Flow Cytometry and applications. [CITOMETRIA DE FLUXO E SUAS APLICAÇÕES] Portuguese
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Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015
CITOMETRIA de FLUXO e suas APLICAÇÕES
Leandro F. Tarosso
Pesquisador Adjunto Laboratório de GenéBca Molecular e Mutagênese Depto de Ciências Biológicas, UNESP Assis-‐SP
Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015
ObjeBvos
Apresentar e construir entendimento sobre: -‐ as caracterísBcas básicas e peculiares da Citometria de Fluxo, suas vantagens e limitações -‐ como é montado um experimento de Citometria de Fluxo -‐ os princípios básicos do funcionamento de um Citômetro -‐ como é feita a análise de dados de Citometria e como "ler" e interpretar dados de Citometria -‐ exemplos de aplicações do método
Apresentar: -‐ a complexidade existente no delineamento, execução e análise dos experimentos -‐ opções de so#wares para análise -‐ organização de importantes laboratórios de Citometria de Fluxo -‐ formas de aprofundar o estudo sobre Citometria de Fluxo
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Citometria de Fluxo
Tecnologia que simultaneamente mensura e analisa múlTplas caracterísBcas Wsicas (tamanho, granularidade, fluorescências) de parXculas únicas (0.2 a 150 um; ex.: células) em suspensão fluida através de um feixe de luz (laser).
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CARACTERÍSTICAS
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CaracterísBcas
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Preparo de amostras para análise por Citometria de Fluxo
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Citômetro de fluxo
ConsTtuído de três sistemas principais: Sistema de fluídos. Transporte das par\culas suspensas, em feixe, até interceptar um laser Sistema óp4co. Lasers que iluminam as par\culas, filtros ópTcos e espelhos que direcionam a luz resultante a detectores apropriados Sistema eletrônico. Conversão dos sinais luminosos em sinais eletrônicos que podem ser processados por computador
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Três sistemas principais
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Componente: Fluido
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Componente: ÓpBca
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Componente: ÓpBca
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FILTROS ÓPTICOS
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História do desenvolvimento de fluorocromos e lasers Engineering advances: 2001 Violet laser 1983 HeNe 1974 lasers Argônio laser (488nm) 1970s Krypton lasers Arc lamps
Modificado a parTr de:
Op4cs: opTmal light collecTon and delivery to detectors; Signal processing: digital electronics;
Data analysis advances:
So#wares: rapidly processing raw data and spillover compensaTon; Tools: displaying and analyzing 20-‐ parameter data
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Luz e Fluorescência Conjugação de mAbs a fluorocromos
Espectros de fluorescências de fluorocromos
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Luz e Fluorescência
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Componente: Eletrônica
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Conversão de sinais eletrônicos para sinais digitais
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ANÁLISE
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FORWARD e SIDE SCATTERS
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FORWARD e SIDE SCATTERS
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PMTs / canais / fluorescências
anT-‐CD14 PE anT-‐CD4 FITC
células
Histograma
Dot-‐plot
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Controles de performance e análise Detectores e fluorescências
Compensação
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Qualidade da aquisição: Parâmetro 'tempo'
Qualidade da aquisição: Exclusão de 'doublets' e agregados celulares
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Compensação
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"(...) data should be collected and stored uncompensated; data for compensaBon samples should also be collected; and compensaTon should be computed and applied when the data are analyzed" "This recommendaTon, which is made in the strongest terms, goes against common pracTce. Errors introduced by compensaTng the data before collecTon are no longer tolerable in an era where fluorescence compensaBon can readily be done aser the (uncompensated) data have been collected and stored.
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FMO (‘fluorescence minus one’)
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Análise de viabilidade celular
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Display e análise
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Display logarítmico vs 'lógico' (ou bi-‐exponencial) para eventos duplo-‐negaBvos
Compensação
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Complexidade da análise mulBdimensional em células únicas
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APLICAÇÕES
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ImunofenoBpagem
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Ontogenia celular, maturação, toB-‐, pluri-‐ mulB-‐potência
These findings demonstrate that normal and CSC-‐like cells can arise de novo from more differenTated cell types and that hierarchical models of mam-‐ mary stem cell biology should encompass bidirecTonal interconver-‐ sions between stem and nonstem compartments. The observed plasTcity may allow derivaTon of paTent-‐specific adult stem cells without geneTc manipulaTon and holds important implicaTons for therapeuTc strategies to eradicate cancer.
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Ciclo celular e apoptose
Efeito anT-‐proliferaTvo e apoptóTco do ácido betulínico de sour jujube fruits sobre células de câncer de mama Apoptose marcação com PI e Annexin V
PI – FL3
Ciclo Celular marcação com Iodeto de Propídeo (PI)
Efeito anT-‐proliferaTvo / parada na fase G2/M
morte celular
apoptose tardia
viáveis
apoptose
Annexin V – FL1
Aumento dose-‐dependente de apoptose
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Análise de Proliferação celular
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Análise CinéBca de Respostas Celulares
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Análise de viabilidade de espermatozóides
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Análise de Estresse OxidaBvo (Espécies ReaBvas de Oxigênio)
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Fagocitose
SSC-A : C : : CD4
SSC-
SSC-A FSC-H SSC-A
:
150K 10
150K 150K 150K 200K
03 0 010 100K
SSC-A
100K 100K 100K 150K 100K 95.9
50K 50K 50K 100K 50K
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0
0
50K
Detecção intracelular de patógenos: definição de infecção ou supressão de infecção
98.4 6.6e-3 98.4 0 98.4 6.6e-3 98.4 0 6.6e-3 0 0050K 2 3 4 5 0 50K 100K 150K 200K 250K 2 3 4 0K 250K 0 10 10 10 0 50K 250K 2 100K 3 10 3150K 4 200K 4 5 0 50K 100K 150K 200K 250K 0 10 10 10 2 5 0 50K 100K 150K 200K 250K 250K 0 10 10 10 10 FSC-A 200K 0 50K 100K 150K 250K :10 p24 250K 0 10 10FSC-A 10 FSC-A : p24 FSC-A : p24 singlets FSC-A lymphs : p24 singlets 98.4 Ungated lymphs 6.6e-3 singlets lymphs singlets 0 HIV Infection_p24 FMO.fcs lymphs HIV Infection_p24 FMO.fcs HIV Infection_p24 FMO.fcs HIV Infection_p24 FMO.fcs HIV Infection_p24 FMO.fcs HIV Infection_p24 FMO.fcs HIV Infection_p24 FMO.fcs HIV Infection_p24 FMO.fcs Event Count: 30796 HIV Infection_p24 FMO.fcs Event Count: 30305 ef34 Event Count: 30796 032098 100K 150K 200K 250K Event Count: 00K 250K 0 102 103 104 105 Event Count: 30305 Event Count: 3079650K Event Count: 30305 Event Count: 30796 Event Count: 30305 FSC-A : p24 singlets 48h lymphs 0h 48h 0h 48h HIV Infection_p24 FMO.fcs HIV Infection_p24 FMO.fcs 0h0h HIV negative (0E:1T) Event Count: 30796 Event Count: 30305 HIV negative (0E:1T) HIV negative (0E:1T) HIV negative (0E:1T) 250K 105 105 HIV HIV negative (0E:1T) HIV negative (0E:1T) negative (0E:1T)
!"#$%&'()&*+,-#$
5
98.4 50K0
2 150K 200K 10100K 103 104 FSC-A : p24
singlets lymphs HIV Infection_p24 FMO.fcs HIV Infection_p24 FMO.fcs EventEvent Count: 3079630305 Count:
0h HIV negative (0E:1T)
: CD4
104 103
0
2
3
4
0 10 10 10 : p24 lymphs HIV Infection_0h-0,3a,1-a.fcs Event Count: 33429
HIV positive (0E:1T) 105
: CD4
104 103
0
102
103 104 105 3.98 3.98 3.98 : p24
3.98 2.41 2.41 2.41 2 2 3 3 4 4 5 5 2 3 4 5 lymphs 0 102 103 104 2 10 3 10 4 10 5 10 0 2 0 10 2 3 4 5 0 2 10 3 10 4 10 5 10 3 10 4 10 5 10 10 10 10 10 : p24 0 0 1010 10: 10 1010 HIV Infection_p24 FMO.fcs : p24 0 0 1010 10: 10 1010 p24 p24 : : p24 lymphs : p24p24 lymphs 2.41 p24 Event Count: 30305: 3.98 lymphs lymphs lymphs lymphs lymphs HIV Infection_48h-0,3a,1-a.fcs lymphs HIV Infection_0h-0,3a,1-a.fcs HIV Infection_48h-0,3a,1-a.fcs HIV Infection_0h-0,3a,1-a.fcs 2 3 4 5 5Infection_48h-0,3a,1-a.fcs HIV HIV Infection_0h-0,3a,1-a.fcs HIV Infection_48h-0,3a,1-a.fcs HIV Infection_0h-0,3a,1-a.fcs Event Count: 0 33429 10 10 10 10 Event Count: 39917 0 102 103 104 10 48h Event Count: 39917 48h Event Count: 33429 0h Event Count: 39917 Event Count: 33429 Event Count: 39917 : p24 Event Count: 33429 : p24 HIV positive (4E:1T) lymphs HIV positive (4E:1T) HIV negative (0E:1T) lymphs HIV positive (0E:1T) HIV positive (4E:1T) HIV negative (0E:1T) HIV negative (0E:1T) HIV positive (0E:1T) HIV positive (0E:1T) HIV positive (0E:1T) HIV positive (0E:1T) HIV Infection_48h-0,3a,1-a.fcs HIV Infection_0h-0,3a,1-a.fcs HIV positive (0E:1T) HIV positive (0E:1T) HIV positive (0E:1T) Event Count: 39917 Event Count: 33429 5 5 10 5 5 10 HIV positive (4E:1T) 5 10 10 10
0
!"#$%&
48h pós reinfecção : CD4
105
0
6.6e-3
250K105
104 4 4 4 10 1010 105 103 3 3 3 10 1010 104
HIV positive (0E:1T)
2.41 105
$"#$%&
!"#$%&
HIV positive (4E:1T) HIV positive (2E:1T) HIV positive (2E:1T) HIV positive (2E:1T)
HIV positive positive (1E:1T) (2E:1T) HIV HIV positive (1E:1T) HIV positive (1E:1T)
HIV positive (2E:1T)
HIV positive (1E:1T)
HIV positive (1E:1T)
'"#$%&
("#$%&
HIV positive (0E:1T)
104
103 0 0 0 0
103
0
0
3.98
1022 00 10 2 2 2
5
24.7 30.2 32.5 18.6 18.6 24.7 18.6 2.41 47.2 24.7 30.2 24.7 32.5 30.2 32.5 30.2 3 4 5 32.5 0 102 103 104 3 4 5 0 21022 0 21022 3103 4104 5105 0 102 103 104 105 2 3 4 5 2 10 3: 4 10 5 10 3103 4104 5105 : p24 0 10 0 10 10 10 10 2 3 4 5 2 3 4 5 2 3 4 5 p24 2 3 4 5 0 10 10 10 10 0 10 10 10 10 2 3 4 5 0 10 10 10 10 10 2 10 3 : 4 10 5 10 :10 p24 2 10 3 10 4 10 5 10 0 10 10 10p24 0 0 1010 1010 1010 0 10 0 10 10 10 10 10 10 lymphs 0 10 10 18.6 : p24 0 0 10 1010 10 10 : p24 lymphs :p24 p24 24.7 : : p24 : lymphs lymphs 30.2 : : p24p24p24 32.5 : : : : p24p24p24 HIV Infection_48h-4,3a,1+a.fcs : p24p24 lymphs lymphs lymphs HIV Infection_48h-2,3a,1+a.fcs lymphs lymphs 47.2 lymphs HIV Infection_48h-1,3a,1+a.fcs lymphs lymphs HIV Infection_48h-0,3a,1+a.fcs 2 3 4 5 lymphs lymphs lymphs lymphs 2 3 4 5HIV lymphs Infection_48h-4,3a,1+a.fcs 0 10 10 10 10 Event Count: 68649 HIV Infection_48h-4,3a,1+a.fcs 5 HIV HIV Infection_48h-0,3a,1-a.fcs Infection_0h-0,3a,1+b.fcs Event Count: 82641 5 Event HIV Infection_48h-4,3a,1+a.fcs Infection_48h-2,3a,1+a.fcs 0 10 10 10 10 HIV Infection_48h-2,3a,1+a.fcs Event Count: 67835 HIV Infection_48h-2,3a,1+a.fcs HIV Infection_48h-1,3a,1+a.fcs Count:078203 102 103 104 10 HIV Infection_48h-1,3a,1+a.fcs Infection_48h-0,3a,1+a.fcs 0 102 103 104 10Infection_48h-1,3a,1+a.fcs HIV Infection_48h-0,3a,1+a.fcs HIV 5HIV HIV Infection_48h-0,3a,1+a.fcs : p24 Event Count: 68649 Event Count: 68649 Event Count: 39917 62766 : p24 Event Count: 68649 10 Event Count: 82641 Event Count: 82641 : p24 Event Count: 82641 : p24 Event Count: 67835 Event Count: 67835 Event Count: 78203 Event Count: 78203 HIV positive (1E:1T) Event Count: 67835 lymphs Event Count: 78203 HIV HIVpositive positive(2E:1T) (1E:1T) lymphs HIV positive (2E:1T) HIV positive (4E:1T) lymphs lymphs HIV positive (4E:1T) HIV Infection_48h-4,3a,1+a.fcs HIV Infection_48h-2,3a,1+a.fcs HIV positive (0E:1T) HIV Infection_48h-1,3a,1+a.fcs HIV Infection_48h-0,3a,1+a.fcs Event Count: 68649 Event Count: 82641 Event Count: 67835 Event Count: 78203
3.98 2.41 47.2 47.2
47.2 1033 1044 1055 10 10 10 3 3 4 4 5 5 3 : 4p24 5 10 : 10 10 10 1010 10p24 1010
10 0 1010 0 0 10 lymphs : : p24p24 lymphs : p24 lymphs HIVInfection_48h-0,3a,1-a.fcs Infection_0h-0,3a,1-a.fcs lymphs HIV lymphs 2 3 4 Event Count:039917 33429 10 10 10 HIV Infection_0h-0,3a,1+b.fcs HIV Infection_0h-0,3a,1+b.fcs Event Count: HIV Infection_0h-0,3a,1+b.fcs : p24 Event Count: 62766 Event Count: 62766 Event Count: 62766 lymphs HIV HIV positive positive (0E:1T) (0E:1T) HIV Infection_0h-0,3a,1+b.fcs Event Count: 62766 105
,-%&'(%."/01*+
Figura 9. Ensaio de supressão viral (ESV) com linhagem de celular T CD8+ do indivíduo Vif01-0006, específica para o peptídeo 15-mero Nef34:IRYPLTFGWCFKLVP. Células T CD4+ foram isoladas de CMSP, ativadas por 48h e infectadas experimentalmente com o isolado NL43 de HIV-1 (células alvo, A). Imediatamente após a infecção, células da linhagem de linfócitos T CD8+ específicos a Nef34 (células efetoras, E) foram adicionadas em razões 1E:1A, 2E,1A e 4E:1A, ou não foram adicionadas (0E:1A). As células alvo infectadas foram detectadas por citometria de fluxo pela detecção intracelular da proteína viral p24 após 48h da infeção e início da co-cultura. As células efetoras foram capazes de eliminar as células alvo infectadas em 36%, 48% e 61%, quando adicionadas nas razões 1E:1A, 2E:1A e 4E:1A, respectivamente. 103
0
1022
1033
1044
00 10 10 10 : p24 p24 : lymphs lymphs HIV Infection_0h-0,3a,1+b.fcs Infection_48h-0,3a,1+a.fcs HIV Event Count: Count: 62766 78203 Event
105
1055
10
00
1022 10
1033 1044 10 10 : p24 p24 :
lymphs lymphs HIV Infection_48h-1,3a,1+a.fcs Infection_48h-0,3a,1+a.fcs HIV Event Count: Count: 67835 78203 Event
1055 10
22 10 00 10
33 44 10 10 10 10 :p24 p24 :
lymphs lymphs HIVInfection_48h-1,3a,1+a.fcs Infection_48h-2,3a,1+a.fcs HIV EventCount: Count:67835 82641 Event
55 10 10
18.6
18.6 24.7
24.7 30.2
32.5 30.2
32.5 47.2
47.2
0 102 103 104 : p24 lymphs HIV Infection_0h-0,3a,1+b.fcs Event Count: 62766
18.6 105
104
: CD4
0
250K250K K00K200K
103
0
6.6e-3
: CD4
50K
10
1003 0 0
!"#$%&'(%$)*+
100K
HIV negative (0E:1T)
4
: CD4
: CD4 : CD4 CD4 :: CD4 : CD4
0h pós reinfecção
0
0
10 3 4 4 1010 10 105 3 10 3 3 1010 104 0
: CD4 : CD4 : CD4 : CD4
: CD4
SSC-A
103
150K
48h
48h
105
!"#$%&
4
5
10
.&'()&*+,-#$(infecção experimental com HIV-1 NL43) HIV negative (0E:1T)
0h HIV negative (0E:1T)
10 5 5 104 1010
104
200K
6.6e-3
1022 00 10
1033 1044 10 10 :p24 p24 :
lymphs lymphs HIVInfection_48h-2,3a,1+a.fcs Infection_48h-4,3a,1+a.fcs HIV EventCount: Count:82641 68649 Event
1055 10
0
102
103 104 : p24
105
lymphs HIV Infection_48h-4,3a,1+a.fcs Event Count: 68649
Tarosso, LF. Doutorado, 2013
Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015
Análise de microorganismos Detecção e quanTficação
Diferenciação de formas / fases Resistência a radiação
SuscepTbilidade a anTbióTcos
Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015
Pesquisa e Desenvolvimento de Vacinas Tetrâmeros de MHC
Resposta imune epíteto-‐específica
Tarosso LF. Citometria de Fluxo e suas Aplicações. 2015. Palestra. Faculdade de Ciências e Letras, UNESP – campus de Assis-‐SP. 03/setembro/2015
Encurtamento telomérico
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Sor4ng
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Citometria de Massa
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Citometria de Massa
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RECURSOS
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So@wares FREE para análise
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Fornecedores e Fabricantes
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DFCI Flow Cytometry Facility
Core Facili4es
Dana Farber Cancer InsTtute, Harvard University Boston -‐ MA, EUA FlowCytometry.dfci.Harvard.edu/
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Core Facili4es
London Regional Flow Cytometry Facility Western University London -‐ Ontario, Canadá Robarts.ca/london-‐regional-‐flow-‐cytometry-‐facility
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Core Facili4es
Department of Oncology Flow Cytometry Facility
Faculty of Medicine & DenTstry, University of Alberta Alberta, Canadá Oncology.med.uALBERTA.ca/Research/MulTUserFaciliTes/FlowCytometryFacility
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Core Facili4es Carver College of Medicine
University of Iowa Iowa City – IA, EUA Healthcare.uIOWA.edu/corefaciliTes/flowcytometry/
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