Métodos Químicos

July 18, 2017 | Autor: Alexandra Castillo | Categoria: Virology
Share Embed


Descrição do Produto

UNIVERSIDAD DE ORIENTE NÚCLEO DE SUCRE ESCUELA DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS

Profesora: Yoleida Rodríguez. Cumaná, mayo de 2015

Bachiller: Alexandra Castillo C.I.: 24130389 Sección: 04

CROMATOGRAFÍA HISTORIA: 1850 el químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas descubrió que los cationes orgánicos se separaban por migración cuando se depositaba una disolución que los contenía sobre un material poroso, como papel

En 1906 Tswett utilizó la cromatografía en columna para separar extractos vegetales coloreados.

1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo.

Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica, y obtienen el premio Nobel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elución y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nobel por sus trabajos en 1948., mientras se aplicaba esta en el campo de la bioquímica, y así Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados.

CROMATOGRAFÍA DEFINICIÓN:

En 1906 Tswett la definió: “Método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente”.

La I.U.P.A.C la define como: “Un método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve”.

ETIMOLOGÍA: Cromatografía Chroma: Color.

Escribir en colores

Graphein: escribir.

Se fundamenta en la separación la fase Método entre de separación estacionaria sólida liquida y la basado en laso diferentes fase móvil liquida con o gaseosa. velocidades que se mueven los solutos disueltos Los rectores del en fenómenos un disolvente llamado proceso eluente a de través retención de un medio y separación sonola adsorción y la estacionario fijo. absorción.

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: Pueden clasificarse atendiendo a distintos factores: estado físico de las fases móvil y estacionaria, soporte utilizado, mecanismo de la separación e incluso el tipo de soluto.

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL En este tipo de cromatografía las moléculas pueden separarse en base a las diferencias de sus tamaños si se pasan a través de una columna que contiene partículas hidratadas de geles muy especiales (Fase estacionaria).

 Dextranos con enlaces cruzados (sephadex).  Agarosa (sepharose, Bio-gel A).  Poliacrilamida (Bio-gel B). Consta de partículas pequeñas de substancias hidrofilias e insolubles, es altamente polar y se hincha considerablemente cuando se coloca en agua.

PRINCIPIO DE LA CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL 1. Las moléculas pequeñas difunden dentro del gel. 2. Las moléculas grandes son completamente excluidas. 3. Se obtiene una separación completa. Materiales:  Columna cromatográfica.  Muestra problema.  Fase móvil (Buffer).  Fase estacionaria (geles de sephadex).  Pipeta Pasteur.  Aro y ampolla de decantación.  Pie universal y agarradera.  Colectores.

TÉCNICA DE LA CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL 1. Se empaqueta el gel dentro de la columna:  Pequeña cantidad de un buffer adecuado.  Se añade lentamente la cantidad necesaria del gel previamente hidratado.  Se lava la columna y se regula la velocidad de flujo. 2. Marcar diferentes tubos en los que se recogerá la muestra eluída.

3. Elución de la columna:  Dejar que la columna gotee.  Se siembra la muestra sobre el mismo (columna).  Dejar goteando el solvente de elución.  Recoger las distintas fracciones del eluído en los tubos numerados.

CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIO IÓNICO Método que permite la separación de moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica, incluyendo aminoácidos, péptidos y proteínas. Su fundamento se basa en que las moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el ambiente iónico. La separación se realiza, en dos fases: 1. Las sustancias a separar se unen al intercambiador. 2. 2. Se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica.

RELLENOS DE INTERCAMBIADOR IÓNICO a. Relleno de partícula pelicular donde la superficie relativamente grande (de 30 a 40 µm)de una partícula esférica y no porosa, de vidrio o polimérica se recubre con una resina sintética de intercambio iónico. b. Relleno preparado recubriendo micropartículas porosas de sílice con una delgada película del intercambiador. INTERCAMBIADOR IÓNICO Matriz sólida insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos cargados. Compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos.

I. aniónicos. Grupos aminos alifáticos o aromáticos. I. catiónicos: grupo sulfónico, SO-3, carbonilo e hidroxilo fenólico.

TÉCNICA DE LA CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Materiales:  Columna cromatográfica.  Muestra problema.  Fase móvil (Buffer).  Fase estacionaria (resina).  Pipeta Pasteur.  Aro y ampolla de decantación.  Pie universal y agarradera.  Colectores.

Esta técnica está basada en 4 etapas:

1. Equilibrio Equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas. (un intercambiador catiónico sulfonado asociado a Na+). 2. Aplicación y lavado. Sembrar la muestra a la cual queremos filtrar a través de la columna y su adsorción mediante un lavado específico.

3. Elución Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídas debido a cambios en la composición del buffer.

Aumentar progresivamente la concentración de un contra ión (NaCl, KCl, entre otros). Cambio en el pH del solvente, empleándose con intercambiadores débiles.

4. Regeneración Remover las intercambiador.

partículas

que

aún

están

asociadas

al

Los iones que se adhieren a los sitios activos de la resina son de muy diferente tipo.

Tipos de regenerantes:  Cloruro de sodio (NaCl).  Cloruro de potasio (KCl).  Ácido clorhídrico (HCl).  Amoníaco (NH4OH), Carbonato de sodio (Na2CO3).  Hidróxido de sodio (NaOH), Hidróxido de potasio (KOH).

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Método de separación, donde el afinante es adsorbido de forma reversible y específica, al ligando inmovilizada en la matriz. PRINCIPIO DE LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

1. Las partículas que se retienen son aquellas que se unen específicamente a un ligando. 2. Las partículas que no se unen al ligando son eluídas a través de la columna. 3. La partículas de interés se eluye mediante el empleo de una solución.

SISTEMAS BIOLÓGICOS MÁS USADOS, EN LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD:  Enzima - Inhibidor, cofactor, virus  Anticuerpo - Antígeno, virus  Hormona - Receptor  Vitamina - Proteína transportadora  Macromoléculas que interactúan con metales - Iones metálicos

Etapas fundamentales de la cromatografía de afinidad

 Inmovilización del ligando.  Adsorción de la sustancia a purificar.  Desorción de la sustancia fijada.

TÉCNICA DE LA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD 1. Selección del ligando: Compuesto que presenta una afinidad reversible y más o menos específica.

2. Selección de la matriz:  Que sea lo más inerte posible.  Que posea una porosidad adecuada.  Estabilidad química, mecánica y biológica.  Poseer grupos químicos para la act.  Resistencia al ataque microbiano.  Facilidad de regeneración.

Capaz de formar complejos reversibles con la molécula a separar. kd = 10-4-10-8 mol/L , si esta ↑: unión L-P débil, mientras que si esta ↓: unión L-P muy fuerte. Estable.  Poseer al menos un grupo químicamente reactivo que permita su inmovilización.

3. Acoplamiento del ligando: Activación de la matriz: Consiste en el ataque químico de la superficie de los soportes. Inmovilización del ligando: Se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalentes.

4. Adsorción de la muestra: Contacto el soluto con el adsorbente para permitir que las interacciones de adsorción se lleven a cabo. 5. Lavado de la muestra: Se realiza con el buffer inicial de 4-10 veces el volumen del gel. Remoción de componentes.

6. Elución: Liberar la Proteína de de la columna. No bioespecífica: alterar las condiciones de la solución: cambios de pH, fuerza iónica o temperatura.

Bioespecífica: desplazar a la molécula del sitio activo. Esta puede ser normal o invertida.

PRECIPITACIÓN POR SALES El método del “salting out” (Precipitación por salación) es uno de los más utilizados en la purificación de proteínas. Cada Permite La sal más deshacerse proteína utilizada es precipita deeluna sulfato grande a cantidad amonio cierta de contaminantes (NH concentración y tipo dede una sal. forma económica. 4)2SO4 .

PRINCIPIO DE LA PRECIPITACIÓN POR SALES Se fundamenta en que al añadir una sal: 1. Aumenta la solubilidad de la proteína (efecto “salting-in”). 2. Disminución hasta que las proteínas precipitan (efecto “saltingout”).

TÉCNICA DE PRECIPITACIÓN POR SALES Material:  Suero de ternera (ST).  Disolución saturada de (NH4)2SO4 (100% de saturación).  Agua destilada.  Tubos de plástico de centrífuga de 12 ml con tapón.  Tubo graduado de vidrio Corex ó Álamo.  Pipetas de vidrio y propipetas de plástico.  Centrífuga de rotor basculante para tubos de 12 ml.

1. Realizar una dilución 1/5 del ST en H2O destilada. Preparar un volumen final de 6 ml. Aplicar la fórmula: Concentracióninicial x Volumeninicial = Concentraciónfinal x Volumenfinal.

(Ci x Vi = Cf x Vf.)

2. 5 ml de esta dilución se llevan hasta un 30 % de saturación con la disolución de (NH4)2SO4, saturada aplicando la siguiente fórmula: Vsal=[V (S2-S1)/1-S2]

Vsal=[V (S2-S1)/1-S2]

V= 5 ml; S1= 0; S2= 0,30. Entonces, Vsal = 2,14 ml.

Mezclar, incubar x 10min en hielo y centrifugar a 4000 r.p.m. x 10 minutos a 4ºC.

3. Sobrenadante tubo graduado, medir el volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fracción 1). Se conserva en hielo a 4°C. 4. El sobrenadante se lleva a un 40% de saturación con el (NH4)2SO4 saturado.

Mezclar, incubar x 10min en hielo y centrifugar a 4000 r.p.m. x 10 minutos a 4ºC.

5. Sobrenadante tubo graduado, medir el volumen. El precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fracción 2). Se conserva en hielo a 4°C.

6. El sobrenadante obtenido se lleva a un 60% de saturación con el (NH4)2SO4 saturado. El precipitado se disuelve en 6 ml de H2O destilada (fracción 3).

7. Con las tres fracciones obtenidas y la ST(1/5) se realizarán las siguientes diluciones (en volumen/volumen):  ST (diluido 1/5): dilución dilución 1/900.  Fracción 1 dilución 1/12 y 1/24.  Fracción 2 dilución 1/90 y 1/180.  Fracción 3 dilución 1/90 y 1/180

1/450 y dilución dilución dilución

DIÁLISIS Se usa para separar moléculas grandes e las pequeñas, y se basa en el hecho de que una membrana semipermeable permite pasar pequeñas moléculas a través de ella , pero previene el paso de las moléculas grandes.

La velocidad de diálisis depende de los siguientes factores:

La membrana Materiales: el celofán material mas común y el tubo recomendado fabricado por División Visking de unión Carbide. Preparación: hervir tubo por 30 minutos en EDTA alcalina con el fin de evitar perdida de actividad de moléculas dializadas, posteriormente se lava con agua destilada, se hace nudo en extremo, se llena con material y se ata el otro extremo.

Permeabilidad: depende del tamaño y tratamiento del tubo. Siendo la membrana permeable a compuestos cuyo peso molecular esta por debajo de 30000 cuando la diálisis se efectúa de un día para otro.

El solvente Solución acuosa: la velocidad de la diálisis es mayor en agua estilada, sin embargo es necesario utilizar soluciones acuosas de pH y fuerza iónica definidas. Solución de una macromolécula: el agua penetra el saco por osmosis, por lo tanto el tubo debe llenarse completamente con el fin de evitar la dilución excesiva del contenido.

Condiciones físicas Temperatura: entre mas alta sea la velocidad será mayor. Presión: la separación de moléculas grandes y pequeñas puede hacerse también por medio de un gradiente de presión a través de la membrana.

TÉCNICA DE LA DÍALISIS: Ejemplo del paso de moléculas a través de una membrana de diálisis: Materiales:  Tubo de celofán Visking  Cloruro de sodio (1 g/l amortiguado con fosfato de sodio 0.02 mol/l a pH 6.8)  Almidón soluble (20 g/l).  Saliva.  Solucion de yodo (5 mmol/l en yoduro de potasio 30 g/l)  Solución de Benedict

Procedimiento: Se preparan los tubos de diálisis que contengan 5 ml de solución de almidón y 4 ml de solución salina amortiguada.

Se añade 1ml de saliva a “tubo de prueba” y 1 ml de agua al “tubo control”. Se colocan los tubos en vasos de precipitados que contengan 100 ml de amortiguador y se agita mecánicamente. Se separan las porciones a intervalos de tiempo conveniente. Se detecta maltosa y almidón.

LIOFILIZACIÓN Se define como el proceso de secado al vacío de un producto que previamente ha sido congelado, de forma tal que se produzca sublimación. HISTORIA: Los incas implementaban una liofilización artesanal; en las noches frías, debido a su altura, en las montañas se presentaba una baja presión y luego mediante radiación solar se efectuara la sublimación. También los vikingos utilizaban este método pero menos efectivo aplicado a los pescados.

Los primeros estudios fueron realizados por Louis Pasteur pero no obtenían buenos resultados debido a que en esa época (siglo XIX), no se contaba con los trabajos al vacio. 1905 que Benedict y Mannyn introdujeron este proceso a la liofilización 1930 se uso industrialmente, para la Segunda Guerra Mundial en la fabricación a gran escala de plasma de sangre. Otro producto liofilizado a gran a escala fue la penicilina.

En 1935 se introdujo el término de liofilización que proviene del griego Luen (solvente) y phileo (amigo) por E. W. Flosdorf y S. Mudd En 1958 se empezó a emplear en la industria alimenticia pero debido a su costo solo se hizo en alimentos seleccionados.

PRINCIPIO DE LA LIOFILIZACIÓN Se basa en el fenómeno físico de la sublimación del agua o bien de un disolvente orgánico o de mezclas acuoso-orgánicas que estén congeladas; el disolvente congelado sublima directam ente a vapor sin pasar por el estado líquido.

Se puede describir en cuatro fases CONGELACIÓN TRATAMIENTO A VACIO

CALENTAMIENTO CONDENSACIÓN (o SUBLIMACIÓN INVERSA)

El LIOFILIZADOR: Cámara seca o cámara de liofilización: es el lugar donde se coloca la sustancia a liofilizar. Condensador con circuito de refrigeración: comunica con la cámara seca y es donde se cond ensa el vapor que se va produciendo en la sublimación. Sistema de vacío: El sistema de vacío elimina primero el aire de la cámara seca al iniciar el proceso de liofilizaci ón, y luego ayuda a la sublimación.

TÉCNICA DE LEOFILIZACIÓN

A nivel de laboratorio, para pequeñas cantidades de muestra se utiliz an viales, tubos o matraces de fondo redondo (mayor resistencia, con posibilidad de cierre dentro del liofilizador). El procedimiento para liofilizar la muestra consta de varias etapas: 1. Congelación de la muestra a bajas temperaturas: habitualmente se introduce la muestra en nitrógeno líquido (-196 °C) o en un baño de nieve carbónica y acetona (78°C) hasta que congele totalmente.

2. Secado del producto congelado por sublimación: se introduce la muestra congelada en uno de los recipientes de la cámara de sublimación y se conecta el vacío con cuidado.

3. Almacenamiento del producto: los productos liofilizados y adecuadamente cerrados se pueden guardar por largos períodos de tiempo con la retención de las propiedades físicas, químicas, biológicas de sus estados originales. Ventajas respecto a otras técnicas Se obtienen productos que se pueden volver a regenerar m uy rápidamente. La forma y características del producto final son esencialmente las originales. Es un proceso idóneo para secar sustancias termolábiles. Los constituyentes oxidables están protegidos. El contenido de humedad final es muy bajo.

Lihat lebih banyak...

Comentários

Copyright © 2017 DADOSPDF Inc.