Marcha Fitoquímica Preliminar de la Especie Colium Maculatum L. (Cicuta)

MARCHA FITOQUÍMICA PRELIMINAR DE LA ESPECIE CONIUM MACULATUM L. (CICUTA)
*Chiappe, Andrea; Castañeda, Brian; Díaz, Jonnathan; Rodríguez, Diego & Romero, Juan Manuel Corporación Tecnológica de Bogotá Carrera 21 No. 53 D – 35, Bogotá Colombia Tecnología en Regencia de Farmacia *Docente asesora en la investigación
Resumen
Esta investigación se divide en tres partes principales, las cuales son esenciales en el proceso de una marcha fitoquimica preliminar convencional: Extracción, identificación y separación cromatografica de los metabolitos secundarios. En la primera parte (extracción de metabolitos) se hizo el correspondiente secado y macerado de las partes aéreas de las planta (hojas y flores), por otro lado con el material seco se extrajeron el aceite esencial por el método de arrastre por vapor y el extracto etanólico con el método Soxhlet. El aceite esencial no se obtuvo. En la segunda parte se efectuó la identificación de metabolitos secundarios por medio de pruebas específicas para cada grupo dependiendo de sus características químicas y estructurales. La preparación de las muestras se hizo con una disolución de la goma en etanol y éter de petróleo. A cada muestra se le agrego un reactivo que determinaba la presencia de un tipo de metabolito en particular. Se encontró la presencia de alcaloides en las raíces, hojas, semillas y frutos; presencia de Flavonoides en la corteza y Cumarinas en los frutos, presencia de Carotenoides en las flores, presencia de compuestos parecidos a los cardiotónicos (tremetona) en las hojas y presencia de esteroides (estigmasterol y β-citosterol) en las hojas. Por último, se probaron varias mezclas de solventes (polares y apolares), a diferentes proporciones para determinar cuál de ellos corría mejor con una muestra del extracto etánolico de la especie vegetal "Conium Maculatum L." en cromatografía en capa fina (TLC). Se determinó que el mejor solvente fue la mezcla entre Acetato de Isopropilo y cloroformo (1:1).
Palabras claves: marcha fitoquimica, metabolitos secundarios, muestra vegetal, cromatografía en capa fina, cicuta, quimiotaxonomía y partes aéreas.
Abstract
This research is divided into three main parts, which are essential in the process of a conventional preliminary phytochemical up : Extraction, chromatographic separation and identification of secondary metabolites . In the first part (extraction of metabolites) and the corresponding macerated dried aerial parts of the plant (leaves and flowers) , on the other hand with the dry material was the essential oil is extracted by steam drive method and ethanol extract with Soxhlet method. The essential oil was not obtained . Identification of secondary metabolites was carried out by specific tests for each group depending on their chemical and structural features in the second half. The sample preparation was done with a solution of gum in ethanol and petroleum ether. To each sample was added a reagent which determined the presence of a particular type of metabolite . The presence of alkaloids in the roots , leaves, seeds and fruits was found ; Flavonoids present in the cortex and the fruits Coumarins , carotenoids present in the flowers , presence of cardiac -like compounds ( tremetona ) on the leaves and the presence of steroids (stigmasterol and β - citosterol ) in the leaves. Finally , various mixtures of solvents ( polar and nonpolar ) at different ratios to determine which one best running with a sample of the ethanol extract of the plant species " Conium maculatum L. " on thin layer chromatography (TLC ) were tested . It was determined that the best solvent was the mixture of isopropyl acetate and chloroform (1:1).
Keywords: phytochemical up, secondary metabolites, plant displays, thin layer chromatography, hemlock, chemotaxonomy and aerial parts.

Introducción
La especie Conium Maculatum, se encuentra en extensas regiones de Europa, América, y norte de África; se encuentra comúnmente en zonas de un ambiente húmedo, la planta apetece de los suelos muy ricos en nitrógeno, por lo cual se puede encontrar en zonas tales como alrededores de establos, caminos transitados por el ganado y el hombre. Es una hierba perenne glabra.





Reino
Plantae
Subreino
Trachebionta
División
Magnoliophyta
Clase
Magnoliopsida
Subclase
Rosidae
Orden
Apiales
Familia
Apiaceae
Subfamilia
Apioideae
Género
Conium
Especie
Conium Maculatum L.


Tabla No. 1 Taxonomía de la especie Conium Maculatum L.
Las características morfológicas son: un tallo hueco, en donde se observan pequeñas manchas esparcidas a lo largo del tallo, de color popular, con hojas de forma triangular de tamaño pequeño, verde-negro, son blandas, divididas en gajos elípticos, puntiagudos y dentados de hasta 5 cm de largo y 4 cm de ancho. La altura de la planta puede abarcar entre 1,20 hasta 2,00 metro de alto. Tiene flores blancas pequeñas de forma ovoide, que se organizan en forma de sombrilla. (San Andrés, M.I et al, 2000).


Figura 1. Conium Maculatum L. Fuente: Vetter (2005)
Las características fitoquimica de la planta son que esta constituida por alcaloides de piperidina: coniina (2-propilpiperidina), N-metil-coniina (1-metil-2-propilpiperidina), conhidrine 2 - (1-hidroxipropil) - piperidina, pseudoconhidrine (5-hidroxipropil) - piperidina (éstos están saturados piperidina alcaloides) y C-coniceine (2n-propil-piperidina-1D), uno parcialmente insaturado (ver. Fig. 2). Conhydrinone y N-metil-pseudoconhydrine. (Corsi et al, 1991) De igual manera presenta la presencia de Flavonoides y Cumarinas en la corteza y el tallo; esteroides en las hojas (estigmasterol y β-citosterol) (Fig. 3). (Radulovic, 2011) También se reporta la presencia de un compuesto llamado Tremetona (Fig. 4) (Garland, 1996).

La marcha fitoquimica preliminar se apoya en un tratamiento general de extracción y sucesivas separaciones mediante solventes de diferentes polaridades con el fin de agrupar en fracciones los metabolitos estructuralmente semejantes y poder caracterizarlos por su comportamiento químico frente a ciertas reacciones químicas estandarizadas.

Las reacciones químicas estandarizadas consisten en cambios químicos en algún grupo funcional de la estructura del metabolito, y desde luego, la formación de otro compuesto químico que al generar cambio en la naturaleza y distribución de los enlaces, produce una manifestación sensible como cambio o perdida de color, o provoca la precipitación del nuevo compuesto o el desprendimiento de gas (Rodríguez, 1997).



Figura 2. Alcaloides presentes en la especie Conium Maculatum L. Fuente: Vetter (2005)

Los alcaloides presentes en la planta presentan características toxicológicas, demuestran ser altamente tóxica para muchas especies de animales, incluido el ser humano, en donde se puede anotar que los síntomas observados cuando es consumida las planta, de forma natural son: Convulsiones, disfagia, disnea, dilatación pupilar, y muerte por parálisis respiratoria, y en recientes investigaciones se ha encontrado que algunos de los alcaloides presentes en la planta, tiene efectos teratogénicos en los tejidos de la piel (Larsson, 2004).



Figura 3. Estructura general de los esteroides presentes en la especie Conium Maculatum L. (A. Estigmasterol y B. β-sitosterol) Fuente: Radulovic et al (2011).

Figura 4. Estructura general de la Tremetona.
Materiales y métodos

Material vegetal

Se obtuvieron varias muestras vegetales de las partes aéreas (flores y hojas) de la especie Conium Maculatum L. en una zona cerca a Chiquinquirá, Boyacá. Estas se envolvieron en papel periódico y se dejaron a la exposición del sol por dos semanas en donde se torno completamente seca.

Obtención de aceite esencial

Las muestras vegetales secas se pusieron en un balón de dos bocas de 100 mL, se utilizo la técnica de arrastre por vapor, se uso agua para la producción de vapor, se recogió el aceite obtenido en un enlermeyer de 100 mL.

Obtención de extractos etanólicos.

Previamente se macero una muestra vegetal seca con etanol al 78% por 24 horas. Por otro lado, en el laboratorio se cogió la muestra seca y se puso en un balón de 100 mL, se agregó Etanol absoluto, se monto el equipo Soxhlet y se calentó hasta obtener el correspondiente extracto.


Imagen No. 1 Macerado y equipo Soxhlet

Identificación de metabolitos secundarios

Se concentró la muestra hasta la obtención de una goma, esta se diluyó por un lado en etanol y por otro en éter de petróleo. Se cogió 1 mL de los extractos y se hicieron las correspondientes pruebas de identificación con los reactivos indicados para cada metabolito. (Tabla 2) Para las pruebas de alcaloides se acidificó el extracto etánolico.

Metabolito secundario
Prueba química
Reactivos
Extracto
Carotenoides
Salkoski
H2SO4 85%
Extracto etéreo
Esteroides y trterpenoides
Lieberman – Burchard
Reactivo de Lieberman- Burchard
Extracto etéreo
Taninos
Cloruro Férrico
Cloruro Férrico 1%
Extracto etánolico

Acetato de Plomo
Acetato de Plomo 10%
Extracto etánolico

Gelatina-Sal

Extracto etánolico
Flavonoides
Shinoda
HCl 10% y Mg
Extracto etánolico

Leucoantocianidas
HCl 10%
Extracto etánolico
Quinonas
Comportamiento ante acido y donador de electrones.
Zinc, HCl [ ] (NaOH 40%)
Extracto etánolico
Saponinas
Espuma
Agua
Extracto etánolico
Cardiotónicos
Antrona
Reactivo de Molish
Extracto etánolico

Molish
Reactivo de Antrona
Extracto etánolico
Sesquiterpenlactonas
Hidroxamato férrico
Solución Metalónica 2N de Clorhidrato de hidroxilamina, KOH 2N Metalónico
Extracto etánolico
Cumarinas
Hidroxamato férrico
Solución Metalonica 2N de Clorhidrato de hidroxilamina, KOH 2N Metalónico
Extracto etánolico

Erlich
Reactivo de Erlich
Extracto etanólico
Alcaloides
Valser
Reactivo de Valser
Extracto ácido

Mayer
Reactivo de Mayer
Extracto ácido

Dragendorff
Reactivo de Dragendorff
Extracto ácido

Schleiber
Reactivo de Schleiber
Extracto ácido

Wagner
Reactivo de Wagner
Extracto ácido
Tabla 2. Reactivos y tipo de extracto utilizado en las pruebas cualitativas de identificación.


Separación en Cromatografía en capa fina (TLC)

Se prepararon 2 mL de tres mezclas de diferentes solventes: éter de petróleo:etanol (7:3); Cloroformo:acetato de Isopropilo (1:1) y tolueno:etanol (3:7). Se saturó la cámara (vaso de precipitados) por 20 minutos y se dejó correr la fase móvil en una placa de cromatografía de Alúmina. Se agregó Vainillina a cada una de las tres placas (Figura 13) y se calentaron en una plancha de calentamiento hasta su correspondiente revelado.

Resultados y discusión

Obtención del aceite esencial

Para el método de extracción por arrastre con vapor no se obtuvieron resultados, debido a que la cantidad de aceite esencial obtenida fue nula.
La extracción del aceite esencial de una muestra vegetal de la especie Conium Maculatum L. (Cicuta) mostro un rendimiento igual a cero. Esto pudo ser debido a que la cantidad de aceite esencial depende de la cantidad de material vegetal, para nuestro caso la cantidad fue de 5 g, lo que limitaba las posibilidades de obtener un rendimiento considerable, cabe resaltar que esta es una desventaja que presenta este montaje en particular, debido a que el balón utilizado no es suficientemente grande como para almacenar una cantidad representativa de material vegetal.
Sin embargo, podemos resaltar que el arrastre con vapor de agua es útil para extraer sustancias volátiles, tales como los aceites esenciales, los cuales no son más que una mezcla compleja de hidrocarburos, terpenos, alcoholes, compuestos carbonilicos, aldehídos aromáticos y fenoles. Estos se encuentran almacenados en las glándulas, conductos, sacos o reservorios dentro del vegetal, por lo cual Olaya et al. (2003) recomienda desmenuzar bien la materia vegetal para que estos reservorios queden expuestos a la acción del vapor de agua. El vapor por presión entra en contacto con las células de las diferentes partes de la planta y las rompe liberando la esencia y atrapándola en las gotas del vapor que luego se condensará. Frente a esto podemos concluir que nuestra trituración del material vegetal no fue la adecuada, por lo cual estos reservorios antes mencionados no tuvieron una exposición considerable ante el vapor de agua circulante dentro del montaje.
Obtención de extracto etanólico con método Soxhlet y Maceración
Se obtuvieron 25 mL de extracto etanólico a partir de 10 g de muestra vegetal seca. Esta fue dejada 15 días en periódico con exposición continua al sol para eliminar la humedad y luego fue puesta en un recipiente de vidrio con etOH al 78% de pureza por dos días más.
La cantidad de extracto obtenido a través del método Soxhlet fue de 50 mL. En el procedimiento que tardo aproximadamente una hora se produjeron cinco sifones, los cuales son detallados en la tabla 1.
Número del sifón
Tiempo (min)
1
17
2
20
3
3
4
3
5
4
Tabla 3. Duración de tiempo entre sifones.
Este procedimiento consiste en la extracción de metabolitos presentes en las plantas. Las muestras vegetales se colocan en la camisa de nuestro montaje, donde al hacer ebullir el disolvente, en este caso etanol, pasa a la parte superior o refrigerante, donde se condensa y cae gota a gota sobre el cartucho. Continuando así hasta que se genera el sifón o volumen máximo que pueda almacenar el brazo de sifón donde todo el etanol que se encontraba con la mezcla de las sustancias absorbidas cae al balón a través de un orificio que tiene el brazo con la extracción ya hecha.
Los resultados detallados en la Tabla 3 demuestran que se obtuvieron un gran número de sifones a la hora de hacer este procedimiento y podríamos asumir que se obtuvo un buen rendimiento de extracto etanólico sin necesitar mayor cantidad de solvente, siendo de esta manera un método económico. Además, siendo una extracción de tipo exhaustiva (Skoog 2001), esta puede destilar, condensar y volver a pasar a través de la fase acuosa de forma automática y continua, generando así, un proceso que equivale a varios centenares de extracciones con un equipo que prácticamente no requiere atención y con un tiempo de duración de menos de una hora. Todo el proceso permite una mayor solvatación de los metabolitos. Esta técnica tiene el inconveniente de que puede causar daño a los compuestos termolábiles, debido a que se debe calentar constantemente el extracto para llegar al punto de ebullición del solvente usado (Satyajit et al).

Según Skoog (2001) es importante determinar que las sustancias iónicas y los compuestos orgánicos polares están en mayor proporción en la fase acuosa y que los compuestos orgánicos apolares están en la fase orgánica. Por lo cual en esta técnica no se extraen compuestos apolares tales como terpenos y en general aceites esenciales, debido en parte a la naturaleza polar del solvente y a que cuando se usan solventes apolares estos se pegan a las paredes del montaje (Valcárcel 1988).

Aunque al principio fue más lenta la generación de los sifones, por la espera de que el etanol llegara a su punto de ebullición, esta se volvió más constante a medida que pasaba el tiempo. El intervalo de tiempo del primer sifón fue de 17 minutos, el del segundo de 20 minutos, el tercero y cuarto de 3 minutos y el quinto de 4 minutos. Esta secuencia nos da a entender que el procedimiento avanza a intervalos grandes al momento de iniciar y que luego estos van siendo más cercanos, siendo a su vez más contantes las descargas del sifón, hecho que es normal entre 5 y 20 minutos (Núñez 2008). El aumento de número de sifones y reducción del tiempo de contacto entre el material y el solvente conlleva a que pueda haber una disminución de los metabolitos presentes en cada descarga. Por lo cual no hay seguridad de que por el número de sifones obtenidos se hayan extraído en su totalidad los metabolitos de la planta.

Identificación de Metabolitos secundarios

Metabolito secundario
Prueba
Resultado
Observaciones
Carotenoides
Salkoski
+
Formación de coloración azul en la interfase
Taninos
Cloruro férrico
-
No hubo reacción

Acetato de plomo
-
No hubo reacción

Gelatina – sal
-
No hubo reacción
Flavonoides
Shinoda
-
Coloración amarilla. No hubo reacción.

Leucoantiocianidinas
-
Coloración amarilla. No hubo reacción
Quinonas
(Comportamiento ante acido y donador de electrones)
HCl [ ]
-
No hubo reacción. Precipitación del Zn

NaOH 40%
+
Coloración amarilla. Precipitación del Zn
Saponinas
Espuma
-
No hubo formación de espuma
Cardiotónicos
Antrona
+
Coloración azul- verdosa

Molish
+
Cloración violeta
Sesquiterpenlactonas
Hidroxamato férrico
-
No hubo reacción
Cumarinas
Hidroxamato férrico
-
No hubo reacción

Erlich
-
No hubo reacción
Alcaloides
Valser
-
No hubo reacción

Mayer
-
No hubo reacción

Dragendorff
-
No hubo reacción

Schleiber
-
No hubo reacción

Wagner
-
No hubo reacción
Esteroides
Lieberman -Burchard
+
Formación inmediata de coloración verde. Después de 5 minutos se sigue la tendencia.
Tabla 4. Resultados obtenidos a partir de las pruebas de identificación de la marcha fitoquimica preliminar.
Para el análisis de taninos en la cicuta los resultados fueron negativos en las tres diferentes pruebas realizadas, según Valderrama (2002) este tipo de compuestos en la familia Apiaceae se encuentra en plantas forestales y de corteza abundante, la especie Conium Maculatum L. no posee un volumen de tallo o corteza abundante por lo que la presencia de este tipo de metabolitos queda descartada.

Prueba del cloruro férrico

Figura 5. Prueba del acetato de plomo

Figura 6. Prueba de la gelatina - sal
En la identificación de Saponinas, no se produjo ninguna espuma al agregar los reactivos correspondientes, Según Tundías (2009) las saponinas en la familia Apiaceae se encuentran solo en algunos casos, comúnmente en las especie Physospermum vercillatu, de la cicuta no hay un reporte sobre la presencia de este tipo de compuestos.
Aunque bibliográficamente no se reporta la presencia de Carotenoides en la Conium Maculatum L. podemos suponer que algunas flores fueron añadidas a nuestra muestra, y por consiguiente a nuestro extracto. Los Carotenoides son compuestos que pueden actuar como pigmentos en las flores, dándoles su color característico. Podemos inferir en la idea de que la presencia positiva de estos se debe al análisis indirecto de las flores de esta planta, las cuales tienen un color amarillo.
La presencia de quinonas en medio básico fue positiva, aunque en la literatura no se encuentra caracterizaciones que hablen sobre su contenido en este tipo de plantas o familia.

Figura 7. Comportamiento ante acido y donador de electrones
Los resultados de las pruebas para la detección de Flavonoides dieron negativo, según Larsson (2004) la familia Apiaceae presenta tejidos que son intermediarios en la biosíntesis de Flavonoides, pero estos se encuentran mayoritariamente en la corteza. No se encuentra una caracterización fiable en donde se detalle la presencia de este tipo de compuestos en la especie Conium Maculatum L.

Figura 8. Prueba de Shinoda
Los resultados para las Cumarinas fueron negativos en las diferentes pruebas. Según Larsson (2004) en la Conium Maculatum L. se ha evidenciado la presencia de furano Cumarinas lineales, pero su lugar de biosíntesis y acumulación no ha sido bien identificado. Se dice que su concentración se da primordialmente en las frutas.

Figura 9. Prueba del Hidroxamato férrico

Figura 10. Prueba de Erlich
Los resultados para los metabolitos de tipo cardiotónico fueron positivos en las dos pruebas realizadas, sin embargo, en la literatura no se reporta presencia de estos metabolitos en las hojas de la Conium Maculatum L.

Figura 11. Prueba de Molish
La identificación de esteroides fue positiva mediante la reacción de Lieberman-Burchard. El cambio a color verde fue inmediato, después de pasados 5 minutos se siguió la misma tendencia. Según Radulovic et al (2011) los esteroides predominantes que se encuentran en la especie Conium Maculatum L. son el estigmasterol (stigmasta-5,22-dien-3β-ol) y el β-sitosterol (estigmast-5-en-3β-ol). Las estructuras de estos compuestos pueden ser detallados en la Figura 3. Según Rodríguez (1999) el mecanismo de reacción para esta prueba no ha sido descubierto.

Figura 12. Reacción general para la identificación de alcaloides.
La cicuta es una planta que está compuesta mayoritariamente por alcaloides. Los resultados para este tipo de metabolito secundario fueron negativos en todas las diferentes pruebas efectuadas. Frente a esto, Farnsworth (1966) informa que si hay presencia de un compuesto alcaloide el cual no tiene el nitrógeno heterocíclico, si no que más bien es un protoalcaloide las pruebas especificas darán falsos negativos. De igual manera ocurre con los compuestos que tienen un grupo oxigeno enlazado con el nitrógeno. Al observar la figura 2, en donde se detallan los diferentes alcaloides reportados en la cicuta se puede detallar como este postulado no se cumple en nuestro caso en particular, debido a que la mayoría de estos compuestos son alcaloides verdaderos, que si pueden ser fácilmente detectados por las pruebas de reconocimiento. Para determinar las posibles causas de estos falsos negativos se tuvieron que mirar otras características y aspectos de la planta. Entre ellos, la concentración de estos alcaloides en las diferentes partes de la planta (cabe resaltar que en nuestros experimentos solo se usaron las hojas y alguna que otra flor) y la concentración de metabolitos secundarios dependiendo del tiempo vegetativo o de crecimiento de la planta.
La especie Conium Maculatum presenta la presencia del alcaloide coniina, este compuesto según Gonzales (2010) se encuentra presente en las semillas, con lo que podemos confirmar que el resultado negativo es verdadero al solo usar las hojas para el análisis. Vetter (2004) reporta que cuando se hacen las pruebas en las raíces y las puntas de los brotes de plantas jóvenes estas indican resultados positivos; en las plantas más maduras estas reacciones positivas tienden a desaparecer, como en nuestro caso. Las reacciones positivas se muestran en las frutas sólo por conductos secretores. Corsi y Biasci (1998) sugieren que la Conium Maculatum L. es similar a otros miembros de la familia Apiaceae, que tiene conductos secretores en órganos vegetativos y frutas. Las concentraciones y las proporciones relativas de los diferentes alcaloides en la Conium Maculatum L parecen depender de diferentes factores (temperatura, humedad, tiempo y la edad de los la planta) (Vetter, 2004). Las fases de floración, polinización y fertilización muestran un cambio brusco en la distribución de alcaloides. La y-coniceina es el componente alcaloide predominante durante la época de lluvias y la coniina predomina durante el período seco. El contenido de y-coniceina disminuye y el contenido de coniina aumenta notablemente durante la fase de maduración de la fruta (Fairbairn y Challen, 1959). En el caso de las hojas se dice que en las plantas jóvenes (es decir, en la fase del crecimiento activo) la y-coniceina es el componente principal alcaloide, con pequeñas cantidades de conhidrina. Vetter (2004) nos dice que la mayoría de las plantas de la familia Apiaceae producen diferentes aceites volátiles en los tejidos claramente delimitados de los frutos. Se sabe que la especie Conium Maculatum L. produce y contiene alcaloides de piperidina pero la síntesis y los sitios de acumulación aún no se han identificado de manera inequívoca. Por tanto, no se puede establecer la verdadera presencia de estos en las hojas de la planta. Cabe resaltar que se dice que estos compuestos se encuentran mayoritariamente en los aceites esenciales. López et al (1999) reporta que el contenido promedio de alcaloides en las hojas va de un 0,5% a un 1,5%. Al igual se puede resaltar malos procedimientos al efectuar las pruebas de identificación, o sobrecalentamiento del extracto, lo cual daña los metabolitos secundarios termolábiles.
Técnicas cromatograficas de separación
Solvente apolar (A)
Solvente polar (P)
Proporción (A:P)
Éter de petróleo
Etanol
7:3
Cloroformo
Acetato de Isopropilo
1:1
Tolueno
Etanol
3:7
Tabla 4. Mezcla de solventes (apolares y polares) y proporciones utilizadas en la práctica.
La selección de cloroformo (apolar/polar) y acetato de isopropilo (polar) en una proporción 1:1, como fase móvil, permitió una mejor separación de cada uno de los compuestos presentes en el extracto etanólico de la Conium Maculatum (Figura 13), hecho que al ser comparado con la fase móvil sugerida por Rodríguez (1997) es aproximado, ya que en la literatura sugiere como fase móvil cloroformo y etanol o hexanocloroformo y Dietilamina al 0.05% en una proporción 3:7 cuando la fase estacionaria es una placa de alúmina, con el objetivo de separar alcaloides que es el blanco de la investigación de la planta. Al observar las proporciones que se sugieren, la fracción polar es mayor que la apolar, siendo en este punto donde se clarifica la razón por la cual la separación no fue optima; ya que la proporción escogida en la práctica fue de 1:1.
De otro lado, Baerheim-Svendsen recomienda que para separar los alcaloides de la cicuta por cromatografía se debe emplear como solvente Cloroformo-etanol absoluto y amonio 25% (18:2:2) con platos de silica gel activa. Stahl (2007) recomienda el uso de acetona, dietil éter y amonio concentrado (50:50:3) y silica gel para la separación de los alcaloides de la cicuta y la identificación de la arecolina.
Ahora bien, la mayoría de metabolitos encontrados en la cicuta son alcaloides piperidinicos, los cuales pueden ser identificados con la mezcla de solventes descrita anteriormente. (Hui, 1997). Los alcaloides piperidinicos pueden ser resueltos en TLC de silica gel eluido con cloroformo y etanol (7:3) y visualizados con el reactivo de Dragendorff. La Gamma Coniceina (Figura 2) puede ser determinada en presencia de otras piperidinas por reacción con nitroprusiato de sodio. (Hui, 1997).
Al no ser óptimamente separados los compuestos presentes en el extracto etanólico, se creó un conflicto entre cada uno de los compuestos, puesto que están superpuestos creando impedimentos que dificultan la reacción, por lo cual al momento de ser revelados con vainillina-ácido fosfórico, revelador indicado para cetonas, no mostro la coloración que cita el autor como positiva, que es rosa, las cuales si se encuentran en los esteroides, compuestos presentes en la especie Conium Maculatum L. (estigmasterol (stigmasta-5,22-dien-3β-ol) y el β-sitosterol (estigmast-5-en-3β-ol)).
Los reveladores adecuados para la identificación de alcaloides son: Disolución de yodoplatinico en yoduro de potasio, o reactivo de Dragendorff o permanganato de potasio-bicarbonato de sodio, para tal objetivo. Por lo cual no fue posible identificar los alcaloides, metabolitos que más se encuentran en la planta.
Figura 13. Recorrido de la muestra del extracto etánolico y la tinta china en las diferentes mezclad de solventes. 1. Éter de petróleo:Etanol (7:3); 2. Cloroformo:Acetato de Isopropilo (1:1) y 3. Tolueno:Etanol (3:7).
Al observar la fase móvil utilizada (Alúmina) se puede decir que no es la adecuada para la separación de compuestos que contienen un grupo Amina (alcaloides) ya que debido a que según UAM esta es útil para la separación de compuestos apolares tales como hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas. De esta manera la literatura recomienda que para la separación de compuestos aminados se debe usar la Silice-gel como fase estacionaria ya que retiene con más fuerza sustancias más polares. Este proceso se da debido a las interacciones intermoleculares de tipo dipolo-dipolo o enlaces de hidrogeno entre el soluto y el adsorbente, de este modo a medida que corre la fase móvil va arrastrando al compuesto y este va siendo retenido por dichas interacciones con la fase estacionaria, en este caso la alúmina, cada metabolito o sustancia tiene un tiempo de retención especifico.
Cabe resaltar que nuestro extracto etanólico no estaba bien concentrado, es decir, no tenía una cantidad suficiente de metabolitos secundarios como para hacer una corrida eficaz. Esta variable pudo ser la que más infirió en los resultados poco concluyentes de la práctica. No obstante, se pudo evidenciar que si hubo una corrida en las placas, pero que estas no estaban resultas de forma tal que pudieran dar una correcta separación e identificación del compuesto en particular.
Conclusiones

Se realizó una marcha fitoquimica preliminar que comprendió tres etapas: extracción, identificación y separación cromatografía de los metabolitos secundarios de las partes aéreas de la especie Conium Maculatum L., ante esto se concluyó lo siguiente:

Se pudo determinar que el mejor método para la obtención de extracto etanólico es el método de soxhlet, ya que es una técnica exhaustiva que requiere poca cantidad de reactivo, menos tiempo para la extracción y genera un rendimiento notable.

La extracción de aceites esenciales por arrastre con vapor de agua demostró ser una técnica que se ve afectada por dos factores en general: la cantidad de muestra vegetal y la trituración de la misma.

Se determinó mediante pruebas positivas y especificas que la composición de metabolitos secundarios en las hojas de la especie Conium Maculatum L. es la siguiente: Carotenoides (en las flores), cardiotónicos, quinonas y esteroides. Aunque la literatura no justifica la presencia de estos metabolitos (excepto los esteroides).

Se determinó que la presencia de los diferentes metabolitos secundarios (en especial alcaloides) reportados por la literatura no se encuentran en su totalidad en las hojas, si no que esto depende de los sitios de biosíntesis y acumulación. Al igual también son factores importantes el clima, la temperatura, la humedad y en particular el tiempo de crecimiento. Aunque se reporta que la cicuta tiene gran cantidad de alcaloides en su composición, cabe aclarar que las reacciones positivas de identificación tienden a desaparecer al madurar la planta.

Se logró determinar a partir de las pruebas específicas de identificación y la literatura la quimiotaxonomía general de la especie Conium Maculatum L., en la que se encuentra: Presencia de alcaloides en las raíces, hojas, semillas y frutos; presencia de Flavonoides en la corteza y Cumarinas en los frutos, presencia de Carotenoides en las flores, presencia de compuestos parecidos a los cardiotónicos (tremetona) en las hojas y presencia de esteroides (estigmasterol y β-citosterol) en las hojas. Las quinonas no son justificadas debido a que no hay una fuente confiable que confirme su presencia en este tipo de plantas.

Se determinó que los compuestos que pudieron posiblemente correr sobre la fase estacionaria son el estigmasterol (stigmasta-5,22-dien-3β-ol) y el β-sitosterol (estigmast-5-en-3β-ol)), debido en parte al grupo cetona presente en su estructura, que según la literatura corre con el tipo de solventes y fase estacionaria utilizados.

Al no tener una separación adecuada de los metabolitos en la placa cromatografica no se puede establecer una identificación clara de los compuestos hallados en la cicuta.
Referencias

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