Berardi et al. (1991) mencionam que estudos anatómicos realizados em Pyrus calleryana revelam a formação de primórdios radiculares 3 a 4 dias após a colocação dos rebentos no escuro em meio com auxina (NAA). Segundo Bertazza et al. (1995), o enraizamento da cultivar ‘Conférence’ foi conseguido sem recorrer a auxinas exógenas, apenas a regimes de luz favoráveis. Este 18

comportamento pode ser consequência de níveis de auxinas endógenas suficientes para induzir a formação de raízes. O efeito benéfico do período de escuridão sobre o enraizamento pode dever-se à redução da actividade peroxidásica e ao aumento dos níveis endógenos de fenóis nos rebentos durante a iniciação radicular, o que está associado a um bom enraizamento (Druart et al., 1982). Ascarelli et al. (1994) mencionam que durante a fase de indução da rizogénese atinge-se o pico da actividade das peroxidases. Quando os primórdios radiculares se começam a diferenciar a actividade peroxidásica diminui, voltando a aumentar com o crescimento dos mesmos. O efeito positivo do escuro é, por vezes, incrementado com o aumento da temperatura, dentro de certos limites (Zimmerman, 1984). Em cultivares de macieira, aumentando a temperatura de 25 ºC para 30 ºC durante o tratamento de escuro consegue-se aumentar o número de rebentos enraizados (Zimmerman, 1984; Zimmerman e Fordham, 1985). Porém, quando os rebentos foram colocados a temperaturas superiores a 35 ºC houve uma inibição da rizogénese. Segundo Wang (1992), a percentagem de enraizamento do porta-enxerto de pereira BP10030 e o número de raízes por rebento aumentaram com o aumento da temperatura de 5 ºC para 25 ºC durante o período de indução no escuro (4 a 7 dias). Com temperaturas superiores a 30 ºC o enraizamento foi prejudicado. No entanto, James (1983) não encontrou diferenças na formação de raízes entre 22 ºC e 29 ºC, enquanto Lê (1985) verificou que, em rebentos adultos e juvenis do porta-enxerto de macieira M26, o enraizamento foi óptimo a 25 ºC, reduzido a 22 ºC e muito reduzido a 28 ºC. As temperaturas elevadas aumentam o metabolismo celular, por isso, podem favorecer a formação de primórdios radiculares ou callus, dependendo do teor auxínico dos explantados (Moncousin, 1991a). Como se pode verificar, os resultados existentes na literatura sobre a influência da temperatura na rizogénese são diversificados e, por vezes, contraditórios. Estas discrepâncias mostram a importância de continuar a analisar os parâmetros relacionados com as culturas in vitro.

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3.1.2.4. Sais minerais e fontes de carbono Em geral, concentrações elevadas de sais minerais exercem um efeito negativo sobre a rizogénese (Zimmerman e Fordham, 1985) e sobre a qualidade das plantas. Os melhores resultados têm sido obtidos com reduções de 1/2, 1/3 ou 1/4 da concentração inicial de sais minerais no meio de cultura durante a fase de enraizamento in vitro (Lane, 1979; Simmonds, 1983; Hutchinson, 1984; Baviera et al., 1989; DolcetSanjuan et al., 1990; Rossi et al., 1991; Al-Maarri et al., 1994; Bertazza et al., 1995). De acordo com Shriskandarajah et al. (1990), uma redução dos níveis de NH4NO3 presentes no meio com sais MS para 1/4, implicou o aumento da percentagem de enraizamento de rebentos de macieira. Na ausência deste composto, mas na presença de KNO3 a percentagem de enraizamento foi de 100%, o que mostra que a formação de raízes adventícias pode ser influenciada pela manipulação da composição salina do meio de cultura. Em Malus pumila, Druart (1996) verificou que tanto o NH4NO3 como o KNO3, quando adicionados a meio com auxinas, atrasaram a emergência e reduziram o comprimento das raízes, mas não afectaram a percentagem de enraizamento. Na presença de Ca(NO3)2 ou de MgSO4 as raízes emergiram mais rapidamente, enquanto que a utilização de KH2PO4 ou de Ca(NO3)2 aumentou o crescimento das raízes, conferindo maior viabilidade ao sistema radicular. Segundo Kader et al. (1991), reduzindo a concentração de sacarose de 30 g/L para 15 g/L, a percentagem de rebentos de macieira enraizados diminui, assim como o comprimento das raízes. Também em macieira, Shriskandarajah et al. (1990) obtiveram maiores percentagens de enraizamento com a concentração de sacarose de 30 g/L do que com as concentrações mais baixas ensaiadas (0 g/L ou 15 g/L). Sem sacarose os rebentos ficaram menos vigorosos. Karhu e Ulvinen (1995) testaram o efeito de diferentes hidratos de carbono sobre o enraizamento de rebentos de macieira e notaram uma superioridade da sacarose em relação à frutose, à glucose, ao sorbitol e ao xilol. Os rebentos colocados em meio de enraizamento com sacarose apresentavam-se mais vigorosos e com mais raízes. No entanto, também em macieira, Moncousin et al. (1992) concluiram que os melhores resultados foram obtidos com a utilização de sacarose durante a fase de multiplicação dos rebentos e glucose durante a fase de enraizamento, ou com sorbitol em ambas as fases do processo de 20

micropropagação. Em gingeira, Snir (1983) verificou que não houve formação de raízes nos rebentos colocados a enraizar em meio sem sacarose.

3.1.2.5. Outras substâncias Têm sido realizados vários ensaios com o objectivo de testar o efeito da adição ao meio de enraizamento de substâncias como o carvão activado, o floroglucinol, as poliaminas ou os antioxidantes como o PVP. O efeito do etileno sobre a rizogénese também tem sido estudado. Os resultados da adição de carvão activado ao meio de enraizamento têm sido contraditórios. Alguns autores referem que o carvão activado não exerce qualquer efeito significativo quando utilizado isoladamente ou em combinação com hormonas de enraizamento (Antonelli e Chiariotti, 1988; Berardi et al., 1993; Shibli et al., 1997). Outros mencionam a redução e, até mesmo, a inibição do enraizamento como se verificou em ameixeira japonesa (Rosati et al., 1980), gingeira (Snir, 1983) e pereira (Wang, 1991). Em ameixeira, o carvão activado causou clorose e queda acentuada de folhas nos rebentos (Rosati et al., 1980). A inibição do enraizamento pode dever-se a uma absorção de substâncias presentes no meio de cultura essenciais para a formação de raízes, como auxinas, citocininas, tiamina-HCl, e outras (Weatherhead et al., 1979). Kader et al. (1991), em Malus pumila, obtiveram resultados opostos aos referidos anteriormente. Verificaram que o carvão activado, em combinação com BAP e IBA, permitiu melhorar a taxa de enraizamento dos rebentos e aumentar o comprimento das raízes formadas. Estes resultados podem estar relacionados com o efeito benéfico da acção do carvão activado que inclui a absorção de fitotóxicos, principalmente compostos fenólicos, produzidos pelos tecidos vegetais em cultura (Weatherhead et al., 1979). A adição de PVP ao meio de enraizamento não exerceu qualquer efeito significativo sobre a taxa de enraizamento de rebentos de Pyrus syrica, conforme referido por Shibli et al. (1997). Pelo contrário, Standardi e Romani (1990) referem que, em Malus pumila, a adição de PVP ao meio de indução reduziu a percentagem de enraizamento, devido a uma possível redução da actividade peroxidásica. No entanto, a sua adição ao meio utilizado durante a fase de alongamento das raízes aumentou a percentagem de rebentos enraizados. Os mesmos autores mencionam que os antioxidantes não influenciaram o número ou o comprimento das raízes. 21

A adição de floroglucinol tem conduzido a resultados inconsistentes em diferentes cultivares ou espécies de fruteiras, por exemplo, gingeira (Snir, 1983), pereira (Rossi et al., 1991; Berardi et al., 1993; Al-Maarri et al., 1994), pessegueiro (Antonelli e Chiariotti, 1988) e macieira (Zimmerman e Fordham, 1985; Kader et al., 1991), o que sugere que a acção desta substância sobre o enraizamento está dependente do genótipo, do tipo de auxina e do tempo de exposição à mesma (Zimmerman e Broome, 1981; James, 1983; Bhojwani et al., 1984; Hirabayashi et al., 1987). Wang (1991) verificou que a adição de floroglucinol ao meio de enraizamento exerceu um efeito positivo sobre o enraizamento do porta-enxerto BP10030. A magnitude desse efeito dependia da concentração utilizada, sendo os melhores resultados obtidos com 20,3 a 162 mg/L, na ausência de tratamento dos rebentos no escuro. James (1983), em macieira, conseguiu resultados semelhantes apenas quando recorreu a um período de incubação dos rebentos no escuro. Pelo contrário, Zimmerman (1984) verificou que em certas cultivares de macieira o floroglucinol melhorou o enraizamento quando os rebentos não foram sujeitos a tratamentos no escuro, mas exerceu um efeito nulo ou reduzido com o aumento do período de incubação no escuro. Welander e Huntrieser (1981) afirmam que os compostos fenólicos aplicados individualmente não exercem qualquer acção sobre o enraizamento de espécies lenhosas. Alguns autores mencionam a existência de um efeito sinérgico entre o floroglucinol e as auxinas (James e Hopgood, 1979; James e Thurbon, 1979; Caboni et al., 1992) que permite aumentar a percentagem de enraizamento dos rebentos em cultura. Este efeito sinérgico não foi constatado com a utilização de outros fenóis como o catecol, o ácido clorogénico, ou o ácido p-cumárico (Caboni et al., 1992). Em Pyrus pyrifolia e P. calleryana, o floroglucinol aumentou a percentagem de rebentos enraizados na presença de NAA (Bhojwani et al., 1984; Berardi et al., 1991). Porém, na última espécie não se obtiveram os mesmos resultados quando se recorreu à associação de IBA e floroglucinol. Zimmerman e Broome (1981) e Banno et al. (1989) concluiram que com a aplicação de floroglucinol houve uma redução da formação de callus na base dos rebentos. Sem a presença deste composto a produção de callus aumentava, à medida que a concentração de IBA ia aumentando.

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As poliaminas podem desempenhar a função de mensageiros secundários das hormonas ou constituir um grupo de reguladores de crescimento actuando possivelmente na divisão celular (Pierik, 1987; Evans e Malmberg, 1989). Estes compostos parecem desempenhar também um papel importante na formação e crescimento das raízes (Evans e Malmberg, 1989). Foram encontradas evidências de que o tratamento de rebentos de feijoeiro com IBA aumentou os níveis de putrescina, espermidina e espermina antes do aparecimento dos primórdios radiculares, e de que aplicações exógenas de espermina aumentaram o número de raízes formadas (Jarvis et al., 1985). Em macieira, Wang e Faust (1986) verificaram que a rizogénese e o aumento de peso das raízes coincidiram com um aumento considerável dos níveis de poliaminas. As poliaminas estão interrelacionadas com o metabolismo do etileno. Ambos têm um precursor comum (SAM) e as poliaminas inibem a ACC-sintase e retêm radicais livres essenciais para a síntese do etileno (Evans e Malmberg, 1989). O etileno é produzido por vários tipos de tecidos vegetais cultivados in vitro. A acumulação do etileno em tubos de ensaio e frascos inibe o crescimento e causa o amarelecimento das folhas (Pierik, 1987). Este composto é sintetisado a partir da metionina que é convertida primeiro em SAM e depois em ACC. Adicionando ACC ou metionina a culturas de plantas in vitro, a produção de etileno aumenta na maioria das vezes (Gaspar et al., 1996). Marino e Ventura (1997) mencionam que uma rápida acumulação de etileno no interior dos tubos de ensaio reduziu o período entre a indução e a expressão das raízes, e aumentou a percentagem de enraizamento dos rebentos. No entanto, as trocas gasosas que se dão através dos tubos de ensaio são importantes, pois previnem o amarelecimento das folhas. Assim, nos primeiros nove dias de duração dos ensaios estes autores utilizaram tampas estanques, trocando-as depois por tampas que favoreciam as trocas gasosas após esse período. Baixas concentrações de oxigénio promovem a síntese de ACC, mas inibem a conversão deste em etileno, enquanto que concentrações elevadas de oxigénio estimulam a conversão de ACC em etileno. Concentrações de dióxido de carbono muito elevadas bloqueiam a acção do etileno (Gaspar et al., 1996; Marino e Ventura, 1997). Algumas das respostas das plantas à aplicação de auxinas podem estar relacionadas com o aumento da síntese de etileno. Em geral, as auxinas estimulam a produção de etileno, 23

enquanto que as citocininas a bloqueiam. No entanto, tem-se observado um sinergismo entre auxinas e citocininas na produção de etileno (Gaspar et al., 1996).

3.2. Enraizamento in vitro de discos caulinares 3.2.1. Aspectos gerais Em macieira têm sido realizados alguns ensaios em que se utilizaram, em vez de rebentos inteiros, discos caulinares de rebentos micropropagados, com o objectivo de determinar as condições mais favoráveis para um bom enraizamento in vitro. Algumas vantagens de utilizar uma quantidade relativamente reduzida de tecidos vegetais são a obtenção nestes tecidos de uma concentração mais elevada de compostos relacionados com a rizogénese e a eliminação de substâncias existentes nas folhas e no ápice que poderiam interferir com o processo de enraizamento (Van der Krieken et al., 1991; Collet e Lê, 1994).

3.2.2. Metodologia de enraizamento in vitro de discos caulinares Os discos são obtidos a partir de cortes transversais dos caules dos rebentos que podem ser realizados com uma lâmina metálica (Van der Krieken et al., 1991; De Klerk et al., 1993) ou com um instrumento constituido por nove a onze lâminas (Welander e Pawlicki, 1993; Seifert et al., 1994 e 1995; De Klerk et al., 1997; Guan et al., 1997). Com este instrumento uma única operação de corte origina oito a dez discos de igual espessura pelo que se trata de um processo mais expedito e reproduzível do que utilização de uma só lâmina de corte (Seifert et al., 1994 e 1995). Todos os autores consultados utilizaram discos caulinares com 1 mm de espessura. Collet e Lê (1994) referem que discos com essas dimensões permitem obter resultados mais homogéneos. De um modo geral, foram usados nos ensaios apenas os 5 mm (De Klerk et al., 1993), 8 mm (Seifert et al., 1995) ou 10 mm (Welander e Pawlicki, 1993) basais de cada rebento. No entanto, De Klerk et al. (1997) e Guan et al. (1997) utilizaram discos provenientes dos 10 mm intermédios dos rebentos porque possuiam idêntica capacidade para regenerar raízes (De Klerk e Caillat, 1994). Antes do corte dos caules, as folhas foram removidas dos rebentos (De Klerk et al., 1997; Guan et al., 1997). Imediatamente após o corte, os discos caulinares foram dispostos sobre uma malha de polietileno ou de nylon colocada sobre o meio de enraizamento com 24

auxina(s), contido em placas de Petri. Os discos foram instalados com a face apical em contacto com a malha, tendo ficado aderentes à malha e ao meio de enraizamento. As placas de Petri com discos foram incubadas no escuro numa posição invertida para que a orientação final dos discos fosse a normal (De Klerk et al., 1993; Welander e Pawlicki, 1993; Seifert et al., 1994; De Klerk et al., 1997; Guan et al., 1997). Embora seja esta a orientação mais generalizada, alguns autores utilizaram uma diferente orientação dos discos caulinares (Seifert et al., 1995). O número de discos instalados em cada placa de Petri de 9 cm de diâmetro variou de autor para autor. Welander e Pawlicki (1993) instalaram 16 discos, De Klerk et al. (1993) 20 discos, De Klerk et al. (1997) e Guan et al. (1997) 30 discos e Seifert et al. (1995) 40 discos. Após o período de indução no escuro, de duração variável consoante os autores, os discos foram transferidos para placas de Petri contendo meio sem auxinas e colocados sob fotoperíodo normal. Ao fazer-se a transferência para o novo meio, a malha de polietileno com os discos foi transferida intacta. O excesso de líquido foi removido colocando a malha em papel de filtro durante 5 segundos (De Klerk et al., 1993 e 1997; Guan et al., 1997).

3.2.3. Factores que influenciam a rizogénese em discos caulinares Os factores que afectam a regeneração de raízes adventícias em discos caulinares são essencialmente os mesmos mencionados em 3.1.2. para a rizogénese em rebentos. Guan et al. (1997) referem que a quantidade de auxina disponível para cada disco é afectada pela quantidade de meio utilizada e pelo afastamento entre os discos. Quando usaram um volume de meio superior (40 ml em vez de 20 ml) e colocaram os discos mais afastados na placa de Petri, a quantidade de auxina disponível para cada explantado aumentou, pois a competição estabelecida entre os discos foi menor, aumentando assim a quantidade de auxina absorvida por cada disco. No que se refere à duração do período de indução, obtiveram-se resultados positivos colocando os discos durante um (De Klerk et al., 1993; Welander e Pawlicki, 1993), dois a três (Van der Krieken et al., 1991), ou cinco (De Klerk et al., 1997) dias no escuro com IBA. Welander e Pawlicki (1993) mencionam que períodos de indução no escuro mais longos do que 24 horas, na presença de IBA, reduziram a percentagem de discos enraizados e aumentaram a formação de callus, em Malus pumila. Estes autores obtiveram os melhores 25

resultados (percentagem de enraizamento e número de raízes por disco superiores) com 24,6 M de IBA durante 24 horas. Seifert et al. (1994) concluiram que a combinação de um tratamento auxínico curto (1,5 a 3 horas) com concentrações de IBA elevadas (45 a 70 M) produziu a máxima percentagem de enraizamento dos discos na ausência de callus. Noutros ensaios (Van der Krieken et al., 1991), a presença de 3 M de IBA no meio de cultura conduziu ao máximo número de raízes nos discos caulinares, enquanto que para os rebentos a concentração auxínica óptima foi de 10 a 30 M, os mesmos autores verificaram que o tempo de incubação óptimo no escuro foi de 2 a 3 dias para os discos e 5 dias para os rebentos. Nos discos a emergência das raízes foi mais rápida do que nos rebentos (após 6 e 10 dias, respectivamente), mas o número máximo de raízes por explantado foi mais elevado nos rebentos (11 raízes comparativamente a 7 raízes nos discos) (Van der Krieken et al., 1991; De Klerk et al., 1997). Alguns investigadores referem que o potencial para a formação de raízes vai aumentando desde a parte apical para a parte basal dos rebentos (Collet e Lê, 1994; Seifert et al., 1995). Por outro lado, De Klerk e Brugge (1992) mencionam que segmentos de caules próximos da extremidade apical ou da extremidade basal dos rebentos possuem menor capacidade de regeneração de raízes. Em Malus spp., Collet e Lê (1994) verificaram que a posição do disco no caule teve influência apenas num porta-enxerto difícil de enraizar, o EMLA9, que apresentou uma percentagem de enraizamento menor em discos próximos do ápice. Seifert et al. (1995) referem que os discos colocados em contacto com o meio pela face apical (posição normal) apresentaram percentagens de enraizamento e número de raízes inferiores aos daqueles cuja face basal foi orientada para o meio de cultura (posição invertida). No primeiro caso, as raízes emergiram apenas pela face basal, enquanto que no segundo surgiram raízes em ambos os lados dos discos. Os mesmos autores concluiram que discos nodais e internodais não diferiram na percentagem de enraizamento ou na formação de callus. Seifert et al. (1995) mencionam ainda a presença de dois tipos de callus distintos nos discos caulinares: ‘gelatinoso’ (‘smooth’) - translúcido, de cor creme e de aspecto vidrado - e ‘filamentoso’ (‘filamentous’) - verde ou branco, de aspecto rugoso com estruturas semelhantes a fios. Verificaram que concentrações de IBA de 15 a 65 M e 26

períodos de incubação de 45 minutos a 11 horas afectaram fortemente a produção, quer de callus ‘gelatinoso’, quer de callus ‘filamentoso’. De facto, quando aumentaram a concentração e a duração do período de exposição ao IBA houve menor formação de callus ‘filamentoso’, mas maior formação de callus ‘gelatinoso’. Os mesmos autores também concluiram que discos provenientes da parte basal dos rebentos apresentaram maior percentagem de enraizamento e maior formação de callus ‘gelatinoso’, mas menor formação de callus ‘filamentoso’.

27

III. ESTABELECIMENTO IN VITRO DE CULTURAS DE PEREIRAS ‘ROCHA’ E ‘WILLIAMS’ 1. Introdução Vários são os factores que influenciam, em maior ou menor grau, o estabelecimento de novas culturas in vitro (Pierik, 1987): a espécie vegetal (espécies lenhosas são mais difíceis de estabelecer do que herbáceas), o genótipo, a idade da planta-mãe (a capacidade de regeneração dos tecidos diminui com a idade da planta), o estado fisiológico da plantamãe (material vegetal em dormência fisiológica é mais difícil de iniciar in vitro), a dimensão do explantado (quanto menor for, mais complicado é induzir o crescimento in vitro, pois as reservas hormonais e de hidratos de carbono são menores), o meio de cultura e as condições ambientais de crescimento (Debergh e Read, 1991). Para propagar plantas lenhosas in vitro com êxito, é importante induzir o rejuvenescimento do material vegetal a utilizar. Esse objectivo pode ser conseguido por meio de cultura de meristemas, de microenxertia, da utilização de material isolado de zonas juvenis e de podas severas para estimular o crescimento de rebentos laterais jovens (Pierik, 1987). Antes do estabelecimento in vitro é necessário proceder à desinfecção dos explantados, pois constituem a principal fonte de contaminações que prejudicam o crescimento e desenvolvimento das culturas instaladas. De acordo com Pierik (1987), os agentes desinfectantes mais utilizados são o hipoclorito de sódio, o hipoclorito de cálcio e o bicloreto de mercúrio, sendo este último o mais tóxico para os tecidos vegetais. Após a desinfecção, procede-se a lavagens sucessivas dos explantados em água destilada e esterilizada com o objectivo de eliminar os resíduos do desinfectante que poderia restringir o desenvolvimento dos explantados. O objectivo deste trabalho foi a instalação in vitro de culturas de pereira ‘Rocha’ e ‘Williams’ a partir de estacas uninodais. Devido à importância da composição do meio de cultura na instalação do material vegetal in vitro, ensaiaram-se vários meios de cultura para ambas as cultivares de pereira. Os meios ensaiados diferiram na composição salina e na concentração de BAP. 28

2. Materiais e métodos 2.1. Esterilização do material de laboratório As operações que exigiam um ambiente estéril foram realizadas numa câmara de fluxo laminar horizontal, previamente desinfectada com etanol a 96%. Todo o material utilizado em operações assépticas foi esterilizado em equipamento especializado para o efeito. Os instrumentos cirúrgicos (pinças, bisturis e lâminas) usados no manuseamento do material vegetal em assepcia eram sucessivamente esterilizados a 250 ºC num esterilizador eléctrico de bancada colocado dentro da câmara de fluxo laminar. O material de vidro foi esterilizado em autoclave a 121 ºC e 1 atm durante 45 minutos.

2.2. Preparação, esterilização e distribuição dos meios de cultura Os meios de cultura foram preparados em balões Erlenmeyer que continham água destilada à qual se foi adicionando, sob agitação em agitador magnético com aquecimento, diversos componentes. Para preparar os meios de cultura usaram-se soluções-mãe concentradas de macronutrientes (10 vezes) e micronutrientes (1000 vezes). O ferro foi adicionado isoladamente sob a forma de FeNaEDTA a partir de uma solução concentrada. Os reguladores de crescimento (BAP e IBA) e a tiamina foram adicionados a partir de soluções concentradas preparadas para cada uma dessas substâncias. O mio-inositol e as fontes de carbono foram adicionados directamente ao meio de cultura logo após a pesagem. Os frascos com as soluções concentradas de macro e micronutrientes foram guardados no escuro a 4 ºC. As soluções de tiamina e de reguladores de crescimento foram conservados no escuro a -20 ºC. Depois da adição dos vários componentes referidos, procedeu-se ao ajustamento do pH do meio em preparação a um valor de 5,7 com uma solução de 0,2 M ou 1 M de NaOH e/ou HCl, adicionando-se em seguida o agente gelificante - Micro Agar (Duchefa). Os meios de cultura foram distribuidos por tubos de ensaio de 150 x 20 mm após a cozedura, sendo estes fechados com tampas de polietileno. A esterilização dos meios de cultura foi efectuada em autoclave a 121 ºC e 1 atm durante 20 minutos.

29

2.3. Instalação in vitro de estacas uninodais 2.3.1. Material vegetal O material vegetal utilizado no estabelecimento de novas culturas in vitro consistiu em raminhos jovens provenientes da rebentação primaveril de pereiras ‘Rocha’ adultas existentes na colecção de clones instalada na Quinta Experimental de S. João (Caldas da Rainha), pertencente à DRARO, e de uma pereira ‘Williams’ existente no pomar do Instituto Superior de Agronomia. Os ramos de pereira ‘Rocha’ (clones C3A4, R307/ 51 e T32) foram colhidos no final de Abril de 1999 e os de ‘Williams’ no final de Junho de 1999, e permaneceram três a quatro dias no frigorífico a 4 ºC até à altura da instalação no meio de cultura.

2.3.2. Desinfecção do material vegetal Inicialmente removeram-se todas as folhas dos ramos, depois procedeu-se ao corte dos mesmos em vários segmentos e à sua colocação em água corrente durante 1 hora. Os passos seguintes foram efectuados na câmara de fluxo laminar. Os segmentos foram lavados numa solução de água destilada, previamente esterilizada, e 0,5 % de detergente. De seguida procedeu-se à imersão do material vegetal em etanol a 70 % durante 60 segundos, após o que se colocou numa solução de água destilada esterilizada e 10 % de lixívia (com 10 % de cloro activo) e 0,05 % de Tween 20 (v/v) durante 20 minutos, sob agitação. Finalmente os segmentos dos ramos foram sujeitos a três lavagens sucessivas em água destilada esterilizada, após o que foram colocados entre folhas de papel de filtro esterilizadas para perderam o excesso de água que foram adquirindo durante o processo de desinfecção. Depois da desinfecção, os segmentos de ramos foram seccionados em estaquinhas uninodais de 1 a 1,5 cm de comprimento. Os explantados primários assim obtidos foram então colocados em tubos de ensaio com 10 ml de meio de cultura na posição vertical, respeitando a sua polaridade.

2.3.3. Meios de cultura ensaiados Foram testados seis meios de cultura (Quadro 1), três dos quais (meios ‘MS’) continham os sais inorgânicos de MS (Murashige e Skoog, 1962) e os restantes (meios ‘QL’) os sais inorgânicos de QL (Quoirin et al., 1977). Todos os meios possuiam ferro na 30

forma de FeNaEDTA, tiamina-HCl e mio-inositol nas concentrações de 73,4 mg/L, 0,4 mg/L e 100 mg/L, respectivamente. Os três meios MS e os três meios QL diferiam entre si na concentração de BAP. Assim, designou-se por ‘MS0,5’, ‘MS1’ e ‘MS2’ os meios MS que possuiam 0,5 mg/L, 1mg/L e 2 mg/L de BAP, respectivamente. Da mesma forma, designou-se por ‘QL0,5’, ‘QL1’ e ‘QL2’ os meios QL com aquelas concentrações de BAP. Adicionou-se a todos os meios 20 g/L de sacarose e 7g/L de Micro Agar.

Quadro 1 - Formulação dos meios de cultura utilizados no estabelecimento in vitro de estacas uninodais de pereiras ‘Rocha’ e ‘Williams’. Meios de cultura MS0,5

MS1

Componentes Macronutrientes NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 CaCl2.2H2O Ca(NO3)2.4H2O Micronutrientes H3BO3 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O MnSO4.H2O Na2MoO4.2H2O KI ZnSO4.7H2O FeNaEDTA Vitaminas Tiamina-HCl Mio-inositol Regulador de crescimento BAP Fonte de carbono Sacarose Agente solidificante Micro Agar (Duchefa)

MS2

QL0,5

QL1

QL2

Concentração (mg/L) 1650 1900 370 170 440,1

400 1800 360 270 1200

6,2 0,025 0,025 16,9 0,25 0,83 8,6 73,4

6,2 0,025 0,025 0,76 0,25 0,08 8,6 73,4 0,4 100

0,5

1

2

0,5

1

2

20 000 7 000

31

O número de estacas instaladas por modalidade de meio de cultura foi de 21 a 25 no ensaio com a cultivar ‘Rocha’ e de 24 no ensaio com a cultivar ‘Williams’.

2.3.4. Condições ambientais de cultura Durante a fase de estabelecimento, os tubos que continham os explantados permaneceram numa câmara de crescimento (Fitoclima 750 E), regulada para um fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 24 ºC dia/ 22 ºC noite. A luz artificial foi proporcionada por lâmpadas tubulares de luz branca fria do modelo Osram L 18W721-840. A intensidade luminosa era de cerca de 40 mol.m-2.s-1 de PAR ao nível dos explantados.

2.3.5. Recolha de dados e análise de resultados Durante a primeira e segunda semanas de instalação, as estacas uninodais eram observadas dia sim, dia não, no sentido de determinar a altura em que os gomos dos explantados instalados começaram o seu desenvolvimento. Após esse período, as observações eram realizadas de semana a semana, sendo as últimas observações efectuadas quatro semanas depois da instalação, no caso dos explantados de ‘Rocha’, e seis semanas depois, no caso dos explantados de ‘Williams’ (estes permaneceram mais tempo em cultura porque se desenvolveram mais lentamente). As observações consistiram na análise da evolução e do aspecto morfológico geral dos explantados, bem como na detecção de contaminações e oxidações. No final da fase de estabelecimento in vitro, contabilizou-se o número de explantados contaminados por bactérias e fungos, o número de explantados oxidados e o número de explantados viáveis e inviáveis em cada uma das modalidades. Foram considerados como explantados viáveis aqueles em que o gomo axilar se desenvolveu e como inviáveis os que se encontravam desidratados, sem qualquer desenvolvimento do gomo axilar. Para cada um desses tipos de explantado, efectuou-se o cálculo da percentagem em relação ao número total de explantados instalados por modalidade, em cada um dos ensaios realizados. Relativamente aos explantados viáveis, determinou-se ainda a classe de desenvolvimento dos explantados e o número de rebentos desenvolvidos por explantado, para as classes 2 e 3. 32

As classes de desenvolvimento dos explantados consideradas foram: classe 1‘gomo inchado’ (início do abrolhamento e aparecimento da ponta verde); classe 2- ‘gomo em início de desenvolvimento’ (aparecimento das primeiras folhas); classe 3- ‘rebento com desenvolvimento’ (presença de folhas expandidas). Procedeu-se ao cálculo da percentagem de explantados por classe de desenvolvimento, em relação ao número total de explantados viáveis. Determinou-se ainda o peso fresco e o peso seco dos rebentos (classes 2 e 3) desenvolvidos por explantado a partir de onze e doze explantados viáveis por modalidade, no caso da ‘Rocha’ e da ‘Williams’ respectivamente. Os explantados viáveis não envolvidos em avaliações destrutivas foram utilizados em culturas subsequentes. Procedeu-se à análise estatística da classe de desenvolvimento dos explantados, do número de rebentos por explantado, e do peso fresco e peso seco dos rebentos. A análise foi efectuada considerando os factores ‘Sais’ (composição salina), ‘BAP’ (concentração de BAP) e ‘Clone’ no ensaio com ‘Rocha’, ou ‘Sais’ e ‘BAP’ no ensaio com ‘Williams’, e respectivas interacções. As variáveis-resposta classe de desenvolvimento e número de rebentos por explantado apresentam apenas três resultados possíveis. Como tal, recorreu-se a uma análise baseada em Modelos Lineares Generalizados (GML’s) com uma distribuição de erros Binomial e link function Logit. Nestes modelos, nos testes aos factores ou interacções, usou-se o facto de a fracção da ‘deviance’ correspondente ao factor ou interacção em estudo ter uma distribuição aproximada qui-quadrado com um número de graus de liberdade igual ao número de graus de liberdade desse factor ou interacção. Quando um dado factor ou interacção se revelaram significativos a nível =0,05 ou inferior, procedeuse à separação de médias utilizando o teste de Wald para =0,05. No que se refere às variáveis-resposta peso fresco e peso seco, realizaram-se os testes de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e de Shapiro-Wilk. Considerou-se que a distribuição normal é um modelo plausível para a distribuição destas variáveis e, como tal, a análise dos resultados baseou-se em Modelos Lineares. Nestes modelos utilizou-se, nos testes a factores ou interacções, a estatística F. Quando um dado factor ou interacção se revelaram significativos a nível =0,05 ou inferior, procedeu-se à separação de médias utilizando o teste t-Student para =0,05.

33

As interacções não significativas foram sucessivamente eliminadas do modelo, o que implicou uma variação dos g.l. dos resíduos. Na apresentação dos valores das médias utilizaram-se os dados originais (não transformados), pois a compreensão é deste modo facilitada. Os testes de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e de Shapiro-Wilk foram efectuados com o ‘package’ Statistica, versão 5.0. Todas as análises estatísticas restantes foram realizadas recorrendo ao ‘package’ Genstat, versão 3.1.

3. Resultados 3.1. Estabelecimento in vitro de culturas de pereira ‘Rocha’ 3.1.1. Percentagem de explantados contaminados, oxidados, inviáveis e viáveis No final da fase de estabelecimento, verificou-se que a percentagem de contaminação foi relativamente reduzida situando-se, em média, entre 3,5 % e 6,3 % para os clones R307/51 e C3A4, respectivamente (Quadro 2). As contaminações eram devidas quer a fungos, quer a bactérias, e surgiram tanto no meio de cultura como no próprio explantado. A percentagem de oxidação aproximou-se de zero, pois apenas houve um explantado oxidado no conjunto dos três clones. A percentagem média de explantados viáveis não variou muito entre os clones utilizados: 91,6 % para o clone C3A4; 95,8 % para o R307/ 51 e 93,5 % para o T32.

3.1.2. Desenvolvimento dos explantados e número de rebentos por explantado Os gomos das estacas uninodais instaladas nos vários meios de cultura ensaiados iniciaram o seu desenvolvimento cerca de seis dias após a instalação. Treze dias depois da instalação no meio de cultura, notava-se já uma diferença nítida no desenvolvimento dos explantados; os explantados instalados nos meios com sais MS apresentavam-se menos desenvolvidos do que os dos meios com sais QL (Figura 1). Essa diferença foi aumentando até ao final do período de quatro semanas de estabelecimento in vitro, altura em que os rebentos axilares que surgiram a partir dos explantados instalados em meios QL se apresentavam particularmente desenvolvidos (Figura 2).

34

Apesar de as estacas instaladas serem todas uninodais, verificou-se o desenvolvimento de mais do que um rebento por estaca em alguns explantados. Tal deveuse ao abrolhamento de gomos estipulares para além do gomo axilar.

Quadro 2 - Percentagem de explantados contaminados, oxidados, inviáveis e viáveis, relativamente ao número inicial de explantados em cada uma das modalidades, avaliada ao fim de quatro semanas de instalação dos clones de ‘Rocha’ C3A4, R307/ 51 e T32. Contaminados (%)

Oxidados (%)

Inviáveis z (%)

Viáveis y (%)

23 24 24 24 24 24 143

8,7 4,2 0 12,5 8,3 4,2 6,3

0 0 0 0 0 4,2 0,7

0 0 0 4,2 0 4,2 1,4

91,3 95,8 100 83,3 91,7 87,5 91,6

24 24 24 24 23 22 141

0 4,2 4,2 8,3 0 4,6 3,5

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 4,2 0 0 0,7

100 95,8 95,8 87,5 100 95,4 95,8

25 24 24 23 23 21 140

4,0 4,2 0 13,0 4,4 0 4,2

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 4,2 0 4,8 2,2

96,0 95,8 100 82,6 95,6 95,2 93,5

Meio de cultura Explantados iniciais (n.º) Clone C3A4 MS0,5 MS1 MS2 QL0,5 QL1 QL2 Total Clone R307/ 51 MS0,5 MS1 MS2 QL0,5 QL1 QL2 Total Clone T32 MS0,5 MS1 MS2 QL0,5 QL1 QL2 Total z y

explantados desidratados explantados em boas condições fisiológicas

35

Figura 1 - Aspecto dos explantados de ‘Rocha’ (clones C3A4, R307/ 51 e T32) treze dias após a instalação in vitro em meio com sais MS ou QL contendo 0,5 mg/L, 1 mg/L ou 2 mg/L de BAP. No entanto, da análise estatística realizada para o conjunto dos três clones (Quadro 3) depreende-se que nenhum factor ou interacção exerceu um efeito significativo sobre a variável classe de desenvolvimento. De facto, no final do ensaio praticamente todos os explantados apresentavam um ou mais rebentos evidentes (classe de desenvolvimento 3), independentemente do clone, composição salina do meio de cultura e concentração de BAP (Quadro 4; Figuras 2 e 3). Em contraste, o número de rebentos por explantado foi significativamente influenciado quer pela interacção Sais.BAP, quer pelo factor Clone (Quadro 3). Os meios MS2, QL0,5, QL1 e QL2 foram os que permitiram o desenvolvimento de maior número de rebentos por explantado, enquanto que o meio MS0,5 originou um número de rebentos significativamente inferior (Quadro 5). Tendo em consideração apenas os meios QL, notou-se uma diferença significativa entre os meios QL0,5 e QL2, sendo este último mais favorável ao desenvolvimento de rebentos. Do mesmo modo, comparando os meios MS entre si, verificou-se que o número de rebentos por explantado aumentou com o aumento da concentração de BAP.

36

A

B

C Figura 2 - Aspecto dos explantados de ‘Rocha’ - clones C3A4 (A), R307/ 51 (B) e T32 (C) - após quatro semanas de instalação in vitro em meio com sais MS ou QL contendo 0,5 mg/L, 1 mg/L ou 2 mg/L de BAP. 37

Quadro 3 - Resumo da análise estatística relativa aos efeitos da composição salina do meio de cultura, da concentração de BAP e do clone na classe de desenvolvimento dos rebentos e no número de rebentos por explantado de ‘Rocha’ formados durante a fase de estabelecimento in vitro. Variável-resposta Classe de Número de rebentos desenvolvimento por explantado ‘Deviance’

2 (0,05)

Factores ou interacções

g.l.

Clone.Sais.BAP

4

0,26 ns z

2,2 ns

9,49

Clone.Sais

2

0,12 ns

3,6 ns

5,99

Clone.BAP

4

0,39 ns

5,0 ns

9,49

Sais.BAP

2

0,35 ns

13,3 **

5,99

Sais

1

0,81 ns

---

3,84

BAP

2

0,34 ns

---

5,99

Clone

2

0,46 ns

z

24,9 ***

5,99

ns - não significativo para =0,05; ** significativo para =0,01; *** significativo para =0,001

Quadro 4 - Médias da classe de desenvolvimento obtidas no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Rocha’, referentes aos factores clone, composição salina do meio de cultura e concentração de BAP (Para cada factor analisado e dentro da mesma coluna os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes a nível =0,05). Factor Clone C3A4 R307/ 51 T32

Classe de desenvolvimento z 3,0 a 2,9 a 2,9 a

Sais MS QL BAP (mg/ L) 0,5 1 2

2,9 a 3,0 a 2,9 a 2,9 a 2,9 a

z

classe 1- ‘gomo inchado’; classe 2- ‘gomo em início de desenvolvimento’; classe 3- ‘rebento com desenvolvimento’ 38

100 80 C3A4

60

R307/ 51

(%) 40

T32

20 0 1

2

3

Classe de desenvolvimento

A

100 90 80 70 60 (%) 50 40 30 20 10 0

Sais MS Sais QL

1

2

3

Classe de desenvolvimento

B

100 80 60 (%) 40 20

0,5 mg/ L de BAP

0

1 mg/ L de BAP 1

2

3

2 mg/ L de BAP

Classe de desenvolvimento

C Figura 3 - Influência do clone de ‘Rocha’ (A), da composição salina (B) e da concentração de BAP (C) na frequência de explantados por classe de desenvolvimento no final da fase de estabelecimento in vitro (1- ‘gomo inchado’; 2- ‘gomo em início de desenvolvimento’; 3- ‘rebento com desenvolvimento’). 39

Os clones C3A4 e T32 deram origem a um número de rebentos por explantado significativamente superior ao do clone R307/ 51 (Quadro 5).

Quadro 5 - Médias do número de rebentos por explantado referentes à interacção Sais.BAP e ao factor clone, obtidas no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Rocha’ (Para cada factor ou interacção analisada e dentro da mesma coluna os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes a nível =0,05). Factor ou interacção

Número de rebentos por explantado

Sais.BAP MS0,5

1,2 d

MS1

1,4 c

MS2

1,8 ab

QL0,5

1,7 b

QL1

1,9 ab

QL2

2,0 a

C3A4

1,8 a

R307/ 51

1,4 b

T32

1,7 a

Clone

3.1.3. Peso fresco e peso seco dos rebentos A análise estatística realizada revelou que nenhuma das interacções entre factores exerceu um efeito significativo sobre o peso fresco e o peso seco dos rebentos formados a partir das estacas uninodais. No entanto, o efeito dos factores Sais e Clone sobre ambas as variáveis em consideração foi significativo (inclusivamente para =0,001, no caso do Meio), contrariamente ao do factor BAP (Quadro 6). O clone C3A4 apresentou os valores mais elevados de peso fresco e peso seco dos rebentos e o clone R307/ 51 os valores mais reduzidos. O meio com sais QL originou rebentos com peso fresco e peso seco mais elevados do que os obtidos com o meio com sais MS (Quadro 7).

40

Quadro 6 - Resumo da análise estatística relativa aos efeitos da composição salina do meio de cultura, da concentração de BAP e do clone, no peso fresco e no peso seco dos rebentos de ‘Rocha’ formados durante a fase de estabelecimento in vitro. Variável-resposta Peso fresco(mg)

Peso seco(mg)

Factores ou g.l. dos factores g.l. dos interacções ou interacções resíduos Clone.Sais.BAP 4 180

Fcalc

F0,05

0,65 ns z

1,08 ns

2,42

Clone.Sais

2

184

1,63 ns

1,43 ns

3,04

Clone.BAP

4

184

0,37 ns

0,57 ns

2,42

Sais.BAP

2

184

0,10 ns

0,39 ns

3,04

Sais

1

192

76,7 ***

68,1 ***

3,89

BAP

2

192

0,19 ns

0,46 ns

3,04

Clone

2

192

6,03 **

3,56 *

3,04

ns - não significativo para =0,05; * significativo para =0,05; ** significativo para =0,01; *** significativo para =0,001 z

Quadro 7 - Médias do peso fresco e do peso seco dos rebentos ao fim de quatro semanas de instalação dos explantados de ‘Rocha’, referentes aos factores clone, composição salina do meio de cultura e concentração de BAP (Para cada factor analisado e dentro da mesma coluna os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes a nível =0,05). Factor Clone C3A4 R307/ 51 T32 Sais MS QL BAP (mg/ L) 0,5 1 2

Peso fresco (mg)

Peso seco (mg)

85,8 a 67,0 b 76,1 ab

11,3 a 9,2 b 10,1 ab

54,9 b 97,7 a

7,6 b 12,7 a

73,7 a 78,5 a 76,7 a

10,4 a 10,4 a 9,8 a

41

3.2. Estabelecimento in vitro de culturas de pereira ‘Williams’ 3.2.1. Percentagem de explantados contaminados, oxidados, viáveis e inviáveis As percentagens de explantados contaminados, oxidados, inviáveis e viáveis relativamente ao número de explantados primários, no final da fase de estabelecimento encontram-se no Quadro 8. No global, a percentagem de contaminação foi de 25,7 %, enquanto que a percentagem de explantados oxidados foi de 9,7 %. Apenas 59,8 % dos explantados foram considerados viáveis.

Quadro 8 - Percentagem de explantados contaminados, oxidados, inviáveis e viáveis, relativamente ao número inicial de explantados em cada uma das modalidades, avaliada ao fim de seis semanas de instalação de ‘Williams’. MS

Composição salina BAP (mg/ L)

0,5

1

QL 2

0,5

Total

1

2

Explantados iniciais (nº)

24

24

24

24

24

24

Contaminados (%)

33,3

20,8

20,8

41,7

20,8

16,7

25,7

Oxidados (%)

8,3

8,3

4,2

8,3

20,8

8,3

9,7

Inviáveis z (%)

0

11,8

8,3

0

8,3

0

4,7

58,3

59,0

66,7

50,0

50,0

75,0

59,8

Viáveis y (%) z y

144

explantados desidratados explantados em boas condições fisiológicas

3.2.2. Desenvolvimento dos explantados e número de rebentos por explantado O desenvolvimento das estacas uninodais começou cerca de oito dias depois da instalação no meio de cultura. Dez dias mais tarde havia diferenças no desenvolvimento dos explantados, diferenças essas que se mantiveram até ao final das seis semanas de estabelecimento, verificando-se que os explantados instalados em meios QL estavam mais desenvolvidos do que os em meios MS (Figura 4).

42

Figura 4 - Aspecto dos explantados de ‘Williams’ após seis semanas de instalação in vitro em meio com sais MS ou QL contendo 0,5 mg/L, 1 mg/L ou 2 mg/L de BAP.

Da análise estatística realizada, pode constatar-se a existência de um efeito significativo do factor Sais sobre a classe de desenvolvimento e o número de rebentos por explantado, bem como do factor BAP sobre a última variável referida (Quadro 9). Verificou-se que o meio QL deu origem a um número de rebentos por explantado e a um grau de desenvolvimento significativamente superiores aos obtidos com o meio MS (Quadro 10; Figura 5A). A concentração de BAP mais favorável ao abrolhamento de gomos estipulares foi de 2 mg/L (Quadro 10).

43

Quadro 9 - Resumo da análise estatística relativa aos efeitos da composição salina do meio de cultura e da concentração de BAP na classe de desenvolvimento dos rebentos e no número de rebentos por explantado de ‘Williams’, formados durante a fase de estabelecimento in vitro. Variável-resposta Classe de Número de rebentos desenvolvimento por explantado ‘Deviance’

2 (0,05)

Factores ou interacções

g.l.

Sais.BAP

2

0,26 ns z

3,81 ns

5,99

Sais

1

4,04 *

8,12 **

3,84

BAP

2

0,33 ns

23,39 ***

5,99

ns - não significativo para =0,05; * significativo para =0,05; ** significativo para =0,01; *** significativo para =0,001 z

Quadro 10 - Médias do número de rebentos por explantado e da classe de desenvolvimento, relativas aos factores composição salina do meio de cultura e concentração de BAP, obtidas no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Williams’ (Para cada factor analisado e dentro da mesma coluna os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes a nível =0,05).

Factor

Número de rebentos por explantado

Classe de desenvolvimento z

1,3 b 1,7 a

2,7 b 3,0 a

1,2 b 1,4 b 2,0 a

2,9 a 2,8 a 2,8 a

Sais MS QL BAP (mg/ L) 0,5 1 2 z

classe 1- ‘gomo inchado’; classe 2- ‘gomo em início de desenvolvimento’; classe 3- ‘rebento com desenvolvimento’

44

100 80 60

Sais MS

40

Sais QL

(%) 20 0 1

2

3

Classe de desenvolvimento

A

100 80 60 (%) 40 20

0,5 mg/ L de BAP

0

1 mg/ L de BAP 1

2

3

2 mg/ L de BAP

Classe de desenvolvimento

B

Figura 5 - Influência da composição salina (A) e da concentração de BAP (B) na frequência de explantados por classe de desenvolvimento, no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Williams’ (1- ‘gomo inchado’; 2- ‘gomo em início de desenvolvimento’; 3- ‘rebento com desenvolvimento’).

45

3.2.3. Peso fresco e peso seco dos rebentos A análise estatística realizada demonstrou que a interacção Sais.BAP e os factores Sais e BAP não exerceram qualquer efeito ao nível de significância =0,05 sobre as variáveis peso fresco e peso seco dos rebentos (Quadro 11).

Quadro 11 - Resumo da análise estatística relativa aos efeitos da composição salina do meio de cultura e da concentração de BAP no peso fresco e peso seco dos rebentos de ‘Williams’ formados durante a fase de estabelecimento in vitro. Variável-resposta Peso fresco (mg) Factores ou interacções Sais.BAP

g.l. dos factores ou interacções 2

g.l. dos resíduos 66

Peso seco (mg)

Fcalc

F0,05

0,82 ns z

1,43 ns

3,14

Sais

1

68

0,98 ns

1,37 ns

3,98

BAP

2

68

1,08 ns

0,44 ns

3,13

z

ns - não significativo para =0,05

Como se pode confirmar na Figura 6, não existem diferenças marcadas no peso fresco e peso seco dos rebentos, quer entre os meios MS e QL, quer entre as várias concentrações de BAP utilizadas no ensaio.

46

120 100

a

a

80

Sais MS

(mg) 60

Sais QL

40

a

20

a

0 Peso fresco

Peso seco

A

120 100

(m g)

a a

a

80

0,5 mg/ L de BAP

60

1 mg/ L de BAP

40

a

20

a

a

2 mg/ L de BAP

0 Peso fresco

Peso seco

B

Figura 6 - Médias do peso fresco e do peso seco dos rebentos referentes aos factores composição salina (A) e concentração de BAP (B), obtidas no final da fase de estabelecimento in vitro de ‘Williams’ (Letras iguais indicam diferenças não significativas a nível =0,05).

47

4. Discussão A percentagem média de contaminação das estacas de pereira ‘Rocha’, obtidas a partir de rebentos em crescimento activo no campo, foi relativamente baixa (entre 3,5 e 6,3%) (Quadro 2), apesar do estabelecimento de culturas in vitro a partir de explantados provenientes de material lenhoso adulto instalado no campo ser difícil de conseguir, devido ao nível de contaminação deste ser geralmente elevado (Pierik, 1987). A percentagem de explantados de ‘Williams’ contaminados foi mais elevada (25,7%) (Quadro 8), o que pode estar relacionado com a época de colheita do material vegetal - fins de Junho para os ramos de ‘Williams’ e fins de Abril para os de ‘Rocha’. De facto, os ramos de ‘Williams’, por permanecerem mais tempo no campo, estavam mais lenhificados que os de ‘Rocha’ e tiveram mais oportunidades de adquirir infecções internas e externas. Os valores de contaminação referentes aos clones de ‘Rocha’ situam-se na mesma ordem de grandeza daqueles obtidos em ensaios realizados na Secção de Horticultura do ISA em 1998 com os mesmos clones. A diferente época de colheita pode ainda justificar a evolução mais lenta dos gomos das estacas uninodais de ‘Williams’ relativamente aos de ‘Rocha’. Dos explantados de ‘Rocha’ instalados in vitro apenas um oxidou após as quatro semanas de estabelecimento (Quadro 2). No caso da cultivar ‘Williams’, após as seis semanas de estabelecimento, a percentagem de oxidação foi superior (9,7%) (Quadro 8). Estes resultados traduzem uma diferente intensidade de oxidação dos compostos fenólicos pelas polifenoloxidases (Debergh e Read, 1991; Wang et al., 1994) que pode estar relacionada com um diferente estado fisiológico do material vegetal, uma vez que os ramos de ‘Williams’ foram colhidos com um grau de maturidade mais avançado. Embora a capacidade regenerativa das plantas adultas, especialmente das lenhosas, seja baixa quando comparada com a das plantas em estado juvenil (Pierik, 1987), verificouse que a rebentação dos gomos dos explantados e o seu desenvolvimento foram satisfatórios em ambas as cultivares de pereira testadas. De facto, no final do ensaio, praticamente todos os explantados sobreviventes (que foram em percentagem muito elevada no caso da pereira ‘Rocha’) deram origem a rebentos bem desenvolvidos possuindo várias folhas expandidas. Os resultados obtidos no ensaio com os clones de ‘Rocha’ (C3A4, R307/ 51 e T32) indicam que o genótipo (clone) e a interacção composição salina x concentração de BAP 48

influenciam o abrolhamento dos gomos estipulares existentes nas estacas uninodais e consequentemente o número de rebentos por explantado (Quadros 3 e 5). Relativamente ao meio com sais QL, a concentração mais elevada de BAP testada (2 mg/L) originou um maior número de rebentos por explantado do que a concentração mais baixa (0,5 mg/L). O efeito da concentração de BAP sobre o número de rebentos por explantado fez-se sentir de uma forma ainda mais notória no caso do meio com sais MS, para o qual os acréscimos resultantes do aumento da concentração de BAP foram particularmente acentuados. A análise destrutiva realizada, em que se avaliou o peso fresco e o peso seco dos rebentos desenvolvidos, evidenciou uma vez mais a influência determinante do clone e revelou que o meio com sais QL foi claramente superior ao meio com sais MS (Quadro 7). Estes resultados relativos ao peso fresco e ao peso seco dos rebentos estão de acordo com os obtidos num ensaio de estabelecimento in vitro semelhante realizado no ISA em 1998. No ensaio com a ‘Williams’, verificou-se uma evolução mais acentuada dos gomos e um maior número de rebentos por explantado quando as estacas foram instaladas em meio com sais QL (Quadro 10; Figura 5A). Verificou-se ainda um efeito favorável da maior concentração de BAP ensaiada (2 mg/L) sobre o número de rebentos por explantado, à semelhança do que sucedeu no ensaio com ‘Rocha’. O efeito favorável das citocininas no estabelecimento de culturas in vitro é atribuido ao estímulo que estes reguladores de crescimento exercem sobre o desenvolvimento de gomos axilares, contrariando a dominância apical (Pierik, 1987). Nos ensaios realizados, em que a generalidade dos explantados sobreviventes originaram rebentos bem desenvolvidos, o aumento da concentração de BAP teve uma influência notória no desenvolvimento dos gomos estipulares. Os ensaios efectuados neste trabalho permitem constatar, de uma forma decisiva, a superioridade dos meios com sais QL no estabelecimento de novas culturas in vitro a partir de estacas uninodais. Este resultado reveste-se de um significado particular atendendo a que a pesquisa bibliográfica efectuada revelou que o meio com sais MS, ou meios salinos dele derivados, têm sido os mais frequentemente utilizados no estabelecimento de culturas in vitro de Pyrus spp. e da maioria das fruteiras lenhosas.

49

IV. ENRAIZAMENTO IN VITRO DE REBENTOS E DISCOS CAULINARES DE PEREIRA ‘ROCHA’ 1. Introdução A propagação in vitro de espécies lenhosas continua a ser um processo problemático, devido à inconsistente capacidade do material vegetal lenhoso para produzir raízes adventícias (James e Thurbon, 1981; Welander, 1981; Zimmerman e Broome, 1981; De Klerk e Brugge, 1992; Baraldi et al., 1993). A rizogénese depende do genótipo, do estado ontogénico (juvenil versus adulto) e fisiológico, e da concentração hormonal (De Klerk e Brugge, 1992), entre outros factores. As plantas perdem total ou parcialmente a capacidade de regenerar raízes na transição da fase juvenil para a adulta (De Klerk e Brugge, 1992). No entanto, com a cultura de tecidos a planta adulta pode rejuvenescer e readquirir a capacidade de enraizar. Subculturas sucessivas podem aumentar também a resposta ao tratamento de indução da rizogénese (Damiano et al., 1991). Os reguladores de crescimento desempenham uma função importante no enraizamento in vitro. As auxinas mais utilizadas para induzir a rizogénese são o IBA, o NAA e o IAA, sendo as duas primeiras as mais eficientes (Moncousin, 1991a; Kader et al., 1991; Rodríguez et al., 1991). A adição da concentração adequada de auxina ao meio de cultura favorece a formação de raízes, possivelmente por amplificar os efeitos de stress causados pelo corte da base do caule. A ocorrência de stress vai induzir a produção de etileno devido ao aumento da actividade da ACC sintase (Moncousin, 1991b). Um tratamento de indução do enraizamento eficiente permite obter percentagens de enraizamento elevadas e sistemas radiculares de boa qualidade, o que implica ausência de formação de callus e um número de raízes por explantado e comprimento das raízes adequados (De Klerk et al., 1997). Estes aspectos vão afectar o desenvolvimento das plantas após a sua transferência para o solo (Welander, 1983). Alguns investigadores têm recorrido ao enraizamento de discos caulinares isolados como um sistema de teste à indução da rizogénese, evitando assim possíveis influências da parte apical dos rebentos sobre o processo de enraizamento in vitro (Van der Krieken et al., 1992). 50

Neste trabalho, foram realizados ensaios de enraizamento in vitro de rebentos micropropagados e de discos caulinares obtidos a partir de rebentos micropropagados de pereira ‘Rocha’. O objectivo dos ensaios de enraizamento in vitro realizados foi testar o efeito de diferentes modalidades de indução sobre a rizogénese. Tentou-se determinar qual a duração dos períodos de exposição ao IBA e de permanência no escuro mais adequados para um bom enraizamento, quer dos rebentos, quer dos discos caulinares. No caso dos discos caulinares ensaiaram-se ainda várias concentrações de IBA no meio de indução do enraizamento.

2. Materiais e métodos 2.1. Esterilização do material de laboratório A esterilização do material de laboratório foi semelhante à descrita no capítulo III (ponto 2.1.). Nos ensaios de enraizamento in vitro de discos caulinares usaram-se placas de Petri descartáveis esterilizadas.

2.2. Preparação, esterilização e distribuição dos meios de cultura A preparação dos meios de cultura foi semelhante à descrita no capítulo III (ponto 2.2.), bem como a esterilização e distribuição dos meios destinados ao enraizamento de rebentos. Os meios utilizados para os ensaios de enraizamento in vitro de discos caulinares foram esterilizados em autoclave a 121 ºC e 1 atm durante 25 minutos, procedendo-se em seguida à sua distribuição por placas de Petri descartáveis, na câmara de fluxo laminar. As placas foram depois seladas com várias camadas de filme de polietileno.

51

2.3. Condições ambientais de cultura As condições ambientais às quais os rebentos e os discos caulinares ficaram sujeitos foram idênticas às referidas no capítulo III (ver 2.3.).

2.4. Enraizamento in vitro de rebentos 2.4.1. Material vegetal O material vegetal utilizado consistiu em rebentos provenientes de culturas in vitro de ‘Rocha’ existentes no ISA, quer de um clone de origem juvenil (clone PR4) resultante da germinação in vitro de uma semente (Ensaio 1), quer de um clone de origem adulta (clone R1934) proveniente de um meristema estabelecido in vitro a partir de uma pereira da colecção de clones da DRARO (Ensaio 2). Os rebentos utilizados apresentavam um comprimento entre 1 a 2,5 cm, tinham um aspecto morfológico semelhante entre si e apresentavam várias folhas expandidas. Antes da colocação dos rebentos no meio de cultura, as folhas basais foram retiradas de forma a não entrarem em contacto com o meio. Cada rebento foi colocado num tubo de 150 x 20 mm que continha 10 ml de meio de cultura.

2.4.2. Composição do meio de indução do enraizamento Em ambos os ensaios de enraizamento, e para todas as modalidades ensaiadas, o meio de indução do enraizamento utilizado continha os sais inorgânicos de QL (Quoirin et al., 1977), estando a concentração de macronutrientes reduzida a metade (Quadro 1). As concentrações de ferro na forma de FeNaEDTA, de tiamina-HCl e de mio-inositol eram de 73,4 mg/L, 0,4 mg/L e 100 mg/L, respectivamente. O regulador de crescimento utilizado foi o IBA na concentração de 10 M (2,032 mg/L). A este meio adicionaram-se ainda duas fontes de carbono, a sacarose (20 g/L) e a galactose (10 g/L), e 7 g/L de Micro Agar.

52

Quadro 1 - Formulação do meio base utilizado nos ensaios de enraizamento in vitro. Componentes Macronutrientes NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 Ca(NO3)2.4H2O Micronutrientes H3BO3 CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O MnSO4.H2O Na2MoO4.2H2O KI ZnSO4.7H2O FeNaEDTA Vitaminas Tiamina-HCl Mio-inositol Fontes de carbono Sacarose Galactose Agente solidificante Micro Agar (Duchefa)

Concentração (mg/L) 200 900 180 135 600 6,2 0,025 0,025 0,76 0,25 0,08 8,6 73,4 0,4 100 20 000 10 000 7 000

2.4.3. Modalidades de enraizamento ensaiadas Foram testadas diferentes condições de enraizamento que diferiram na duração do período de ausência de luz e do período de exposição ao IBA (Quadro 2). No ensaio com material juvenil (Ensaio 1) testaram-se quatro modalidades de indução tendo a concentração de IBA no meio de cultura sido sempre de 10 M. As modalidades ensaiadas foram: 5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 42D- 6 semanas com IBA, os primeiros 5 dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal. Nas três primeiras modalidades os rebentos eram transferidos, após a fase de indução, para novos tubos de ensaio que continham 10 ml de meio idêntico ao inicial mas sem IBA, e aí permaneciam até ao fim das seis semanas de enraizamento in vitro. No

53

Ensaio 2 apenas se testaram as modalidades 5D e 10D devido à menor disponibilidade de rebentos de origem adulta.

Quadro 2 - Modalidades dos ensaios de enraizamento in vitro de rebentos, de acordo com a duração do período de ausência de luz e do período de exposição ao IBA.

Modalidade

Duração da ausência de luz (dias)

Duração do período de exposição ao IBA (dias)

Clone PR4

Clone R1934

(Ensaio 1)

(Ensaio 2)

5D 5D+5D 10D 42D

5 5 10 5

5 10 10 42

x x x x

x --x ---

Em ambos os ensaios foram instalados 24 rebentos por modalidade de indução do enraizamento. Quando se procedeu à transferência dos rebentos para o meio de cultura sem auxina, colocaram-se os mesmos sobre uma folha de papel de filtro por alguns segundos. O objectivo foi eliminar o excesso de meio (com auxina) existente na base do rebento, que poderia prejudicar o alongamento das raízes.

2.4.4. Recolha de dados e análise de resultados Durante a primeira e segunda semanas de instalação, os rebentos foram observados em dias alternados, com o objectivo de determinar a altura em que surgiriam as primeiras raízes. Depois deste período, as observações foram realizadas em intervalos semanais para avaliar a evolução das raízes e o aspecto morfológico geral dos rebentos. As últimas observações foram efectuadas seis semanas após a instalação do ensaio. No ensaio com os rebentos de origem juvenil (Ensaio 1), realizaram-se as seguintes avaliações ao fim das seis semanas de cultura in vitro: número de rebentos com callus friável, dimensão do callus de cada rebento, número de rebentos enraizados, número de rebentos sobreviventes, número de raízes por rebento, peso fresco das raízes (PFR), peso fresco da parte aérea do rebento (PFA), peso fresco do callus (PFC), peso seco das raízes (PSR), peso seco da parte aérea dos rebentos (PSA), peso seco do callus (PSC), e comprimento aproximado do conjunto de raízes de cada rebento (COMPR). No ensaio 54

com rebentos provenientes de material adulto (Ensaio 2), não se efectuaram as determinações de peso fresco e de peso seco porque houve a necessidade de utilizar este material vegetal para outros ensaios a realizar no laboratório de micropropagação. Para a avaliação da dimensão do callus, foram consideradas três classes: dimensão 1 (reduzida), dimensão 2 (moderada) e dimensão 3 (elevada). Em ambos os ensaios de enraizamento in vitro procedeu-se ao cálculo da percentagem de rebentos enraizados em relação ao número total de rebentos sobreviventes em cada modalidade. Procedeu-se à análise estatística das variáveis-resposta COMPR, PFR, PFA, PFC, PSR, PSA, PSC, presença de raízes, dimensão do callus e número de raízes por rebento. As análises foram feitas para um único factor, ‘Exposição ao IBA’. As variáveis-resposta COMPR, PFR, PFA, PFC, PSR, PSA e PSC, foram analisadas recorrendo a Modelos Lineares, pois os testes de normalidade efectuados (KolmogorovSmirnov e Shapiro-Wilk) revelaram que a distribuição normal é uma distribuição plausível para estas variáveis. Nestes modelos utilizou-se a estatística F para testar a significância do factor em análise. Quando o factor se revelou significativo a nível =0,05 ou inferior, procedeu-se à separação de médias utilizando o teste t-Student para =0,05. A variável-resposta número de raízes por rebento toma valores inteiros não negativos, não sendo desta forma a distribuição normal um modelo plausível. Esta variável foi analisada recorrendo a modelos log-lineares que são Modelos Lineares Generalizados (GML’s) com uma distribuição de erros de Poisson e link function logaritmica. As variáveis-resposta presença de raízes e dimensão do callus apresentam, em sentido respectivo, apenas dois e três resultados possíveis. Assim, fez-se a análise dos resultados utilizando Modelos Lineares Generalizados (GML’s) com uma distribuição de erros Binomial e link function Logit. Para as variáveis analisadas através de GML’s, avaliou-se a significância do factor em análise recorrendo ao facto de a fracção da ‘deviance’ correspondente ao factor ter uma distribuição aproximada qui-quadrado com um número de graus de liberdade igual ao número de graus de liberdade do factor. Quando o factor em análise se revelou significativo a nível =0,05 ou inferior, procedeu-se à separação de médias utilizando o teste de Wald.

55

Na apresentação dos valores das médias utilizaram-se os dados originais (não transformados), com o objectivo de uma mais fácil compreensão. Os testes de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e de Shapiro-Wilk foram efectuados com o ‘package’ Statistica, versão 5.0. Todas as restantes análises estatísticas foram realizadas recorrendo ao ‘package’ Genstat, versão 3.1.

2.5. Enraizamento in vitro de discos caulinares 2.5.1. Material vegetal Para estes ensaios usaram-se rebentos de origem juvenil provenientes de culturas in vitro do clone PR4 existentes no ISA. Os rebentos utilizados tinham um comprimento de 1 a 2,5 cm. Para a instalação do ensaio, as folhas foram removidas e os caules dos rebentos foram seccionados transversalmente em pequenos discos com cerca de 1 mm de espessura cada um, utilizando o bisturi. O corte dos discos começava 2 a 5 mm acima da base do rebento, indo até cerca de 10 mm acima. Assim, de cada rebento, obtinham-se em média 10 discos caulinares.

2.5.2. Plaqueamento dos discos caulinares A metodologia seguida no plaqueamento dos discos caulinares foi baseada em De Klerk et al. (1993 e 1997). Os discos obtidos a partir dos vários rebentos usados foram colocados em placas de Petri descartáveis que possuiam 25 ml de meio de indução do enraizamento (ver 2.5.3.). Os discos eram colocados em cima de uma malha apertada de nylon de 4 x 4 cm que se encontrava sobre o meio, de forma a facilitar a posterior transferência dos mesmos para o meio de cultura sem auxina. A face dos discos em contacto com a malha e com o meio de enraizamento era a apical. As placas de Petri eram colocadas na câmara de crescimento numa posição invertida, de forma a proporcionar a correcta orientação dos discos para o crescimento das raízes. Em cada placa de Petri foram colocados 20 discos caulinares na disposição apresentada na Figura 1.

56

Figura 1 - Disposição dos discos caulinares numa placa de Petri de 9 cm de diâmetro contendo 25 ml de meio de enraizamento com IBA (de notar que os discos foram distribuidos por cinco linhas e quatro colunas para uma fácil referência).

2.5.3. Modalidades de enraizamento ensaiadas Realizaram-se dois ensaios de enraizamento in vitro de discos caulinares. No primeiro (Ensaio 3) foram testadas diferentes concentrações de IBA no meio de indução do enraizamento, no segundo (Ensaio 4) testaram-se diferentes condições de exposição a uma concentração única de IBA. No Ensaio 3, usou-se o meio base referido em 2.4.2 (Quadro 1). A este meio foram adicionadas seis concentrações de IBA diferentes, entre 2,5 e 20 M, constituindo as seis modalidades de meio de indução do enraizamento ensaiadas. Os discos permaneceram no meio de indução durante 5 dias, no escuro (Quadro 3).

57

Quadro 3 - Modalidades dos ensaios de enraizamento in vitro de discos caulinares de acordo com os níveis de IBA utilizados e a duração do período de ausência de luz e de exposição à auxina. Concentração de IBA (M)

Ensaio 3 (Diferentes concentrações de IBA) Ensaio 4 (Diferentes períodos de exposição ao IBA)

2,5 5 7,5 10 15 20 10

Duração da ausência de luz (dias)

Duração do período de exposição ao IBA (dias)

5

5

5 5 10 5

5 10 10 28

Modalidade C2,5 C5 C7,5 C10 C15 C20 5D 5D+5D 10D 28D

O meio de cultura utilizado no Ensaio 4 era igual ao dos ensaios de enraizamento in vitro de rebentos, ou seja, incluia 10 M de IBA. Neste ensaio testaram-se quatro modalidades de indução: 5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 28D4 semanas com IBA, os primeiros 5 dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal (Quadro 3). No Ensaio 3 e nas três primeiras modalidades do Ensaio 4 os discos eram transferidos, após a fase de indução, para meio idêntico ao inicial mas sem IBA até se completar as quatro semanas de duração do ensaio. Ao fazer-se a transferência para o meio sem auxina, a malha de nylon com os discos aderentes era retirada com duas pinças metálicas e colocada em cima de uma folha de papel de filtro para eliminar o excesso de meio que permanecia em contacto com os discos, sendo depois colocada no novo meio de cultura. Em ambos os ensaios realizados, cada modalidade de enraizamento teve três repetições (três placas de Petri).

58

2.5.4. Recolha de dados e análise de resultados Na primeira e segunda semanas após a instalação do ensaio, os discos caulinares foram observados em dias alternados no sentido de determinar quando surgiriam as primeiras raízes. Após esse período, as observações foram realizadas semanalmente, sendo a última realizada quatro semanas depois da instalação. Na última observação registou-se o número de discos enraizados, o número de raízes por disco enraizado, o número de discos que formaram callus, a dimensão do callus existente em cada disco, e o número de discos com callus do tipo ‘filamentoso’ (branco e rugoso) ou ‘gelatinoso’ (creme e de aspecto vidrado) (Seifert et al., 1995). Procedeu-se ao cálculo das percentagens de discos enraizados e de discos com callus em relação ao número total de discos instalados, e de discos com callus do tipo ‘filamentoso’ ou ‘gelatinoso’ em relação ao número total de discos com callus. Realizou-se a análise estatística das variáveis-resposta presença de callus, tipo de callus e dimensão do callus. Uma vez que estas variáveis apresentam, respectivamente, apenas dois e três resultados possíveis, a análise foi feita recorrendo a Modelos Lineares Generalizados (GML’s) com uma distribuição de erros Binomial e link function Logit. As análises foram realizadas para os factores ‘Concentração de IBA’ (Ensaio 3), e ‘Exposição ao IBA’ (Ensaio 4). Nos testes ao factor em análise em cada ensaio, utilizou-se o facto de a fracção da ‘deviance’ correspondente a esse factor ter uma distribuição aproximada qui-quadrado com um número de graus de liberdade igual ao número de graus de liberdade do factor. Quando o factor em estudo se revelou significativo a nível =0,05 ou inferior, procedeu-se à separação de médias utilizando o teste de Wald para =0,05. Na apresentação dos valores das médias utilizaram-se, por uma questão de facilidade de compreensão, os dados originais (não transformados). A análise estatística foi realizada recorrendo ao ‘package’ Genstat, versão 3.1. O número de raízes por disco enraizado não foi analizada estatisticamente porque a reduzida percentagem de enraizamento fez com que os valores obtidos não pudessem ser considerados representativos.

59

3. Resultados 3.1. Enraizamento in vitro de rebentos Ensaio 1 - Rebentos de origem juvenil (clone PR4) Sete dias após o início da fase de enraizamento in vitro, surgiram as primeiras raízes. Dez dias após a instalação em cultura, os rebentos sujeitos aos diferentes tratamentos de escuro e de exposição ao IBA apresentavam um aspecto depauperado e alguns tinham folhas amareladas (Figura 2). Dezassete dias após a instalação do ensaio, a maioria dos rebentos tinha folhas amareladas e o ápice necrosado, e na sua base notava-se a presença de um halo bacteriano, situação que se manteve até ao final das seis semanas de cultura in vitro (Figura 3). Em três das modalidades, dois rebentos acabaram por ser eliminados do ensaio por se apresentarem completamente castanhos. A percentagem de enraizamento, no final do ensaio, variou entre 20,8 % e 50,0 %. As modalidades 5D+5D e 42D foram as que apresentaram uma maior percentagem de rebentos enraizados, de 45,4 % e 50,0 %, respectivamente (Quadro 4). É de salientar que todos os rebentos (enraizados ou não) possuiam callus friável. Da análise estatística realizada pode concluir-se que o factor em análise, Exposição ao IBA, exerceu um efeito significativo sobre o peso fresco e o peso seco da parte aérea dos rebentos e sobre a classe de dimensão do callus. Porém, não teve um efeito significativo sobre as restantes variáveis-resposta consideradas, incluindo as variáveis-resposta relacionadas com o desenvolvimento radicular (Quadros 5 e 6). A modalidade 5D foi a que proporcionou o maior desenvolvimento da parte aérea dos rebentos. De facto, esta modalidade conduziu a um PFA significativamente superior ao das modalidades 5D+5D e 10D, e a um PSA significativamente superior ao de todas as outras modalidades testadas (Quadro 7). Pelo contrário, a dimensão do callus na modalidade 5D foi significativamente inferior à das outras modalidades (Quadro 8; Figura 4).

60

Figura 2 - Rebentos do clone PR4 em meio de indução com 10 M de IBA, 10 dias após a instalação do ensaio (5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA) (Ensaio 1).

Figura 3 - Aspecto dos rebentos do clone PR4 sujeitos às diferentes modalidades de exposição ao IBA, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 42D- 42 dias com IBA, os 5 primeiros dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal) (Ensaio 1).

61

Quadro 4 - Número de rebentos do clone PR4 instalados e número de rebentos sobreviventes, número de rebentos com callus friável e número e percentagem de rebentos enraizados, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

Modalidadez

Número de rebentos instalados

Número de rebentos sobreviventes

Número de rebentos com callus friável

Número de Percentagem rebentos de enraizados enraizamento

5D

24

24

24

5

20,8

5D+5D

24

22

24

10

45,4

10D

24

22

24

7

31,8

42D

24

22

24

11

50,0

z

5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 42D- 42 dias com IBA, os 5 primeiros dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal

Quadro 5 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA no peso fresco e peso seco da parte aérea dos rebentos (PFA e PSA), do callus (PFC e PSC) e das raízes (PFR e PSR), e no comprimento das raízes (COMPR), ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

PFA (mg) Factor

g.l. do factor Exposição ao IBA 3

Factor

g.l. do factor Exposição ao IBA 3 z

g.l. dos resíduos 86

g.l. dos resíduos 29

Variável-resposta PSA PFC (mg) (mg) Fcalc

4,5 ** z

11,85 ***

COMPR (cm)

Variável resposta PFR (mg) Fcalc

2,64 ns

PSC (mg) F0,05

1,98 ns

2,44 ns

0,88 ns

2,71

PSR (mg) F0,05 1,4 ns

2,93

ns - não significativo para =0,05; ** significativo para =0,01; *** significativo para =0,001

62

Quadro 6 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA na presença de raízes, na dimensão do callus e no número de raízes por rebento, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

Presença de raízes Factor Exposição ao IBA z

g.l. 3

4,22 ns z

Variável-resposta Dimensão Número de raízes do callus por rebento ‘Deviance’ 2(0,05) 20,9 ***

0,13 ns

7,81

ns - não significativo para =0,05; *** significativo para =0,001

Quadro 7 - Médias do peso fresco e peso seco da parte aérea dos rebentos (PFA e PSA), do callus (PFC e PSC) e das raízes (PFR e PSR) para cada modalidade, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Dentro da mesma coluna os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes a nível =0,05) (Ensaio 1). Modalidade z

PFA (mg)

PSA (mg)

PFC (mg)

PSC (mg)

PFR (mg)

PSR (mg)

5D

47,8 a

14,4 a

31,7 a

5,6 a

11,7 a

1,8 a

5D+5D

39,2 b

10,7 b

39,5 a

5,6 a

15,6 a

1,8 a

10D

33,5 b

8,8 b

44,2 a

6,2 a

3,3 a

0,7 a

42D

40,6 ab

10,2 b

40,2 a

6,3 a

9,8 a

1,4 a

z

5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 42D- 42 dias com IBA, os 5 primeiros dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal

63

Quadro 8 - Médias do número de raízes por rebento, do comprimento total das raízes por rebento e da dimensão do callus para cada modalidade, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Dentro da mesma coluna os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes a nível =0,05) (Ensaio 1). Modalidade

z

Comprimento das Dimensão y do raízes (cm) callus

Número de raízes por rebento

5D

1,6 a

3,7 a

1,3 b

5D+5D

1,5 a

3,5 a

1,8 a

10D

1,7 a

1,2 a

2,2 a

42D

1,5 a

2,4 a

2,1 a

z

5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 42D- 42 dias com IBA, os 5 primeiros dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal y dimensão 1- reduzida; dimensão 2- moderada; dimensão 3- elevada

100 80 60 (%) 40

Modalidade 5D

20

Modalidade 5D+5D Modalidade 10D

0 1

2

3

Modalidade 42D

Dim ensão do callus

Figura 4- Influência da modalidade de exposição ao IBA (5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias no escuro com IBA; 42D- 42 dias com IBA, os 5 primeiros dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal) sobre a frequência de rebentos por classe de dimensão do callus (1- reduzida; 2- moderada; 3- elevada), ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 1).

64

Ensaio 2 - Rebentos provenientes de material adulto (clone R1934). Cinco dias após a instalação do ensaio, apareceram as primeiras raízes em alguns rebentos. Os rebentos sujeitos às duas modalidades de indução ensaiadas apresentavam um aspecto morfológico geral semelhante dez dias após o início do ensaio (Figura 5). Dezoito dias após a instalação, alguns rebentos apresentavam o ápice necrosado e as folhas amarelas, bem como um halo bacteriano na sua base, situação que se manteve até ao fim das seis semanas de enraizamento (Figura 6).

Figura 5 - Rebentos do clone R1934 em meio de indução com 10 M de IBA, 10 dias após a instalação de ensaio (5D- 5 dias no escuro com IBA; 10D- 10 dias no escuro com IBA) (Ensaio 2).

65

Figura 6 - Aspecto dos rebentos do clone R1934 sujeitos às diferentes modalidades de exposição ao IBA, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (5D- 5 dias no escuro com IBA; 10D- 10 dias no escuro com IBA) (Ensaio 2). Após as seis semanas de enraizamento todos os rebentos apresentavam callus friável na zona basal. A percentagem de enraizamento foi inferior a 30% em ambas as modalidades (29,2% na modalidade 5D e 26,1% na modalidade 10D) (Quadro 9).

Quadro 9 - Número de rebentos do clone R1934 instalados e número de rebentos sobreviventes, número de rebentos com callus friável e número e percentagem de rebentos enraizados, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2).

Modalidadez

Número de rebentos instalados

Número de rebentos sobreviventes

Número de rebentos com callus friável

Número de rebentos enraizados

Percentagem de enraizamento

5D

24

24

24

7

29,2

10D

24

23

23

6

26,1

z

5D- 5 dias no escuro com IBA; 10D- 10 dias no escuro com IBA

66

A análise estatística revelou a existência de um efeito significativo do factor Exposição ao IBA apenas sobre a variável dimensão do callus (Quadros 10 e 11). Tal como no Ensaio 1, a modalidade 5D conduziu a uma dimensão do callus significativamente inferior à da modalidade 10D (Quadro 12; Figura 7).

Quadro 10 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA na presença de raízes, na dimensão do callus e no número de raízes por rebento, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2).

Factor

g.l.

Exposição ao IBA z

1

Variável-resposta Presença Dimensão Número de raízes de raízes do callus por rebento Valor da estatística relativa ao teste de Wald - 0,22 ns z

2,75 **

1,04 ns

z 0,025 1,96

ns - não significativo para =0,05; ** significativo para =0,01

Quadro 11 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA no comprimento das raízes (COMPR), ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2). Variável-resposta COMPR (cm) Factor Exposição ao IBA z

g.l. do factor

g.l. dos resíduos

Fcalc

F0,05

1

11

0,21 ns z

4,48

ns - não significativo para =0,05

67

Quadro 12 - Médias do número de raízes por rebento, comprimento total das raízes por rebento e dimensão do callus para cada modalidade, ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (dentro da mesma coluna os valores seguidos da mesma letra não são significativamente diferentes a nível =0,05) (Ensaio 2).

Modalidade z

Número de raízes por rebento

Comprimento das raízes (cm)

Dimensão y do callus

5D

1,0 a

3,4 a

1,9 b

10D

1,7 a

1,7 a

2,6 a

z y

5D- 5 dias no escuro com IBA; 10D- 10 dias no escuro com IBA dimensão 1- reduzida; dimensão 2- moderada; dimensão 3- elevada

100 80 (%)

60

Modalidade 5D

40

Modalidade 10D

20 0 1

2

3

Dim ensão do callus

Figura 7 - Influência da modalidade de exposição ao IBA (5D- 5 dias no escuro com IBA; 10D- 10 dias no escuro com IBA) sobre a frequência de rebentos por classe de dimensão do callus (1- reduzida; 2- moderada; 3- elevada), ao fim de seis semanas de enraizamento in vitro (Ensaio 2).

3.2. Enraizamento in vitro de discos caulinares Ensaio 3 - Efeito da concentração de IBA Os primeiros primórdios radiculares surgiram nove dias após a instalação do ensaio. O aparecimento de raízes prosseguiu até ao final da 3ª semana de instalação do ensaio, a partir daí não surgiram quaisquer novas raízes. 68

No final da fase de enraizamento in vitro (quatro semanas após a instalação do ensaio) muitos dos discos instalados apresentavam callus, quer do tipo ‘gelatinoso’, quer do tipo ‘filamentoso’ (Figura 8). As raízes que se tinham formado apresentavam um crescimento reduzido e alguns discos mostravam-se desidratados e necrosados. A percentagem de enraizamento dos discos foi muito reduzida (Quadro 13). A modalidade C10 deu origem a 8,3% de discos enraizados, enquanto que na modalidade C15 não houve formação de quaisquer raízes. O número médio de raízes por disco foi superior na modalidade C10, coincidindo com a maior percentagem de enraizamento.

Figura 8 - Aspecto dos discos caulinares ao fim de quatro semanas in vitro [de notar a diferença entre callus ‘gelatinoso’, de cor creme (A) e callus ‘filamentoso’, de cor branca (B)].

69

Quadro 13 - Número e percentagem de discos enraizados e número médio de raízes por disco, ao fim de quatro semanas in vitro (Ensaio 3).

Modalidade z

Número inicial de discos

Número de discos enraizados

Número médio de raízes por disco

Percentagem de enraizamento

C2,5 C5 C7,5 C10 C15 C20

60 60 60 60 60 60

2 2 3 5 0 2

1 1 1,3 2,2 0 1

3,3 3,3 5,0 8,3 0 3,3

z

Modalidades definidas pela concentração de IBA no meio de indução do enraizamento (C2,5- 2,5 M; C5- 5 M; C7,5- 7,5 M; C10- 10 M; C15- 15 M; C20- 20 M). Os discos permaneceram às escuras no meio de indução durante um período inicial de 5 dias.

A análise estatística realizada revelou que a concentração de IBA teve um efeito altamente significativo sobre a presença e a dimensão do callus (Quadro 14). O número de discos com callus foi mais elevado na modalidade C20 (Figura 9). As modalidades C10 e C20 apresentaram callus com dimensão superior à das modalidades C2,5 e C15 (dados não apresentados). A concentração de IBA não influenciou significativamente o tipo de callus formado (Quadro 14) embora se tenha notado uma tendência para uma maior formação de callus ‘gelatinoso’ nos discos das modalidades correspondentes a concentrações de IBA mais elevadas (Figura 9).

Quadro 14 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da concentração de IBA na presença de callus e no seu tipo e dimensão do callus formado durante a fase de enraizamento in vitro de discos caulinares (Ensaio 3).

Factor Concentração de IBA z

g.l. 5

Variável-resposta Presença Tipo de de callus callus ‘Deviance’ 35,7 *** z

8,6 ns

Dimensão do callus 2(0,05) 24,2 ***

11,07

ns - não significativo para =0,05; *** significativo para =0,001

70

Figura 9 - Influência da concentração de IBA sobre a frequência de discos caulinares por tipo de callus (‘gelatinoso’ ou ‘filamentoso’) e sua presença nos discos, ao fim de quatro semanas in vitro (Ensaio 3).

Ensaio 4 - Efeito das condições de exposição ao IBA Neste ensaio, os primeiros primórdios radiculares foram vísiveis dez dias após o início da fase de enraizamento in vitro. No final do período de quatro semanas de enraizamento, muitos dos discos instalados apresentavam callus, quer do tipo ‘filamentoso’, quer do tipo ‘gelatinoso’, as raízes eram incipientes e os discos tinham começado a necrosar. As percentagens de enraizamento obtidas foram baixas, situando-se entre um mínimo de 1,7 % e um máximo de 11,7 % nas modalidades 10D e 5D, respectivamente. O número médio de raízes por disco foi superior na modalidade 5D+5D (Quadro 15). A análise estatística efectuada demonstrou que o factor Exposição ao IBA exerceu um efeito significativo sobre o tipo de callus, mas não sobre a presença ou dimensão do callus (Quadro 16). Todas as modalidades conduziram a um predomínio de callus ‘gelatinoso’ relativamente ao ‘filamentoso’ (Figura 10). Essa diferença foi particularmente acentuada para a modalidade 10D, a qual originou um número de discos com callus do tipo ‘filamentoso’ significativamente inferior ao obtido com as restantes modalidades.

71

Quadro 15 - Número e percentagem de discos enraizados e número médio de raízes por disco, ao fim de quatro semanas in vitro (Ensaio 4). Modalidade z

Número inicial de discos

Número de discos enraizados

Número médio de raízes por disco

Percentagem de enraizamento

5D 5D+5D 10D 28D

60 60 60 60

7 6 1 4

1,4 2 1 1,2

11,7 10 1,7 6,7

z

5D- 5 dias no escuro com IBA; 5D+5D- 5 dias no escuro com IBA+ 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal; 10D- 10 dias co escuro com IBA; 28D- 28 dias com IBA, os 5 primeiros dias no escuro e os restantes sob fotoperíodo normal

Quadro 16 - Resumo da análise estatística relativa ao efeito da modalidade de exposição ao IBA na presença de callus e no seu tipo e dimensão do callus formado durante a fase de enraizamento in vitro de discos caulinares (Ensaio 4).

Presença de callus Factor Exposição ao IBA z

g.l. 3

1,7 ns z

Variável-resposta Tipo de callus ‘Deviance’ 13,4 **

Dimensão do callus 2(0,05) 4,0 ns

7,81

ns - não significativo para =0,05; ** significativo para =0,01

Figura 10 - Influência da modalidade de exposição ao IBA sobre a frequência de discos caulinares por tipo de callus (‘gelatinoso’ ou ‘filamentoso’) e sua presença nos discos, ao fim de quatro semanas in vitro (Ensaio 4). 72

4. Discussão 4.1. Enraizamento in vitro de rebentos No Ensaio 1 sobre enraizamento in vitro de rebentos de origem juvenil (clone PR4) as maiores percentagens de rebentos enraizados foram de 45,4 %, para a modalidade 5D+5D (rebentos sujeitos a 5 dias de exposição a 10 M de IBA no escuro, após o que foram transferidos para a luz, permanecendo mais 5 dias em meio com auxina) e de 50 % para a modalidade 42D (rebentos em meio de indução com 10 M de IBA durante as seis semanas de duração do ensaio, sujeitos a um período inicial de 5 dias no escuro) (Quadro 4). Quando os rebentos permaneceram apenas 5 dias no escuro em meio de indução (modalidade 5D), a percentagem de rebentos enraizados obtida foi a menor das modalidades testadas (apenas 20,8 %). Estas percentagens de enraizamento foram baixas quando comparadas com as de um ensaio semelhante realizado em 1998 na Secção de Horticultura do ISA, igualmente com material vegetal de origem juvenil mas de um outro clone (clone PR3). Nesse ensaio obteve-se 100 % de rebentos enraizados independentemente da modalidade de indução ensaiada. Esta variação pode reflectir uma influência decisiva do genótipo e/ou do diferente estado fisiológico dos rebentos. De facto, dezassete dias após a instalação, verificou-se que a maioria dos rebentos de origem juvenil apresentava as folhas amareladas, o ápice necrosado e na base um halo bacteriano, indicador de infecções internas. Estes sintomas também surgiram no material adulto (Ensaio 2) embora com menor intensidade. O amarelecimento das folhas pode ser causado por uma acumulação de etileno no interior dos tubos de ensaio (Marino e Ventura, 1997). De Klerk et al. (1997) verificaram que, por vezes, quando utilizaram o IBA para induzir a rizogénese, as folhas ficavam amarelas ou castanhas. A necrose do ápice pode ser consequência de infecções internas ou de falta de humidade (Lane, 1979; Pierik, 1987). Estas condições podem ter afectado a capacidade dos rebentos para regenerar raízes pois, conforme referido por Baviera et al. (1989) e Druart (1994), as folhas e o ápice influenciam a rizogénese em rebentos. Como tal, os resultados obtidos em ambos os ensaios apresentam um carácter preliminar devido ao facto de não se terem repetido os ensaios. No Ensaio 2, realizado com rebentos provenientes de material adulto (clone R1934), os rebentos da modalidade 5D (5 dias no escuro em meio de enraizamento com 10 M de IBA) apresentavam uma percentagem de enraizamento ligeiramente mais elevada (29 %) 73

que os da modalidade 10D (10 dias no escuro em meio com IBA) (Quadro 9). A permanência no escuro em meio com IBA durante 5 dias foi também a modalidade mais favorável nos ensaios de enraizamento in vitro de Banno et al. (1989) e De Klerk et al. (1997) com Pyrus serotina e Malus pumila, respectivamente De facto, esta modalidade de indução da rizogénese tem sido bastante utilizada, quer noutros ensaios realizados com rebentos de pereira ‘Rocha’ no ISA, quer em trabalhos realizados por outros investigadores em diferentes cultivares de Pyrus spp. e Malus spp. No entanto, as maiores percentagens de enraizamento obtidas no Ensaio 1 com as modalidades 5D+5D e 42D, sugerem que para a pereira ‘Rocha’ poderá ser vantajoso aumentar a duração do período de exposição ao IBA mantendo, no entanto, a duração do período de permanência no escuro (5 dias). Esta hipótese será avaliada em ensaios posteriores com material adulto, pois no presente trabalho não foi possível dispor de rebentos homogéneos de R1934 em quantidade suficiente para testar aquelas modalidades. Pierik (1987) menciona que o material vegetal adulto possui menor capacidade de regeneração do que o juvenil, o que está de acordo com os resultados de Bhojwani et al. (1984) em Pyrus pyrifolia e Banno et al. (1989) em P. serotina. Do mesmo modo, em ensaios anteriormente realizados no ISA com rebentos de origem adulta obtiveram-se percentagens de enraizamento da ordem de 30 %, bastante inferiores às obtidas com material vegetal de origem juvenil que atingiram 100 %, conforme já foi referido. No entanto, nos ensaios efectuados neste trabalho, não se verificou uma diferença tão acentuada na capacidade de enraizamento entre os dois tipos de material vegetal utilizado, provavelmente devido à condição particularmente depauperada em que se encontravam os rebentos de origem juvenil e também devido à presença da infecção bacteriana. Relativamente à influência significativa da exposição ao IBA sobre o desenvolvimento vegetativo dos rebentos (Quadro 5), verificou-se que o valor mais elevado de peso seco da parte aérea dos rebentos (Ensaio 1) foi obtido com a modalidade 5D (Quadro 7) na qual os rebentos ficaram expostos ao IBA durante o período mais curto (5 dias). Este resultado poderá traduzir um antagonismo entre a exposição prolongada a uma elevada concentração de auxinas e o desenvolvimento da parte aérea dos rebentos, à semelhança do que sucede para uma elevada razão auxina/ citocinina (De Klerk et al., 1993 e 1995). No entanto, esta explicação não poderia justificar, à primeira vista, o facto de o desenvolvimento da parte aérea ter sido estatisticamente semelhante nas modalidades com 74

10 dias (5D+5D e 10D) e com 42 dias de exposição ao IBA. Porém, atendendo à degradação das auxinas na presença de luz (De Klerk et al., 1997) poder-se-à admitir que, na modalidade 42D, a concentração real de IBA durante parte do ensaio tenha diminuido consideravelmente em relação à concentração inicial de 10 M. Em nenhum dos ensaios realizados se verificou um efeito significativo da exposição ao IBA nas variáveis-resposta associadas ao desenvolvimento radicular dos rebentos (Quadros 5, 6, 10 e 11), embora a modalidade 10D tenha conduzido a valores médios de PFR e PSR (Ensaio 1) e de comprimento de raízes (Ensaios 1 e 2) bastante menores que os das restantes modalidades (Quadros 7, 8 e 12), e a um ligeiramente maior número de raízes por rebento (Quadros 8 e 12). A ausência de significância estatística poder-se-à dever à conjugação do número pouco representativo de rebentos enraizados com a grande variabilidade que se verificou no crescimento das raízes. Além disso, há que ter em conta que uma exposição mais prolongada ao IBA (e, no caso da modalidade 10D, uma menor degradação da auxina durante os 10 dias iniciais no escuro) poderia, por um lado, ter favorecido a indução da rizogénese mas, por outro lado, teria afectado negativamente o crescimento das raízes. De facto, a permanência dos rebentos em meio com auxina tem tendência a causar inibição do alongamento das raízes (De Klerk et al., 1990; Druart, 1996). Nos ensaios aqui apresentados a única auxina testada foi o IBA porque em ensaios anteriormente realizados no ISA verificou-se que rebentos tratados com NAA tinham um menor número de raízes do que aqueles expostos ao IBA. A concentração de IBA utilizada, 10 M, foi a que conduziu aos melhores resultados nos ensaios de Banno et al. (1989), Rodríguez et al. (1991) e Yeo e Reed (1995). A duração do período de exposição ao IBA influenciou a dimensão do callus formado na base dos rebentos (Quadros 8 e 12), mas não afectou o seu peso fresco ou seco (Quadro 7). Em ambos os ensaios, a formação de callus foi menor em rebentos da modalidade 5D (Figuras 4 e 7), os que ficaram menos tempo em contacto com a auxina. Diversos autores têm constatado que uma maior duração do período de exposição ao IBA causa maior formação de callus (James e Thurbon, 1979; Dolcet-Sanjuan et al., 1990), pois a auxina promove divisões celulares contínuas. A presença de callus pode afectar o desenvolvimento das raízes e a capacidade de sobrevivência dos rebentos durante a aclimatização (Welander, 1983; Berardi et al., 1991). 75

4.2. Enraizamento in vitro de discos caulinares Nos ensaios de enraizamento in vitro de discos caulinares observou-se a formação de um número bastante reduzido de discos enraizados. De facto, as percentagens máximas de enraizamento foram de 8,3 % e 11,7 % nos Ensaios 3 e 4, respectivamente (Quadros 13 e 15). A bibliografia consultada apenas menciona ensaios com discos caulinares em cultivares de macieira. Assim, no presente estudo, a reduzida capacidade para regenerar raízes a partir de discos caulinares pode estar relacionada com a espécie e a cultivar utilizada - a pereira ‘Rocha’. Em estudos realizados em macieira, o número de raízes por disco caulinar foi inferior ao obtido em rebentos (7 e 11 raízes, respectivamente) (Van der Krieken et al., 1991). No entanto, no presente trabalho, essa diferença não foi evidente ao comparar os resultados dos Ensaios 1 e 4 (Quadros 8 e 15). Das concentrações de IBA testadas (Ensaio 3), a que originou uma percentagem superior de discos caulinares enraizados foi a de 10 M (Quadro 13). No Ensaio 4, em que se testou a duração e as condições de luz do período de exposição a uma concentração única de IBA (10 M), verificou-se que a percentagem de enraizamento mais elevada (11,7 %) foi obtida com a exposição dos discos à auxina durante 5 dias no escuro (modalidade 5D), ao contrário do que aconteceu no ensaio de enraizamento de rebentos do mesmo clone (Ensaio 1). O número de raízes por disco mais elevado foi obtido com a modalidade 5D+5D (Quadro 15). Quando os discos permaneceram em meio com IBA durante 10 dias no escuro obteve-se o menor número de raízes por disco e a menor percentagem de discos enraizados (1,7 %). Tanto no Ensaio 1 (rebentos) como no Ensaio 4 (discos), a permanência de 10 dias no escuro em meio com IBA (modalidade 10D) conduziu a um menor enraizamento do que a permanência de 10 dias em meio com IBA mas em que apenas os 5 dias iniciais foram passados no escuro (modalidade 5D+5D). Estes resultados podem estar relacionados com a fotooxidação das auxinas (De Klerk et al., 1997) no caso da modalidade 5D+5D, enquanto que na modalidade 10D a exposição prolongada à auxina terá sido inibitória. Nos discos a permanência de quatro semanas em meio com IBA causou uma diminuição acentuada da percentagem de enraizamento, contrariamente ao que se verificou nos rebentos com uma exposição prolongada (42 dias) à auxina. Welander e Pawlicki (1993) verificaram que 76

bastava usar períodos de indução superiores a 24 horas para reduzir a percentagem de enraizamento dos discos caulinares e favorecer a formação de callus em meio de indução com 24,6 M de IBA. Estes autores concluiram que o efeito nefasto da exposição prolongada dos discos ao IBA ou a concentrações crescentes de auxina no meio de indução pode estar relacionado com a reduzida dimensão dos discos que, por isso, são mais sensíveis à acção da auxina que os rebentos. Em ambos os ensaios realizados com discos caulinares, a maioria dos discos estava desidratada e necrosada após as quatro semanas de enraizamento in vitro e os discos enraizados apresentavam raízes muito pequenas. Nos ensaios referidos na bibliografia não são mencionados tais aspectos dos discos, provavelmente por não se tratar da mesma espécie. A concentração de IBA aplicada (Ensaio 3) afectou significativamente a dimensão do callus e a sua presença nos discos (Quadro 14; Figura 9), enquanto que a modalidade de exposição ao IBA (Ensaio 4) afectou o tipo de callus formado mas não a presença de callus ou a sua dimensão (Quadro 16; Figura 10). Em ambos os ensaios, notou-se uma tendência para uma maior formação de callus ‘gelatinoso’ com o aumento da concentração auxínica (Figura 9) e do período de exposição ao IBA (Figura 10), o que está de acordo com os resultados obtidos por Seifert et al. (1995).

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V. CONCLUSÕES A pereira ‘Rocha’ é a cultivar de pereira mais importante no nosso País. Com este trabalho pretendeu-se contribuir para o desenvolvimento de uma metodologia eficaz de micropropagação desta cultivar, tendo sido abordadas as fases de enraizamento in vitro e de estabelecimento in vitro de novas culturas. Estas fases, e em particular a fase de enraizamento, à qual foi dada uma atenção especial, são consideradas críticas para o sucesso da micropropagação de fruteiras lenhosas. Na fase de iniciação e estabelecimento in vitro de novas culturas de pereira ‘Rocha’ conseguiram-se percentagens de contaminação inferiores a 7 % ao utilizar como explantados primários estacas uninodais obtidas de rebentos colhidos na Primavera em árvores adultas de clones seleccionados. Essas percentagens foram bastante satisfatórias, tendo em conta que o material proveniente do campo apresenta geralmente um grau de contaminação elevado. Os ensaios realizados evidenciaram a vantagem de utilizar a composição salina do meio QL na instalação de novas culturas in vitro relativamente à composição salina do meio MS, embora este último seja o mais frequentemente referido na literatura. De facto, o meio QL conduziu a um maior desenvolvimento dos rebentos que surgiram dos explantados de ‘Rocha’. Num ensaio comparativo em que se utilizou pereira ‘Williams’ confirmou-se a superioridade do meio QL que originou, nesta cultivar, um maior grau de evolução dos gomos e um maior número de rebentos por explantado. O sucesso e a reproducibilidade obtidos com os ensaios de estabelecimento realizados indicam que a utilização de estacas uninodais como explantados é bastante vantajosa para a micropropagação de pereira ‘Rocha’ e, indirectamente, para a regeneração adventícia, o saneamento fitossanitário (por exemplo, através de termoterapia in vitro seguida de cultura de meristemas) e o melhoramento por via biotecnológica desta cultivar. Nos ensaios de enraizamento in vitro de rebentos de pereira ‘Rocha’, a modalidade 5D (apenas 5 dias de indução com IBA, no escuro), que é a mais frequentemente referenciada na literatura, promoveu um maior desenvolvimento da parte aérea dos rebentos, originou callus de menor dimensão, mas conduziu também a uma menor percentagem de enraizamento que as modalidades 5D+5D (5 dias com IBA no escuro + 5 dias com IBA sob fotoperíodo normal) e 42D (permanência em meio com IBA durante toda a fase de enraizamento, mas apenas com os 5 dias iniciais no escuro). Por outro lado, uma 78

permanência particularmente prolongada dos rebentos em meio de indução com IBA, como sucedeu no caso da modalidade 42D, embora possa favorecer a indução da rizogénese inibe normalmente o crescimento das raízes. O aumento da duração do período de escuro de 5 para 10 dias (modalidade 10D) revelou-se desfavorável ao desenvolvimento quer da parte aérea, quer da parte radicular dos rebentos. Nos ensaios de enraizamento de discos caulinares, a concentração de IBA influenciou a presença e a dimensão do callus, enquanto que a modalidade de exposição ao IBA influenciou o tipo de callus formado. Os ensaios realizados evidenciam a dificuldade (ou impossibilidade) de definir uma modalidade de exposição ao IBA que consiga aliar o máximo enraizamento ao máximo desenvolvimento da parte aérea e simultaneamente à mínima formação de callus, uma vez que a presença de callus na base dos rebentos pode afectar a sua capacidade de sobrevivência durante o processo de aclimatização. De facto, estes fenómenos são geralmente antagónicos entre si. Assim, há que estabelecer um compromisso o mais favorável possível, o que requer uma continuidade deste tipo de ensaios. De qualquer forma, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o enraizamento de pereira ‘Rocha’ poderá beneficiar com uma exposição mais prolongada ao IBA do que a exposição de 5 dias, frequentemente referida como a mais favorável para outras cultivares, mantendo, no entanto, em 5 dias a duração do período de escuro. Neste contexto, a modalidade 5D+5D e mesmo a 42D poderão ser mais adequadas do que a modalidade 5D. Haverá interesse em efectuar novos ensaios com estas modalidades de indução e modalidades afins para, com uma maior representatividade, se poder avaliar o alcance dos resultados deste trabalho e estabelecer uma metodologia de enraizamento in vitro adequada para a pereira ‘Rocha’.

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VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AL-MAARRI, K., ARNAUD,Y. e MIGINIAC, E. (1987) Microbouturage in vitro de jeunes poiriers issus de pépins de "Passe Crassane". Can. J. Bot. 65: 803-806. AL-MAARRI, K., ARNAUD, Y. e MIGINIAC, E. (1994) Micropropagation of Pyrus communis cultivar 'Passe Crassane' seedlings and cultivar 'Williams': factors affecting root formation in vitro and ex vitro. Scientia Horticulturae 58: 207-214. AL-MAARRI, K., DURON, M., ARNAUD, Y. e MIGINIAC, E. (1986) Étude comparative de l'aptitude à la micropropagation, par culture de méristèmes in vitro, du poirier cv. "Passe Crassane" adulte et de poiriers juvéniles issus de semis de "Passe Crassane". CR. Acad. Agric. Fr. 72(5): 413421. ANTONELLI, M. e CHIARIOTTI, A. (1988) In vitro rooting of different peach genotypes. Acta Horticulturae 227: 414-418. ASCARELLI, A., DAMIANO, C. e FALASCA, G. (1994) Peroxidase activity and isoperoxidase variation on in vitro rooting in apple rootstock MM106. In: Proceedings VIII International Congress on Plant Tissue and Cell Culture, 12 a 17 de Junho 1994, Florença, pp. 2-6. BANNO, K., YOSHIDA, K., HAYASHI, S. e TANABE, K. (1989) In vitro propagation of Japanese pear cultivars. J. Japan. Soc. Hort. Sci. 58(1): 37-42. BARALDI, R., BERTAZZA, G., PREDIERI, S. e BREGOLI, A.M. (1993) Uptake and metabolism of indole-3-butyric acid during the in vitro rooting phase in pear cultivars (Pyrus communis). Acta Horticulturae 329: 289-291. BAVIERA, J.A., GARCÍA, J.L. e IBARRA, M. (1989) Commercial in vitro micropropagation of pear cv. Conference. Acta Horticulturae 256: 63-68. BERARDI, G., INFANTE, R. e NERI, D. (1993) Micropropagation of Pyrus calleryana Dcn. from seedlings. Scientia Horticulturae 53: 157-165. BERARDI, G., NERI, D., MAIORINO, A. e ADVERSI, R. (1991) In vitro rooting of Pyrus calleryana. Acta Horticulturae 300: 181-188. BERTAZZA, G., BARALDI, R. e PREDIERI, S. (1995) Light effects on in vitro rooting of pear cultivars of different rhizogenic ability. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 41: 139-143. BHOJWANI, S.S., MULLINS, K. e COHEN, D. (1984) In vitro propagation of Pyrus pyrifolia. Scientia Horticulturae 23: 247-254. CABONI, E., BOUMIS, G. e DAMIANO, C. (1992) Effects of phenols, gibberelic acid and carbohydrates on the rooting of the apple rootstock M9 Jork. Agronomie 12: 789-794. CASTILHO, A. (1937) Pereiras Portuguesas (Subsídios para a Pomologia Portuguesa). Gazeta das Aldeias 1737: 9-10.

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