FERTILIZAÇÃO IN VITRO

August 7, 2017 | Autor: André Frare | Categoria: Animal breeding and genetics
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Descrição do Produto

APOSTILA LABORATÓRIO DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO
Desenvolvida por: Frare, André & Frare, Jairo – Médicos Veterinários da Santa Clara Genética.

INTRODUÇÃO
Todas as semanas as incubadoras tem que ser revisadas, se na semana tiver muito movimento dentro do laboratorio e as portas das incubadoras se abrem excessivamente, é conveniente revisar duas vezes por semana os níveis.
Água no interior: as incubadoras na parte de dentro tem na sua parte inferior caldeiras para água, é importante que estas caldeiras permaneçam sempre com mais da metade de sua capacidade. Pore star sempre emu ma temperature elevada, a agua se evapora, e esta agua tem o proposito de evaporar para que não vá para os outros meios que estão ali. Por isso é importante manter o seu nível. A água com que se deve deixar é sempre água destilada.
Água exterior: a incubadora para poder regular a temperature contem agua entre as paredes, os niveis de agua sao regulados automaticamente, quando o nivel baixa criticamente a incubadora por si vai avisar. Quando isto acontece tem que se colocar agua pela abertura deixada para este proposito até que a incubadora deixe de apitar e recupere o seu nível.
Temperatura: A temperature corporal das vacas é de 39 graus celcius, e esta temperature em que se deve seguir a risca o cultivo e o desenvolvimento dos OVOCITOS; sem embargo a maioria das incubadoras os termometros medidores estao errados por 1 ou 2 graus, por isso se recomenda que a temperature seja de 38.5. Se usa esta temperatura já que uns graus a menos nao repercutam tanto nos ovocitos como em seu desenvolvimento, porem uns graus a mais antes modifiquem certa produção podendo ser letais.
A incubadora mostra a temperature em um painel frontal, sem ambargo, esta medição estar errada, por isso se coloca dentro da incubadora um becker com um pouco de água e um termometro de mercurio para verificar que as duas temperaturas estejam de acordo. Se não for assim, se deverá ajustar a temperature na parte frontal com os controles para igualá-las com a temperature do termometro.
Gás: A maioria dos aparelhos reprodutivos dos mamíferos, a tensáo dos gases vaira entre 3,5 e 8%, esta tensão é a que se trata de imitar os cultivos in vitro. Em geral a tensão de CO2 se desenvolve de maneira favorável a 5%, se a tensão não chega a ser ótima pode sim afetar o desenvolvimento embrionário; se a tensao é muito baixa, pode causar apoptose, se a tensão é muito alta, pode acelerar o processo de produção de radicais livres.
As incubadoras devem manter um ambiente de: 5% CO2 + 95% ar = 100% gases totais.
A incubadora mostra o nível de CO2 no painel frontal, sem embargo, esta medida pode estar erra, por isso, se verifica os niveis de CO2 com a ajuda de FYRITA?
Para medir com a Fyrita segue-se o seguinte procedimento:
Conectar os extremos das mangueiras das incubadoras
Insulflar a bomba por no minimo 18 vezes
Apertar o botão da Fyrita para fazer que seu nível abaixe. Nunca colocar a Fyrita com o botao para baixo já se fizer assim o liquido pode sair.
Girar a Fyrita duas vezes pelo menos e apertar o botão para que o nível abaixe.
Observar que o nivel do liquido vemelho esteja em zero, se não estiver mover o parafuso para ajustar.
Uma vez qeu a Fyrita se voltou para trás duas vezes e está ajustado no zero, colocar a extremidade grossa da Fyrita sobre o botão e pressionar.
Ao mesmo tempo insulflar a bomba por no minimo 20 vezes.
Soltar a pressão do botão na ultima vez que se insulflar de uma unica vez.
Girar a fyrita duas vezes.
Checar o nível em que ele se encontra.
O nível deve marcar 5,5% se não coincide então adaptar os niveis da tela da incubadora, e ir fazendo isto aos poucos para não saturar a incubadora, geralmente em meia hora chega-se ao nível desejado.
A mediçao de CO2 e a temperature devem fazer na primeira hora antes de que sejam abertas as portas das incubadoras para uma medição mais precisa.
TANQUES DE GÁS
Os tanques de g[as se encontram na parte exterior do laboratorio. É importante checar com regularidade os niveis dos gases para ter uma previsáo de mudança e sempre ter um tanque de CO2 extra para este proposito. Destes tanques dependem os ovocitos e os embrioes produzidos no laboratório, por isso é de extrema importância a sua regulação.
No exterior tem 4 tipos de tanques com as seguintes concentrações de gases:
CO2 = Conectado a incubadora NUARE
CO2 = Conectado a incubadora FISHER
CO2 = Tanque de reposição
10% CO2
5% CO2
Nitrogênio, CO2, 02.
Quando os niveis de g[as se encontram muito abaixo e a pressao diminuida, o tanque deve ser mudado.
Para mudar o tanque:
Fechar a chave
Fechar o manômetro
Quando este se aperta aumentamos a pressão, por isso que temos que fechar deixando mais frouxo no sentido anti-horário.
Remover toda a chave com o medidor
Passar teflón na saida do gás
Colocar a chave e os medidores no tanque novo
Apertar bem
Abrir as chaves.
Perguntar sobre a INFRA nos tanques, fazer o pedido com tempo e ter o cuidado ao pedir a mistura de gazes adequados.

TENDA DE EXTRAÇÃO DE AR
Todo tempo deve se trabalhar dentro da tenda.
Cada vez antes de usar a tenda se deve limpar com alcool e tambem cada vez que se termine de trabalhar.
Deve-se manter a tenda acesa quando se está trabalhando com ela, quando terminar o uso limpar adequadamente e apagar a luz.
A Luz da tenda somente se deve usar mediante e ao manejo dos meios e se fazem places. Nunca deixar ligada enquanto se está se manejando ovócitos , embrões e semens já que são sensíveis a luz.
As pipetas dentro das tendas também devem ser limpadas com alcool ao começar o dia, quando não se está usando devem permanecer ajustadas a metade do seu caliber, em 5 microlitros, 50 e 50 microlitros respectivamente.
REVISÕES NECESSÁRIAS PARA O LABORATÓRIO
APARELHO
REVISÃO NECESSÁRIA
FREQUÊNCIA
incubadoras
Gás, agua, temperature
1 x semana
Campana (tenda)
Sacudir os filtros
1 x mês
Campana (tenda)
Secar tudo e limpar com alcool
1 x mês
Silica
Esquentar quando mudar a colocaração
Cada vez que se faça necessário
Sistema miliq
Chegar níveis m (18.2) e TOC (5-8)
Diário
Sistema miliq
Checar niveis ELIX (produto = 0,066)
1 x semana
Sistema miliq
Checar niveis ELIX (rejeição > 97%)
1 x semana
Sistema miliq
Mudar filtros
Quando indica a tela
Sistema miliq
Revisão base
A cada 60 dias
Sistema miliq
Adicionar cloro
A cada 60 dias
Sistema miliq
Revisar ácidos
A cada 60 dias
Tanques de gas exteriors
Checar os níveis
1 x mês
Tanques de nitrogenio liquid
Checar os níveis
1 x mês
Checar armazenamento
Quando faz falta
1 x mês




MATURAÇÃO
Maturação in vitro (MIV)
DIA 1
Placas:




30 mcl médio MIV + azeite + 60mcl médio MIV = 90 mcl
Para fazer as placas se calcula 2 gotas por vaca aspirada, se fazem placas com um máximo de 5 gotas.
Os ovócitos de cada vaca, colocar em uma gota separada, não colocar duas vacas em uma mesma gota.
Criotúbulos:
Tampa de Rosca

300mcl azeite

400 mcl MIV

Faz-se um critoubo por vaca, porem sempre se faz um criotubo a mais para qualquer eventualidade.
Se os ovócitos vierem em criotubos e falta pouco tempo para ficarem maturados (3 horas), já não se remove a placa. Porém se falta más os ovócitos podem ser mudados de placas.
Para retirar os ovócitos do critotubo:
- Checar a temperatura da incubadora de onde vieram os ovócitos. Se vierem a uma temperatua mais baixa de 25 graus, os ovócitos ficam maduros por até ou mais que 3 horas.
- Se coloca a ponteira de 10mcl no criotubo e se retira todos os ovócitos de uma só vez.
- Se retira o excesso de azeite em um lado da placa
- Coloca-se os ovócitos em placas, não mais que 25 ovocitos por gota.
* Cada vez que se receber os ovócitos, tem-se que checar as horas de controle que são duas e ir dando sequencia a todo processo.
Para o calculo médio da maturação:
Número de vacas x 400mcl de MIV criotubo = 400
Numero de vacas x 180mcl de MIV para gotas de placa = 180
Numero de vacas x 60mcl de MIV para gotas de lavado = 60
Total = 640 o que?
CRIOTUBOS ML
1
3
2 a 7
5
8 a 15
10
16 a 19
13
20 a 24
15
25 a 29
20


FERTILIZAÇÃO
Fertilização in Vitro (FIV)
Dia 0
Placas:




SEMEN NORMAL = 30mcl médio FIV + azeite + 60mcl médio FIV = 90mcl
SEMEN SEXADO = 10mcl médio FIV + óleo = 20mcl médio FIV = 30mcl

Maturação de 24 a 26 horas.
Se os ovcitos ao chegar da aspiração se encontram em uma temperatura abaixo de 25 graus, se colocam até 3 horas a mais na incubadora para a maturação.
Depois de maturados lavar os ovócitos:
- Remover sujidades
- Limpar um pouco, retirando toadas as células de acumulo que se expandiram durante a maturação
- Passar uma gota de TC? SEMEN (os ovócitos de cada vaca em uma gota)
- Passar uma gota de TC SEMEN + FIV
- Passar a gota de FIV
- Passar a gota da placa de FIV.
Cálculo médio FIV:
Numero de gotas por vaca x 90mcl de gota de placa
Numero de gotas por vaca x 100mcl de gotas do lavado
1ml por touro para lavado de Percoll
1ml para agregação a diluição do sêmen
140mcl para eppendorfs de motilidade e concentração espermática.
Cálculo médio de TL:
Numero de gotas por vaca x 80mcl de gotas de lavado
50mcl a mais para que sobre um pouco para o desperdício da pipeta.

PREPARAÇÃO DO SEMEN
O sêmen já é capacitado pelo método de Percoll ou por lavado. O método a ser utilizdo depende do sêmen a se usar. A técnica de Percoll recupera mais e melhor o sêmen, por tanto se usa o sêmen que é muito viscoso, leitoso e sujo. Assim o Percoll sempre vai ser usado em sêmen congelado em campo pela sua possibilidade de estar contaminado para ter uma maior índice de pureza, em toros Brahman, Guzera e no sêmen sexado que contem uma quantidade menor de espermatozoides. Quando não se sabe qual método utilizar, recorrer aos recordes anteriores desse touro e ver como é feito o processo desse sêmen, se ainda tiver duvidas escolher sempre o método de lavado.

Percoll
Se prepara em um tubo eppendorf de 1 a 2ml:
- Colocar 125mcl de TL? Sêmen ao fundo
- Colocar 125mcl de percoll (com outra ponta da pipeta e misturar)
- Colocar 250mcl de percoll (com a mesma ponta, depositar os 250mcl no fundo e não misturar.)
- Tem que se enxergar a linha divisória entre o percoll de 45% de baixo com o de 90% de cima.
Percoll 45% { 125mcl TC sêmen + 125mcl de Percoll


Percoll 90% = 250mcl Percoll

500mcl Total

Uma vez preparado o percoll se coloca na incubadora e se descongela o sêmen.
- Para descongelar o sêmen se retira a paleta do tambor de Nitrogenio liquido e se passa o mais rápido possível a uma temperatura com água a 37 graus.
- Se deixa assim por 1 minuto
- Se retira e se seca a paleta
- A ponta da paleta se corta um tesoura previamente desinfectada com álcool, e aponta oposta com algodão
- Coloca-se o extremo no tubo de percoll previamente preparado sem submergi-lo, colocando somente em uma borda.
- O sêmen tem que ir resbalando lentamente pela parede do tubo eppendorf, podendo se utilizar um mandril.
- Uma vez que o sêmen se encontra no tubo, se centrifuga a 4000rpm durante 4 minutos.
- Depois da centrifugação se retira o sobrenante do tubo eppendorf, deixando somente o pellet com o sêmen no fundo.
- Se introduza 1ml do meio FIV no tubo junto com o sêmen para um segundo lavado.
- Se centrifuga a 1500rpm durante 3 mintuos.
- Se retira 30mcl do pellet que se encontra no fundo do eppendorf.


SEMEN
SEMEN




+ 1ml FIVDecantar e deixar o semenRetirar 30mcl1500 rpm x 3 min4000rpm x 4 minutos
+ 1ml FIV
Decantar e deixar o semen
Retirar 30mcl
1500 rpm x 3 min
4000rpm x 4 minutos





LAVADO
Não se fazerm gradentes de Percoll, em vez disso se colocam 2ml do meio TL sêmen, no lugar onde se vai depositar o sêmen e depois de descongelá-lo vai se centrifugar e processar igual as intruções de cima, a única diferença é que a centrifugação se fará a 700rmp por 5 minutos. Para o segundo lavado, uma vez que se haja acabado de centrifugar, também se colocará meio FIV, porem esta vez serão 2ml ao invés de um, e também se voltará a centrifugar a 700rpm por 5 minutos.
Depois se procede igualmente com o Percoll.
Depois da centrifugação preencher os três tubos de eppendorf seguir da seguinte forma:
- Eppendorf 1: Diluição de sêmen
[ Meio FIV 30mcl + 30mcl do que se retirou do tubo que contém o sêmen]

- Eppendorf 2: Motilidade
[ Meio FIV 100mcl + 5mcl do tubo numero 1]

- Eppendorf 3: Conteúdo espermático
[ Agua destilada 245mcl + 5mcl do tubo numero 1]

Depois fazer as seguintes diluições:
- Colocar o eppendor numero 1 dentro da incubadora para manter o sêmen quente e fora da luz.
- Colocar 10mcl de eppendorf 2 motilidade na camara de Neubauer em uma das extremidades (A)
- Colocar 10mcl de eppendorf 3 conteúdo espermático na camara de Neubauer no extremo oposto (B).
- Desinfetar previametne a camara de Neubauer com álcool.
Colocar a camara de Neubauer no microscópio e focar com aumento de 10 vezes até ver os quadrados mostradas na pequena camara.
- Para a motilidade (A) calcular a porcentagem de espermatozoides de 10 que movem de forma ascendente e dar uma porcentagem. O sêmen não servirá para a fertilização in vitro se sua motilidade é menor que 50% e o máximo de graduação de motilidade que se utiliza é 70%.
- Para a concentração espermática (B) focar o microscópio com a lente de 40x e contar os espermatozoides em 5 quadrados dentro da camara de Neubauer.

















































































































































































































































































































































































































- Desinfectar novamente a camara de Neubauer com álcool e secar bem.

Fazer a conta para concentração espermática final que eve ser 10 x5 milhões de espermatozoides:
- Para isso se necessita o volume inicial que é 50mcl, e esses 50mcl advem de: 30mcl de FIV + 30mcl de sêmen – 5mcl de mitilidade – 5mcl de contração espermática = 50mcl.
- Concentração espermática = é o resultado da conta dos 5 quadros da camara de Neubauer por exemplo 32.
- Motilidade = porcentagem de espermatozoides em movimento ascendente na camara de neubauer divido pela porcentagem exemplo 60% = 0,060
- Cálculo: VOLUME INICIAL X CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA X MOTILIDADE = 50mcl x 32 x 0,060 = 96mcl.
- Estes 96 é nosso volume final, para ajustar este volume a nosso tubo com 50mcl tem-se que sobrar: 96 – 50 = 46mcl
- Estes 46mcl é o volume do meio que se tem que agregar a nosso tubo com sêmen para leva-lo a uma concetração final de 10 x5 com um volume final de 96mcl.

FERTILIZAÇÃO
Agregar 8mcl do tubo com sêmen a cada gota de FIV.
SEMEN SEXADO
Ao fazer o ultimo lavado de sêmen depois dos gradientes de Percoll com meio FIV, não se retira 30mcl, em vez disso se conta para quantas gotas o sêmen sexado vai ser utilizado. Uma paleta de sêmen sexado não deve se usar mais que 6 gotas.
Ao se retirar o pellet a quantidade de gotas multiplicadas por 10mcl.
Exemplo:
Gotas a fertilizar com essa paleta = 5
5 x 10mcl = 50mcl
E se adicionarmos 5mcl para assegurar o alcance ao sêmen devido ao desperdício na pipeta.
Ao final se somaram 10mcl de sêmen a cada gota de FIV.

SEMEN
O sêmen dos clientes se encontra localizado nos tanques de nitrogênio. Os tanques tem etiquetas indicativas A-B-C e cada letra tem duas cestas com essa etiqueta de identificação.
Cada vez que se entra um sêmen de um toro seja um novo ou um velho, tem que se fazer uma bussola de "controle e saída de sêmen", com o nome do proprietário, fazenda, caneta na qual vai se localizar, data de entrada, etc... Também cada vez que uma paleta desse touro ser usada se apontará na bussola e se guardará a paleta vazia nas bolsas dispostas para isso dentro do laboratório.
Para localizar as paletas de sêmen de um touro novo, primeiro tem-se que checar em que letra (A_B_C) tem um pouco de espaço para um recipiente mas esse será seu numero assinado que se colocará na bussuloa e se dará o numero consecutivo que segue dentro do recipiente (1,2,3,...).

CULTIVO
Cultivo In Vitro (CIV)
Dia 1
Placas: 30mcl do meio SOF? + 4ml de óleo + 70mcl do meio SOF = 100mcl.
Depois da Fertilização, aproximadamente 21 horas depois, se deve passar os embriões eleitos para o cultivo. Neste meio aonde acontecerá o desenvolvimento dos embriões já se vai haver a divisão de duas células, mórulas, até blastócitos.
Cálculo do meio SOF:
Numero de gotas por vaca x 100mcl de gota de placa
Numero de gotas por vaca x 150mcl de gotas para desagregar ovócitos
50mcl a mais para que se sobre um pouco para o desperdício da pipeta.
Antes de passar os possíveis embriões para a placa de CIV, estes devem ser lavados da seguinte maneira:
- Desagregar os ovócitos de embriões com pipeteiro, podem se postos até 200mcl, porem quando saem embriões de sêmen sexado se dvem usar os 10mcl já que sua zona pelúcida é mais frágil. Desagregar significa remover todas as células de acúmulo que rodeiam os ovócitos, estes devem ser deixados o mais limpo possível.
- Passar uma gota de SOF (os ovócitos de cada vaca em uma gota)
- Ir retirando a sujeira restante
- Passar a outra gota de SOF, duas vezes mais, para um total de 3 gotas
- Passar a gota da placa CIV.

FEEDING
Dia 3 a 5
Cada dois dias (48 horas) depois de haver passado os embriões para o cultivo, se deve fazer o feeding. O feeding consiste em retirar 50mcl da gota de cultivo e agregar 50mcl do meio SOF novo, assim se assegura que o meio não se sature com radicais livres que são produtos de oxidação e outros elementos tóxicos, ao fazer isso se melhora a qualidade do cultivo. Ainda é bom para ir observando o desenvolvimento correto dos embriões.
Calculo médio de SOF?
Numero de gotas por vaca x 50mcl de gota de placa
20mcl a mais para se sobre um pouco para o desperdício do pipetador

DESENVOLVIMENTO
Dia 4
Dois dias depois de haver passado os embriões para o cultivo, durante o primeiro Feeding, se inicia o processo de clivagem, e ocorre a primeira divisão embrionária.
Serão considerados os embriões que já estão em desenvolvimento com mais de 6 células e estão vivos. Os embriões que estão com esta condição são contados e anotados.
Todos os meios contém antibióticos (Amicacina em 75mcl/ml); sem exceção, quando ocorre uma contaminação em alguma gota ou em uma placa, no preparo do meio correspondente com penicilina + gentamicina, que são antibióticos mais potentes porém também tóxicos.

PREVISÃO
Dia 6
O dia 6 de cultivo, se faz uma previsão dos possíveis embrioens, e se conta quantos já desenvolveram a mórulas tardias e os blastócitos para ter um numero aproximado de quantos embriões se terão no dia seguinte. Se as condições são ótimas, o numero de embriões aumentará.



ENVASE – TRANSFERÊNCIA – VITRIFICAÇÃO
Dia 7
Este dia se revisão os embrioens que se desenvolveram, que evoluíram na bussola.
Se os embriões vão ser transferidos, tem-se que envasar uma hora antes de serem levados da seguinte maneira:
Separar os embriões de acordo com a sua classificação:
- mórulas
- blastocistos inicais (grau I,II ou III)
- blastocistos (grau I,II, e III)
- blastocistos expandidos
- blastócitos extruidos
Calculo médio H-SOF???????????:
Calcular 250mcl por embrião para envasar.
Etiquetar as paletas de acordo a quantos embriões conter
Cada paleta deverá ter o numero da vaca e o numero do embrião
Proteger as pontas das paletas em todo momento, evitar o contato, para isso se deve proteger com pontas de alumínio.
VACA NUMERO EMBRIÃO NUMERO PONTA DE PAPEL ALUMINIO





- Preencher duas placas de petri em meio H-SOF
- Passar a uma placa de embriões
- Preencher a paleta correspondente a esse embrião
- Subir e abaixar o meio H-SOF da paleta para deixá-la limpa de qualquer impureza, despejar esse meio.
- Preencher uns 2-3cm da paleta com meio H-SOF
- Preencher com ar, menos de 0,5cm
- preencher o embrião com 1cm de liquido aproximado
- preencher com ar menos de 0,5cm
- preencher o meio com H-SOF
- Deixar ar na ponta.
* Sempre ir emparalhando os embriões da melhor qualidade para os de pior.
AR
H-SOF
AR
EMBRIÃO
AR
H-SOF
TAMPÃO ALGODÃO

Uma vez que estes todos os embriões emparelhados, estiverem dentro da paleta inteira com papel alumínio, e a parte em que se deja as pontas das paletas colocar uma etiqueta que deve conter:
- o numero da vaca
- o sêmen usado para FIV
- fazenda
- numero de embriões por paleta
Vaca numeroTouroNumero total de embriões
Vaca numero
Touro
Numero total de embriões
Se faz uma paleta por vaca
Todas as pipetas com embriões de um mesma fazenda jaó protegidos com papela alumínio e etiquetadas, se colocam uma bolsa com papel celofane. A Bolsa com celofane se sela com o selador.





A bolsa com papel celofane se colocará uma caixa de isopor vedada junto com bolsas com água quente entre 37-38 graus uma acima e outra abaixo.
Cada vez que se mandar embriões se registrará a hora correspondente, imprimir duas cópias, uma se guarda arquivada e outra para o registro que se envia para a fazenda.

Caixa de isopor
Caixa de isopor


Bolsa contendo os embriõesBolsas seladas com água quente
Bolsa contendo os embriões
Bolsas seladas com água quente

Bolsa selada com água quente
Bolsa selada com água quente













9 - 11 diasBLASTOCISTO EM PROCESSO DE LIBERAÇÃO0 -2 diasBLASTOCISTO8 - 10 diasBLASTOCISTO EXPANDIDO7 - 8 diasBLASTOCISTO TEMPRANO5 - 7 diasMÓRULA COMPACTA7 - 9 diasUMA CÉULA5-6 diasMÓRULA4 – 5 dias16 CÉULAS3 – 5 diasOITO CÉULAS2 - 3 diasQUATRO CÉULAS1 - 3 diasDUAS CÉULAS0 -2 diasUMA CÉULADIAGRAMA DE DESENVOLVIMENTO DE OVOCITO A EMBRIÃO
9 - 11 dias
BLASTOCISTO EM PROCESSO DE LIBERAÇÃO
0 -2 dias
BLASTOCISTO
8 - 10 dias
BLASTOCISTO EXPANDIDO
7 - 8 dias
BLASTOCISTO TEMPRANO
5 - 7 dias
MÓRULA COMPACTA
7 - 9 dias
UMA CÉULA
5-6 dias
MÓRULA
4 – 5 dias
16 CÉULAS
3 – 5 dias
OITO CÉULAS
2 - 3 dias
QUATRO CÉULAS
1 - 3 dias
DUAS CÉULAS
0 -2 dias
UMA CÉULA

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