LEISHMANIOSE: RESPOSTA IMUNE E MECANISMOS ANTIOXIDANTES DE ESCAPE

LEISHMANIOSE: RESPOSTA IMUNE E MECANISMOS ANTIOXIDANTES DE ESCAPE Leishmaniasis: immune response and antioxidants mechanisms of evasion Pedro Roosevelt Torres Romão, PhD; 1Renata de Oliveira Dias, graduação em Ciências Biológicas, 2Keith Karen Cruz, graduação em Ciências Biológicas, 2Fúlvia Carina de Souza Marques, graduação em Medicina & 3Marta Chagas Monteiro, PhD. 1Laboratório de Imunologia e Mutagênese, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000, Criciúma/SC. 2 Laboratório de Imunoparasitologia, Universidade do Sul de Santa Catarina, 88704-900, Tubarão/ SC. 3Universidade Estadual do Centro-Oeste, Departamento de Farmácia, Av. Simeão Camargo Varela de Sá, nº 03, 85040-060, Guarapuava/PR. 1*

*Endereço para correspondência: Laboratório de Imunologia e Mutagênese, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000, Criciúma, SC.

Resumo Diferentes espécies de parasitas pertencentes ao gênero Leishmania são importantes causas de mortalidade e morbidade em áreas tropicais e subtropicais. Dependendo da espécie do parasita e da resposta imune desenvolvida pelo hospedeiro, a infecção causa um espectro de doença que varia de lesões autocicatrizantes a infecções disseminadas e fatais. Em modelo de infecção experimental com Leishmania major, linhagens de camundongos normalmente resistentes conseguem curar a lesão espontaneamente. A resistência depende da geração de uma resposta Th1, com produção de IL-12, IFNg e TNF-a e conseqüente indução da óxido nítrico sintase tipo 2 (iNOS) em macrófagos infectados. Contrariamente, camundongos suscetíveis BALB/c desenvolvem lesões progressivas e infecção disseminada mediada pelo desenvolvimento de uma resposta Th2 com secreção de citocinas, como IL-4 e IL-10. Além do tipo de resposta Th1 ou Th2 estabelecido em reação aos antígenos de Leishmania, outros fatores, como variação genética e condição nutricional, podem influenciar a capacidade do hospedeiro em controlar a infecção. Entre os fatores de virulência intrínsecos ao parasito, está sua

capacidade de escapar ao estresse oxidativo no interior de macrófagos ativados. Em Leishmanias, ambos os sistemas antioxidantes glutationa e tripanotiona/ tripanotiona redutase estão envolvidos na proteção contra os efeitos tóxicos do óxido nítrico.

Palavras-chave: Leishmania. Leishmaniose. Parasita. Evasão. Resposta Imune. Abstract Different species of intracellular parasites belonging to genus Leishmania cause significant morbidity and mortality in tropical and subtropical areas. Depending on the species involved and on the host immune response, the infection causes a spectrum of diseases ranging from self-healing ulcers to disseminated and often fatal infection. In experimental infection with Leishmania major resistant mouse strains normally heal lesions spontaneously. This resistance depends on the generation of a Th1 response with essential production of IL-12, IFN-g and TNF-a with consequent induction of inducible nitric oxide synthase 2 (iNOS) in the infected

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macrophages. Conversely, susceptible BALB/c mice infected with L. major develop an uncontrolled lesion, followed by disseminated infection mediated by the development of a Th2 response with secretion of cytokines such IL-4 and IL-10. Besides Th1 or Th2 host’s immune response developed in response to Leishmania antigenes, others host’s factors such as genetic variations and nutritional conditions can influence the capacity of infected host to control the infection. Between the virulence factors intrinsec to parasites are their capacity to evade the oxidative stress inside macrophages. In Leishmanias, both antioxidant systems, glutathione and trypanothione/ trypanothione reductase are involved in protection of parasites against the toxic effect of nitric oxide.

Keywords: Leishmania; leishmaniasis; oxidative stress; glutathione; trypanothione.

Introdução As doenças negligenciadas, embora afetem milhares de pessoas ao redor do mundo, ainda não dispõem de tratamentos eficazes ou adequados. Em sua maioria, são doenças tropicais infecciosas que atingem principalmente pessoas pobres, a exemplo da Leishmaniose. Há um grande volume de trabalhos científicos dedicados à biologia, imunologia e genética dos parasitas causadores dessas doenças, porém não se consegue reverter todo esse conhecimento em novas ferramentas terapêuticas para as pessoas afetadas. A razão para que isso aconteça é que quem sofre de doenças negligenciadas possui baixo poder aquisitivo e não oferece um retorno lucrativo suficiente para que a indústria farmacêutica invista em pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos voltados a esse fim. Nesta revisão, os autores farão considerações a respeito da biologia dos parasitos e seus mecanismos de subversão à resposta imunológica do hospedeiro ou aos efeitos citotóxicos dos fármacos.

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Formas clínicas da doença e epidemiologia Protozoários do gênero Leishmania são responsáveis por um grupo de doenças cujos sintomas variam de lesão cutânea, em muitos casos autocicatrizantes, a infecções viscerais freqüentemente fatais se não tratadas adequadamente. As Leishmanioses são endêmicas em 88 países e a população sob risco de infecção é estimada em 350 milhões de pessoas. Segundo estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS), a prevalência mundial é de 12 milhões de pessoas infectadas, com uma incidência anual de dois milhões de novos casos (Desjeux, 1999). No Novo Mundo, a Leishmaniose pode ser dividida em dois grupos principais: Leishmaniose Visceral Americana (LVA) e Leishmaniose Cutânea Americana (LCA) (Grimaldi & Tesh, 1993). A última inclui a forma cutânea (LC), mucocutânea (LM) e cutânea difusa (LCD). A LVA é geralmente causada por Leishmania chagasi (L. chagasi), embora, ocasionalmente, a Leishmania amazonensis tenha sido isolada de pacientes com a forma visceral da doença (Barral et al., 1991). Do mesmo modo, a L. chagasi tem sido associada a manifestações cutâneas com ausência de envolvimento visceral (Oliveira Neto et al., 1986). Em contraste, a LCA é geralmente causada por espécies pertencentes aos complexos de L. braziliensis ou L. mexicana. Porém, alguns casos de LCA ocorridos no Brasil (Momen et al., 1985), Equador e Venezuela (Hashiguchi et al., 1991) têm sido associados a um parasito similar a L. major do Velho Mundo. A LC (forma ulcerativa, autocicatrizante) tem sido associada a todas as espécies dermatotrópicas do Novo Mundo. Em contraste, a LCD (forma não ulcerativa, progressiva, anérgica) tem sido observada somente com espécies do complexo de L. mexicana. A forma LM (ulcerativa invasiva hiperérgica) é mais freqüentemente associada a L. braziliensis (Grimaldi et al., 1989), mas L. panamensis (Saravia et al., 1985), L. guyanensis (Santrich et al., 1990), e membros de L. mexicana (Barral et al., 1991) podem causar formas mutilantes da doença. A LVA é mundialmente uma das doenças emergentes de maior relevância, causando até 98% de mortalidade em pacientes não tratados (Tesh, 1995). Nos últimos 19 anos, 48.455 casos de leishmaniose visceral foram notificados no Brasil

(Brasil, 2003). Estima-se que, em todo o mundo, ocorram dois milhões de novos casos de LTA a cada ano e que 10% da população mundial estejam sob risco de infecção (Roberts et al., 2000).

Transmissão e ciclo de vida da Leishmania O gênero Leishmania possui um ciclo de vida do tipo heteroxênico, vivendo alternadamente em hospedeiros vertebrados, e insetos vetores. No tubo digestivo de vetores invertebrados, são encontradas as formas promastigotas infectantes (formas alongadas e com flagelos), enquanto em hospedeiros vertebrados (mamíferos) são encontradas as formas amastigotas (arredondadas e sem flagelo aparente), no interior de células como macrófagos (Muller & Baker, 1990; Titus et al., 1994), células de Langerhans (Blank et al., 1993), neutrófilos e eosinófilos (Grimaldi et al., 1984; Beil et al., 1992). No Novo Mundo (Américas), as Leishmanias são transmitidas ao homem geralmente por fêmeas do gênero Lutzomyia. No Velho Mundo (Europa, África e Ásia), tais vetores pertencem ao gênero Phlebotomus (Killick-Kedrick, 1990). Ao picar um hospedeiro vertebrado infectado, no momento do repasto sangüíneo, a fêmea do vetor ingere células parasitadas com for mas amastigotas contidas no tecido do hospedeiro vertebrado. No intestino do vetor, as células se rompem e as formas amastigotas liberadas se diferenciam em formas promastigotas, as quais serão transmitidas para um hospedeiro mamífero não infectado. Durante um novo repasto sangüíneo, a fêmea infectada irá regurgitar as formas promastigotas, juntamente com a sua saliva, dentro da pele do hospedeiro vertebrado (Schlein et al., 1992). No hospedeiro vertebrado, essas formas infectarão rapidamente células do sistema fagocítico, diferenciando-se em formas desprovidas de flagelo a chamadas de amastigotas (Chang et al., 1990). Essas formas amastigotas sobrevivem e se replicam por divisão binária no ambiente ácido do fagolisossomo. À medida que as formas amastigotas vão se multiplicando, as células infectadas são lisadas e as formas amastigotas são

liberadas a fim de parasitar novas células (Mosser & Brittingham, 1997). Embora a infecção inicial possa não resultar em sintomas clínicos, o parasitismo intracelular da Leishmania no organismo pode persistir num curso crônico localizado ou difundido para tecidos mucocutâneos ou órgãos viscerais, resultando na doença propriamente dita (WHO, 1990). Em termos imunológicos, a doença crônica pode estar associada à exacerbação ou à completa anergia da resposta imune do hospedeiro, resultando, assim, na incapacidade do hospedeiro em controlar a infecção (Foli et al., 1995).

A importância da saliva do vetor no processo inflamatório e a modulação da resposta imune De maneira geral, a saliva do inseto vetor é muito importante no processo inflamatório, visto que a mesma apresenta componentes associados à vasodilatação, inibição da agregação plaquetária e coagulação sangüínea, o que aumenta o fluxo sangüíneo e possibilita a alimentação do inseto (Ribeiro, 1987). Várias investigações já demonstraram que o lisado da glândula salivar dos vetores do gênero Lutzomyia e Phlebotomus acentuam a infecção com Leishmania major, L. mexicana, L. braziliensis e L. donovani em modelos animais (Samuelson et al., 1991; Theodos et al., 1991). Além disso, foi demonstrado que componentes imunossupressores presentes na saliva inibem o desenvolvimento da resposta imune contra o parasita, facilitando o estabelecimento da infecção (Ribeiro et al., 1989). Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a ação imunossupressora da saliva: 1) redução da capacidade de produção de óxido nítrico, peróxido de Hidrogênio (H2O2) e apresentação de antígeno por macrófagos infectados (Hall & Titus, 1995; Titus & Ribeiro, 1990; Theodos & Titus, 1993); 2) indução da produção de IL-4 por linfócitos em animais infectados (Lima & Titus, 1996); 3) inibição do desenvolvimento da resposta Th1 (Mbow et al., 1998) e 4) redução da expressão de moléculas coestimulatórias, como B7-1/B7-2 ou CD40, nas células apresentadoras de antígenos (APCs) (Theodos & Titus, 1993).

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Papel de citocinas e óxido nítrico na Leishmaniose Para um melhor entendimento de infecções humanas e mecanismos imunológicos e/ou genéticos de resistência frente a parasitas intracelulares como Leishmania, têm sido utilizados modelos de infecções experimentais com diferentes linhagens de camundongos. As diferentes linhagens utilizadas são capazes de mimetizar a infecção humana. Quando camundongos suscetíveis da linhagem BALB/c são infectados com L. major, eles apresentam doença progressiva e visceralizante (Scott & Scharton, 1994; Fonseca et al., 2003). Entretanto, camundongos das linhagens C57BL/6, C3H/HeJ e CBA são capazes de controlar a infecção por L. major (Fonseca et al., 2003). O perfil de resistência à infecção por L. major está associado ao desenvolvimento de uma resposta tipo Th1 (linfócito T helper tipo I), enquanto o padrão de susceptibilidade é decorrente de uma resposta Th2. A entrada do protozoário na pele do hospedeiro vertebrado através da picada do vetor infectado provoca uma reação inflamatória local na tentativa de estabelecer a homeostasia. A importância dessa resposta inflamatória, que se desenvolve logo após a infecção por Leishmania spp., durante o processo de evolução da doença, não está esclarecida. Lima e colaboradores (1997) demonstraram que, na fase inicial da infecção por L. major, os neutrófilos são importantes para controlar a disseminação do parasito. Nesse sentido, demonstrou-se que os eosinófilos ativados são capazes de produzir NO e matar formas amastigotas de L. major (Oliveira et al., 1998). Atualmente, nosso grupo está investigando o efeito imunomodulatório dos mastócitos em modelo animal de Leishmaniose cutânea. A incapacidade dos camundongos BALB/c em controlar a infecção está relacionada com a produção de interleucina-4 (IL-4) (Heinzel et al., 1993; Sypek et al., 1991; Launois et al., 1995; Mattner et al., 1996; Kopf et al., 1996; Himmelrich et al., 2000) e IL-13 (Matthews et al., 2000). Contrariamente, a capacidade de resolver a infecção (camundongos C57BL/6) parece ser dependente de IL-12, IL-18 e interferon-g (IFN-g). Nesse sentido, foi demonstrado que a IL-18 e a IL-12 atuam sinergicamente, influenciando o desenvolvimento de células Th1 por meio da regulação positiva sobre os

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receptores para IL-12 e IL-18, respectivamente (Xu et al., 1998; Wei et al., 1999). No entanto, a IL-18 parece não ser fundamental para o desenvolvimento da resposta tipo Th1. Em tal contexto, verificou-se que o tratamento de camundongos BALB/c infectados com L. major com IL-18 recombinante não modificou o fenótipo de doença típico dos animais. Além disso, na presença de IL-4, a IL-18 induz a produção de citocinas do padrão Th2 (Xu et al., 2000). Apesar do modelo de resistência e susceptibilidade à infecção por L. major parecer muito simples inicialmente, a produção de IL-12 ou IL-4 não implica resistência ou susceptibilidade. Na verdade, camundongos BALB/c são capazes de produzir IL-12 no primeiro dia após a infecção por L. major. Essa produção, inesperadamente, foi igual ou até maior que aquela gerada por camundongos resistentes (Scharton-Kersten et al., 1995). A expressão diferencial do receptor para IL-12 é importante para a manutenção e o desenvolvimento da resposta Th1 protetora (Hondowicz et al., 2000). Nesse sentido, IL-4 modula negativamente a expressão desse receptor em células de linfonodo de camundongos BALB/c (Jones et al., 1998; Himmelrich et al., 2000). Atualmente, sabe-se que o Óxido Nítrico (NO) é efetivo contra vários patógenos, incluindo T. cruzi (Gazzinelli et al., 1992), T. musculis (Vincendeau & Dalaude, 1991), M. avium (Denis, 1991), M. leprae (Adams et al., 1991), Toxoplasma gondii (Adams et al., 1990), Candida albicans (Cenci et al., 1993) e L. major (Green et al., 1990; Liew et al., 1990). O NO é sintetizado a partir da oxidação do átomo de nitrogênio guanidínico terminal da L-arginina (Palmer et al., 1988; Sakuma et al., 1988) por ação da enzima óxido-nítrico-sintase induzida (iNOS). As citocinas são importantes moduladoras da expressão da iNOS. De uma maneira geral, citocinas do perfil Th1 induzem a iNOS (Drapier et al.,1988), enquanto as do padrão Th2 inibem a sua indução (Nelson et al., 1991; Cunha et al., 1992; Gazzinelli et al., 1992). Especificamente em relação à Leishmaniose, macrófagos peritoneais de camundongos estimulados in vitro com IFN-g, em presença de lipopolissacarídio (LPS), liberam grandes quantidades de NO e destroem o parasito eficientemente. Além disso, formas promastigotas de L. major são destruídas quando incubadas na presença de doador de NO, S-Nitroso-N-Acetil-D, L-penicilamina SNAP. Essa atividade leishmanicida é inibida de

maneira dose-dependente pelo tratamento com LNMMA (análogo da L-arginina) (Liew et al., 1990). In vivo, várias evidências correlacionam a produção de NO com o controle da infecção (Wei et al., 1995; Stenger et al., 1996).

Evasão do parasita ao sistema imune por mecanismos dependentes de glutationa e tripanotiona/tripanotiona redutase As manifestações clínicas da Leishmaniose e sua severidade, que variam de lesões localizadas autocicatrizantes a infecções viscerais potencialmente fatais, dependem da espécie e dos fatores intrínsecos ao parasito infectante, como, por exemplo, o desenvolvimento de resistência a antimoniais (Mukhopadhyay et al., 1996; Hadighi et al., 2006; Rojas et al., 2006) e do perfil de resposta imune induzido no hospedeiro infectado (Malla & Mahajan, 2006). Atualmente, não existe vacina protetora adequada contra infecções por tripanossomatídeos. Embora os antimoniais pentavalentes, como o estibogluconato de sódio e o antimoniato de meglumina, continuem sendo as principais drogas utilizadas no tratamento das Leishmanioses, têm sido descritas cepas de Leishmania resistentes ao tratamento antimonial e casos de pacientes refratários ao tratamento (Mukhopadhyay et al., 1996; Molyneux, 1997; Rodrigues et al., 2006; Rojas et al., 2006; Singh, 2006). Com relação ao mecanismo de ação, foi proposto que esses quimioterápicos atuam no parasito pela indução do efluxo de glutationa (GSH) e tripanotiona (T[SH]2) e a inibição da atividade da enzima tripanotiona redutase (TryR) (Wyllie et al., 2004). Desse modo, uma das prioridades na área de pesquisa em doenças tropicais tem sido a identificação e caracterização de biomoléculas parasito-específicas que possam ser exploradas como alvo molecular ou quimioterápico de ataque seletivo (Dumas et al., 1997; Tovar et al., 1998; Castro-Pinto et al., 2004). A glutationa (GSH) é um abundante antioxidante que tem sido relacionado com a proteção celular. Os tripanossomatídeos como a Leishmania mantêm o balanço de óxido-redução (redox) por um mecanismo singular, pois são desprovidos de

glutationa redutase que, na maioria dos outros organismos, é responsável pela manutenção de um ambiente intracelular redutor/protetor dependente de GSH. Em substituição, eles possuem um sistema antioxidante baseado em tripanotiona (T[SH]2; duas moléculas de GSH ligadas por uma unidade de espermidina) como principal tiól reduzido (Fairlamb et al., 1985; Fairlamb & Cerami, 1992). Juntamente com três outras óxido-redutases, tripanotiona redutase (TryR), tryparedoxin (TryX) e triparedoxin peroxidase (TryP) (Nogoceke et al., 1997; Ariyanayagam & Fairlamb, 2001), a T[SH]2 é responsável pela defesa contra oxidantes, metais pesados (Mukhopadhyay et al., 1996) e xenobióticos (Fairlamb & Cerami, 1992). A tripanotiona é mantida em sua forma reduzida pela enzima tripanotiona redutase (TryR), de modo que a TryR exerce um papel central na proteção de Leishmania spp. contra espécies reativas derivadas do oxigênio e nitrogênio (produzidos pelo hospedeiro) por meio da reciclagem de tripanotiona oxidada (Dumas et al., 1997; Tovar et al., 1998; Romão et al., 2006). Desse modo, uma função fisiológica vital tem sido descrita para a TryR na manutenção dos níveis de T[SH]2, particularmente no interior de células do hospedeiro, sob condições altamente oxidantes geradas durante a resposta de defesa. Estudos realizados em nosso laboratório demonstram que a GSH protege L. major da morte mediada pelo NO (Romão et al., 1999). Comparando os níveis do antioxidante GSH de diferentes espécies de Leishmania (L. amazonensis, L. braziliensis, L. donovani e L. major) com a sensibilidade dos parasitos ao NO, nós verificamos que o grau de resistência das diferentes espécies de Leishmania ao NO correlacionou-se inversamente com os níveis de GSH, mas não com o nível de tiól total (Romão et al., 2006). Quando investigamos a função da TryR na proteção contra o NO, usando mutantes de L. donovani para o gene da trypanotiona redutase (tryR), verificou-se que em comparação aos parasitos “wildtype”, o clone expressando apenas uma cópia do alelo tryR foi significantemente mais sensível aos efeitos citotóxicos do NO (Romão et al., 2006).

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Conclusões O controle da infecção causada por Leishmania depende não só do tipo de resposta imune desenvolvida no hospedeiro infectado, mas também de fatores que são determinantes para a virulência dos parasitos, como sua capacidade de seqüestrar e neutralizar intermediários reativos derivados do oxigênio e nitrogênio e ainda a aquisição de resistência a antimônios pentavalentes. O estudo detalhado desses sistemas antioxidantes e, talvez, a inibição específica dessas vias de proteção podem propiciar o desenvolvimento de novos fármacos ou vacinas que poderão auxiliar no futuro controle dessa infecção.

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