NATURAL ANTIOXIDANTS (ENVIRONMENTAL ASPECT)

July 24, 2017 | Autor: Pavel Maslennikov | Categoria: Antioxidants, Natural antioxidants
Share Embed


Descrição do Produto

ÅÄãíàâëäàâ îÖÑÖêÄãúçõâ ìçàÇÖêëàíÖí ËÏ. àååÄçìàãÄ äÄçíÄ

É. ç. óÛÔ‡ıË̇, è. Ç. å‡ÒÎÂÌÌËÍÓ‚, ã. ç. ëÍр˚ÔÌËÍ

èêàêéÑçõÖ ÄçíàéäëàÑÄçíõ (ùäéãéÉàóÖëäàâ ÄëèÖäí)

àÁ‰‡ÚÂθÒÚ‚Ó Å‡ÎÚËÈÒÍÓ„Ó Ù‰Âр‡Î¸ÌÓ„Ó ÛÌË‚ÂрÒËÚÂÚ‡ ËÏ. àÏχÌÛË· ä‡ÌÚ‡ 2011

1

УДК 581.1 + 581.19 ББК 28.57 Ч920 Рецензенты В. К. Гинс — зав. лабораторией биохимии и биотехнологии функциональных продуктов ВНИИССОК, академик АНИРР, заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии РФ в области науки и техники, д-р биол. наук, профессор; П. В. Кононков — зав. лабораторией интродукции и семеноведения ВНИИССОК, президент АНИРР, заслуженный деятель науки РФ, лауреат Государственной премии РФ в области науки и техники, д-р сельхоз. наук, профессор

Ч920

Чупахина Г. Н., Масленников П. В., Скрыпник Л. Н. Природные антиоксиданты (экологический аспект): монография. — Калининград: Изд-во БФУ им. И. Канта, 2011. — 111 с. В монографии изложены современные представления о свободных радикалах, свободнорадикальном окислении клеточных компонентов, об антиоксидантах. Подробно рассмотрено действие экологических факторов на антиоксидантные ферменты: супероксиддисмутазу, глютатионпероксидазу, каталазу, дегидроаскорбатредуктазу, аскорбатпероксидазу и антиоксидантные пигменты — антоцианы. Предназначена для физиологов растений, биохимиков, экологов, специалистов пищевой промышленности и сельского хозяйства, аспирантов, магистрантов и студентов.

УДК 581.1 + 581.19 ББК 28.57 © Чупахина Г. Н., Масленников П. В., Скрыпник Л. Н., 2011 © БФУ им. И. Канта, 2011 2

éÉãÄÇãÖçàÖ

Введение .............................................................................. 4 Список сокращений .......................................................... 6 Глава 1. Свободные радикалы и окислительный стресс 7 Библиографический список ............................................ 14 Глава 2. Ферментативная антиоксидантная система растений .............................................................................. 16 2.1. Супероксиддисмутаза .............................................. 16 2.2. Каталаза ..................................................................... 26 2.3. Глютатионпероксидаза ............................................ 35 2.4. Ферменты аскорбат-глютатионового цикла .......... 40 2.5. Глютатионредуктаза ................................................. 48 Библиографический список ............................................ 52 Глава 3. Антоцианы — природные антиоксиданты растений .............................................................................. 60 3.1. Биосинтез антоцианов .............................................. 69 3.2. Физиологическая роль антоцианов ......................... 73 3.3. Влияние экологических факторов на образование антоцианов ................................................................ 83 Библиографический список ............................................ 102 Заключение ......................................................................... 111

3

ÇÇÖÑÖçàÖ

В современном обществе вся разумная человеческая деятельность должна быть направлена на решение глобальных проблем: сохранение, продление и улучшение качества человеческой жизни. К сожалению, цивилизация, решая их, одновременно меняет среду, сформировавшую человека, заставляя его приспосабливаться к новым условиям. Человеческий организм имеет определенный ресурс адаптационных возможностей, но он не безграничен и требует поддержки извне. Эффективность такой помощи будет тем выше, чем лучше мы будем знать влияние действующих факторов и механизмы ответных реакции организма человека. Негативная окружающая среда, вызывающая стрессы, может стимулировать накопление в организме человека свободных радикалов кислорода: супероксидного, пергидроксильного и гидроксильного. Активные формы кислорода образуются и в процессе нормального метаболизма, но в неблагоприятных условиях (загрязнение воздуха, недоброкачественная пища, облучение, тяжелые металлы, некоторые виды лекарств и т. д.) их количество значительно возрастает. Возникают патологические последствия за счет повреждения липидов, особенно липидов клеточных мембран, белков, нуклеиновых кислот, что в конечном итоге приводит к преждевременному старению и даже гибели клеток. Растения обладают достаточной устойчивостью к окислительным повреждениям, которые возникают при резком изменении физиологического состояния организма. Это обусловлено существованием в растительной клетке эффективных антиоксидантов, которые способны обеспечить защиту от кислородных радикалов. 4

ǂ‰ÂÌËÂ

Антиоксидантными свойствами обладают многие природные соединения. Часть из них — витамины, например С, Е, и предшественник витамина А — β-каротин. Кроме того, к антиоксидантам относятся глутатион, цистеин, метионин, лютеин, мелатонин, убихиноны, токоферолы, ретиноиды, флавоноиды, липоевая кислота и многие другие соединения, а также группа антиоксидантных ферментов. Антиоксиданты растений более разнообразны, чем у животных, а антиоксиданты-витамины человек получает только с пищей. Следовательно, качественная растительная пища должна содержать достаточное количество антиоксидантов, а для ее получения необходимо знать условия, способствующие их накоплению. Влияние экологических факторов на биосинтез и накопление антиоксидантов в растениях начинает привлекать внимание ученых, но пока еще не стало объектом целенаправленного изучения. В данной работе представлены результаты исследований экологии антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, глютатионпероксидазы, каталазы, дегидроаскорбатредуктазы, аскорбатпероксидазы) и представителей неферментативных антиоксидантов — антоцианов. Авторы с признательностью примут все пожелания, замечания и конструктивную критику, которые будут учтены в дальнейшей работе.

5

ëèàëéä ëéäêÄôÖçàâ

АК — аскорбиновая кислота АПО — аскорбатпероксидаза АФК — активные формы кислорода ГПО — глютатионпероксидаза БС — белый свет ВЭР — высокоэнергетическая реакция ГР — глютатионредуктаза ДАК — дегидроаскобиновая кислота ДГАР — дегидроаскорбатредуктаза ДКГК — дикетогулоновая кислота ДКС — дальний красный свет КАТ — каталаза МДА — малоновый диальдегид МДАК — монодегидроаскорбиновая кислота МДГАР — монодегидроаскорбатредуктаза НЭР — низкоэнергетическая реакция ПА — проантоцианы СОД — супероксиддисмутаза СС — синий свет ССК — светособирающий комплекс ФАЛ — фенилаланинаммиаклиаза ФХ — фитохром ФС — фотосистема ЭТЦ — электронтранспортная цепь GSH — глютатион восстановленный GS-SG — глютатион окисленный НО• — гидроксильный радикал 1 О2 — синглетный кислород О•2− — супероксидный радикал 6

ë‚Ó·Ó‰Ì˚ р‡‰Ë͇Î˚ Ë ÓÍËÒÎËÚÂθÌ˚È ÒÚрÂÒÒ

É·‚‡ 1 ëÇéÅéÑçõÖ êÄÑàäÄãõ à éäàëãàíÖãúçõâ ëíêÖëë

Первые живые организмы на нашей планете были анаэробами, так как свободный кислород в атмосфере Земли отсутствовал. Он появился позже, в результате жизнедеятельности фототрофов, что привело к первой экологической катастрофе, так как существующие формы оказались вынуждены приспосабливаться к присутствию в среде мощного окислителя — кислорода. У ныне живущих форм молекулярный кислород является конечным акцептором электронов в митохондриальной дыхательной цепи, где он восстанавливается до воды: О2 + 4 е + 4Н+ → 2Н2О. В стрессовых условиях идет неполное восстановление кислорода, что может привести к образованию активных его форм (АФК), таких как супероксид. Это реакционноспособный анион-радикал, возникающий при одноэлектронном восстановлении кислорода: О2 + е →

О •2− .

Супероксидный радикал особенно опасен для мембранных структур. Мембраны не становятся препятствием для молекулярного кислорода. Супероксидный анион, обладающий зарядом, окружен молекулами воды, поэтому он не может преодолеть гидрофобный мембранный барьер. Кроме того, супероксидный радикал имеет длительное время жизни и может стать источником других активных форм кислорода (Чиркова, 2002). В организме супероксид образуется по нескольким причинам. В норме восстановление молекулярного кислорода в 7

É·‚‡ 1

дыхательной цепи происходит только с помощью цитохромоксидазы, которая отдает ему 4 электрона, необходимых для образования воды. Утечка электронов с переносчиков приводит к образованию некоторого количества супероксида. Другой причиной образования супероксида могут быть мутации митохондриальной ДНК, блокирующие ЭТЦ. Такие мутации опасны, так как митохондрии лишены системы репарации ДНК. Ионизирующая радиация и другие факторы также вызывают образование супероксида. К супероксидному радикалу может присоединиться 1 электрон и 2 протона, в результате чего образуется пероксид водорода (Н2О2). Он достаточно стабилен и относится к окислителям средней силы; растворим в липидном бислое, поэтому легко диффундирует через мембрану. При дальнейшем одноэлектронном восстановлении пероксида водорода возможно появление гидроксильного радикала НО• — очень сильного окислителя. Гидроксильный радикал не способен к внутриклеточной миграции, так как моментально вступает в реакцию с биомолекулами. Следовательно, пероксид водорода участвует в образовании более токсичных активных форм кислорода. К АФК относится и синглетный кислород (1О2). Он образуется в световых реакциях растений. Поглощая квант света, пигмент переходит в синглетное или триплетное возбужденное состояние. Сталкиваясь с О2, пигмент передает на него энергию, в результате чего получается химически активный синглетный молекулярный кислород. Таким образом, к АФК относятся свободные радикалы ( О•2− и НО•) и соединения, не являющиеся ими (1О2, Н2О2). Взаимодействуя с органическими веществами, АФК (главным образом НО•) образуют гидропероксиды ДНК, белков, липидов. В ходе метаболизма гидропероксиды переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные соединения. Образование гидропероксидов называется перекисным окислением. Например, в липидах происходит перекисное окисление липидов (ПОЛ). 8

ë‚Ó·Ó‰Ì˚ р‡‰Ë͇Î˚ Ë ÓÍËÒÎËÚÂθÌ˚È ÒÚрÂÒÒ

В нормальных условиях жизни образование АФК и ПОЛ — обычные метаболические процессы. АФК образуются в различных структурах клетки. И если у животных основной источник АФК — митохондрии, то у растений — хлоропласты, пероксисомы и митохондрии. АФК постоянно образуются в растительных и животных клетках, в тех реакциях и процессах, в которых участвует молекулярный кислород (фотосинтез, дыхание, многие биохимические реакции). Содержание АФК в тканях невелико: Н2О2 — 10–8моль/л; О•2− и НО• — 10–11 моль/л (Чиркова, 2002), но при чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и их производных, что происходит в стрессовых условиях, возникают патологические последствия. Окислительный стресс развивается при действии самых разных стрессовых экологических факторов: под действием света высокой интенсивности, при засухе, в условиях засоления, при низких положительных (+4…+5 °С) и высоких температурах, под действием атмосферных поллютантов, при избытке тяжелых металлов в почве, при действии гербицидов, патогенов, при аноксии и в других случаях. Субклеточную локализацию АФК в условиях абиотического стресса демонстрирует рисунок 1.1. Апопласт

Стресс

Хлоропласт

Экспрессия генов Пероксисомы

Митохондрии

Рис. 1.1. АФК и абиотический стресс (Полесская, 2007) 9

É·‚‡ 1

Абиотические стрессы разной природы провоцируют образование АФК в клеточных компартементах. Повысившийся уровень АФК в клетке активирует сигнальные пути, обусловливающие активацию транскрипции соответствующих генов и усиление антиоксидантной защиты (Полесская, 2007) Окислительный стресс приводит к повреждению нуклеиновых кислот, белков и липидов. Вызванные АФК повреждения и мутации в митохондриальной ДНК, накапливаясь в течение жизни, становятся причиной старения. Выявлена обратная связь между интенсивностью генерации супероксидрадикала в митохондриях и продолжительностью жизни. Растения обладают достаточной устойчивостью к окислительным повреждениям, которые возникают лишь при резком изменении физиологического состояния организма. Это обусловлено существованием в растительной клетке эффективных антиоксидантных систем (АОС), которые способны обеспечить защиту от кислородных радикалов и синглетного кислорода. Они более разнообразны, чем у животных, которые имеют иммунную систему. Антиоксидантные системы состоят из антиоксидантных ферментов и неферментативных антиоксидантов. Последние могут быть гидрофильными и гидрофобными. К первым относятся аскорбиновая кислота (АК) и восстановленный глютатион. В химическом отношении АК является лактоном 2,3-диэнол-l-гулоновой кислоты (С6Н8О6). Она обладает сильно выраженными восстанавливающими свойствами. Окисляясь, АК легко переходит в дегидроформу (ДАК). Окисление АК до ДАК происходит в результате отдачи двух протонов и двух электронов. При окислении в особых условиях, когда происходит отдача только одного протона, возникает свободный радикал — монодегидроаскорбиновая кислота. Это нестабильная, реакционноспособная форма АК. Переход АК в ДАК — двухэтапный. На первом этапе две молекулы АК дают начало двум молекулам монодегидроаскорбиновой кислоты. Далее они дисмутируют: одна молекула превращается в ДАК, другая — в АК. 10

ë‚Ó·Ó‰Ì˚ р‡‰Ë͇Î˚ Ë ÓÍËÒÎËÚÂθÌ˚È ÒÚрÂÒÒ

Лактоновое кольцо в молекуле АК стабильно, а в ДАК легко гидролизует с образованием 2,3-дикетогулоновой кислоты. Реакция необратима и 2,3-дикетогулоновая кислота может подвергаться окислительному распаду с образованием щавелевой и треоновой кислот. В клетках растений большая часть АК находится в хлоропластах, обнаружена она в митохондриях, около ядер, во внешнем слое цитоплазмы, в вакуолях, пероксисомах, апопласте. Однако нужно иметь в виду, что субклеточная локализация АК в большой степени определяется физиологическим состоянием клетки и ее структур (Чупахина, 1997). Свет стимулирует биосинтез АК. Из донорных листьев АК по флоэме может транспортироваться в акцепторные органы — развивающиеся листья, цветочные почки, плоды, корни. АК — полифункциональное соединение, но главная ее роль — участие в системах антиоксидантной защиты, действующих в хлоропластах, митохондриях, пероксисомах, цитозоле, апопласте. АК способна напрямую реагировать с супероксидным и гидроксильным радикалами. Однако основная функция АК в ПОЛ состоит в регенерации токофероксильного радикала: ТО• + АК → ТОН + А•, где А• — радикал монодегидроаскорбиновой кислоты. Дальнейшее окисление А• приводит к образованию дегидроаскорбиновой кислоты. Окисленные формы АК восстанавливаются ферментами монодегидроаскорбатредуктазой и дегидроаскорбатредуктазой. Глютатион — основной восстановитель клетки. Как и АК, он восстанавливает токофероксильные радикалы и Н2О2, обезвреживает вторичные метаболиты окислительного обмена. Глютатион-зависимые ферменты работают во всех частях клетки. Антиоксидантный эффект селена также опосредован глютатионпероксидазами. К важнейшим антиоксидантам клетки относится α-токоферол (витамин Е). Кроме него известны токоферолы β, γ и δ, которые различаются по количеству и положению метильных групп в ароматическом кольце. Все токоферолы являются ли11

É·‚‡ 1

пидорастворимыми амфипатическими соединениями. Гидрофобная часть их молекул связана с липидами, а гидрофильная направлена к поверхности мембран. Токоферолы синтезируются только фототрофами, животные и человек получают их с растительной пищей. В фотосинтезирующих тканях доминирует α-токоферол, в нефотосинтезирующих — γ-токоферол (Munne-Boch, Falk, 2004). Состав и содержание токоферолов в тканях растений могут сильно варьировать. Токоферолы поддерживают стабильность мембран хлоропластов и митохондрий; α-токоферол мембран защищает их от действия АФК, вызывает обрыв цепей свободнорадикального окисления. Он нейтрализует свободные радикалы мембранных липидов, отдавая свой электрон и восстанавливая липидные радикалы, и в результате сам становится радикалом, но быстро получает потерянный электрон, восстанавливаясь АК. При этом АК окисляется до монодегидроаскорбиновой кислоты, которая может быть восстановлена НАДН или НАДФН при участии монодегидроаскорбатредуктазы. Токоферол взаимодействует с супероксидным анион-радикалом и синглетным кислородом. Кроме того, он снижает проницаемость мембран, связывает свободные жирные кислоты, избыток которых дестабилизирует мембранную структуру. Витамин Е — один из самых сильных природных антиоксидантов, прежде всего липидов. Антиоксидантными свойствами обладают биофлавоноиды — вещества фенольной природы, синтез которых активируется в стрессовых условиях (Костюк, Потапович, 2004). Они могут быть донорами атома водорода из ОН-группы ароматического кольца, что способствует ликвидации свободных радикалов, окисляющих липиды и другие важные биомолекулы (Takahama, Oniki, 2000). Полифенолы также могут связывать металлы переменной валентности, которые выступают катализаторами свободнорадикального окисления (Чиркова, 2002). В обзоре (Takahama, Oniki, 2000) указывается, что антиоксидантным действием обладают восстановленные формы 12

ë‚Ó·Ó‰Ì˚ р‡‰Ë͇Î˚ Ë ÓÍËÒÎËÚÂθÌ˚È ÒÚрÂÒÒ

биологически активных хинонов — убихинона (коэнзима Q), филлохинона (витамин К1), менахинона (витамин К2), менадиона (витамин К3), хотя они не имеют «подвижного» атома водорода, благодаря которому могли бы легко вступать во взаимодействие со свободными радикалами. Однако экспериментальные данные показывают, что эндогенный убихинон и витамины группы К являются эффективными потенциальными антиоксидантами и способны предохранять биологические мембраны от повреждающего действия свободнорадикальных процессов. К липофильным антиоксидантам относятся каротиноиды, которые участвуют в тушении избыточной энергии триплетных хлорофиллов и синглетного кислорода. Воспринимая энергию возбуждения, они рассеивают ее в виде тепла, тем самым предотвращая возможность образования синглетного кислорода. В тканях листьев при осеннем старении и в плодах при созревании сохраняется много каротиноидов, способных дезактивировать АФК, особенно синглетный кислород. Каротиноиды могут взаимодействовать с органическими радикалами жирных кислот. В этом случае они действуют не как доноры водорода, а как «ловушки» радикалов (Чиркова, 2002). Антиоксидантные свойства характерны для изопрена (С5Н8, 2-метил-1,3-бутадиен), относящегося к терпенам. Он синтезируется в хлоропластах только на свету и не запасается в тканях листа, а сразу улетучивается в атмосферу. При высоких температурах в клетках листа усиливается синтез изопрена, возрастает и уровень АФК, появляются некрозы. Изопрен снижает уровень АФК и препятствует повреждению мембран, хотя механизм этого процесса неизвестен (Полесская, 2007). Основную роль в снижении уровня АФК играют ферменты антиокислительной системы: супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, глютатион-трансфераза, фосфолипидгидропероксидаза, глютатионпероксидаза, глютатионредуктаза, а также ферменты аскорбат-глютатионового цикла: аскорбатпероксидаза, монодегидроаскорбатредуктаза, дегидроаскорбатредуктаза (Чиркова, 2002; Попов и др., 2006; Дерябин 13

É·‚‡ 1

и др., 2007; Polle, 2001; Arora et al., 2002; Mittler, 2002; Harrach et al., 2005). Устойчивые растения обладают более высоким содержанием аскорбата, α-токоферола, активностью антиоксидантных ферментов. Ответ антиоксидантной системы на один и тот же стрессор зависит от вида растений, степени и продолжительности стрессового воздействия, от характера стрессового фактора, состояния антиоксидантной системы, исходного уровня антиоксидантной активности, возраста растений и условий их выращивания. Поэтому оценка успешности антиоксидантной защиты предполагает всестороннее исследование данного многофакторного процесса. ÅË·ÎËÓ„р‡Ù˘ÂÒÍËÈ ÒÔËÒÓÍ

1. Дерябин А. Н., Синькевич М. С., Дубинина И. М. и др. Влияние сахаров на развитие окислительного стресса, вызванного гипотермией (на примере растений картофеля, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей) // Физиология растений. 2007. Т. 54, № 1. С. 39—46. 2. Костюк В. А., Потапович А. И. Биорадикалы и биоантиоксиданты. Минск: Изд-во БГУ, 2004. 3. Полесская О. Г. Растительная клетка и активные формы кислорода. М.: Изд-во КДУ, 2007. 4. Попов В. Н., Кипайкина Н. В., Астахова Н. В., Трунова Т. И. Особенности окислительного стресса растений табака, трансформированных геном desC Δ9-ацил-липидной десатуразы из Synechococcus vulcanus, при гипотермии // Физиология растений. 2006. Т. 53, № 4. С. 525—529. 5. Чиркова Т. В. Физиологические основы устойчивости растений. СПб.: Изд-во СПбГУ, 2002. 6. Чупахина Г. Н. Система аскорбиновой кислоты растений: монография / Калинингр. ун-т. Калининград, 1997. 7. Arora A., Sairam R. K., Srivastata G. S. Oxidative stress and antioxidative system in plants // Current Science. 2002. Vol. 82. Р. 1227—1238. 8. Harrach B. D., Fodor J., Barna B. Changes of antioxidants following powdery mildew infection of near-isogenic barley lines carrying different resistance genes // Proceedings of the 8th Hungarian Congress 14

ë‚Ó·Ó‰Ì˚ р‡‰Ë͇Î˚ Ë ÓÍËÒÎËÚÂθÌ˚È ÒÚрÂÒÒ

on Plant Physiology and the 6th Hungarian Conference on Photosynthesis. Budapest, 2005. Р. 91—92. 9. Mittler R. Oxidative stress. antioxidants and stress tolerance // Trends Plant Sci. 2002. Vol. 7. Р. 405—410. 10. Munne-Boch S., Falk J. New insights into the function of tocopherols in plants // Planta. 2004. Vol. 218. P. 323—326. 11. Polle A. Dissecting the Superoxide Dismutase-Ascorbate-Glutathione-Pathway in Chloroplasts by Metabolic Modeling. Computer Simulations as a Step towards Flux Analysis // Plant Physiol. 2001. Vol. 126. Р. 445—462. 12. Takahama U., Oniki T. Flavonoides and some other phenolics as substrates of peroxidase: physiological significance of the redox reactions // Plant Res. 2000. Vol. 133. P. 301—309.

15

É·‚‡ 2

É·‚‡ 2 îÖêåÖçíÄíàÇçÄü ÄçíàéäëàÑÄçíçÄü ëàëíÖåÄ êÄëíÖçàâ

К антиоксидантным ферментам относят супероксиддисмутазу, каталазу, глютатионпероксидазу, глютатион-S-трансферазу, глютатионредуктазу, а также ферменты аскорбат-глютатионового цикла — аскорбатпероксидазу, монодегидроаскорбатредуктазу и дегидроаскорбатредуктазу (Asada, 1994; Foyer et al., 1994; Polle, 2001; Arora et al., 2002; Mittler, 2002). Как правило, в детоксикации АФК участвует несколько сопряженных ферментативных систем и низкомолекулярных антиоксидантов. Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенных форм АФК, специфичностью клеточной и органной локализации, спецификой использования металлов в качестве катализаторов, к которым относят медь, цинк, марганец, железо, никель, а также неметалл селен. Кроме того, в отличие от неферментативных антиоксидантов для антиоксидантных ферментов характерно значительное время, необходимое для индукции их синтеза, и быстрая инактивация конституционного пула ферментов свободными радикалами (Кения и др., 1993). 2.1. ëÛÔÂрÓÍÒˉ‰ËÒÏÛÚ‡Á‡

Супероксиддисмутаза — СОД (КФ 1.15.1.1) впервые была выделена из крови вола и описана как сине-зеленый белок, связывающий ионы меди. Антиоксидантные свойства супероксиддизмутазы были открыты позже, в 1967 г., Мак-Кордом 16

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

и Фридовичем (Giannopolitis, Ries, 1977; Bowler et al., 1992; Scandalios, 1993). Установлено, что СОД катализирует реакции дисмутации О•2− в хлоропластах, митохондриях и цитозоле: 2 О•2− + 2Н+ → Н2О2 + О2. Супероксидный радикал в водных растворах может дисмутировать и неферментативным путем, однако супероксиддисмутаза значительно ускоряет эту реакцию. Так, скорость спонтанной реакции при нейтральных рН не превышает 7 • 105 М/с, в присутствии же СОД скорость реакции возрастает до 2 • 109 М/с, т. е. приблизительно в 104 раз (Ogawa et al., 1996). В связи с тем, что супероксиддисмутаза присутствует во всех аэробных организмах и большинстве субклеточных компонентах, производящих АФК, был сделан вывод, что именно СОД принадлежит важная роль в защите против окислительного стресса (Bowler et al., 1992; Scandalias, 1993). В растениях присутствует несколько форм СОД, содержащих в активных центрах медь и цинк (CuZnСОД), железо (FeСОД) или марганец (MnСОД). Изоформы СОД могут быть разделены электрофорезом и идентифицированы на основании их чувствительности к цианиду и перекиси водорода. MnСОД устойчива к обоим ингибиторам, тогда как CuZnСОД реагирует как на пероксид водорода, так и на цианид, FeСОД устойчива к цианиду и чувствительна к H2O2 (Романова, 2008). Поверхность супероксиддисмутазы несет отрицательный заряд, однако в строении молекулы выявлены положительно заряженные каналы, которые ведут к активным центрам и служат, как предполагается, для захвата отрицательно заряженных частиц супероксид анион-радикалов. В результате такого избирательного захвата ионов О•2− значительно повышается скорость реакции дисмутации (Бараненко, 2006). MnСОД и FeСОД найдены во всех прокариотах, в отличие от CuZnСОД, которая для них не характерна, зато присутствует в клетках большинства эукариотов (Романова, 2008). 17

É·‚‡ 2

MnСОД и FeСОД, содержащиеся в клетках прокариот, и эукариотическая CuZnСОД являются димерами, тогда как MnСОД, локализованная в митохондриях эукариот, — тетрамер (Scandaliоs, 1993). Сравнение данных о локализации разных форм СОД показывает, что наиболее изобильна в клетках растений CuZnСОД. Она обнаружена во всех внутриклеточных компартментах — в цитозоле, митохондриях, пероксисомах, a также в апопласте (табл. 2.1). Что касается MnСОД и FeСОД, они обнаружены лишь в определенных органеллах. В частности, MnСОД расположена в митохондриях и пероксисомах, а FeСОД — в хлоропластах и цитоплазме клубеньков некоторых бобовых (Бараненко, 2006). Таблица 2.1 Характеристика и локализация изоформ СОД в клетках растений Изоформа СОД

Локализация в клетках растений Гомодимер (33 кДа); в активном Хлоропласты, митохонCuZnСОД центре содержится по 2 г-атома дрии, пероксисомы, цимеди (Cu2+) и цинка (Zn2+) топлазма, апопласт Гомодимер (46 кДа) или гомо- Митохондрии, перокситетрамер (92 кДа); в активном сомы MnСОД центре содержится 2 или 4 г-атома марганца (Mn3+) Гомодимер (36—46 кДа) — в Хлоропласты, цитоплазхлоропластах; содержание же- ма клубеньков некотолеза (Fe3+) варьируется от 1 до рых бобовых 2 г-атомов и 54 кДа — в цитоFeСОД плазме клубеньков бобовых или гомотетрамер (92 кДа); в активном центре содержится 2 г-атома железа 18

Характеристика

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

Цитозольная форма CuZnСОД обнаружена возле или на тонопласте, а также в самом ядре, что указывает на образование супероксидных радикалов внутри ядра (Ogawa et al., 1996). В ядре СОД (до 80 %) связана с ДНК-филаментами, защищая их от окислительных повреждений (Ogawa et al., 1996). Данная изоформа обнаружена также возле или на цитоплазматической мембране (Ogawa et al., 1996). В хлоропластах CuZnСОД локализована в мембранах тилакоидов и строме (Ogawa et al., 1995; Gomez et al., 2004). В частности, около 70 % CuZnСОД прикреплено к стромальной поверхности мембран тилакоидов, где расположен комплекс фотосистемы I (Ogawa et al., 1995). Отмечено, что локальная концентрация фермента в мембранах тилакоидов составляет около 1 мМ, тогда как в строме — около 20 мкМ (Ogawa et al., 1995). Таким образом, большее количество СОД прикреплено к тилакоидным мембранам, и это свидетельствует о том, что в них продукция супероксидных радикалов выше по сравнению со стромой. Фермент обнаружен также во внутритилакоидном пространстве хлоропластов (около 4 % хлоропластной CuZnСОД) (Науаkawa et al., 1984). Поскольку основное количество CuZnСОД в клетках листьев растений, как свидетельствуют данные литературы, локализовано в хлоропластах (Asada, 1999), очевидно, что последние являются важным источником супероксидных радикалов в клетке. Кроме хлоропластов CuZnСОД обнаружена в матриксе пероксисом (Sandalio, Del Rio, 1987; Corpas et al., 1998), где она является также преобладающей изоформой СОД. На долю пероксисомной CuZnСОД приходится около 18 % общей активности СОД в клетках растений (Sandalio, Del Rio, 1987). В апопласте данная изоформа принимает участие в лигнификации клеточных стенок и защите клеток и тканей растений от патогенов (Ogawa et al., 1997). MnСОД обнаружена в матриксе митохондрий и пероксисом (Del Rio et al., 2003). FeСОД в клетках растений располо19

É·‚‡ 2

жена главным образом в хлоропластах — как в строме, так и на мембранах тилакоидов (Gomez et al., 2004). Кроме хлоропластов обнаружена локализация фермента в нефотосинтезирующих органеллах и тканях: в пероксисомах листьев Lycopersicon esculentum (Mittova et al., 2003), пероксисомах лепестков гвоздики (Droillard, Paulin, 1990), а также в цитозоле клубеньков некоторых бобовых — клевера, сои и фасоли (Moran et al, 2003). Однако не у всех бобовых найден фермент в цитозоле клубеньков: у люцерны и гороха он локализован исключительно в хлоропластах (Moran et al., 2003). Достаточно важен вопрос регуляции СОД. Литературные данные свидетельствуют о том, что регуляция активности фермента происходит на разных уровнях: на уровне транскрипции, трансляции и (или) путем посттрансляционной модификации молекул СОД (Бараненко, 2006). Влияние экологических факторов на активность супероксиддисмутазы Свет

Показано, что выращивание растений бегонии при низкой интенсивности света (I = 25 мкмоль м–2 • с–1) ведет к снижению активности фермента более чем в 2 раза по сравнению с растениями, выращенными при более высокой интенсивности света (I = 155 мкмоль м–2 • с–1) (Burritt, Mackenzie, 2003). Прямая корреляционная зависимость между активностью супероксиддисмутазы и интенсивностью света была выявлена и в работе (Cakmak, Marschner, 1992). Вместе с тем в ряде исследований показана инвариантность активности супероксиддисмутазы при изменении интенсивности света. Например, изучалось действие света повышенной интенсивности (I = 360 мкмоль м–2 • с–1) на активность антиоксидантных ферментов в растениях табака. Было уста20

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

новлено, что активность СОД в исследуемых растениях достоверно не изменялась по сравнению с контрольными значениями (Gechev et al, 2003). Изучено действие света повышенной интенсивности (I = 200 мкмоль м–2 • с–1) на активность ферментов антиоксидантной системы в растениях Arabidopsis thaliana (L.). Достоверного изменения активности супероксиддисмутазы при увеличении интенсивности света в 2 раза авторами работы выявлено не было. Вместе с тем установлено резкое повышение активности супероксиддисмутазы при облучении растений УФ-светом (0,25 Вт м–2) (Kubo et al., 1999). В нашей работе проводилось изучение ответной реакции антиоксидантной системы растений ячменя при облучении их светом высокой интенсивности (I = 520 мкмоль м–2 • с–1) в течение 12 часов. Было установлено повышение активности СОД в растениях после 12-часовой световой экспозиции на 12 % по сравнению с контрольным вариантом (Скрыпник, Чупахина, 2008). Температура

Влияние температуры на активность супероксиддисмутазы неоднозначно и зависит не только от продолжительности действия фактора, его интенсивности, но и от вида исследуемого растения. Так, изучалось действие низких отрицательных температур (–9 °С, 15 минут) на развитие окислительного стресса и активность супероксиддисмутазы в растениях картофеля. Было установлено значительное повышение активности СОД в листьях картофеля при гипотермии (Демина и др., 2008). Повышение активности супероксиддисмутазы выявлено и в листьях ячменя в условиях низкотемпературного стресса (2 °С, 24 часа) (Радюк и др., 2009). Было установлено, что общая активность СОД в условиях низкотемпературного стресса превышала ис21

É·‚‡ 2

ходное значение на 15 %. После окончания действия холодового фактора общая активность СОД медленно снижалась, возвращаясь к исходной величине (через 48 часов). Анализ изоформ СОД показал, что активность цитоплазматической CuZnСОД в ответ на низкотемпературный стресс увеличилась на 15 %, в то время как активность хлоропластной CuZnСОД возрастала только на 9 %. Исследование динамики активности цитозольной СОД в листьях картофеля в условиях длительной гипотермии показало, что в 1-е сутки у растений наблюдается всплеск активности СОД, на 3-и сутки происходит резкий спад и последующее незначительное увеличение активности фермента к окончанию опыта (на 6-е сутки) (Дерябин и др., 2007). Вместе с тем некоторые авторы отмечают снижение активности супероксиддисмутазы или отсутствие реакции фермента при действии на растения низких температур. Так, изучение изменения активности супероксиддисмутазы в растениях табака при охлаждении до 2 °С в течение 2 часов показало, что уже через 30 минут после начала охлаждения активность СОД резко снижается. Самое значительно уменьшение активности (в 4 раза) наблюдалось в растениях табака спустя 1 час после охлаждения. После 2 часов выдерживания при пониженной температуре активность СОД несколько возрастала, но все же оставалась значительно ниже исходного (до охлаждения) уровня (Попов и др., 2006). Было проведено исследование изменения активности антиоксидантных ферментов в динамике охлаждения в растениях с различной степенью холодоустойчивости. Самое значительное снижение активности (более чем в 6 раз) наблюдали в листьях огурца — наиболее теплолюбивого из всех исследуемых в данном опыте растений (Лукаткин, 2002). Минеральное питание

Наряду со светом и температурой основным фактором, влияющим на активность супероксиддисмутазы, является минеральное питание. Исходя из строения СОД, естественным 22

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

будет предположить, что дефицит в питательной среде меди, цинка, железа и марганца существенно повлияет на активность супероксиддисмутазы. Изучалось влияние дефицита меди, цинка и марганца на общую активность супероксиддисмутазы и активность ее отдельных изоформ (MnСОД, FeСОД, CuZnСОД) в листьях люпина. Установлено, что дефицит меди приводил к снижению общей активности СОД и активности всех изучаемых изоформ. При исключении из питательного раствора цинка снижалась общая активность СОД и активность MnСОД и CuZnСОД, а активность FeСОД достоверно не изменялась. При дефиците марганца, напротив, общая активность супероксиддисмутазы и активность MnСОД, CuZnСОД повышались, а активность FeСОД понижалась по сравнению с контрольным вариантом (Yu, Rengel, 1999). Увеличение общей активности супероксиддисмутазы при дефиците марганца отмечалось также в хвое ели обыкновенной (Polle et al., 1992). Также исследовалось влияние дефицита магния на активность супероксиддисмутазы в листьях фасоли. Уровень активность СОД в растениях, выращенных на питательной среде, не содержащей магний, был ниже по сравнению с контрольным вариантом. При этом снижение общей активность СОД происходило, главным образом, за счет уменьшения активности CuZnСОД (Cakmak, Marschner, 1992). Нами проводилось изучение влияния селена и цинка на суммарную активность супероксиддисмутазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). В опыте использовали четыре группы растений: 1) растения, выращенные на среде с добавлением селена; 2) растения, выращенные на среде с добавлением цинка; 3) растения, выращенные на среде с добавлением селена и цинка; 4) растения, выращенные на среде, не содержащей ни селена, ни цинка. Селен добавлялся в форме селената натрия в концентрации 1 мкмоль/л, цинк — в форме хлорида цинка в концентрации 2 мкмоль/л. 23

É·‚‡ 2

Как показали исследования, исключение цинка из питательной среды приводило к снижению активности СОД более чем в 2 раза (рис. 2.1). 7,0 Активность СОД, отн. ед/г белка • мин

6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.1. Влияние селена и цинка на активность супероксиддисмутазы в листьях ячменя

Добавление селена в питательный раствор способствовало повышению СОД по сравнению с Zn-дефицитным вариантом, однако и в этом случае активность СОД была примерно в 1,5 раза меньше, чем у растений, выращенных на питательной среде, содержащей цинк. Кроме того, установлено снижение активности супероксиддисмутазы в растениях, выращенных при наличии в питательной среде и цинка, и селена. Действие тяжелых металлов

Загрязнение почвы, воды и воздуха тяжелыми металлами представляет большую опасность для биосферы. Устойчивость растений к действию токсикантов во многом зависит от эффективности работы антиоксидантной системы. Как показа24

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

ли исследования, реакция супероксиддисмутазы на действие тяжелых металлов может быть различной. Например, изучалось действие ионов свинца на активность антиоксидантных ферментов в листьях рдеста курчавого (Potamogeton crispus L.). Растения обрабатывали раствором нитрата свинца в различных концентрациях (от 0 до 50 мг/л). В результате эксперимента была установлена обратная корреляционная зависимость между активностью СОД и концентрацией свинца (r = –0,969) (Ху и др., 2007). В другой работе изучали влияние свинца на рост, активность антиоксидантных ферментов и ультраструктуру листьев у двух экотипов, растений Sedum alfredii: экотипа аккумулирующего тяжелые металлы, и неаккумулирующего экотипа. Растения выращивали в лабораторных условиях на питательных растворах с концентрацией свинца от 0,02 до 0,2 ммоль/л. У растений экотипа, аккумулирующего тяжелые металлы, активность СОД возрастала с увеличением концентрации свинца. У растений неаккумулирующего экотипа активность СОД также увеличивалась соответственно увеличению уровня свинца, но до тех пор, пока его концентрации была менее 0,2 ммоль/л, затем активность фермента снижалась (Лиу и др., 2008). Проведено исследование влияния различных концентраций цинка (1—1000 мкмоль/л) на систему антиоксидантной защиты в корнях Sedum alfredii двух экотипов: гипераккумуляторов цинка и не аккумулирующих цинк растений. В корнях растений-гипераккумуляторов при повышенных концентрациях цинка (от 250 мкмоль/л) наблюдали значительную активацию ферментативной активности. Активность СОД в корнях растений экотипа, не аккумулирующего тяжелые металлы, находившихся на растворах, содержавших до 250 мкмоль/л цинка, повышалась, а при более высоких концентрациях резко снижалась: при 1000 мкМ снижение составляло 29,8 % по сравнению с контролем (Ли и др., 2008). Изучалось влияние различных концентраций меди (50— 200 мкМ) на антиоксидантную систему растений горчицы индийской (Brassica juncea L.). В ходе проведенного исследова25

É·‚‡ 2

ния была установлена положительная корреляционная зависимость между концентрацией меди и активностью супероксиддисмутазы как в корнях, так и в листьях исследуемых растений. В листьях активность СОД возрастала на 9—16 %, в корнях на 8—27 % (Деви, Прасад, 2005). Также изучалось действие различных концентраций (10— 1000 мкМ) ряда тяжелых металлов (Cr, Cd, Cu, Zn) на активность супероксиддисмутазы в растениях гидриллы (Hydrilla verticillata (Linne f.) Royle). Активность супероксиддисмутазы повышалась в растениях под действием кадмия и меди и понижалась под действием цинка и хрома соответственно увеличению концентрации тяжелых металлов (Panda, Khan, 2004). Солевой стресс

В настоящее время большое внимание уделяется выяснению роли антиоксидантных систем в устойчивости растений к солевому стрессу. Было установлено, что при солевом стрессе активность супероксиддисмутазы в листьях пшеницы незначительно возрастает. В корнях солевой стресс не вызывал достоверного изменения в активности СОД (Полесская и др., 2006). Увеличение активности фермента в листьях различных видов растений при солевом стрессе было выявлено и в других работах (Карташавов и др., 2008; Ху, Лиу, 2008). 2.2. ä‡Ú‡Î‡Á‡

Каталаза — КАТ (КФ 1.11.1.6) — гемсодержащий тетрамерный фермент, катализирующий реакцию превращения пероксида водорода в воду: 2H2O2 → 2Н2О + О2. В отличие от других ферментов, способствующих ликвидации пероксида водорода, КАТ не требует дополнительного субстрата. Каталаза — основной фермент, ликвидирующий избыточные количества пероксида водорода, однако вследствие 26

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

низкого сродства к субстрату она эффективна только при высоких концентрациях H2O2 (Baker, Orlandi, 1995). При низких концентрациях пероксида водорода каталаза способна катализировать его восстановление только при наличии дополнительных доноров водорода, например этанола, муравьиной или аскорбиновой кислот. Каталаза содержится во всех аэробных организмах. В растениях было определено несколько ее изоформ, которые локализованы преимущественно в пероксисомах клетки, однако они могут находиться и в ассоциированном с пластидами или митохондриями состоянии (Willekens et al., 1995). В растениях табака (Nicotiana plumbaginifolia) было выделено три гена, кодирующих каталазы (Willekens et al., 1994). КАТ1 является наиболее распространенной формой в фотосинтетически активных тканях и участвует в ликвидации пероксида водорода, образующегося при фотодыхании (Streb, Feierabend, 1996). КАТ2 наиболее активно проявляет свои функции в тканях сосудов, при этом ее активность быстро возрастет под действием диоксида серы, озона или УФ-излучения (Willekens et al., 1994). В связи с этим был сделан вывод о защитной роли КАТ2 от окислительного стресса, однако ее физиологические функции в растениях и точное место локализации (пероксисомы или митохондрии) установлены не были (Chamnongpol et al., 1996). КАТ3 участвует в детоксикации H2O2, образующегося в глиоксомах при разрушении жирных кислот. Влияние экологических факторов на активность каталазы Свет

Реакция каталазы на стресс, вызванный светом высокой интенсивности, может быть различной и зависит от продолжительности действия стрессового фактора и вида растения. Изучение действия света высокой интенсивности (I = = 360 мкмоль м–2 • с–1) на активность антиоксидантных фер27

É·‚‡ 2

ментов в растениях табака показало, что на начальном этапе действия стрессового фактора (1—2-й день) активность каталазы снижалась более чем на 20 % по сравнению с контрольным вариантом. Затем активность фермента повышалась и на 4-й день эксперимента была выше контрольного значения на 13 % (Gechev et al., 2003). Похожий результат был получен и в другой работе, авторы которой изучали изменение антиоксидантного статуса листьев бегонии при акклиматизации растений к высокоинтенсивному свету. Установлено, что активность каталазы снижалась в течение 24 часов после начала световой экспозиции более чем на 50 %, однако уже через 72 часа активность фермента достигала уровня контроля. Более длительное экспонирование растений бегонии на свету приводило к увеличению активности каталазы более чем в 2 раза по сравнению с контролем (Burritt, Mackenzie, 2003). Изучалось действие УФ-света на активность антиоксидантной системы растений перца. Было показано увеличение активности каталазы в листьях перца на 32, 183 и 184 % при облучении растений УФ-А, УФ-В и УФ-С соответственно (Махдавиан и др., 2008). В нашей работе проводилось изучение ответной реакции антиоксидантной системы растений ячменя при облучении их светом высокой интенсивности (I = 520 мкмоль м–2 • с–1) в течение 12 часов (Скрыпник, Чупахина, 2007). В ходе проведенного исследования было установлено повышение активности каталазы в растениях после 12-часовой световой экспозиции на 45 % по сравнению с контрольным вариантом. Вместе с тем исследование действия света высокой интенсивности на активность каталазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных в условиях дефицита цинка, показало снижение активности фермента после 12-часовой световой экспозиции (рис. 2.3) (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008). 28

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

I1

Активность КАТ, отн. ед. / г белка • мин

0,50

I2

0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 ячмень

капуста китайская

Рис. 2.3. Влияние интенсивности света на активность каталазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных при дефиците цинка:

для ячменя: I1 = 160 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 520 мкмоль м–2 • с–1; для капусты китайской: I1 = 290 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 680 мкмоль м–2 • с–1

Как видно из представленных данных, активность каталазы в листьях ячменя уменьшилась на 32 %, в листьях капусты китайской на 11 % после облучения растений светом высокой интенсивности. Температура

В последнее время появились многочисленные исследования влияния низких положительных температур на активность антиоксидантных ферментов, в том числе и каталазы. Однако полученные данные еще раз доказывают неспецифичность реакции антиоксидантной системы на действие стрессовых факторов. Например, исследовалось действие низких положительных температур (2 °С, 24 часа) на активность антиоксидантных ферментов растений с различной степенью холодоустойчивости. Активность каталазы у изученных видов до охлаждения была различной: наибольшей — в зеленых листьях 29

É·‚‡ 2

кукурузы, значительно меньшей — в листьях огурца и проса, самой малой — в этиолированных листьях кукурузы и побегах картофеля. В ходе охлаждения наблюдались изменения активности фермента, неодинаковые у разных растений. Так, в начале охлаждения (через 1 час) активность каталазы в зеленых листьях кукурузы снижалась на 28 %, у огурца — на 50 %; в этиолированных листьях кукурузы и проса она не менялась, а в побегах картофеля увеличивалась на 50 % по сравнению с контролем. Через 4 часа охлаждения активность фермента изменялась: восстанавливалась у кукурузы, проса и картофеля и снижалась у огурца. К окончанию холодовой экспозиции (24 часа) активность каталазы у наиболее устойчивых видов (проса и картофеля) превышала контроль, у менее устойчивого вида (кукурузы — как зеленой, так и этиолированной) была на уровне контроля, у самого чувствительного вида (огурца) снижалась по сравнению с контролем (Лукаткин, 2002). Незначительное увеличение активности каталазы наблюдалось в листьях растений табака, подвергнутых действию низкотемпературного стресса (2 °С, 2 часа) (Попов и др., 2006). Имеются, однако, данные о снижении активности каталазы в листьях табака при действии на растения низких положительных температур (5 °С, 4 дня) (Gechev et al., 2003). Различия в полученных результатах объясняются, скорее всего, разной продолжительностью действия стрессового фактора. Минеральное питание

Реакция каталазы на дефицит макро- и микроэлементов может быть различной. Например, было выявлено увеличение активности каталазы на 154 % в листьях фасоли, выращенной при дефиците магния (Cakmak, Marschner, 1992). Вместе с тем в другом исследовании наблюдалось снижение активности каталазы в цитрусовых при дефиците железа в питательной среде (Chouliaras et al., 2004). Аналогичный результат был получен и в работе, посвященной изучению влияния дефицита железа и цинка на активность некоторых ферментов в Neurospo30

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

ra: было установлено снижение активности каталазы при дефиците железа, однако дефицит цинка не оказывал существенного влияния на активность фермента (Nicholas, Goodman, 1958). Другие исследователи, напротив, отмечают существенное снижение активности каталазы при дефиците цинка (Cakmak, 2000). В нашей работе проводилось изучение влияния селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). Максимальная активность каталазы отмечалась в растениях, выращенных на питательной среде, не содержащей ни селена, ни цинка, что может свидетельствовать о существенной роли именно данного фермента в утилизации пероксида водорода в условиях микроэлементного дефицита (рис. 2.4).

Активность КАТ, отн. ед. / г белка • мин

0,4 0,3 0,2

0,1 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.4. Влияние селена и цинка на активность каталазы в листьях ячменя

Кроме того, проводилось исследование влияния селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя и китайской капусты, подвергнутых действию света высокой интенсивности (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008). Результаты исследования представлены на рисунках 2.5 — 2.6. 31

É·‚‡ 2

Активность КАТ, отн. ед. / г белка • мин

6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.5. Влияние селена и цинка на активность каталазы в растениях капусты китайской на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 680 мкмоль м–2 • с–1)

Активность КАТ, отн. ед. / г белка • мин

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.6. Влияние селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 520 мкмоль м–2 • с–1). 32

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

Как видно из представленных на рисунках 2.5—2.6 данных, при исключении из питательной среды цинка и селена активность каталазы в растениях капусты китайской и ячменя резко снижалась. Такой результат, вероятно, связан с тем, что при действии на растения нескольких неблагоприятных факторов — дефицита микроэлементов и света повышенной интенсивности — в их клетках образуется избыточное количество О•2− . Известно, что каталаза очень чувствительна к супероксидному радикалу, повышенный уровень которого может существенно инактивировать ее активность (Fridovich, 1986). Действие тяжелых металлов

Изучение действия ионов свинца на активность антиоксидантных ферментов в листьях рдеста курчавого (Potamogeton crispus L.) показало уменьшение активности каталазы при возрастании концентрации свинца (от 0 до 50 мг/л). Установлена обратная корреляционная зависимость между активностью КАТ и концентрацией свинца (r = –0,984) (Ху и др., 2007). При этом показано различие в ответной реакции каталазы на действие свинца для двух экотипов растений Sedum alfredii: экотипа, аккумулирующего тяжелые металлы, и неаккумулирующего экотипа. Растения выращивали на питательных растворах с концентрацией свинца от 0,02 до 0,2 ммоль/л. Активность КАТ в листьях растений экотипа, аккумулирующего тяжелые металлы, медленно возрастала с увеличением концентрации свинца. Однако у растений неаккумулирующего экотипа была отмечена противоположная тенденция: активность КАТ значительно снижалась после обработки свинцом (Лиу и др., 2008). Исследовано влияние различных концентраций цинка (1—1000 мкмоль/л) на систему антиоксидантной защиты в корнях Sedum alfredii двух экотипов: гипераккумуляторов цинка и не аккумулирующих цинк растений. Для обоих экотипов 33

É·‚‡ 2

было установлено увеличение каталазы в корнях исследуемых растений при увеличении концентрации цинка до 500 мкМ и снижение активности фермента при более высоких концентрациях микроэлемента (Ли и др., 2008). Изучалось влияние различных концентраций меди (50— 200 мкМ) на антиоксидантную систему растений горчицы индийской (Brassica juncea L.). Установлено значительное увеличение активности каталазы (на 30—106 %) в листьях исследуемых растений при обработке их медью (Деви, Прасад, 2005). Вместе с тем было выявлено снижение активности каталазы более чем в 2 раза в листьях растений тыквы обыкновенной, выращенной на питательной среде, содержащей 10 мМ (El-Shora, 2003). Различия в ответной реакции растений на внесение меди могут быть связаны с использованием в эксперименте разных концентраций меди и видовой специфичностью растений. Солевой стресс

Полученные данные по изменению активности каталазы в растениях с различной степенью солеустойчивости при увеличении концентрации хлорида натрия позволили некоторым авторам сделать вывод, что КАТ играет важную роль в детоксикации перекисей, образующихся при солевом стрессе (Ху, Лиу, 2008; Ясар и др., 2008). В этих работах наблюдали значительное повышение активности каталазы в растениях фасоли и топинамбура солеустойчивых сортов, в то время как в чувствительных к засолению сортах активность каталазы изменялась незначительно. Также установлено, что изменение активности каталазы в листьях и корнях растений пшеницы при солевом стрессе зависит от азотного питания растений. Например, активность КАТ падала в листьях NO 3− -растений и достоверно не изменя+ + лась у NH 4 - и N-дефицитных. В корнях NH 4 -растений на-

34

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

блюдали уменьшение активности фермента. В остальных вариантах активность каталазы достоверно не изменялась (Полесская и др., 2006). 2.3. ÉβڇÚËÓÌÔÂрÓÍÒˉ‡Á‡

Глютатионпероксидаза — ГПО (КФ 1.11.1.9), локализованная в цитоплазме, плазмалемме и матриксе митохондрий, разрушает пероксид водорода и органические гидропероксиды свободных жирных кислот, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, белков (3—4) (Чиркова, 2002; Kuehn, Borschert, 2002; Ursini et al., 1995): H2O2 + 2GSH → 2Н2О + GSSG; ROOH + 2GSH → ROH + Н2О + GSSG. В активный центр глютатионпероксидазы входит селеноцистеин, который играет роль каталитического центра вышеописанных реакций, так как селенольная группа окисляется легче, чем тиольная. В связи с этим схема реакций детоксикаций гидроперекисей приобретает несколько иной вид (Племенков, 2001): G −SH

ROOH

Enzym − SeH → Enzym − SeOH → + ROH

G − SH

→ Enzym − Se − S − G → Enzym +H 2O



+ G −S−S− G

SeH

Несмотря на то что физиологические функции и строение этого фермента для животных и человека установлены точно, вопрос относительно его роли и формы в растениях до сих пор не решен. В клетках человека и животных было выявлено четыре изоформы ГПО, содержащие в активном центре микроэлемент селен, в том числе и фосфолипидгидроксипероксид-глютатионпероксидазу (PH-ГПО), катализирующую в основном редукцию гидропероксидов фосфолипидов (Brigelius-Flohe et al., 1994). В некоторых высших растениях был выделен и описан 35

É·‚‡ 2

ген, идентичный гену PH-ГПО животных и человека (RoeckelDrevet et al., 1998; Depege et al., 1998). В то же время было установлено, что ГПО имеет в растениях меньшую ферментативную активность по сравнению с животными. Это связано с тем, что активным центром в растительной ГПО является не селеноцистеин, а цистеин (Eshdat et al., 1997; Yoshimura et al., 2004). Однако, несмотря на то что физиологическая роль ГПО в растениях не совсем ясна, существуют данные о реакции ГПО-системы на стрессовое воздействие на молекулярном уровне (Roeckel-Drevet et al., 1998; Depege et al., 1998; Tamas et al., 2006), а кроме того, выявлено повышение устойчивости трансгенных растений, трансформированных геном ГПО к окислительному стрессу (Yoshimura et al., 2004; Chen et al., 2004). Антиоксидантная роль глютатионпероксидазы была установлена как при воздействии на растение абиотических, так и биотических стрессовых факторов (Navrot et al., 2006). Влияние экологических факторов на активность глютатионпероксидазы Свет

Несмотря на то что в последнее время активно исследуется ответная реакция антиоксидантной системы на стресс, вызванный светом высокой интенсивности, вопрос о роли глютатионпероксидазы в данных условиях остается малоизученным. В нашей работе исследовалось действие света высокой интенсивности (I = 520 мкмоль м–2 • с–1) на активность глютатионпероксидазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). После 12-часовой световой экспозиции в исследуемых растениях было зафиксировано снижение уровня ГПО на 15 % по сравнению с контролем. 36

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

Кроме того, изучалось действие света высокой интенсивности на активность глютатионпероксидазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных в условиях дефицита цинка (рис. 2.7) (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008). I1

Активность ГПО, отн. ед. / г белка • мин

3,00

I2

2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 ячмень

капуста китайская

Рис. 2.7. Влияние интенсивности света на активность глютатионпероксидазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных при дефиците цинка:

для ячменя: I1 = 160 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 520 мкмоль м–2 • с–1; для капусты китайской: I1 = 290 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 680 мкмоль м–2 • с–1

Как видно из представленных данных, активность глютатионпероксидазы в листьях ячменя уменьшилась на 33 %, а в листьях капусты китайской на 29 % после облучения растений светом высокой интенсивности. Минеральное питание

Изучено влияния селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). Несмотря на то что до сегодняшнего дня отсутствуют данные, подтверждающие наличие селенсодержащей глютатионпероксидазы в высших растениях, за последнее время получены многочисленные данные, свидетельствующие о повышении активности 37

É·‚‡ 2

Активность ГПО, отн. ед. / г белка • мин

ГПО под действием селена (Hartikainen et al., 2000; Xue et al., 2001; Xu et al., 2003; Seppaenen et al., 2003; Djanaguiraman et al., 2005). Полученные нами результаты подтвердили значительную роль селена в функционировании данного фермента. Максимальная активность ГПО была установлена в растениях ячменя, выращенных на питательной среде с добавлением селена (рис. 2.8). Активность глютатионпероксидазы в данных вариантах была практически в 1,5—2 раза выше. 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.8. Влияние селена и цинка на активность глютатионпероксидазы в листьях ячменя

Кроме того, проводилось исследование влияния селена и цинка на активность каталазы в растениях ячменя и китайской капусты, подвергнутых действию света высокой интенсивности (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008). Результаты проведенных экспериментов показали, что при исключении из питательной среды микроэлемента цинка активность глютатионпероксидазы в листьях капусты китайской снижалась примерно на 12 %, в листьях ячменя — на 9 % (рис. 2.9, 2.10). Наиболее высокая активность фермента наблюдалась в растениях, выращенных на питательной среде, содержащей селен. При этом селен проявлял положительное 38

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

действие как при наличии цинка в питательной среде, так и — особенно — при его отсутствии.

Активность ГПО, отн. ед. / г белка · мин

3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Активность ГПО, отн. ед. / г белка · мин

Рис. 2.9. Влияние селена и цинка на активность глютатионпероксидазы в растениях капусты китайской на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 680 мкмоль м–2 • с–1) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.10. Влияние селена и цинка на активность глютатионпероксидазы в растениях ячменя на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 520 мкмоль м–2 • с–1) 39

É·‚‡ 2

2.4. îÂрÏÂÌÚ˚ ‡ÒÍÓр·‡Ú-„βڇÚËÓÌÓ‚Ó„Ó ˆËÍ·

Аскорбатпероксидаза — АПО (КФ 1.11.1.11), присутствуя в растениях в нескольких изоформах, участвует в реакции восстановления пероксида водорода аскорбиновой кислотой в хлоропластах (Groden, Beck, 1979; Nakano, Asada, 1981; Shigeoka et al., 2002; Mittler, 2002). В результате данной реакции образуется монодегидроаскорбат, который спонтанно диспропорционирует с образованием аскорбата и дегидроаскорбата. А также он может ферментативно восстанавливаться НАД(Ф)Н-зависимой монодегидроаскорбатредуктазой до аскорбиновой кислоты. Образовавшийся дегидроаскорбат под действием дегидроаскорбатредуктазы взаимодействует с восстановленным глютатионом и превращается в аскорбиновую кислоту. Окисленный глютатион регенируется глютатионредуктазой. Таким образом, аскорбатпероксидаза вместе с другими компонентами аскорбат-глютатионого цикла эффективно защищает клетки от токсического действия избыточных количеств Н2О2 (Asada, 1992; Mittler, 2002). Кроме того, тилакоидно-связанная АПО участвует в водно-водном цикле по утилизации АФК (Asada, 1999). Всего в растениях выявлено четыре изоформы АПО: две формы, находящиеся в хлоропластах (тилакоидно-связанная аскорбатпероксидаза (тАПО) и растворенная в строме (сАПО)), а также связанная с микротелами (в том числе глиоксомами и пероксисомами) аскорбатпероксидаза (мАПО) и цитозольная аскорбатпероксидаза (цАПО) (Chen, Asada, 1989; Miyake et al., 1993; Yamaguchi et al., 1995; Bunkelmann, Trelease, 1996; Ishikawa et al., 1996, 1998). Дегидроаскорбатредуктаза — ДГАР (КФ 1.8.5.1) — важный элемент ферментативной антиоксидантной системы растений, участвующий в аскорбат-глютатионовом цикле по ликвидации излишних количеств АФК. ДГАР восстанавливает дегидроаскорбат в аскорбиновую кислоту, используя в качестве донора электрона восстановленный глютатион (Hossain, Asada, 1984). В отличие от остальных ферментов, участвующих в ликвидации Н2О2, ДГАР изучена плохо, что частично может быть объяснено ее низкой стабильностью (Truemper et al., 40

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

1994). Вместе с тем дегидроаскорбатредуктаза была обнаружена как в растительных, так и в животных клетках (Wells et al., 1990; Xu et al., 1996; Dipierro, Borraccino, 1991; Foyer, Mullineaux, 1998; Hou et al., 2000; Foyer, Noctor, 2005). Антиоксидантная роль дегидроаскобатредуктазы определяется, прежде всего, ее участием в регерации аскорбиновой кислоты. (Chen, Gallie, 2006). Монодегидроаскорбатредуктаза — МДГАР (КФ 1.6.5.4) — фермент, участвующий в восстановлении монодегидроаскорбата до аскорбиновой кислоты: 2 МДАК + НАДН + Н+ → 2АК + НАД+. В растениях МДГАР локализована в различных частях клетки — хлоропластах, цитозоле, митохондриях, пероксисомах. Кроме участия в поддержании постоянного уровня восстановленной аскорбиновой кислоты монодегидроаскорбатредуктаза выступает посредником в реакции фотовосстановления супероксидного анион-радикала в хлоропластах клетки (Miyake et al., 1998). Влияние экологических факторов на активность ферментов аскорбат-глютатионового цикла Свет

Реакция ферментов аскорбат-глютатионового цикла на стресс, вызванный светом высокой интенсивности, может быть различной и зависит от продолжительности действия стрессового фактора и вида растения. Изучение влияния света высокой интенсивности (I = = 360 мкмоль м–2 • с–1) на активность антиоксидантных ферментов в растениях табака показало, что уже через 24 часа после начала действия стрессового фактора активность аскорбатпероксидазы резко повышалась (почти на 20 %). На 4-й день эксперимента активность АПО была максимальной, превышая контрольные значения более чем в 2 раза. Активность дегидроаскорбатредуктазы и монодегидроаскорбатредуктазы не менялась (Gechev et al., 2003). 41

É·‚‡ 2

В работе по изучению роли антиоксидантов при акклиматизации растений бегонии к высокоинтенсивному свету также было установлено повышение активности АПО уже через 24 часа после начала световой экспозиции. При этом активность ДГАР и МДГАР также увеличивалась, хотя и не столь резко (Burritt, Mackenzie, 2003). Выявлена активация аскорбатпероксидазы при облучении растений УФ-В светом (Kubo et al., 1999; Махдавиан и др., 2008). В нашей работе, посвященной изучению влияния света высокой интенсивности (I = 520 мкмоль м–2 • с–1) на антиоксидантную систему растений ячменя, было установлено повышение активности аскорбатпероксидазы и дегидроаскорбатредуктазы в растениях после 12-часовой световой экспозиции на 10 и 16 % соответственно (Скрыпник, Чупахина, 2007). Однако изучение действия света высокой интенсивности на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных в условиях дефицита цинка, показало снижение активности фермента после 12-часовой световой экспозиции (рис. 2.11) (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008). I1

Активность ДГАР, отн. ед. / г белка • мин

7,00

I2

6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 ячмень

капуста китайская

Рис. 2.11. Влияние интенсивности света на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя и капусты китайской, выращенных при дефиците цинка: для ячменя: I1 = 160 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 520 мкмоль м–2 • с–1; для капусты китайской: I1 = 290 мкмоль м–2 • с–1, I2 = 680 мкмоль м–2 • с–1 42

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

Как видно из представленных данных, активность каталазы в листьях ячменя уменьшилась на 12 %, а в листьях капусты китайской менее чем на 10 % после облучения растений светом высокой интенсивности. Температура

Показана важная роль аскорбатпероксидазы в нейтрализации пероксида водорода, активно образующегося в клетках в первые часы холодового повреждения растений. Близкая к нулю температура (2 °С) оказывала значительное влияние на активность АПО в листьях ячменя, максимальное значение которой наблюдали уже через 8 часов действия стрессового фактора. Затем активность АПО снижалась и в постстрессовый период не отличалась от значений, зарегистрированных в контрольных растениях (Радюк и др., 2009). Исследовалось действие низких положительных температур (2 °С, 24 часа) на активность антиоксидантных ферментов растений с различной степенью холодоустойчивости. Автором было установлено незначительное изменение активности АПО у различных видов растений при выдерживании их при температуре 2 °С (Лукаткин, 2002). Было выявлено снижение активности АПО, ДГАР и МДГАР при действии на растения табака низких положительных температур (5 °С, 4 дня) на 45, 62 и 43 % соответственно (Gechev et al., 2003). Однако имеются данные о повышении активности аскорбатпероксидазы в листьях Arabidopsis thaliana (L.) при действии на растения низких положительных температур (5 °С) и отсутствии достоверного изменения активности ДГАР и МДГАР в растениях при данных условиях (Kubo et al., 1999). Минеральное питание

Ферменты аскорбат-глютатионового цикла по-разному реагируют на нарушение минерального питания растений. Выявлено увеличение активности АПО и МДГАР на 80 и 90 % соответственно при недостаточном обеспечении расте43

É·‚‡ 2

ний ели обыкновенной марганцем. Достоверного же изменения в активности ДГАР в данном эксперименте установлено не было (Polle et al., 1992). Кроме того, установлено значительное увеличение активности аскорбатпероксидазы и дегидроаскорбатредуктазы в листьях фасоли, выращенной при дефиците магния. Уровень активности АПО в Mg-дефицитных растениях был более чем в 7 раз, а ДГАР-дефицитных более чем в 3 раза выше, чем в контрольных растениях (Cakmak, Marschner, 1992). В нашей работе проводилось изучение влияния селена и цинка на активность аскорбатпероксидазы и дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя (Скрыпник, Чупахина, 2007). Как показали результаты исследования, при исключении из питательной среды цинка активность АПО снизилась на 25 % (рис. 2.12). Добавление в питательную среду селена способствовало повышению активности АПО. Однако данный эффект наблюдался только при цинковом дефиците, так как добавление селена в Zn-содержащую питательную среду приводило к уменьшению активности аскорбатпероксидазы в исследуемых растениях.

Активность АПО, отн. ед. / г белка • мин

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.12. Влияние селена и цинка на активность аскорбатпероксидазы в листьях ячменя 44

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

Активность дегидроаскорбатредуктазы также снижалась при исключении из питательной среды цинка (рис. 2.13). Добавление же селена положительно сказывалось на функционировании данного фермента, увеличивая его активность до исходного уровня.

Активность ДГАР, отн. ед. / г белка • мин

10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.13. Влияние селена и цинка на активность дегидроаскорбатредуктазы в листьях ячменя

Кроме того, проводилось исследование влияния селена и цинка на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя и китайской капусты, подвергнутых действию света высокой интенсивности (рис. 2.14—2.15) (Скрыпник, Чупахина, 2007; 2008). В ходе исследования было установлено положительное влияние микроэлемента селена на активность дегидроаскорбатредуктазы как в растениях капусты китайской, так и в растениях ячменя. 45

É·‚‡ 2

8,0 Активность ДГАР, отн. ед. / г белка • мин

7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.14. Влияние селена и цинка на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях капусты китайской на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 680 мкмоль м–2 • с–1)

Активность ДГАР, отн. ед. / г белка • мин

12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 –Se; +Zn

–Se; –Zn

+Se; –Zn

+Se; +Zn

Рис. 2.15. Влияние селена и цинка на активность дегидроаскорбатредуктазы в растениях ячменя на фоне окислительного стресса, вызванного светом высокой интенсивности (I света = 520 мкмоль м–2 • с–1) 46

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

Действие тяжелых металлов

Выявлено снижение активности АПО и ДГАР в листьях тыквы обыкновенной, выращенной на питательной среде, содержащей 10 мМ меди. Активность АПО уменьшилась в 3 раза, ДГАР — более чем в 2 раза по сравнению с контрольным вариантом (El-Shora, 2003). Уменьшение активности аскорбатпероксидазы при воздействии на растения тяжелых металлов наблюдали также в работе, посвященной изучению влияния никеля (0,25 мМ) на антиоксидантную систему растений сои (Саиди-Саир и др., 2007). Исследовано влияние различных концентраций цинка (1—1000 мкмоль/л) на систему антиоксидантной защиты в корнях Sedum alfredii двух экотипов: гипераккумуляторов цинка (ГА) и не аккумулирующих цинк растений (НА). Активности АПО в корнях НА заметно повышались при более низких концентрациях (максимум при 250 мкМ), а при дальнейшем повышении концентрации Zn снижалась. В то же время в корнях ГА значительное повышение активности АПО наблюдали даже при 1000 мкМ (активность превышала контроль в 2,1 раза). Тот факт, что высокая активность аскорбатпероксидазы в ГА коррелирует с большей биомассой и высокими концентрациями Zn в растениях, предполагает роль этого фермента в поддержании роста растений при загрязнении почвы тяжелыми металлами (Ли и др., 2008). Солевой стресс

Имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют о важной роли ферментов аскорбат-глютатионового цикла при адаптации растений к солевому стрессу. Так, в работе Ф. Ясар и соавторов наблюдали значительное повышение активности аскорбатпероксидазы в растениях фасоли — как солеустойчивого сорта, так чувствительного к засолению. Однако скорость повышения активности АПО была выше в растениях, устойчивых к засолению (Ясар и др., 2008). Вероятно, повышение активности аскорбатпероксидазы при адаптации растений к солевому стрессу и обеспечивает их устойчивость к засолению. 47

É·‚‡ 2

Было установлено (Полесская и др., 2006), что изменение активности аскорбатпероксидазы в листьях и корнях растений пшеницы при солевом стрессе зависело и от азотного питания растений. Так, активность АПО значительно возрастала в листьях NH +4 -растений, падала у NO 3− -растений и достоверно не изменялась у N-дефицитных растений. В корнях исследуемых растений наблюдали уменьшение активности аскорбатпероксидазы, особенно у NO 3− -растений. У листьев NO 3− -растений при засолении признаки окислительного стресса были выражены намного сильнее, что коррелировало со снижением активности АПО. Устойчивость же NH +4 -растений к солевому стрессу, возможно, связана именно с быстрой мобилизацией и активацией аскорбатпероксидазы. 2.5. ÉβڇÚËÓÌр‰ÛÍÚ‡Á‡

Глютатионредуктаза — ГР (КФ 1.6.4.2) — важный фермент системы антиоксидантной защиты растений. Она катализирует восстановление дисульфидной связи окисленного глютатиона GSSG до его сульфгидрильной формы GSH. Восстановление глютатиона происходит за счет энергии НАДФ-Н, образующегося в пентозном цикле: GSSG + НАДФН + Н+ → 2GSH + НАДФ+. В растениях имеется четыре изоформы глютатионредуктазы, которые ассоциированы с разными клеточными компартментами. Наибольшее количество этого фермента находится в хлоропластах, выявлены изоэнзимы ГР в цитозоле и митохондриях (Romero-Puertas et al., 2006). Влияние экологических факторов на активность глютатионредуктазы Свет

В работе, посвященной изучению адаптационных механизмов растений к высокоинтенсивному свету, было показано, что активность глютатионредуктазы увеличивается при экспо48

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

зиции растений бегонии на свету повышенной интенсивности (I = 155 мкмоль м–2 • с–1) (Burritt, Mackenzie, 2003). Однако большее число работ свидетельствует об инвариантности активности глютатионредуктазы в растениях, подвергнутых действию света высокой интенсивности. Так, не выявлено достоверного изменения активности глютатионредуктазы в растениях фасоли, на которые воздействовали светом высокой интенсивности (580 мкмоль м–2 • с–1) (Cakmak, Marschner, 1992). Аналогичный результат получен и в работе по изучению действия света высокой интенсивности (I = = 360 мкмоль м–2 • с–1) на активность антиоксидантных ферментов в растениях табака (Gechev et al., 2003). Не выявлено достоверного изменения активности ГР в листьях растений Arabidopsis thaliana (L.) при увеличении интенсивности света до 200 мкмоль м–2 • с–1. Однако некоторыми исследователями было зафиксировано резкое повышение активности фермента при действии на растения УФ-излучения (Kubo et al., 1999). Температура

Изучалось действие низких положительных температур на активность антиоксидантных ферментов в листьях ячменя. Близкая к нулю температура (2 °С) оказывала значительное влияние на активность ГР. Активность ГР быстро возрастала в первые 8 часов действия стресса, после чего следовало более медленное увеличение ее активности, которая к концу стрессового периода на 60 % превышала первоначальное значение. После снятия стресса активность ГР снижалась до исходного уровня (Радюк и др., 2009). Сходный результат получен и в работе (Kubo et al., 1999), где было показано увеличение активности ГР в листьях растений Arabidopsis thaliana (L.) при воздействии на них низких положительных температур (5 °С, 7 дней). Однако имеются данные о снижении активности глютатионредуктазы в листьях табака при действии на растения низких положительных температур (5 °С, 4 дня) (Gechev et al., 2003). 49

É·‚‡ 2

Минеральное питание

На сегодняшний день имеются противоречивые данные о роли глютатиоредуктазы при стрессе, вызванном дефицитом макро- и микроэлементов. Например, было выявлено значительное увеличение активности глютатионредуктазы в листьях фасоли, выращенной при дефиците магния. Активность ГР повышалась более чем в 3 раза по сравнению с контрольными значениями (Cakmak, Marschner, 1992). Вместе с тем достоверного изменения активности ГР в хвое ели обыкновенной при дефиците марганца выявлено не было (Polle et al., 1999). Действие тяжелых металлов

Изучение влияния меди на антиоксидантный статус листьев растений тыквы обыкновенной, выращенной на питательной среде, содержащей 10 мМ меди, показало снижение активности глютатионредуктазы более чем в 1,5 раза под действием меди по сравнению с контрольным вариантом (El-Shora, 2003). Солевой стресс

Изучено влияния азотного питания на развитие окислительного стресса и изменение антиоксидантного статуса в растениях пшеницы, выращенной в условиях сильного засоления. Выявлено увеличение активности глютатионредуктазы в листьях пшеницы независимо от азотного питания. В корнях же исследуемых растений наблюдали уменьшение активности фермента в N-дефицитных растениях и увеличение в NH +4 -растениях. В NO 3− -растениях достоверного изменения активности ГР в корнях растений при солевом стрессе выявлено не было (Полесская и др., 2006). Исследовано действие высоких концентраций хлорида натрия (100 мМ) на антиоксидантный статус двух сортов топинамбура, отличающихся устойчивостью к засолению. Авторами было выявлено повышение активности глютатионредук50

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

тазы в растениях топинамбура устойчивого к засолению сорта и понижение в растениях сорта, чувствительного к солевому стрессу сорта (Ясар и др., 2008). ***

Различные аспекты действия экологических факторов на антиоксидантную систему растений, в том числе на активность антиоксидантных ферментов, становятся в последнее время объектом изучения многих исследований. В большинстве работ изучается ответная реакция таких антиоксидантных ферментов, как каталазы, супероксиддисмутазы, аскорбатпероксидазы, тогда как изучению действия экологических факторов на активность глютатионпероксидазы и монодегидроаскорбатредуктазы посвящено незначительное количество работ. Основные экологические факторы, привлекающие внимание исследователей, — свет, температура, минеральное питание. При этом, как правило, изучается действие полихроматического света различной интенсивности и УФ-света, в то время как действие монохроматического света не исследовалось. Анализ работ, посвященных изучению ответной реакции ферментов антиоксидантной системы растений на действие различных экологических факторов, позволил выявить противоречия. Так, практически для всех ферментов была выявлена различная реакция на один и тот же экологический фактор, например свет высокой интенсивности. Такие противоречия, вероятно, связаны с различиями в методиках эксперимента, видовой специфичностью используемых в работе растений, различной интенсивностью и продолжительностью действия фактора. Кроме того, остается малоизученным вопрос о механизмах ответной реакции антиоксидантной ферментативной системы растений на различные экологические факторы. 51

É·‚‡ 2

ÅË·ÎËÓ„р‡Ù˘ÂÒÍËÈ ÒÔËÒÓÍ

1. Бараненко В. В. Супероксиддисмутаза в клетках растений // Цитология. 2006. № 6. С. 465—474. 2. Деви С. Р., Прасад М. Н. В. Антиокислительная активность растений Brassica juncea, подвергнутых действию высоких концентраций меди // Физиология растений. 2005. № 3. С. 233—237. 3. Демин И. Н., Дерябин А. Н., Синькевич М. С. и др. Введение гена desA Δ12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии повышает устойчивость растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному гипотермией // Физиология растений. 2008. № 5. С. 710—720. 4. Дерябин А. Н., Синькевич М. С., Дубинина И. М. и др. Влияние сахаров на развитие окислительного стресса, вызванного гипотермией (на примере растений картофеля, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей) // Физиология растений. 2007. № 4. С. 39—46. 5. Карташов А. В., Радюкина Н. Л., Иванов Ю. В. и др. Роль систем антиоксидантной защиты при адаптации дикорастущих видов растений к солевому стрессу // Физиология растений. 2008. № 4. С. 516—522. 6. Кения М. В., Лукаш А. И., Гуськов Е. П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи современной биологии. 1993. Т. 113. С. 456—470. 7. Ли Т. К., Лу Л. Л., Жу Е. и др. Антиоксидантная система в корнях двух контрастных экотипов Sedum alfredii при повышенных концентрациях цинка // Физиология растений. 2008. № 6. С. 886—894. 8. Лиу Д., Ли Т. Ц., Ян С. Е. и др. Влияние свинца на активность ферментов антиоксидантной защиты и ультраструктуру листьев у двух экотипов Sedum alfredii Hance // Физиология растений. 2008. № 1. С. 73—82. 9. Лукаткин А. С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 2: Активность антиоксидантных ферментов в динамике охлаждения // Физиология растений. 2002. № 6. С. 878—885. 10. Махдавиан К., Горбанли М., Калантари Х. М. Влияние салициловой кислоты на формирование окислительного стресса, индуцированного УФ-светом, в листьях перца // Физиология растений. 2008. № 4. С. 620—623. 11. Мерзляк М. Н. Пигменты, оптика листа и состояние растений // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 4. С. 19—24. 12. Племенков В. В. Введение в химию природных соединений. Казань, 2001. 52

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

13. Полесская О. Г., Каширина Е. И., Алехина Н. Д. Влияние солевого стресса на антиоксидантную систему растений в зависимости от условий азотного питания // Физиология растений. 2006. № 2. С. 207—214. 14. Попов В. Н., Кипайкина Н. В., Астахова Н. В. и др. Особенности окислительного стресса растений табака, трансформированных геном desC Д9-ацил-липидной десатуразы из Synechococcus vulcanus, при гипотермии // Физиология растений. 2006. № 4. С. 525—529. 15. Радюк М. С., Доманская И. Н., Щербаков Р. А. и др. Влияние низкой положительной температуры на содержание низкомолекулярных антиоксидантов и активность антиоксидантных ферментов в зеленых листьях ячменя // Физиология растений. 2009. № 2. С. 193—199. 16. Романова Е. В. Ферменты в антиокислительной системе растений: супероксиддисмутаза // АгроXXI. 2008. № 7—9. С. 27—30. 17. Саиди-Саир С., Хавари-Неджад Р. А., Фахими Х. и др. Совместное влияние гиббереловой и аскорбиновой кислот на перекисное окисление липидов и активность антиокислительных ферментов в проростках сои при обработке никелем // Физиология растений. 2007. № 1. С. 85—91. 18. Скрыпник Л. Н., Чупахина Г. Н. Микроэлемент селен и устойчивость растений ячменя к окислительному стрессу, вызванному светом повышенной интенсивности и дефицитом цинка // Регуляция роста, развития и продуктивности растений: материалы V Международной научной конференции, г. Минск, 28—30 ноября 2007. Минск: ИООО «Право и экономика», 2007. С. 186. 19. Скрыпник Л. Н., Чупахина Г. Н. Влияние селена на активность антиоксидантных ферментов в растениях китайский капусты // Сборник материалов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11—15 мая 2008. Новосибирск: Арта, 2008. С. 509. 20. Ху Ц. Ц., Ши Г. С., Су Ц. С. и др. Воздействие Pb2+ на активность антиоксидантных ферментов и ультраструктуру клеток листьев Potamogeton crispus // Физиология растений. 2007. № 3. С. 469—474. 21. Ху Ю. Ф., Лиу Ж. П. Ферменты антиоксидантной защиты и физиологические характеристики двух сортов топинамбура при солевом стрессе // Физиология растений. 2008. № 6. С. 863—868. 22. Ясар Ф., Элиальтиглу C., Ильдис К. Действие засоления на антиоксилительные защитные системы, перекисное окисление липидов и содержание хлорофилла в листьях фасоли // Физиология растений. 2008. № 6. С. 869—873. 23. Arora A., Sairam R. K., Srivastata G. S. Oxidative stress and antioxidative system in plants // Current Science. 2002. Vol. 82. P. 1227—1238. 53

É·‚‡ 2

24. Asada K. Ascorbate peroxidase: a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants // Physiol. Plant. 1992. Vol. 85. P. 235—241. 25. Asada K. Production and action of active oxygen species in photosynthetic tissue // Foyer C. H., Mullineaux P. (hrsg.). Photooxidative stresses in plants: Causes and Amelioration. CRC Press, Inc. Boca Raton; 1994. P. 77—104. 26. Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. Vol. 50. P. 601—639. 27. Baker C. J., Orlandi E. W. Active oxygen in plant pathogenesis // Annu. Rev. Phytopathol. 1995. Vol. 33. P. 299—321. 28. Bowler C., Van Montagu M., Inze D. Superoxide dismutase and dtress tolerance // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant mol. Biol. 1992. Vol. 43. P. 83—116. 29. Brigelius-Flohe R., Aumann K. D., Bloecker H. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 7342—7348. 30. Bunkelmann J. R., Trelease R. N. Ascorbate peroxidase: a prominent membrane protein in oilseed glyoxysomes // Plant Physiol. 1996. Vol. 110. P. 589—598. 31. Burrit D. J., Mackenzie S. Antioxidant metabolism during acclimation of Begonia x erythrophylla to high light levels // Ann. Bot. 2003. Vol. 91. P. 783—794. 32. Cakmak I. Possible roles of zinc in protecting plant cells from damage by reactive oxygen species // Rev. New Phytol. 2000. Vol. 146. P. 185—205. 33. Cakmak I., Marschner H. Magnesium deficiency and high light intensity enhance activities of Superoxide Dismutase, Ascorbate Peroxidase and Glutathione Reduktase in Bean leaves // Plant Physiol. 1992. Vol. 98. P. 1222—1227. 34. Chamnongpol S., Willekens H., Langebartels C. et al. Transgenic tobacco with a reduced catalase activity develops necrotic lesions and induces pathogenesis-related expression under high light // Plant J. 1996. Vol. 10. P. 491—503. 35. Chen G.-X., Asada K. Ascorbate peroxidase in tea leaves: occurrence of two isozymes and the differences in their enzymatic and molecular properties // Plant Cell Physiol. 1989. Vol. 30. P. 987—998. 36. Chen S., Vaghchhipawala Z., Li W. et al. Tomato Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase Inhibits Cell Death Induced by Bax and Oxidative Stresses in Yeast and Plants // Plant Physiol. 2004. Vol. 135. P. 1630—1641. 54

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

37. Chen Z., Gallie D. R. Dehydroascorbate Reductase Affects Leaf Growth, Development, and Function // Plant Physiol. 2006. Vol. 142. P. 775—787. 38. Chouliaras V., Therios I., Molassiotis A. et al. Effect of iron deficiency on gas exchange and catalase and peroxidase activity in citrus // J. Plant Nutr. 2004. Vol. 27. P. 2085—2099. 39. Corpas F. J., Sandalio L. M., Del Rio L. A. et al. Copper-zinc cuperoxide dismutase is a constituent enzyme of the matrix of peroxisomes in the cotyledons of oilseed plants // New Phytol. 1998. Vol. 138. P. 307—314. 40. Del Rio L. A., Sandalio L. M., Altomare D. et al. Mitochondria and peroxisomal manganese superoxide dismutase: different expression during leaf senescence // J. Exp. Bot. 2003. Vol. 54. P. 923—933. 41. Depege N., Drevet J., Boyer N. Molecular cloning and characterization of tomato cDNAs encoding glutathione peroxidase-like proteins // Eur. J. Biochem. 1998. Vol. 253. P. 445—451. 42. Dipierro S., Borraccino G. Dehydroascorbate reductase from potato tubers // Phytochemistry. 1991. Vol. 30. P. 427—429. 43. Djanaguiraman M., Durga Devi D., Shanker Arun K. et al. Selenium — an antioxidative protectant in soybean during senescence // Plant Soil. 2005. Vol. 272. P. 77—86. 44. Droillard M., Paulin A. Isozymes of superoxide dismutase in mitochondria and peroxisomes isolated from petals of carnation {Dianthus caryophyllus) during senescence // Plant Physiol. 1990. Vol. 94. P. 1187—1192. 45. El-Shora H. M. Activities of antioxidative enzymes and senescence in detached Cucurbita pepo under Cu- and Oxidative stress by H2O2 // Вестник Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2003. Т. 44. C. 66—71. 46. Eshdat Y., Holland D., Faltin Z. et al. Plant glutathione peroxidases // Physiol. Plant. 1997. Vol. 100. P. 234—240. 47. Foyer C. H., Descourvieres P., Kunert K. J. Protection against oxygen radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants // Cell Plant Envir. 1994. Vol. 17. P. 507—523. 48. Foyer C. H., Mullineaux P. M. The presence of dehydroascorbate and dehydroascorbate reductase in plant tissues // FEBS Lett. 1998. Vol. 425. P. 528—529. 49. Foyer C. H., Noctor G. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a re-evaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context // Plant Cell Envir. 2005. Vol. 28. P. 1056—1071. 50. Fridovich I. Biological effects of the superoxide radical // Arch Biochem Biophys. 1986. Vol. 247. P. 1—11. 55

É·‚‡ 2

51. Gechev T., Willekens H., Van Montagu M. et al. Different responses of tobacco antioxidant enzymes to light and chilling stress // J. Plant Physiol. 2003. Vol. 160. P. 509—515. 52. Giannopolitis C. N., Ries S. K. Superoxide Dismutases. I. Occurrence in higher plants // Plant Physiol. 1977. Vol. 59. P. 309—314. 53. Gomez J., Jimenez A., Olmos E. et al. Location and effects of long-term NaCl stress on superoxide dismitase and ascorbate peroxidase isoenzymes of pea (Pisum sativum, cv. Puget) chloroplasts // J. Exp. Bot. 2004. Vol. 55. P. 119—130. 54. Groden D., Beck E. H2O2 destruction by ascorbate-dependent systems from chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 546. P. 426—435. 55. Hartikainen H., Xue T., Piironen V. Selenium as an anti-oxidant and pro-oxidant in ryegrass // Plant Soil. 2000. Vol. 225. P. 193—200. 56. Hayakawa T., Kanematsu S., Asada K. Occurrence of CuZn-superoxide dismutase in the thylakoid space of spinach chloroplasts // Plant Cell Physiol. 1984. Vol. 25. P. 883—889. 57. Hossain M. A., Asada K. Purification of dehydroascorbate reductase from spinach and its characterization as a thiol enzyme // Plant Cell Physiol. 1984. Vol. 25. P. 85—92. 58. Hou W.-C., Wang Y.-T., Lin Y.-H. et al. A complex containing both trypsin inhibitor and dehydroascorbate reductase activities isolated from mitochondria of etiolated mung bean (Vigna radiata L. (Wilczek) cv. Tainan No. 5) seedlings // J. Exp. Bot. 2000. Vol. 51. P. 713—719. 59. Ishikawa T., Takeda T., Shigeoka S. Purification and characterization of cytosolic ascorbate peroxidase from Komatsuna (Brassica rapa) // Plant Sci. 1996. Vol. 120. P. 11—18. 60. Ishikawa T., Yoshimura K., Sakai K. et al. Molecular characterization and physiological role of a glyoxysome-bound ascorbate peroxidase from spinach. // Plant Cell Physiol. 1998. Vol. 39. P. 23—34. 61. Kubo A., Aono M., Nakajima N. et al. Differential responses in activity of antioxidant enzymes to different environmental stresses in Arabidopsis thaliana // J. Plant Res. 1999. Vol. 112. P. 279—290. 62. Kuehn H., Borschert A. Regulation of enzymatic lipid peroxidation: the interplay of peroxidizing and peroxide reducing enzymes // Free Rad. Biol. Med. 2002. Vol. 33. P. 154—172. 63. Mittler R. Oxidative stress. antioxidants and stress tolerance // Trends Plant Sci. 2002. Vol. 7. P. 405—410. 64. Mittova V., Tal M., Volokita M. et al. Up-regulation of the leaf motochondrial and peroxisomal antioxidative systems in response to salt56

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

induced oxidative stress in the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii // Plant, Cell Envir. 2003. Vol. 26. P. 845—856. 65. Miyake C., Cao W.-H., Asada K. Purification and molecular properties of thylakoid-bound ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts // Plant Cell Physiol. 1993. Vol. 34. P. 881—889. 66. Miyake C., Schreiber U., Hormann H. et al. The FAD-enzyme monodehydroascorbate radical reductase mediates photoproduction of superoxide radicals in spinach thylakoid membranes // Plant Cell Physiol. 1998. Vol. 39. P. 821—829. 67. Moran J. F., James E. K, Rubio M. C. et al. Functional characterization and expression of a cytosolic iron-superoxide dismutase from cowpea root nodules // Plant Physiol. 2003. Vol. 133. P. 773—782. 68. Nakano Y., Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts // Plant and Cell Physiology. 1981. Vol. 22. P. 867—880. 69. Navrot N., Collin V., Gualberto J. et al. Plant Glutathione Peroxidases Are Functional Peroxiredoxins Distributed in Several Subcellular Compartments and Regulated during Biotic and Abiotic Stresses // Plant Physiol. 2006. Vol. 142. P. 1364—1379. 70. Nicholas D. J.D., Goodman T. The Effects of Deficiencies of Zinc and Iron on Some Enzyme Systems in Neurospora // J. Exp. Bot. 1958. Vol. 9. P. 97—108. 71. Ogawa K., Kanematsu S., Asada K. Generation of superoxide anion and localuzation of CuZn-superoxide dismutase in vascular tissue of spinach hypocotyls: their association with lignifi-cation // Plant Cell Physiol. 1997. Vol. 38. P. 1118—1126. 72. Ogawa K., Kanematsu S., Asada K. Intra and extra-cellular localization of «cytosolic» CuZn-superoxide dismutase in spinach leaf and hypocotyls // Plant Cell Physiol. 1996. Vol. 37. P. 790—799. 73. Ogawa K., Kanematsu S., Takabe K. et al. Attachment of CuZnsuperoxide dismutase to thylakoid membrane at the site of superoxide generation (PSI) in spinach chloroplast: detection by immunogold labeling after rapid freezing and substitution method // Plant Cell Physiol. 1995. Vol. 36. P. 565—573. 74. Panda S. K., Khan M. H. Changes in growth and superoxide dismutase activity in Hydrilla verticillata L. under abiotic stress // Braz. J. Plant Physiol. 2004. Vol. 16. P. 115—118. 75. Polle A. Dissecting the Superoxide Dismutase-Ascorbate-Glutathione-Pathway in Chloroplasts by Metabolic Modeling. Computer Simulations as a Step towards Flux Analysis // Plant Physiol. 2001. Vol. 126. P. 445—462. 57

É·‚‡ 2

76. Polle A., Chakrabarti K., Chakrabarti S. et al. Antioxidants and Manganese Deficiency in Needles of Norway Spruce (Picea abies L.) Trees // Plant Physiol. 1992. Vol. 99. P. 1084—1089. 77. Roeckel-Drevet P., Gagne G., de Labrouhe D. et al. Molecular characterization, organ distribution and stress-mediated induction of two glutathione peroxidase-encoding mRNAs in sunflower (Helianthus annuus) // Physiol. Plant. 1998. Vol. 103. P. 385—394. 78. Romero-Puertas M. C., Corpas F. J., Sandalio L. M. et al. Glutathione reductase from pea leaves: response to abiotic stress and characterization of the peroxisomal isozyme // New Phytologist. 2006. Vol. 170. P. 43—52. 79. Sandalio L. M., Del Rio L. A. Localization of superoxide dismutase in glyoxysomes from Citrullus vulgaris. Functional implications in cellular metabolism // J. Plant Physiol. 1987. Vol. 127. P. 395—409. 80. Scandalios J. G. Oxygen Stress and Superoxide Dismutases // Plant Physiol. 1993. Vol. 101. P. 7—12. 81. Seppaenen M., Turakainen M., Hartikainen H. Selenium effects on oxidative stress in potato // Plant Sci. 2003. Vol. 165. P. 311—319. 82. Shigeoka S., Ishikawa T., Tamoi1 M. et al. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes // J. Exp. Bot. 2002. Vol. 53. P. 1305—1319. 83. Streb P., Feierabend J. Oxidative stress responses accompanying photoinactivation of catalase in NaCl-treated rye-leaves // Botan. Acta. 1996. Vol. 109. P. 125—132. 84. Tamas L., Huttova J., Mistrik I. et al. Aluminium-induced drought and oxidative stress in barley roots // J. Plant Physiol. 2006. Vol. 163. P. 781—784. 85. Truemper S., Follmann H., Haeberlein I. A novel dehydroascorbate reductase from spinach chloroplasts homologous to plant trypsin inhibitor // FEBS Lett. 1994. Vol. 352. P. 159—162. 86. Ursini F., Bindoli A. The role of selenium peroxidase in the protection against oxidative damage of membranes // Chem. Phys. Lipids. 1987. Vol. 44. P. 255—276. 87. Wells W. W., Xu D. P., Yang Y. et al. Mammalian thioltransferase (glutaredoxin) and protein disulfide isomerase have dehydroascorbate reductase activity // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 15351—15364. 88. Willekens H., Inze D., van Montagu M. et al. Catalases in plants // Mol. Breed. 1995. Vol. 1. P. 207—228. 89. Willekens H., van Camp W., van Montagu M. et al. Ozone, sulfur dioxide, and ultraviolet B have similar effects on mRNA accumulation 58

îÂрÏÂÌÚ‡Ú˂̇fl ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ̇fl ÒËÒÚÂχ р‡ÒÚÂÌËÈ

of antioxidant genes in Nicotiana plumbaginifolia L. // Plant Physiol. 1994. Vol. 106. P. 1007—1014. 90. Xu D. P., Washburn M. P., Sun G. P. et al. Purification and characterization of a glutathione dependent dehydroascorbate reductase from human erythrocytes // Biochem Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 221. P. 117—121. 91. Xu J., Yang F., Chen L. et al. Effects of selenium on increasing the antioxidant activity of tea leaves harvested during early spring tea producing season // J. Agric. Food Chem. 2003. Vol. 51. P. 1081—1084. 92. Xue T., Hartikainen H., Piironen V. Antioxidative and growthpromoting effect of selenium on senescing lettuce // Plant Soil. 2001. Vol. 237. P. 55—61. 93. Yamaguchi K., Mori H., Nishimura M. A novel isoenzyme of ascorbate peroxidase localized on glyoxysomal and leaf peroxisomal membranes in pumpkin // Plant Cell Physiol. 1995. Vol. 36. P. 1157—1162. 94. Yoshimura K., Miyao K., Gaber A. et al. Enhancement of stress tolerance in transgenic tobacco plants overexpressing Chlamydomonas glutathione peroxidase in chloroplasts or cytosol // Plant J. 2004. Vol. 37. P. 21—33. 95. Yu Q., Rengel Z. Micronutrient deficiency influences plant growth and activities of superoxide dismutase in narrow-leafed Lupins // Ann. Bot. 1999. Vol. 83. P. 175—182.

59

É·‚‡ 3

É·‚‡ 3 ÄçíéñàÄçõ — èêàêéÑçõÖ ÄçíàéäëàÑÄçíõ êÄëíÖçàâ

Антоцианы (агликоны антоцианов, или гликозиды антоцианидинов) представляют собой производные катиона флавилия (2-фенилбензопирилия) и являются классом наиболее распространенной и многочисленной группы фенольных соединений — флaвоноидов. При гидролизе антоцианы распадаются на сахар и антоцианидин, а в растениях, как правило, присутствуют в виде гликозидов. Флавоноиды принадлежат к соединениям С6-С3-C6-ряда, в их молекулах имеется два бензольных ядра (А и B), соединенных друг с другом трехуглеродным фрагментом (рис. 3.1).

Рис. 3.1. Основная структура веществ флавоноидного ряда 60

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

Наиболее общепринятая классификация флавоноидов предусматривает их деление на 11 основных классов исходя из степени окисленности или восстановленности трехуглеродного фрагмента: катехины (флаван-3-олы), лейкоантоцианидины (флаван-3,4-диолы), флаваноны, дигидрохалконы, халконы, антоцианидины, дигидрофлаванолы, флавоны, флавононы, ауроны и флаваны. Катехины, лейкоантоцианидины, дигидрохалконы, флаваноны и дигидрофлаванолы не имеют окраски, все же другие классы флавоноидов представляют собой окрашенные соединения. Термин «антоцианы» (от греч. антос — цветок; кианос — синий) охватывает как флавилевые агликоны, так и их гликозиды. В англоязычной литературе для гликозидов антоцианидинов используется термин «антоцианины», но в русской литературе он не нашел распространения. Наряду с хлорофиллом и каротиноидами антоцианы выступают главными красящими веществами растений. Они придают плодам, ягодам, листьям и цветкам окраску самых разнообразных оттенков: от розового до черно-фиолетового (Brouillard, 1993). Эти пигменты вносят свой вклад как в быстро изменяющуюся окраску молодых листьев, так и в появление у них осенних тонов, при этом почти во всех случаях отмечается участие цианидин-3-глюкозида. Помимо шести основных антоцианидинов (пеларгонидин, цианидин, пеонидин, дельфинидин, петунидин, мальвидин), имеющих 5,7-диокси-замещение в кольце А, существуют и другие агликоны антоцианидиновой природы. Например, аурантинидин, содержащийся в цветках недотроги (Impatiens aurantiaka Teijsm. ex Koord.), розинидин из цветков примулы (Primula rosea Royle) и хирзутидин из Gatharanthus roseus (L.) G. Don (Запрометов, 1993). Известны также три агликона без гидроксилирования в пирановом гетероцикле (3-дезоксиантоцианидины). Они содержатся главным образом во мхах и папоротниках, за редким исключением — у цветковых растений. Многочисленность антоцианов объясняется не только большим числом агликонов, но и огромным разнообразием гликозидных форм. Так, для пеларгонидина известно более 40 гликозидов (Timberlake, 1980). 61

É·‚‡ 3

По Дж. Харборну, антоцианы подразделены на 21 подгруппу в зависимости от места присоединения и природы сахарного остатка. Среди монозидов антоцианов наиболее часто встречаются глюкозиды, галактозиды, рамнозиды, арабинозиды; из дисахаридов — рутиноза (6-L-L-рамнозидо-D-глюкоза). Среди трисахаридов, входящих в состав пигментов, можно отметить три линейных: гентиотриозид, глюкозилрамнозилглюкозид, арабинозилсамбубиозид и два разветвленных: 2-глюкозилрутиноза, 2-ксилозилрутиноза (Запрометов, 1993). Широко распространены ацилированные антоцианы. При этом ацильный остаток присоединяется эфирной связью к одному из сахарных фрагментов (Nakatani et al., 1995). В качестве ацильных заместителей чаще всего выступают оксикоричные и оксибензойные кислоты. Например, 3,7,3’-триглюкозид цианидина, ацилированный двумя оксикоричными кислотами, кофейной и феруловой, обнаружен в цветках растений Zebrina pendula Schnizl; антоцианидин C2, извлеченный из цветов Matthiola incana (L.), в состав которого входят кофейная, синаповая и малоновая кислоты (Saito et al., 1995). В цветках колокольчиков был найден дважды ацилированный n-оксибензойной кислотой 3 ди {n-оксибензоил} рутинозидо-7-глюкозид пеларгонидина. Помимо оксикоричных и оксибензойных кислот, ацильными заместителями могут служить уксусная, янтарная, коричная, кумаровая, феруловая кислоты (Dougall et al., 1997). В цветках Clitoria ternatea L. содержится серия антоцианов, названных тернатинами, например А3. В их основе 3,5’,5’-триглюкозид дельфинидина, к которому присоединены несколько остатков D-глюкозы, малоновой, кофейной и n-кумаровой кислот (Saito et al., 1995). Тернатины благодаря такой специфике строения представляют собой стойкие красители и могут быть использованы в пищевой промышленности. Среди наиболее часто встречающихся антоцианов можно указать следующие: пеларгонин (3,5-диглюкозид пеларгонидина), содержащийся в гранате (Punica granatum L.), пеоне (Paeonica suffrutikosa subsp. rockii), недотроге (Impatiens balsamina L.); хризантемин (3-моноглюкозид цианидина), содержащийся в землянике (Fragaria vesca Coville), сливе (Prunus cera62

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

sus L.); цианин (3,5-диглюкозид цианидина), содержащийся в цветках василька, мака, розы (Запрометов, 1993). Выделенные из растения антоцианы имеют красную или фиолетово-красную окраску. Например, пеларгонидин — оранжево-красный, а цианидин — сине-красный (Гудвин, Мерсер, 1986). Долгое время считалось, что окраска антоцианов в тканях растений определяется величиной pH клеточного сока. Так, сдвиг pH клеточного сока в кислую сторону объяснял наличие красной окраски, в слабощелочную — синей, а преобладание в клеточном соке нейтральной pH отвечало за наличие фиолетовой окраски (Запрометов, 1993). Но позднее было показано, что клеточный сок лепестков свыше 200 растений, принадлежащих к разным видам и семействам, имеет независимо от окраски одинаковое значение Ph = 5,5. В дальнейших исследованиях было установлено, что в формировании антоциановой окраски в тканях растений могут принимать участие фенольные соединения других классов и групп, ионы металлов, а в ряде случаев вещества не фенольной природы (Malien-Aubert et al., 2001). По-видимому, нативная окраска антоцианов в тканях растений определяется следующими факторами: строением агликона (причем увеличение степени гидроксилирования цикла В сдвигает окраску в синюю сторону, а увеличение степени метилирования — в красную) и комплексообразованием с ионами металлов (так, ионы Мо2+ и Ca2+ способствуют развитию синей окраски). Например, пигмент, выделенный из экстракта цветов Centaurea cyanus L. (3,5-диглюкозид цианидина): ассоциация трехвалентного иона металла (Fe3+ или Al3+), связанного с двумя молекулами цианина и молекулой полигалактоуроновой кислоты. Коммелин (M6F6Mg2)2–, выделенный из экстракта цветов Commelina communis L.: два иона магния соединяют три подъединицы, каждая из которых образована расположенными друг на друге двумя молекулами ацилированного малоновой кислотой антоциана (малонилавобанин-М), окруженного двумя молекулами флавона (флавокоммелин F (4’-0-глюкозид свертизин)) (Kondo et al., 1992). 63

É·‚‡ 3

В усилении окраски антоциановых пигментов участвуют желтые пигменты — флавоны и флавонолы (Saito et al., 1995), а также иные фенольные соединения, такие как оксикоричная, кофейная, феруловая кислоты и их производные (Markovic et al., 2000). Как уже было отмечено, в большинстве случаев антоцианы встречаются в форме гликозидов. Они представляют собой катион, гидролизуются медленнее, чем флавонолы и другие гликозиды, и в клетке существуют в виде солей с органическими кислотами (Giusti et al., 1999). По этой причине экстракцию и выделение антоцианов проводят в слабокислой среде. Чаще всего используют охлажденный метанол и этанол, содержащий 0,1—1 % соляной кислоты (Валуйко и др., 1980). Следует отметить, что антоцианы растворимы в воде, спирте, но не растворяются в эфире, хлороформе, бензине (Гудвин, Мерсер, 1986). Выяснено, что в водных растворах они присутствуют в виде равновесной смеси четырех форм: хиноидное основание, флавилиевый катион, халконная форма и карбинол (рис. 3.2).

Рис. 3.2. Формы антоцианов в растворах 64

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

Спектр поглощения антоцианов, выделенных из различных растений, охватывает в основном сине-фиолетовые (400— 420 нм) и зеленые (500—550 нм) лучи (Da Cunha Filho, Nascimento, 2000). Как и все флавоноиды, антоцианы, кроме того, имеют характерное поглощение в ультрафиолетовой области (Giusti et al., 1999). Совокупность литературных данных свидетельствует о том, что все растения образуют (в тех или иных количествах) фенольные соединения. Это, однако, не означает, что все органы и ткани растения синтезируют одинаковые фенольные соединения. Характерная антоциановая окраска чаще всего ограничивается лепестками, хотя у некоторых растений антоцианы придают окраску и листьям, пыльникам, семенам, стеблям и корням, не говоря уже о плодах и ягодах. Содержание флавоноидов в растениях различно: в среднем 0,5—5 %, но иногда достигает 20 %, как, например, в цветках софоры японской. Показано, что специфическая окраска цветков, в которой принимают участие антоцианы, флавоны и халконы, привлекает внимание насекомых-опылителей. При этом важна не только яркая, видимая окраска цветка, создаваемая главным образом антоцианами, но и поглощение этими пигментами УФ, поскольку многие насекомые, в частности пчелы, чувствительны к свету УФ-области спектра, что, по мнению некоторых ученых, сказывается на видообразовании и эволюции как растений, так и насекомых (Harborne, 1993). С помощью электронной микроскопии, а также на изолированных вакуолях было установлено, что многие вторичные соединения накапливаются либо в одной центральной вакуоли, либо в нескольких более мелких. Специальные исследования локализации флавоновых соединений (Волынец, Прохорчик, 1983) показали, что флавоноиды образуются только в периферических частях и тканях растений, главным образом в эпидермисе, и это находится в прямой зависимости от про65

É·‚‡ 3

должительности действия видимого света. Сказанное справедливо и для антоцианов (Brouillard, 1993), причем в большинстве случаев их тканевая локализация ограничивается верхним эпидермисом (Woodall, Stewart, 1998; Markham, 2000). Растения, адаптированные к теневым условиям, обнаруживают присутствие данных пигментов в нижнем эпидермисе, возможно для боле полного и эффективного поглощения фотосинтетической радиации (Lee et al., 1987). Кроме того, описаны случаи локализации антоцианов исключительно в мезафильных тканях некоторых видов растений из родов Mahonia, Viburnum, Rhododendron (Kaku et al., 1992) и некоторых тропических древесных из рода Syzygium (Woodall et al., 1998). Накопление антоцианов в специальных везикулах — антоцианопластах — происходит в клетках гипокотилей проростков редиса (Raphanus sativus L.) и нескольких других растений, а также в культивируемых клетках батата (Запрометов, 1993). Кроме того, антоцианы могут встречаться в кристаллическом виде, например в клеточном соке плодов апельсинов и в плазме некоторых луков. В гиподермальных клетках красной капусты (Brassica oleracea L.) центральная вакуоль содержит один антоцианопласт, окруженный трехслойной мембраной. C помощью специфических ингибиторов мембранных АТФаз на дисках из лепестков розы было выяснено, что поступление антоцианов в вакуоль происходит с участием АТФазы тонопласта (Запрометов, 1993). Антоцианы синтезируются в цитоплазме и, как показывают электронно-микроскопические исследования, транспортируются в центральную вакуоль с помощью ограниченных мембраной микровезикул (антоцианопластов) (рис. 3.3). Однако по вопросу о месте возникновения таких микровезикул существуют разногласия. Одни авторы считают, что транспортные везикулы образуются при эвагинации оболочки пластид. Другие полагают, что место их образования — шероховатый эндоплазматический ретикулум (Запрометов, 1993). 66

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

Рис. 3.3. Схема образования и транспортирования антоцианов в клетке: 1 — халконсинтаза, 2 — дигидрофлавонолредуктаза, 3 — антоцианидинсинтаза, 4 — флавонол-3-0-гликозилтрансфераза, 5 — глютатион-S-трансфераза, 6 — лейкоантоцианидинредуктаза

Вакуоли клеток — не единственное место локализации флавоноидов. Имеются интересные данные по локализации многообразных фенольных соединений в других органоидах клетки. Например, в хлоропластах растений выявлены производные оксикоричных кислот, флавоны, флаваноны, катехины и антоцианы, т. е. практически все наиболее широко распространенные фенольные соединения листьев растений (Волынец, Прохорчик, 1983). Важные данные по определению отно67

É·‚‡ 3

сительного содержания флавоноидов приводятся для железистых клеток тополя черного (Воскресенская, 1965). Максимальное количество флавоноидов обнаружено в пластидах железистых клеток, находящихся на стадии созревания. В зрелых и старых клетках флавоноиды преобладали в вакуолях. А это может означать, что флавоноиды могут образовываться в пластидах и накапливаться в значительных количествах в вакуолях. Вместе с антоцианами в растениях встречаются лейкоантоцианы, представленные бесцветными веществами, имеющими способность при нагревании в присутствии минеральных кислот превращаться в ярко окрашенные антоцианы. Одним из первых исследователей лейкоантоцианов был М. С. Цвет, назвавший их искусственными антоцианами. Позже эти соединения были выделены в отдельную группу — лейкоантоцианы, представляющие собой бесцветные, обычно аморфные соединения. Они хорошо растворимы в воде, этаноле, ацетоне, а при обработке разбавленной соляной кислотой переходят в соответствующие ярко окрашенные соли антоцианов. Вместе с антоцианами в растениях встречаются флавоны и флаванолы, участвующие в создании так называемой антоциановой окраски, а также часто отмечаются высокоолигомерные и полимерные проантоцианидины А2 и В1, в состав которых входят антоцианы. Например, при гидролизе молекулы процианидина В1 образуется молекула цианидина и молекула катехина (Laouenan et al., 1997). Помимо димерных процианидинов, известны также димерные продельфинидины, в состав которых входит дельфинидин (Laouenan et al., 1997) и полимерные проантоцианидины — пигмент, извлеченный из околоплодника Litchi chinensis Sonn (Laouenan et al., 1997). Их принято относить к дубильным веществам — конденсированным проантоцианидинам. В растениях также встречаются представители класса халконов и флавонолов; благодаря наличию хромофорной группировки они окрашены в желтый цвет. 68

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

3.1. ÅËÓÒËÌÚÂÁ ‡ÌÚӈˇÌÓ‚

В настоящее время процесс биосинтеза антоциановых пигментов хорошо изучен и открыто довольно много генов, которые непосредственно контролируют и регулируют так называемый антоциановый путь биосинтеза (Wang, Wessler, 2001). Мутации в антоциановых генах хорошо изучены вследствие их легкой идентификации и отсутствия вредного воздействия на рост и развитие клетки. Сейчас хорошо изучены три модификации биосинтеза антоцианов: биосинтез пигментов в растениях кукурузы (Zea mays L.), в растениях львиного зева (Snapdragon majus L.), и в гибридных растениях петунии. Следует отметить, что петуния раньше всех стала объектом для изучения антоциановых генов. Так, уже известно почти 35 генов, затрагивающих формирование цветочной окраски. Позднее, по мере развития генетики и ее методов, в качестве объектов для изучения стали использовать кукурузу и другие растения, синтезирующие флавоноиды. Следует отметить, что путь биосинтеза антоцианов видоспецифичен. Так, у кукурузы, львиного зева и петунии начальный биосинтез состоит из общих реакций, но имеются некоторые важные различия между видами. Одно из них в том, что петуния обычно не производит пеларгонидин, в отличие от кукурузы и львиного зева, которые к тому же не способны синтезировать дельфинидин. Степень модификации антоцианов также видоспецифична. Растения способны синтезировать большое количество разнообразных ароматических соединений, содержащих в своих молекулах одно или несколько бензольных ядер. Для их образования используются два основных механизма: шикиматный путь, объединяющий в себе биосинтез ароматических аминокислот и начальные этапы биосинтеза фенольных соединений, в котором исходными соединениями служат продукты углеводного метаболизма (фосфоенолпируват и эритрозо-4-фосфат), и ацетатно-малонат69

É·‚‡ 3

ный (поликетидный) путь (Запрометов, 1993), в котором в качестве исходных соединений используется ацетил-КоА и малонил-КоА. Предшественниками для синтеза всех флавоноидов, включая антоцианы, являются малонил-КоА и n-кумарил-КоА. Халконсинтаза катализирует пошаговую конденсацию трех ацетатных блоков от малонил-КоА с n-кумарил-КоА с получением тетрагидроксихалкона. Халконизомераза катализирует стереоспецифическую изомеризацию окрашенного в желтый цвет тетрагидрохалкона в бесцветный нарингенин. Нарингенин преобразуется в дигидрокемпферол флаванон-3-гидроксилазой (рис. 3.4).

Рис. 3.4. Биосинтез антоцианов: первый этап

Дигидрокемпферол может впоследствии быть гидроксилирован флавоноид-3’-гидроксилазой с получением дигидрок70

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

верцитина или флавоноид-3’, 5’-гидроксилазой с получением дигидромирицитина. Флавоноид-3’, 5’-гидроксилаза может также преобразовывать дигидрокверцитин в дигидромирицитин. Требуется по крайней мере три фермента для преобразования бесцветных дигидрофлавонолов (дигидромирицитин, дигидрокверцитин, дигидрокемпферол) в антоцианы. Первое из этих ферментативных преобразований — превращение дигидрофлавонолов в лейкоантоцианидины (дигидрофлавонол редуктаза). Дальнейшее окисление, дегидратация и глюкозидирование лейкоантоцианидинов (флаван-3, 4-цис-диолов) приводит к образованию кирпично-красного пеларгонидина, красного цианидина и синего дельфинидина (Bruce et al., 2000) (рис. 3.5).

Рис. 3.5. Биосинтез антоцианов: второй этап

Однако механизм и ферменты, катализирующие эти реакции, не полностью известны до сего дня. Последний шаг в биосинтезе данных веществ — гликозидирование в положении 71

É·‚‡ 3

3’ — осуществляется антоцианидин/флавонол-3—0-глюкозилтрансферазой, что существенно стабилизирует молекулу. Кроме пути биосинтеза в настоящее время изучается генная регуляция ферментов пути биосинтеза. Так, на примере растений кукурузы была показана способность к регуляции некоторых ферментов локусом R. Халконсинтаза кодируется С2-областью. Дигидрофлавонол-4-редуктаза, флавоноид-3-глюкозилтрансфераза и дигидрофлавонолредуктаза кодируется А1-доменом. Флавонол-3—0-глюкозилтрансфераза и флавоноид-3-глюкозилтрансфераза, кодируется Bz1-областью. Флавонол-3—0-глюкозилтрансфераза или флавоноид-3-глюкозилтрансфераза переводят пеларгонидин и цианидин в пеларгонидин-3-глюкозид и цианидин-3-глюкозид соответственно (Lesnick, Chandler, 1998; Selinger, Chandler, 1999). Регулирование антоцианового синтеза в кукурузе, кроме того, требует наличия двух факторов транскрипции: классы B и R, содержащий bHLH область, и классы C1 и P1, содержащий область Myb. Локус А2 в кукурузе к тому же может кодировать диоксигеназы. Это может означать, что антоцианидинсинтаза может практически предоставлять лейкоантоцианидиндиоксигеназу, которая в растениях рода Arabidopsis ответственна за преобразование лейкопеларгонидина в пеларгонидин и лейкоцианидина в цианидин. Выяснено, что в растениях этого рода дигидрофлавонолредуктаза кодируется tt3-локусом; флавонолсинтаза кодируется участком tt6; халконсинтаза — tt4; флавоноид 3-гидроксилаза — tt7, где tt относят к прозрачным тест мутантам (Rohdea et al., 2000). Другой ген — Bz2 — в растениях кукурузы может кодировать глютатион-S-трансферазу, которая выполняет последний генетический шаг в биосинтезе антоцианов — маркировку цианидин-3-глюкозида глютатионом при транспортировке в вакуоль через тонопласт (Mueller et al., 2000). Эквивалент этого локуса (Bz 2) у растений рода петуния — An 9, но, в отличие от него, он кодирует не 3-й тип фермента глютатион-S-трансферазы, а 1-й тип глютатион-S-трансферазы (De Vetten et al., 1999). 72

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

3.2. îËÁËÓÎӄ˘ÂÒ͇fl рÓθ ‡ÌÚӈˇÌÓ‚

Уже давно высказывались предположения о защитной роли фенольных соединений, но экспериментальные доказательств этого долгое время не было. Лишь сравнительно недавно на примере суспензионной культуры клеток Rosa damascena Mill. было показано, что если проводить селекцию на устойчивость к облучению УФ, то выживать будут те клетки, которые способны синтезировать повышенное количество фенольных соединений, в частности антоцианов. При этом приобретшие устойчивость к облучению клетки не только содержали примерно в 15 раз больше флавоноидов, но и имели вдвое большее количество ДНК (Запрометов, 1993), а это означает, что антоцианины могут быть вовлечены в так называемую систему УФ-толерантности — как молекулы, экранирующие УФ. Имеются данные о том, что эпидермальные флавоноиды могут выступать в качестве экрана, рассеивающего вредное УФ-излучение в вечнозеленых зрелых листьях (Day et al., 1994). Мезофильные флавоноиды также являются важными компонентами защитной системы, способной поглощать УФ-излучение, особенно в течение роста и развития листа, когда УФ-радиация не может быть полностью нивелирована еще не до конца сформированной кутикулой и эпидермисом (DeLucia et al., 1992). Ацилирование ароматическими или органическими кислотами увеличивает поглощение в УФ-области за счет возникновения максимума поглощения при 310—320 нм в результате наложения спектров кислот и основы антоциана. Хотя значимость антоцианов в этих процессах некоторыми исследователями ставится под большое сомнение (Chalker-Scott, 1999) вследствие имеющихся данных об отставании накопления антоцианов от синтеза более эффективных основных экранирующих молекул-флавоноидов, например гидроксикоричных кислот и других, в течение периода развития листовой пластинки (Gould et al., 2000). 73

É·‚‡ 3

Резистентность растений к УФ-стрессу основана на фоторепарировании (фотовосстановлении) ущерба, нанесенного этим излучением, или при ослаблении УФ. Последняя стратегия включает в себя уплотнение кутикулы, клеточных стенок, инкорпорацию фенольных смол в клеточные стенки, включая лигнин и увеличение опушенности (Johanson et al., 1995). Входит ли в эту стратегию обнаруженная активация биосинтеза антоциановых пигментов в ювенильных листьях и растительных тканях, подверженных свету высокой интенсивности, пока еще не ясно. Сообщается, что зрелые листья красной разновидности рода Coleus, содержащие эпидермальные антоцианы, были подвержены меньшему повреждению УФ-В и УФ-С, чем их зеленые аналоги, не содержащие антоцианов (Burger, Edwards, 1996). Показано, что ДНК растений кукурузы, содержащих флавоноиды, преимущественно антоцианы (Stapleton, Walbot, 1994), была защищена в большей степени от вредного воздействия УФ-излучения, чем ДНК растений — генетических мутантов, не способных синтезировать данные соединения. Сходные данные были получены на мутантных растениях из рода Arabidopsis (Li et al., 1993). М. Хада (Hada, 1996) связывал уменьшение уровня антоцианов в проростках Sorghum bicolor (L.) Moench с увеличением повреждения ДНК, освещенных УФ. Имеются данные, что антоцианины могут предохранять суспензии клеточных культур Centaurea cyanus L. от вредного воздействия УФ (Takahashi et al., 1991). Отмечено (Gitz et al., 1998) большее повреждающее действие УФ на растения, обработанные ингибитором фенилаланинаммиак-лиазы (ФАЛ) по сравнению с необработанными растениями. Хотя в этих исследованиях подобный эффект мог бы быть достигнут в большей степени за счет уменьшения других, более эффективных, чем антоцианины флавоноидных молекул. Следует отметить, что исследования в поддержку гипотезы экранирования клетки от УФ проводились на растениях, содержащих ацилированные оксикоричными кислотами (Burger, Edwards, 74

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

1996) или ароматическими кислотами антоцианы (Stapleton, Walbot, 1994). Противоположные данные были получены Беггсом и Веллманном (Beggs, Wellmann, 1985), которые не обнаружили поглощения антоцианов, выделенных из растений кукурузы в УФ-области спектра, и, следовательно, не нашли твердых доказательств в подтверждение гипотезы УФ-защиты. Сторонники этой точки зрения констатируют, что антоцианы часто встречаются в очень низких концентрациях по сравнению с другими УФ-поглощающими компонентами и нуждаются в очень длинных световых экспозициях УФ для активации их биосинтеза (Brandt et al., 1995). Гипотеза вовлеченности антоцианов в защитный механизм, экранирующий вредное УФ-излучение, предполагает их специальную тканевую локализацию внутри листовой пластинки. К примеру, для эффективного экранирования от вредного УФ-излучения, а также света высокой интенсивности нижележащих тканей данные пигменты должны быть локализованы либо в верхнем эпидермисе, либо в гиподерме листа. В большинстве случаев тканевая локализация антоцианинов ограничивается верхним эпидермисом (Johanson et al., 1995; Woodall, Stewart, 1998), хотя некоторые растения, адаптированные к теневым условиям, содержат данные пигменты в нижнем эпидермисе (Lee et al., 1987). Ювенильные листья манго (Mangifera indica L.) содержат антоцианы в клеточных слоях, примыкающих к нижнему эпидермису, в концентрациях, не свидетельствовующих в пользу выполнения данными пигментами сколько-нибудь значимой экранирующей роли (Lee et al., 1987). Имеются данные о присутствии антоциановых пигментов в высокой концентрации в палисадном мезофилле некоторых видов растений из родов Mahonia, Viburnum, Rhododendron (Kaku et al., 1992) и некоторых тропических древесных из рода Syxygium (Woodall et al., 1998). Таким образом, различная локализация антоциановых пигментов в растительных тканях не предполагает их узкой 75

É·‚‡ 3

специализации в области защиты от действия УФ или света высокой интенсивности и, следовательно, говорит о более широком их участии в обменных процессах, а не только в защите растений от УФ. Хотя химическая структура антоцианинов важна в определении их потенциальной роли, не менее значимо их содержание относительно других УФ-поглощающих компонентов. В листьях Coleus (Burger, Edwards, 1996), Zea mays L. (Stapleton, Walbot, 1994) и в клеточных культурах Centaurea cyanus L. (Takahashi et al., 1991) антоцианы были главными УФ-поглощающими компонентами, в отличие от ювенильных листьев рода Syzygium, где антоцианы составляли очень небольшую часть от общего УФ-поглощающего комплекса: S. luehmannii — 3,4 %; S. wilsonii — 5,5 % (Woodall, Stewart, 1998). Имеются данные о том, что антоцианы могут непосредственно нейтрализовывать АФК: Н2О2, O −2 , 1О2, образующиеся вследствие фотосинтетических процессов в хлоропластах по типу, сходному с α-токоферолом и каротиноидами (Ehlenfeldt, Prior, 2001). Однако локализация антоцианов в вакуолях не позволяет им напрямую выполнять эту функцию, ограничивая область их деятельности в пределах вакуоли и частично клеточной стенки. В отличие от других активных видов кислорода, перекись водорода стабильна и способна к распространению через мембранные структуры. Несмотря на относительно слабую токсичность и даже пользу в нейтрализации вирусов и бактерий, в присутствии супероксидного радикала перекись индуцирует образование высокореактивного гидроксильного радикала. Таким образом, нейтрализация Н2О2 антоциановыми пигментами позволяет избежать сильного окислительного стресса, возникающего в результате действия неблагоприятных условий или интенсивного метаболизма в период роста (ювенильные ткани). К тому же отсутствие аскорбатпероксидазы в вакуолях клеток не позволяет участвовать аскорбиновой кислоте в детоксикации АФК (Yamasaki et al., 1996). 76

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

В связи с этим Х. А. Ямасаки (Yamasaki, 1997) была предложена схема флавоноид-пероксидазной системы для детоксикации водородного пероксида в вакуолях: 2FlavOH +H2O2 → 2 FlavO• + 2H2O (флавоноид пероксидаза). Образующийся флавоноидный феноксильный радикал (FlavO•) может реагировать с аскорбиновой кислотой (АК) с образованием радикала монодегидроаскорбиновой кислоты МДАК., который претерпевает обратное изменение, превращаясь в АК и ДАК. Последняя также повышает уровень АК под влиянием дегидроаскорбатредуктазы: 2 FlavO• + 2АК→ 2FlavOH + 2МДАК• 2МДАК• → АК + ДАК ДАК → АК (дегидроаскорбатредуктаза) H2O2 + АК → 2H2O + ДАК. Полагают, что свободные радикалы аскорбата и флавоноидов выполняют важную биологическую функцию, реагируя с деструктивными свободными радикалами, причем наличие флавоноидной системы значительно повышает эффективность антиокислительной функции АК (Yamasaki et al., 1997; Девис и др., 1999). Так, изучение экстракции антоциановых пигментов на предмет их антиокислительной способности, основанное на окислении линолевой кислоты и коллагена, показало, что антоцианы нейтрализовали свободные радикалы настолько быстро, что последние не имели никакого шанса воздействовать на коллаген и показали значительное антиокислительное действие в пределах нескольких часов с линолевой кислотой (Monboisse, 1983). Способность разрушать супероксидный радикал по типу флавонолов (наличие свободных гидроксильных групп определяет реакционную способность) позволяет функционировать антоцианам как эндогенным антиоксидантам, уменьшающим кислородно-радикальную токсичность, и наравне конкурировать с СОД, а также дополнять или компенсировать недоста77

É·‚‡ 3

ток таких эндогенных антиоксидантов, как АК, глютатион или флавонолы, выступая в качестве донора электронов для пероксидазной реакции (Yamasaki et al., 1996). Уровень антоциановых пигментов может также использоваться в качестве индикатора для определения уровня O•2− или активности СОД (Yamasaki et al., 1996). Кроме того, некоторыми учеными показана защитная, антиокислительная роль антоцианов в предотвращении и профилактике заболеваний, возникающих в результате окислительного стресса, включая рак и старение, причем без побочных эффектов (Robert, 1990; Meiers et al., 2001). Имеются данные (Курсанов, 1988), что иммунитет растений к любым заболеваниям может определяться количеством органических и ароматических кислот в клеточном соке, в частности дубильными веществами и антоцианами. Чем больше этих веществ содержится в соке растений, тем устойчивее растение к заболеваниям. Кроме того, на примере возбудителя коричневой гнили плодов Sclerotinia fructigena (Pers.) Schrot было отмечено фунгицидное действие некоторых проантоцианидинов, в состав которых входят антоцианы. Уже давно накапливались данные о том, что растения не только синтезируют флавоноиды, но и обладают способностью к их глубокому катаболизму. О такой способности можно судить по изменению в растениях содержания тех или иных фенольных соединений в ходе вегетации растений. Например, в репродуктивных органах во время цветения после вспышки биосинтеза флавоноидов часто наблюдается уменьшение их содержания или даже полное исчезновение. Внешне это иногда можно наблюдать по обесцвечиванию антоциановой пигментации в лепестках цветков. В процессе созревания плодов также нередко происходит устранение вяжущего вкуса, который обычно придают плодам проантоцианидины. Оказалось также, что проростки кукурузы подвергают интенсивному катаболизму введенный в них 14С-цианидин (Запрометов, 1993). Основным механизмом запасания энергии в клетке служит локализованный в митохондриях процесс окислительного 78

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

фосфорилирования. Так, в экспериментах с митохондриями, выделенными из гипокотилей кукурузы, было отмечено слабое разобщающее действие антоцианов на окислительное фосфорилирование (Запрометов, 1993). Данных о влиянии флавоноидов, в особенности антоцианов, на процессы в хлоропластах in vitro, и тем более об участии этих фоторецепторов в процессах фотосинтеза in vivo, мало. Имеющиеся материалы побуждают к новым экспериментам и развитию представлений о флавоноидах как эндогенных регуляторах энергетического обмена хлоропластов. Появилось основание считать антоцианы эффективными стимуляторами электронного транспорта хлоропластов (Шахов, 1993). Предполагается, что поглощенная антоцианами лучистая энергия используется для определенных типов регуляции метаболизма растений, в первую очередь, возможно, в процессах трансформации энергии в биологических мембранах (Шахов, 1993). Установлено противоположное изменение в соотношении антоцианов и фотосинтетических пигментов к середине северного лета: при снижении содержания антоцианов в растениях увеличивается содержание хлорофилла и каротиноидов. Это может свидетельствовать об участии антоцианов в фотоэнергетике растительных клеток в качестве дополняющих к пластидным пигментам (Рузиева, 1987). Антоцианы в результате поглощения и преобразования энергии сине-фиолетовых и зеленых лучей могут влиять на световой внутриклеточный режим и способствовать более производительному использованию солнечной энергии, например в условиях низких температур (Шахов, 1993). В обычных условиях биосинтез антоцианов и зеленых пигментов идет более или менее параллельно, о чем может свидетельствовать сходный характер накопления этих веществ в растениях при воздействии светом на разных этапах их развития (Волынец, Прохорчик, 1983). Сведения о характере накопления антоциановых пигментов в условиях ингибирования биосинтеза фотосинтетических пигментов малочисленны. Тем 79

É·‚‡ 3

не менее имеются данные о влиянии полихроматического света различной интенсивности на накопление антоцианов в альбиносных тканях ячменя (Масленников, 2001; Масленников, 2003). Показано, что стимуляция накопления антоцианов нарастала с повышением интенсивности света и превосходила исходный уровень при максимальной интенсивности света в 25 Дж/м2 · с в 2,3 раза (рис. 3.6).

Содержание антоцианов, мг/г

Зеленые Полиномиальный

Альбиносные Полиномиальный

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 ИС

0

5

10

15

20

25

Дж/м2.с

Рис. 3.6. Влияние условий освещения на накопление антоцианов в листьях 20-дневных зеленых и альбиносных проростков ячменя, находящихся на воде (экспозиция — 48 часов)

Активация биосинтеза антоциановых пигментов в альбиносных листьях может быть также связана с процессами трансформации световой энергии и увеличением эффективности фотосинтетических процессов в условиях нестабильно функционирующего фотосинтетического аппарата за счет дополнительно поглощенной световой энергии антоцианами в тканях, имеющих следовое количество зеленых пигментов (Масленников, 2003). 80

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

В настоящее время выяснено, что доля энергии, поглощаемая антоцианами, зависит от распределения последних в толще листовой пластинки. При равномерном распределении они поглощают 10—26 %, а при сосредоточенности в нижнем эпидермисе — до 6 % общего поглощения. Имеются данные о том, что антоциансодержащие растения клещевины, капусты декоративной и периллы по сравнению с зелеными поглощают больше, но отражают и пропускают меньше лучей зеленой области спектра. В листьях ряда антоциановых растений на долю антоцианов приходилось 12—30 % общей суммы поглощенной радиации (Ishikura, 1978). На основании данных об оптических свойствах листьев, содержащих антоцианы, по ряду свойств последних следует предположить их участие в качестве фоторегуляторного компонента при полифункциональном использовании света растениями. В таком аспекте антоцианы почти не изучались. Видимо, они могут включаться в качестве переносчиков электронов в электронно-транспортной цепи на различных участках, например между первичным акцептором ФСII, дихлорфенолиндофенолом и феррицианидом (модельные системы) (Рузиева и др., 1987). Усиление электронного транспорта по электронно-транспортной цепи фотосинтеза под влиянием антоцианов свидетельствует, по мнению авторов, о том, что антоцианы в зависимости от ситуации могут выполнять роль эндогенных факторов, способствующих более эффективному использованию света при неблагоприятных внешних условиях. Исследованиями Р. М. Севдималиева и его соавторов (1990) показано, что экзогенные антоцианы, добавленные к хлоропластам гороха, влияют на фотохимические реакции, происходящие в реакционном центре ФСII. Антоцианы влияют на процесс переноса электрона на донорной и акцепторной частях реакционных центров ФСII, а также являются тушителями флуоресценции хлорофилла. Предполагается, что тушение флуоресценции вызвано образованием нефлуоресцирующего 81

É·‚‡ 3

комплекса между молекулами антоцианов и хлорофилла в основном состоянии. Отмечается неожиданная способность антоцианов растворяться в тилакоидной мембране хлоропластов (Sharma, Banerji, 1981). Показано усиление реакции Хилла антоцианами при освещении светом ламп накаливания и на зеленом свете, которому, как отмечалось выше, принадлежит максимум в спектре действия антоцианов (Dhawale et al., 1983). При указанном освещении антоцианы, добавленные к суспензии хлоропластов Rosa damascene Mill. и Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch, усиливали реакцию Хилла с дихлорфенолиндофенолом. Возможен перенос энергии от антоцианов к хлорофиллу. Развитие этих работ привело к подтверждению участия флавоноидов, связанных с хлоропластами, в фотосинтетических реакциях. Об этом говорят и данные о том, что хлоропласты из красной части цветка Amaryllis vittata L'Her. имели в 3 раза более высокую активность (в расчете на хлорофилл) реакции Хилла, чем хлоропласты из зеленой части цветка; при добавлении к последним экстракта антоциана скорость реакции Хилла увеличивалась в 2 раза. Следовательно, участие флавоноидов в регуляции энергетических процессов не вызывает сомнений, хотя до полной ясности регуляторного механизма еще далеко. Поставленный нами вопрос о возможном участии флавоноидов в интегративном использовании поглощенной световой энергии пока не решен и требует изучения (Масленников, 2003). На пути к развитию фотоинтегративного принципа с участием флавоноидов в его реализации стоит задача изучить последовательность, соподчиненность в функционировании фитохрома и криптохрома, а также условий, при которых это не соблюдается. Если будет доказан перенос энергии от антоцианов к хлорофиллу, то указанный вопрос приобретет важное фотоэнергетическое значение. Все это должно способствовать дальнейшему изучению механизма нефотосинтетического использования энергии 82

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

света как в этиолированных, так и в содержащих хлорофилл клетках. Немалую роль здесь должно сыграть изучение фотоиндуцированных генетических процессов, определяющих фоторегуляцию флавоноидов. Таким образом, физиологическая роль и механизм индукции биосинтеза антоцианов еще не вполне выяснены, особенно в отношении нерепродуктивных тканей. Обсуждается ряд гипотез, из которых наибольшего внимания заслуживают следующие: а) трансформация количественных и качественных характеристик поглощенного света (Hughes et al., 2008); б) защита от ультрафиолетового излучения (Burger, Edwards, 1996); в) защита от травоядных (Karageorgou, Manetas, 2006); г) предохранение фотосинтетического аппарата от фотоингибирующих процессов (Liakopoulos et al., 2006); д) защита от АФК (Yamasaki et al., 1996). 3.3. ÇÎËflÌË ˝ÍÓÎӄ˘ÂÒÍËı Ù‡ÍÚÓрÓ‚ ̇ Ó·р‡ÁÓ‚‡ÌË ‡ÌÚӈˇÌÓ‚

Свет

Известно, что содержание антоцианов у растений разных видов неодинаково и зависит от многих факторов, главный из которых — освещение (Singh et al., 1999; Масленников, Чупахина, 2001а). Внимание большинства исследователей сфокусировано на фотоиндукции биосинтеза антоциановых пигментов УФ- и ДК-светом, при этом механизм взаимодействия высокоэнергетической реакции (ВЭР) и низкоэнергетической реакции (НЭР), проявляющийся в накоплении антоцианов, остается недостаточно ясным. Фотоиндукция биосинтеза антоцианов СС и БС получила гораздо меньшее внимание (Merzlyak, Chivkunova, 2000; Масленников, Чупахина, 2001б). Например, 83

É·‚‡ 3

было показано, что дальний красный свет (ДК) и УФ-свет действуют независимо на образование антоцианов в Rumex patientia L. (Lindoo, Caldwell, 1978). Дальнейшие исследования также не внесли никакой ясности в этот процесс. Изучение световой индукции биосинтеза антоцианов на различных видах растений и тканей разделило исследователей на два лагеря. Первые полагали, что синтез антоцианов активируется УФ-B-рецептором (Brandt et al., 1995). Другие говорили о существовании некоторой комбинации между УФ-B-рецептором, криптохромом и фитохромом (Fambrini et al., 1993). Кроме того, возможно участие в процессе биосинтеза пигментов фоторецептора СС/УФ-А (Singh et al., 1999). Убедительные доказательства в поддержку первой гипотезы были продемонстрированы K. Брандтом и соавторами (Brandt et al., 1995). Было показано, что мутантные растения (Lycopersicon), имеющие дефицит фитохромного фоторецептора, аккумулировали антоцианы после экспозиций УФ-В. Эксперименты с исключением УФ (Krizek et al., 1998) показывали значительное уменьшение уровня как флавоноидов, так и антоцианов в растениях салата (краснолепестковая форма). Было продемонстрировано (Ambasht, Agrawal, 1995), что накопление антоцианов происходит в растениях кукурузы, выращенных в полевых условиях, только после облучения соответствующей дозой УФ-света. Противоположный результат был получен на том же объекте в исследованиях Беггса и Веллманна (Beggs, Wellmann, 1985). Эти ученые обнаружили некоторые различия биосинтеза антоцианов в растениях кукурузы в ответ на ДК- и УФ-свет, а также поставили под сомнение наличие фотоиндукционого механизма, запускающего биосинтез данных пигментов. Видоспецифичность фоторецепторных систем, участвующих в синтезе антоцианов, была исследована и на примере культур клеток и тканей. Показано, что в каллюсных тканях Haplopappus gracilis (Nutt) образование антоцианов индуциру84

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

ется лишь синим светом (Запрометов, 1993), а в суспензионной культуре клеток Н. gracilis (Nutt) лишь УФ-светом с длиной волны ниже 345 нм (Запрометов, 1993). В культуре клеток тополя интенсивное образование хризантемина происходило при освещении синим и белым светом. Имеются данные (Масленников, 2003) об активности синего (480 нм) и дальнего красного (715 нм) света в стимулировании образования антоцианов в зеленых листьях ячменя, кукурузы и горчицы белой. Так, авторами показано увеличение уровня антоциановых пигментов на синем свету в листьях кукурузы на 25,2—26,5 %, на дальнем красном свету — на 31,2—32,9 % (рис. 3.7). В растениях горчицы (1—2-й лист и семядольные листья) уровень антоцианов составил на синем свету 19,3 и 20,5 %; на дальнем красном — 40,1 и 40,8 % от контрольного уровня этих пигментов (рис. 3.8).

Содержание антоцианов, %

160 140 120 100 80 60 40 20 0 К

480

498

545

1-2-й лист

618

632

715

нм

5-6-й лист

Рис. 3.7. Влияние монохроматического света на образование антоциановых пигментов в листьях 15-дневных проростков кукурузы (экспозиция — 10 часов) 85

Содержание антоцианов, %

É·‚‡ 3

160 140 120 100 80 60 40 20 0 К

480

498

Семядольные листья

545

618

632

715

нм

Первые настоящие листья

Рис. 3.8. Влияние монохроматического света на образование антоциановых пигментов в листьях 15-дневных проростков горчицы (экспозиция — 10 часов)

Аналогичное действие СС и ДКС проявилось в проростках ячменя: содержание пигмента при освещении СС составило 23,3 %, а ДКС — 38,3 % от уровня контроля (рис. 3.9). Свет других участков спектра: зеленого (498 нм), зеленого (545 нм), оранжевого (618 нм), красного (632 нм) в растениях горчицы, ячменя и кукурузы не изменял уровень антоцианинов.

Содержание антоцианов, %

200 150 100 50 0

К 480 498 545 618 632 715 нм 15-дневные растения 30-дневные растения

Рис. 3.9. Влияние монохроматического света на образование антоциановых пигментов в листьях 15—30-дневных проростков ячменя (экспозиция — 10 часов) 86

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

В то же время биосинтез антоцианов в каллюсной ткани Impatiens balsamina L. был опосредован типичной фитохромной системой с участием красного и дальнего красного света (Запрометов, 1993), в тканях яблока — УФ-В, КС и СС (Arakawa et al., 1985). Также имеются данные, что фитохромная система контролирует активность и синтез ФАЛ, основного фермента биосинтеза флавоноидов (Волынец, Прохорчик, 1983). Влияние УФ-света на образование антоцианов частично обобщено в работах А. П. Дуброва (1963), согласно которым синтез этих соединений наиболее эффективно протекает в средневолновых УФ-лучах. По мнению Дуброва, он опосредуется через воздействие на генетический аппарат клетки, вызывая тем самым синтез de novo специфических ферментов. Последнее было убедительно продемонстрировано на примере нескольких ферментов биосинтеза фенольных соединений (L-фенилаланинаммиак-лиазы, халконсинтазы и халконфлаванонизомеразы) в культуре клеток петрушки, когда удалось установить, что фотоиндукции этих ферментов предшествует индукция активности соответствующих м-РНК. Особое место, как указывает М. Н. Запрометов, в биосинтезе занимает фермент L-фенилаланинаммиаклиаза, так как он находится в точке ответвления биосинтеза фенольных соединений от белка (Запрометов, 1993). В основе накопления фенольных соединений в тканях растений под влиянием света лежит активизация ферментов соответствующего биосинтеза. Активность этих ферментов, в том числе ферментов, ответственных за образование антоцианов, регулируется светом. По предложенной Мором гипотезе (Гродзинский, 1972) Ф-730 через сигнальную цепь (медиатор) активирует гены, что и приводит к синтезу соответствующих энзимов. В качестве медиатора может выступать аскорбиновая кислота, которая, по мнению Мора, воздействует на связь ДНК с гистонами: при увеличении концентрации АК некоторые гистоны теряют связь с ДНК, что сопровождается дерепрессией соответствующих генов. Так, в опытах Шопфера ДК-свет 87

É·‚‡ 3

усиливал образование аскорбиновой кислоты и антоцианов в проростках горчицы, причем усиление синтеза АК опережало усиление накопления антоцианов и ростовые реакции на ДК-свет. Кроме того, имеются данные о влиянии АК на синтез антоцианов. Если проростки находились на растворе экзогенной АК, синтез антоцианов происходил и в темноте, при этом интенсивность синтеза линейно зависела от концентрации АК. При отсутствии АК синтез в темноте не наблюдался (Гродзинский, 1972). Различную эффективность действия света разной длины волны на биосинтез антоцианов подтверждают и другие исследования (Волынец, Прохорчик, 1983), установившие наибольшую активность в биосинтезе антоцианов белого света — в отличие от монохроматического любой длины волны. Показано, что белый свет способен индуцировать накопление антоцианов в клетках суспензионной культуры Centaurea cyanus L. Исследования по продолжительности лаг фазы, после которой начинается быстрое накопление антоцианов, показало постоянную скорость и отсутствие зависимости ее от освещенности и количества света. Например, для гипокотилей гречихи линейная фаза накопления пигментов составляла при 48-часовом фотопериоде 30—35 часов. А с уменьшением продолжительности световой обработки проростков линейная фаза накопления антоцианов сокращалась (Халлоп, Маргна, 1971). Имеются данные, что антоцианы образуются только на свету после более или менее продолжительной лаг-фазы (Волынец, Прохорчик, 1983). Хотя для некоторых растений, в том числе растений кукурузы, отмечается не всегда облигатный светозависимый характер биосинтеза данных пигментов (Singh et al., 1999). Указывается возможность синтеза антоцианов в темноте и при поранении, что свидетельствует о возможности протекания этих процессов без участия ФХ или других фоторецепторов (Волынец, Прохорчик, 1983; Запрометов, 1993). Очевидно, в этих случаях активацию ферментов можно рассматривать как проявление генной регуляции или как результат пе88

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

рехода ферментов в растворимое состояние вследствие нарушения структуры клеток. Положительное действие света на накопление антоцианов сохраняется некоторое время и в темноте. Как и следовало ожидать, продолжительность темнового периода образования фенольных соединений зависела от длины фотопериода или времени непрерывного предосвещения. Так, при выдерживании проростков горчицы белой в темноте после 8—16-часового воздействия светом биосинтез антоцианов продолжался, хотя и с менее выраженной интенсивностью, чем на свету. Однако при увеличении периода свыше 24 часов отмечалось заметное разрушение пигментов в темноте. По данным Л. Е. Халлопа и У. В. Маргна (1971), продолжительность темнового периода синтеза антоцианов в гипокотилях гречихи постепенно снижалась, и через 30—32 часа дальнейшее накопление пигментов прекращалось. При использовании искусственного экранирования проростков гречихи наблюдалось 10—20-кратное ослабление образование антоцианов (Халлоп, Маргна, 1971). Влияние семенной оболочки как естественного экрана на накопление антоцианов в проростках гречихи аналогично по характеру, но меньше по величине: содержание антоцианов при удалении оболочки увеличивалось в 2 раза. Таким образом, можно считать вполне доказанным светозависимый характер биосинтеза антоциановых пигментов, особенно выраженный при наличии в клетках ФХ. Хотя существует ряд исключений, подтверждающих обратное (Garry, Christopher, 1981). Это доказывается дозовой и спектральной характеристиками биосинтеза, а также предварительным (до проявления действия ФХ) освещением проростков СС или УФС. Накапливается все больше данных о вероятности взаимодействия ФХ и рецепторов СС в биосинтезе антоцианов и других флавоноидов, но механизм такого взаимодействия не изучен и нуждается в дальнейших исследованиях. Так, повышение содержания антоцианов на СС в растениях ячменя, кукурузы и горчицы белой (Масленников, Чупа89

É·‚‡ 3

хина, 2001б) можно связать с активностью криптохромового фоторецептора, представляющего собой группу фоточувствительных веществ, производных флавинов и каротиноидов, один из максимумов спектра действия которых находится в области СС (400—490 нм) (Mancinelli, 1985). Можно предположить также участие в фотоконтроле биосинтеза антоцианов в этих растениях ВЭР или УФ-А/СС-фоторецептора (Singh et al., 1999). Активность ДК-света в биосинтезе антоцианов в проростках кукурузы, горчицы и ячменя может быть обусловлена типичной фитихромной системой. Из двух активных для биосинтеза участков спектра (СС и ДКС) наибольшее влияние в этих растениях оказал ДК свет. Вероятно, это может быть объяснено тем, что для инициирования реакций в синей области спектра необходимы гораздо большие дозы действующего света (ВЭР), чем в дальней красной области (Запрометов, 1993). С другой стороны, возможно существование двух отдельных путей биосинтеза антоцианинов с различной ферментной и внешней регуляцией (Chalker-Scott, 1999). Например, УФили СС-фоторецептор может выполнять функцию единственного фотоиндуктора, запускающего накопление антоцианов, в то время как их относительное содержание в растительных тканях может регулироваться фитохромом (Chalker-Scott, 1999). Кроме того, различные фотоиндукционые механизмы могут быть обусловлены возможной модификацией вследствие различных этапов развития и действия факторов окружающей среды, таких, например, как температура (Shichijo et al., 1993). Минеральное питание

Следует отметить, что факт накопления антоцианов вследствие нарушения нормальных условий минерального питания известен уже давно. Так, появление коричневых, бронзовых, красных и пурпурных пятен на листьях растений картофеля, капусты, хлопчатника, томатов в условиях дефицита ряда элементов питания обусловлено присутствием антоцианов. Несмотря на наличие подобных данных, роль антоциановых 90

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

пигментов в условиях нарушения минерального питания не выяснена, так как изменение оптических свойств тканей в основном связывалось с деградацией хлорофилла, маскирующего антоцианы, а не с увеличением уровня последних в условиях дефицита элементов питания. Данные, полученные на целых растениях, свидетельствуют о том, что наибольшее влияние на образование фенольных соединений оказывает азотное питание. Дефицит азота в почве стимулирует накопление фенольных соединений в различных органах растений, избыток азота сопровождается обеднением. Так, в суспензионной культуре клеток Acer pseudoplatanus интенсивное образование фенольных соединений начинается только после практически полного исчерпания источников азота в культуральной среде (Запрометов, 1993). Высокая концентрация нитрата (0,18 M) подавляла образование антоцианов в культуре клеток виноградной лозы (Запрометов, 1993). В культуре клеток чайного растения удвоение стандартной концентрации нитрата приводило к ослаблению образования фенольных соединений на 25—30 %, а уменьшение в 4 раза сопровождалось стимуляцией образования антоцианов на 50—60 %. Данные о влиянии фосфатного питания более разнообразны и менее четко выражены. Фосфатный дефицит может благоприятствовать биосинтезу фенольных соединений в тканях ячменя (Hamy, 1983) и Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Trull et al., 1997). В культивируемых клетках виноградной лозы обеднение фосфором приводило к стимуляции образования антоцианов, а в каллюсных тканях табака — к увеличению содержания кумаринов. Аналогичные данные были получены для культивируемых клеток табака и барвинка Catharanthus roseus (L.) G. Don (Запрометов, 1993). Более подробно условия накопления антоциановых пигментов в условиях дефицита макроэлементов были изучены в работах (Чупахина, Масленников, 1998; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003). Было показано, что биосинтез антоцианов может активироваться в условиях дефицита ряда макроэлементов в среде выращивания — азота, калия и фос91

É·‚‡ 3

фора (рис. 3.10, 3.11) — и сопровождаться при недостатке последнего активацией биосинтеза зеленых пигментов, каротиноидов, неорганических полифосфатов и АК в листьях кукурузы. Авторами отмечается повышение содержания аскорбиновой кислоты в условиях дефицита калия и азота. Содержание антоцианов, мг/г

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Контроль

Фосфор

Зелёные проростки

Азот

Этиолированные

Калий Прозелененные

Содержание антоцианов, мг/г

Рис. 3.10. Влияние дефицита макроэлементов в среде выращивания на накопление антоцианов в стеблях 30-дневных проростков кукурузы с различной пигментацией 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Возраст, дни 2

4

6

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Опыт Экспоненциальный

Контроль Полиномиальный

Рис. 3.11. Влияние фосфорного дефицита в среде выращивания на накопление антоцианов в листьях растений кукурузы (гидропонная культура) 92

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

Прочность связи хлорофилла b , %

Более высокий уровень зеленых пигментов в растениях кукурузы, выращенных в условиях дефицита фосфора, авторы связывают с наличием в тканях антоциановых пигментов (Чупахина, Масленников, 1998; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003). В частности, увеличение прочности связи хлорофилла b с белково-липоидным комплексом (рис. 3.12) и более высокое содержание суммы хлорофилла может быть следствием защитного действия антоцианинов, экранирующих активные центры мембранных пигментов и белков фотосистемы II от избыточных потоков света высокой интенсивности в области 630—690 нм (Gould et al., 1995; Масленников, 2003). Увеличение поглощения света антоцианами, чей спектр может частично перекрываться поглощением хлорофилла b (450— 470 нм), также может уменьшить световую нагрузку с ФСК в исследуемых растениях кукурузы (Gould et al., 1995; Чупахина, Масленников, 1998; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003). 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1

2 3 4

4

8

12

16

20

24

Возраст, дни 28

Рис. 3.12. Влияние фосфорного дефицита на прочность связи хлорофилла b с белково-липоидным комплексом в растениях кукурузы (гидропонная культура), % от неизвлекаемого хлорофилла (тип линий тренда — полиномиальный): экстракция хлорофилла бензином с 0,4 % спирта: 1 — опыт, 2 — контроль; с 0,8 % спирта: 3 — опыт, 4 — контроль

93

É·‚‡ 3

Относительное снижение содержания CСК-II по сравнению с другими пигмент-белковыми компонентами тилакоидных мембран (возрастание отношения а/b, рис. 3.13) в этих условиях может быть компенсировано и участием антоциановых пигментов в процессах сбора и трансформации поглощенной световой энергии, что снимает нагрузку с периферических антенн фотосистем (ФС I, ФС II (ССК II)) и в результате повышает устойчивость растений к неблагоприятным условиям среды (Чупахина, Масленников, 1998; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003). а/b 12 10 8 6 4 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Возраст, дни

Контроль

Опыт

Экспоненциальный

Логарифмический

Рис. 3.13. Влияние дефицита фосфора на накопление зеленых пигментов: динамика соотношения хлорофиллов а/b в онтогенезе растений кукурузы (гидропонная культура)

Авторами (Чупахина, Масленников, 1998; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003) также отмечается, что увеличение содержания антоцианов при дефиците фосфора сопровождается повышенным уровнем макроэргических соединений — неорганических полифосфатов (резерв фосфата), играющих важную роль в энергетических процессах клетки и обладающих способностью при гидролизе своей фосфор-ангидридной связи выделять такое же количество энергии, как при отщеплении терминального фосфата от АТФ. Неоргани94

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

ческие полифосфаты являются предшественниками АТФ в процессе эволюции и участвуют в регуляции АТФ-уровня в клетке в качестве соединений, сопрягающих энергодающие и энергопотребляющие процессы (Кулаев, 1998). Таким образом, накопление неорганических полифосфатов в данных условиях может быть опосредовано процессами восполнения недостатка основных фосфорсодержащих макроэргических соединений (АТФ), необходимых для преобразования сахаров в крахмал или для транспорта сахаров по флоэме. Уменьшение уровня АТФ в клетке вызывает депонирование сахаров и трансформирование халконов или других флавоноидов в антоцианидины в растительных тканях, а увеличение содержания неорганических полифосфатов призвано снизить негативный эффект дисбаланса между синтезом и распадом фосфорсодержащих соединений (Васильев, 1988; Wiebold, 2000). Влияние других элементов минерального питания изучено гораздо меньше, и полученные данные противоречивы. Имеются сведения о том, что в ряде случаев дефицит Мn2+ может благоприятствовать накоплению фенольных соединений (Вехов, 1978). Так или иначе, механизм, ответственный за запуск накопления антоциановых пигментов в условиях нарушения минерального питания, до сих пор остается малоизученным. Не выяснено, является ли стимуляция биосинтеза данных пигментов следствием только лишь дефицита одного элемента питания, например фосфора (Wiebold, 2000; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003), уровень которого в клетке, возможно, выступает индикатором для запуска биосинтетических реакций, или механизм активации более сложен и включает дополнительное воздействие на этот процесс других элементов, имеющих различные трансляционные и транскрипциональные уровни регуляции индукции биосинтеза различных предшественников антоциановых пигментов. Нарушение обмена одного конкретного элемента питания может оказать влияние на поступление в растение других питательных элементов. Например, накопление промежуточных продуктов азотного обмена вследствие дефицита азота может оказывать токсическое действие и приводить к возникновению 95

É·‚‡ 3

дисбаланса между поглощением натрия, калия, магния и сульфатов, вызывая соответствующее калийное, магниевое или сульфатное голодание. Стимулирование накопления антоциановых пигментов в условиях дефицита азота, фосфора и калия в растениях кукурузы, возможно, становится следствием ослабления ингибиторного эффекта PO 24− K+; NO 3− на действие основных ферментов флавоноидного биосинтеза в растительной клетке (ФАЛ и халконсинтазы) или следствием активации накопления предшественников данных пигментов, например халконов, и дальнейшей их трансформации в ярко окрашенные антоцианидины (Kakegawa et al., 1995; Чупахина, Масленников, 1998; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003). Активация биосинтеза антоциановых пигментов в листьях (0,0001—0,1 %) и корнях (0,001—0,1 %) растений кукурузы с увеличением концентрации хлорида натрия (рис. 3.14) также может быть следствием нарушения минерального питания (Чупахина, Масленников, 1998; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003).

Содержание антоцианов, мг/г

3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 К

0,0001 0,001

0,01

0,1

1 NaCl, %

Корни

Стебли

Полиномиальный

Полиномиальный

Рис. 3.14. Содержание антоцианов в стеблях 10-дневных проростков кукурузы в зависимости от концентрации хлорида натрия в среде выращивания 96

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

Отрицательное действие солей на растительный организм складывается главным образом из двух факторов — эффекта осмотического давления в питательном растворе и токсического действия солей непосредственно на протоплазму растительных клеток. Повышение уровня осмотического давления во внешнем растворе хлоридом натрия вызывает отравление растений (некрозы, отмирание листьев, почернение корней), в результате чего происходит подавление их роста (Строганов, Кабанов и др., 1970). Ингибирование ростовых процессов засолением может быть следствием нарушения ряда физиологических процессов, в том числе поглощения калия, изменения проницаемости мембран клеток под влиянием накопления натрия (Ebert, Gasierra et al., 1999) с последующим дефицитом влаги в тканях растений (Delgado, Scnchez-Raya, 1999). Замедление и остановка роста растений при засолении также могут быть связаны со снижением концентрации N, Ca, Mg, B, Zn, Mn в листьях растений (Esechie, Rodriguez, 1999). Есть данные (Кабузенко, Животенко, 1997), указывающие на то, что засоление корневой системы может вызывать снижение как пассивного, так и активного поглощения ионов фосфора корнями злаковых культур по сравнению с контролем. Накопление промежуточных продуктов азотного обмена может оказывать токсическое действие и приводить к возникновению дисбаланса между поглощением натрия, калия, магния и сульфатов. Интенсивное поглощение натрия уменьшает поступление катионов К+, Mg2+ и сульфатов и может вызвать у растений соответственно калийное, магниевое или сульфатное голодание (Pliego et al., 1998). С одной стороны, засоление вызывает резкое нарушение углеводного обмена растений, что проявляется в снижении содержания глюкозы (Fernandes — Ballester et al., 1998), фруктозы, увеличении уровня сахарозы и снижении содержания пировиноградной, лимонной, щавелевой, аконитовой и фумаровой кислот. Последняя, в свою очередь, влечет непродуктивное передвижение ассимилятов по органам растения. С другой стороны, некоторые исследователи (Kerepesi, Galiba, 1998) отмечают рост уровня углеводов (глюкозы, 97

É·‚‡ 3

фруктозы, сахарозы) в условиях хлоридного засоления, что может стать причиной увеличения пула антоциановых пигментов вследствие дополнительного субстратного стимулирования биосинтеза данных пигментов. Так или иначе, наличие отрицательной корреляции средней степени сопряженности между уровнем антоцианов и ростовыми процессами позволяет говорить о накоплении антоцианов как ответной реакции на солевой стресс (Чупахина, Масленников, 1998; Чупахина, Масленников, 2001; Масленников, 2003). Температура

Известен факт активации биосинтеза антоцианов при действии низких температур, особенно в сочетании с инсоляцией (Коровин, 1984). Так, имеются данные о стимулировании низкой температурой накопления антоцианов в цитрусе китайском (Citrus sinensis Pers.) и в плодах яблони (Jerry, McClure, 1975). Отмечено увеличение содержания антоцианов в проростках Arabidopsis (Graham, 1998), Sorghum (Shichijo et al., 1993), Poncirus (Tignor et al., 1997), Zea mays L. (Чупахина, Масленников, 1998), а также в листьях Cotinus (Oren-Shamir, Levi-Nissim, 1997) и Pinus (Krol et al., 1995), в стеблях Diospyros (Leng et al., 1993) и в клетках лучей паренхимы Fagus sylvatica L. (Schmucker, 1947). Обработка низкой температурой покоящихся растений бересклета вызывало повышение активности фенилаланинаммиаклиазы, последующее накопление коричных кислот, флавонолов и антоцианов, а также тормозило рост этих растений (Creasy, 1974). Некоторые авторы связывают увеличение содержания антоцианов в побегах яблони в осенне-зимний период с морозоустойчивостью (Ханина, Леонченко, 1989). Хотя по вопросу о связи между накоплением антоцианов и низкотемпературной толерантностью нет однозначного мнения. Более ранние исследования показывали наличие зависимости между появлением и исчезновением антоциановых пигментов в листьях Hedera helix L. и низкотемпературной выносливостью (Parker, 1962). Более поздние иссле98

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

дования (Steponkus, Lanphear, 1969) опровергли эти результаты, показав, что между устойчивостью к низким температурам Hedera helix L. и накоплением антоцианов нет никакой связи. Хотя следует отметить, что последние исследования проводились в теплице, в отличие от предыдущих (Parker, 1962), и уровень освещения, в том числе и УФ-излучения, в них был далек от природного. Была отмечена исключительная значимость накопления антоцианов в исследованиях с мутантами Arabidopsis, неустойчивыми к низким температурам и неспособными синтезировать эти соединения (McKown et al., 1996). Имеются данные, что ткани зимостойких растений содержат очень высокие концентрации антоцианов, впоследствии резко снижающиеся в течение весеннего периода (Foot et al., 1996). Северные экотипы Populus trichocarpa L. в отличие от южных аналогов также имеют более высокие уровни данных пигментов (Howe et al., 1995). Предполагается, что антоцианы могут защищать мезофилл молодых растений Pinus от низких температур и фотоокислительных процессов, возникающих вследствие этого (Krol et al., 1995). Отмечено, что некоторые растения с высоким содержанием флавоноидов, такие как Photinia, имеют растянутый период роста в сравнении с другими декоративными видами (Knox, 1989) — возможно, как результат повышения толерантности к низким температурам вследствие накопления антоцианов. Предварительное изучение устойчивости к низким температурам зеленых растений Cotinus, экранированных от УФ и КС, показало, что и экспозиции УФ способны увеличивать низкотемпературную толерантность этого вида (Chalker-Scott, 1999). Кроме того, отмечено, что у некоторых растений, например у красноцветных разновидностей китайской примулы Primula sinensis Ldl., высокие температуры снимают образование антоциана. У иных, например гераниевых, высокие температуры благоприятствуют образованию антоцианов (Буклет, Емцев, 1969). Иначе говоря, оптимальные температуры для образования антоцианов видоспецифичны, а механизм, ответствен99

É·‚‡ 3

ный за накопление антоциановых пигментов и увеличение резистентности растений к низким температурам, остается нераскрытым. Одна из предполагаемых гипотез основана на способности антоцианов повышать температуру листа (Es’kin, 1960). Однако данные, полученные в этих экспериментах, не нашли подтверждения и требуют дальнейшего изучения (ChalkerScott, 1999). Согласно другой гипотезе, механизм повышения устойчивости к низким температурам регулируется осмотически. Например, низкие температуры могут инициировать механическое повреждение растительных клеток и тканей вследствие образования кристаллов льда или обезвоживания. Для предотвращения подобного сценария в тканях, подверженных низким температурам, существует множество защитных механизмов, включая депонирование компонентов, богатых фенольными соединениями, такими как, например, лигнин в клеточных стенках. Подобные структурные изменения позволяют клеткам избежать физического ущерба вследствие образования кристаллов льда в межклеточных пространствах или на эпидермальных поверхностях. В отличие от зрелых тканей, молодые и развивающиеся клетки не имеют способности к лигнификации своих клеточных стенок. Накопление же антоциановых пигментов в эпидермальных слоях развивающихся листьев может снизить чувствительность растительных тканей к разрушительному эффекту низких температур через механизм суперохлаждения вследствие уменьшения осмотического потенциала клеток, снижающего активность процессов образования поверхностных центров кристаллизации (ChalkerScott, 1999). Увеличение уровня растворимых веществ в вакуолях клеток (антоцианов) означает, что вода замерзает при боле низких температурах и, таким образом, предотвращается образование льда и механическое разрушение клеток. Следовательно, даже небольшое увеличение низкотемпературной толерантности растений вследствие накопления антоциановых пигментов, особенно в молодых развивающихся 100

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

тканях, способно защитить их от случайных и кратковременных температурных колебаний. Кроме того, уменьшение уровня насыщенности мембранных липидов, вызывающее повышение чувствительности к действию УФ и увеличение вследствие этого уровня свободных радикалов, имеющих более пролонгированный период жизни в этих условиях (ChalkerScott, 1999), может быть компенсировано увеличением содержания антоцианинов в эпидермальных слоях растительных тканей. ***

В последнее время исследованы различные аспекты действия экологических факторов на накопление антоциановых пигментов в растениях. Наиболее изучен свет, температура, минеральное питание, действие химических веществ и поллютантов, а также периоды интенсивного роста и старения, сопровождающиеся образованием антоциановых пигментов. Известно, что и уровень АФК повышается в этих условиях. Способность антоцианов нейтрализовывать АФК по типу, сходному с α-токоферолом и каротиноидами, позволяет им функционировать как эндогенным антиоксидантам, уменьшающим их токсичность, и наравне конкурировать с супероксиддисмутазой, дополняя или компенсируя недостаток таких эндогенных антиоксидантов, как глютатион, флавонолы или АК, выступая в качестве донора электронов для пероксидазной реакции. Возможно, усиление накопления антоцианов — адаптивная стадия развития растительного организма, включенная в механизм защиты растений от неблагоприятных условий среды и способствующая приобретению неспецифической устойчивости под воздействием стресс-фактора. Почему антоцианины синтезируются взамен бесцветных и более эффективных флавоноидных предшественников — остается не вполне ясным. Возможно, антоциановые пигменты являются более эффективными фотопротективными водорастворимыми соединениями, которые в противоположность другим флавоноидам почти всегда гликозилированы, что, вероятно, и позволяет им 101

É·‚‡ 3

быть более эффективными в выполнении своих функций, находясь в вакуолярном резерве. Так или иначе, антоцианы могут действовать совместно с другими, более эффективными протективными молекулами в растительной клетке, возмещая их дефицит в течение действия ряда стрессовых факторов. Это, в свою очередь, позволяет рассматривать эндогенный уровень антоцианов в качестве индикатора состояния растений на молекулярно-генетическом, клеточном, организменном и популяционном уровнях и использовать их содержание как тест, диагностирующий воздействие различных поллютантов, нефти, ТМ на состояние растений и растительных сообществ на самых ранних этапах. ÅË·ÎËÓ„р‡Ù˘ÂÒÍËÈ ÒÔËÒÓÍ

1. Буклет Н. А., Емцев В. Т. Ботаника с основами физиологии растений и микробиологии. М., 1969. 2. Валуйко Г. Г., Датунашвили Е. Н., Огородник С. Т. Методы технохимического и микробиологического контроля в виноделии. М.: Пищевая промышленность, 1980. С. 34—35. 3. Васильев А. Е., Воронин Н. С., Еленовский А. Г. Ботаника: морфология и анатомия растений. М: Просвещение, 1988. 4. Вехов В. Н. Культурные растения СССР. М.: Наука, 1978. 5. Волынец А. А., Прохорчик Р. А. Ароматические оксисоединения — продукты и регуляторы фотосинтеза. Минск: Наука и техника, 1983. 6. Воскресенская Н. П. Фотосинтез и спектральный состав света. М.: Наука, 1965. 7. Гродзинский Д. М. Биофизика растений. Киев: Изд-во АНУССР, 1972. 8. Гудвин Г., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986. Т. 2. 9. Девис М., Остин Дж., Патридж Д. Витамин С: химия и биология / пер. c англ. М.: Мир, 1999. 10. Дубров А. П. Действие ультрафиолетовой радиации на растения. М: Изд-во АНСССР, 1963. 11. Запрометов М. Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 102

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

12. Коровин Ф. И. Растения и экстремальные температуры. Л: Гидрометеоиздат, 1984. 13. Курсанов Т. А. Развитие представлений о природе иммунитета растений. М.: Наука, 1988. 14. Кабузенко С. Н., Животенко Л. Ф. Влияние засоления и экзогенных фитогармонов на содержание макроэргического фосфора и показателей роста культурных растений // Укр. бот. журнал. 1997. Т. 54, № 4. С. 357—361. 15. Кулаев И. С. Происхождение эукариотических клеток // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 5. С. 17—22. 16. Масленников П. В. Влияние освещения на накопление антоцианинов в листьях Hordeum vulgare, Sinapis alba, Zea mays // Актуальные проблемы современной науки: материалы 2-й Международной конференции молодых ученых и студентов. Естественные науки. Самара: Изд-во СамГТУ, 2001. Ч. 5. С. 41. 17. Масленников П. В. Экологические аспекты накопления антоциановых пигментов в растениях: автореф. дис. …канд. биол. наук. Калининград: Изд-во КГУ, 2003. 18. Масленников П. В., Чупахина Г. Н. Влияние света различной интенсивности на биосинтез антоцианов // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: материалы IV Международного симпозиума. Пущино, 2001. С. 522—524. 19. Масленников П. В., Чупахина Г. Н. Влияние монохроматического света на биосинтез антоцианов // Теоретические и прикладные аспекты экологии и биологии: межвузовский сборник научных трудов. Калининград: Изд-во КГУ, 2001б. С. 48—52. 20. Рузиева Р. Х., Мухин Е. Н., Бородина Ю. С. Антоцианы — эффективные стимуляторы электронного транспорта хлоропластов // V Всесоюзный симпозиум по фенольным соединениям: тез. докл. Таллин, 1987. С. 128—129. 21. Севдималиев Р. М., Закржевский Д. А., Возняк В. М. Действие антоцианов на фотоиндуцированные изменения флуоресценции хлоропластов // Физиология и биохимия культурных растений. 1990. Т. 22, № 4. С. 340—343. 22. Строганов Б. П., Кабанов В. В. Структура и функции клеток растений при засолении. М.: Наука, 1970. 23. Халлоп П., Маргна Л. Эффект экранирования на светоиндуцированное образование флавоноидов в проростках гречихи // Изв. АНЭССР. Биология. 1971. Т. 20, № 4. С. 347—349. 103

É·‚‡ 3

24. Ханина Н. П., Леонченко В. Г. Функции флавоноидных соединений. Мичуринск, 1989. Рукопись. Деп. № 3315-В89. 25. Шахов А. А. Фотоэнергетика и урожай. М.: Наука, 1993. 26. Чупахина Г. Н., Масленников П. В., Дьяков М. Г. Возможная роль антоцианов в формировании устойчивости кукурузы к неблагоприятным факторам среды // Физиология и биотехнология растений: материалы Всероссийского совещания, посвященного 120-летию ТГУ и 175-летию кафедры физиологии и биотехнологии растений. Томск: Факел, 1998. С. 77—78. 27. Чупахина Г. Н., Масленников П. В. Биосинтез антоцианинов и пигментов, участвующих в фотосинтетических процессах у растений при дефиците фосфора // Регуляция роста, развития и продуктивности растений: материалы II Международной научной конференции. Минск, 2001. С. 134—135. 28. Ambasht N. K., Agrawal M. Physiological responses of field grown Zea mays L. plants to enhanced UV-B radiation // Biotronics. 1995. Vol. 24. P. 15—23. 29. Arakawa O., Hori Y., Ogata R. Relative effectiveness and interaction of ultraviolet B, red and blue light in anthocyanin synthesis of apple fruit // Physiol. Plant. 1985. Vol. 64. P. 323—327. 30. Beggs C. J., Wellmann E. Analysis of light-controlled anthocyanin formation in coleoptiles of Zea mays L.: the role of UV-B, blue, red and far-red light // Photochem. Pho-tobiol. 1985. Vol. 41. P. 481—486. 31. Brandt K., Giannini A., Lercari B. Photomorphogenic responses to UV radiation III: a comparative study of UVB effects on anthocyanin and flavonoid accumulation in wild-type and aurea mutant of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) // Photochem. Photobiol. 1995. Vol. 62. P. 1081—1087. 32. Brouillard R. The Flavonoids / Advances in research since 1986 / еd. J. B. Harborne. L.: Chapman and Hall, 1993. P. 525—538. 33. Bruce W. B., Folkerts O., Garnaat C. W. et al. Expression profiling of the maize flavonoid pathway genes controlled by estradiol-inducible transcription factors CRC and P // Plant Cell. 2000. Vol. 12, № 1. P. 65—79. 34. Burger J., Edwards G. E. Photosynthetic efficiency, and photodamage by UV and visible radiation, in red versus green leaf Coleus varieties // Plant and Cell Physiology. 1996. Vol. 37. P. 395—399. 35. Chalker-Scott L. Environmental Significance of Anthocyanins in Plant Stress Responses // Photochemistry and Photobiology. 1999. Vol. 70. P. 1—9. 104

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

36. Creasy L. L. Sequence of development of autumn coloration in Euonymus // Phytochemistry. 1974. Vol. 13, № 8. P. 1391—1394. 37. Da Cunha Filho L. A., Nascimento L. S. Inheritance of leaf sheath anthocyanin coloration in rice (Oryza sativa) // Rev. Univ. Rur., Sér. Ciênc. Vida. 2000. Vol. 17, № 1. P. 25—30. 38. Day T. A., Howells B. W., Rice W. J. Ultraviolet absorption and epidermal-transmittance spectra in foliage // Physiologia Plantarum. 1994. Vol. 92. P. 207—218. 39. Delgado I. C., Sanchez-Raua A. J. Physiological response of sunflower seedlings to salinity and potassium supply // Commun. Soil. Sci. And Plant Anal. 1999. Vol. 30, № 5. P. 773—783. 40. Delucia E. H., Day T. A., Vogelman T. C. Ultraviolet-B and visible light penetration into needles of two species of subalpine conifers during foliar development // Plant, Cell and Environment. 1992. Vol. 15. P. 921—929. 41. De Vetten N., Van Schaik H.-P., Mol J. et al. A cytochrome b 5 is required for full activity of flavonoid 3’,5’-hydroxylase, a cytochrome P450 involved in the formation of blue flower colors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96, № 2. P. 778—783. 42. Dhawale N. M., Ahtar M., Sharma V. Hill reaction of chloroplasts from Amaryllis vittata flowers and its enhancement by anthocyanin supplementation // Photosynthetic. — 1983. Vol. 17, № 2. P. 264—266. 43. Dougall D. K., Baker D. C., Gakh E. et al. Biosynthesis and Stability of Monoacylated Anthocyanins // Food Technology. 1997. Vol. 51. P. 69—71. 44. Ebert G., Gasierra F., Ludders P. Influence of NaCl salinity on growth and mineral uptake of lulo (S. quitoense L.) // Appl. Bot. 1999. Vol. 73, № 1. P. 31—33. 45. Ehlenfeldt M. K, Prior R. L. Oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and phenolic and anthocyanin concentrations in fruit and leaf tissues of highbush blueberry // J. Agric Food Chem. 2001. Vol. 49, № 5. P. 2222—2227. 46. Esechie H. A., Rodriguez V. Does salinity inhibit alfalfa leaf growth by reducing tissue concentration of essential mineral nutrients // Agron. and Grope Sci. 1999. Vol. 182, № 4. P. 273—278. 47. Es’kin B. I. Anthocyanin and plant frost resistance // Bot. Sci. 1960.Vol. 130. P. 58—60. 48. Fambrini M., Pugliesi C., Vernieri P. et al. Characterization of a sunflower (Helianthus annuus L.) mutant, deficient in carotenoid synthesis and abscisicacid content, induced by in-vitro tissue culture // Theor. Appl. Genet. 1993.Vol. 87. P. 65—69. 105

É·‚‡ 3

49. Fernandes-Ballester G., Martinez V., Gerda A. Changes in inorganic and organic solutes in citrus growing under saline stress // Plant Nutr. 1998. Vol. 21, № 12. P. 2497—2514. 50. Foot J. P., Caporn S. J.M., Lee J. A. et al. The effect of long-term ozone fumigation on the growth, physiology and frost sensitivity of Calluna vulgaris // New Phytol. 1996. Vol. 133. P. 503—511. 51. Garry W. C., Christopher J. Membrane permeability changes: a component of phytochrome-mediated anthocyanin synthesis in Sinapis alba // Phytochemistry. 1981. Vol. 20, № 1. P. 9—11. 52. Gitz D. D., Liu L., McClure J. W. Phenolic metabolism, growth, and UV-B tolerance in phenylalanine am-monia-lyase-inhibited red cabbage seedlings // Phytochemistry. 1998. Vol. 49. P. 377—386. 53. Giusti M. M., Rodriguez-Saona L. E., Griffin D. et al. Electrospray and tandem mass spectroscopy as tools for anthocyanin characterization // J. Agric Food Chem. 1999. Vol. 47, № 11. P. 4657—4664. 54. Gould K. S., Kuhn D. N., Lee D. W. et al. Why Leaves Are Sometimes Red // Nature. 1995. Vol. 378. P. 241—242. 55. Gould K. S., Markham K. R., Smith R. H. et al. Functional role of anthocyanins in the leaves of Quintinia serrata A. Cunn // Journal of Experimental Botany. 2000. Vol. 51, № 347. P. 1107—1115. 56. Graham T. L. Flavonoid and flavonol glycoside metabolism in Arabidopsis // Plant Physiol. Biochem. 1998. Vol. 36. P. 135—144. 57. Hada M., Tsurumi S., Suzuki M. et al. Involvement and non-involvement of pyrimidine dimer formation in UV-B effects on Sorghum bicolor Moench seedling // J. Plant Physiol. 1996. Vol. 148. P. 92—99. 58. Hamy A. Effect of phosphorus deficiency on pigments of barley leaves // Compets Rendus des Seances de l Academie d Agriculture de France. 1983. Vol. 69, № 12. P. 935—943. 59. Harborne J. B. The Flavonoids // Advances in research since 1986 / еd. R. J. Grayer. L.: Chapman and Hall, 1993. P. 589—618. 60. Howe G. T., Hackett W. P. et al. Photoperiodic responses of a northern and southern ecotype of black cottonwood // Physiol. Plant. 1995. Vol. 93. P. 695—708. 61. Hughes N. M., Vogelmann Th.C., Smith W. K. Optical effects of abaxial anthocyanin on absorption of red wavelengths by understorey species: revisiting the back-scatter hypothesis // J. Exp. Bot. 2008. Vol. 59, № 12. P. 3435—3442. 62. Ishikura N. Light absorption patterns of anthocyanin — containing cells // Plant and Cell Physiol. 1978. Vol. 19, № 5. P. 887—893. 63. Jerry W., McClure J. W. Physiology and function of flavonoid // The flavonoid. N.Y.: Chapman and Hall, 1975. P. 970—1055. 106

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

64. Johanson U., Gehrke C., Björn L. O. et al. The effects of UV-B radiation on a subarctic heath ecosystem // Ambio. 1995. Vol. 24. P. 106—111. 65. Kakegawa K., Suda J., Sugiyama M. et al. Regulation of anthocyanin biosynthesis in cell suspension of Vitis in relation to cell division // Physiologia Plantarum. 1995. Vol. 94. P. 661—666. 66. Kaku S., Iwaya-Inoue M., Toki K. Anthocyanin influence on water proton NMR relaxation times and water contents in leaves of evergreen woody plants during the winter // Plant Cell Physiol. 1992. Vol. 33. P. 131—137. 67. Karageorgou P., Manetas Y. The importance of being red when young: anthocyanins and the protection of Quercus coccifera from insect herbivory and excess light// Tree Physiology. 2006. Vol. 26. P. 613—621. 68. Kerepesi I., Galiba G., Banyai E. Osmotic and salt stresses induced differential alteration in water-soluble carbohydrate content in wheat seedlings // Agr. And Food Chem. Vol. 98, № 12. P. 5347—5354. 69. Knox G. W. Water use and average growth index of five species of container grown woody landscape plants // J. Environ. Hort. 1989. Vol. 7. P. 136—139. 70. Kondo T., Yoshida K., Nakagawa A. et al. Structural basis of blue-color development in flower petals from Commelina communis // Nature. 1992. Vol. 358. P. 515—518. 71. Krizek D. T., Britz S. J., Mirecki R. M. Inhibitory effects of ambient levels of solar UV-A and UV-B radiation on growth of cv. New Red Fire lettuce // Physiol. Plant. 1998. Vol. 103. P. 1—7. 72. Krol M., Gray G. R., Hurry V. M. Low temperature stress and photoperiod affect an increased tolerance to photoinhibition in Pinus bank-siana seedlings // Can. J. Bot. 1995. Vol. 73. P. 1119—1127. 73. Laouenan P., Michon V., Herve du Penhoat C. et al. NMR structural investigations and conformational analysis of condensed tannins. A Continuing challenge due to restricted rotation about the interflavanoid linkage // Analusis. 1997. Vol. 25. P. 29—32. 74. Lee D. W., Brammeier S., Smith A. P. The Selective advantages of anthocyanins in developing leaves of mango and cacao // Biotropica. 1987. Vol. 19. P. 40—49. 75. Leng P., Itamura H., Yamamura H. Freezing tolerance of several Diospyros species and kaki cultivars as related to anthocyanin formation // J. Jpn. Soc. Hort. Sci. 1993. Vol. 61. P. 795—804. 76. Lesnick M. L., Chandler V. L. Activation of the maize anthocyanin gene a 2 is mediated by an element conserved in many anthocyanin promoters // Plant Physiol. 1998. Vol. 117. P. 437—445. 107

É·‚‡ 3

77. Liakopoulos G., Nikolopoulos D., Klouvatou A. et al. The photoprotective role of epidermal anthocyanins and surface pubescence in young leaves of grapevine (Vitis vinifera) // Annals of Botany. 2006. Vol. 98. P. 257—265. 78. Li J., Ou-Lee T.-M., Raba R. Arabidopsis flavonoid mutants are hypersensitive to UV-B irradiation // Plant Cell. 1993. Vol. 5. P. 171—179. 79. Lindoo S. J., Caldwell M. M. Ultraviolet-B radiation-induced inhibition of leaf expansion and promotion of anthocyanin production // Plant Physiol. 1978. Vol. 61. P. 278—282. 80. Malien-Aubert C., Dangles O., Amiot M. J. Color stability of commercial anthocyanin-based extracts in relation to the phenolic composition. Protective effects by intra- and intermolecular copigmentation // Jan. J Agric Food Chem. 2001. Vol. 49, № 1. P. 170—176. 81. Mancinelli A. L. Light-dependent anthocyanin synthesis: a model system for the study of plant photomorphogenesis // Bot. Rev. 1985. Vol. 51, № 1. P. 143—154. 82. Markham K. R., Gould K. S., Winefield C. S. et al. Anthocyanic vacuolar inclusions, their nature and significance in flower colouration // Phytochemistry. 2000. Vol. 55, № 4. P. 327—336. 83. Markovic J. M., Petranovic N. A., Baranac J. M. A spectrophotometric study of the copigmentation of malvin with caffeic and ferulic acids // J. Agric Food Chem. 2000. Vol. 48, № 11. P. 5530—5536. 84. McKown R., Kuroki G., Warren G. Cold responses of Arabidopsis mutants impaired in freezing tolerance // J. Exp. Bot. 1996. Vol. 47. P. 1919—1925. 85. Meiers S., Kemeny M., Weyand U. et al. The anthocyanidins cyanidin and delphinidin are potent inhibitors of the epidermal growthfactor receptor // J. Agric Food Chem. 2001. Vol. 49, № 2. P. 958—962. 86. Merzlyak M. N., Chivkunova O. B. Light stress induced pigment changes and evidence for anthocyanin photoprotection in apple fruit // Photochemistry and Photobiology. 2000. Vol. 55. P. 154—162. 87. Monboisse J. Cl. Non-enzymatic degradation of acid-soluble calf-skin collagen by superoxide ion: protective effect of flavonoids // Biochemical Pharmacology. 1983. Vol. 1, № 32. P. 53—58. 88. Mueller L. A., Goodman C. D., Silady R. A. AN9, a Petunia glutathione S-transferase required for anthocyanin sequestration, is a flavonoid-binding protein // Plant Physiol. 2000. Vol. 123. P. 1561—1570. 89. Nakatani N., Kikuzaki H., Hikida J. et al. Acylated anthocyanins from fruits of Sambucus Canadensis // Phytochemistry. 1995. Vol. 38, № 3. P. 755—757. 108

ÄÌÚӈˇÌ˚ — ÔрËрÓ‰Ì˚ ‡ÌÚËÓÍÒˉ‡ÌÚ˚ р‡ÒÚÂÌËÈ

90. Oren-Shamir M., Levi-Nissim A. Temperature effect on the leaf pigmentation of Cotinus coggygria ‘Royal Purple’// J. Hort. Sci. 1997. Vol. 72. P. 425—432. 91. Parker J. Relationships among cold hardiness, watersoluble protein, anthocyanins, and free sugars in Hedera helix L // Plant Physiol. 1962. Vol. 37. P. 809—813. 92. Pliego L., Khadri M., Soussi M. et al. Nitrogen and carbon metabolism in Phaseolus vulgaris root modules under saline conditions: Abstr. 11th congress of the federation of European societies of plant physiology, Yarna, 7—11 sept., 1998 // Plant Physiol. 1998. Spec. Issue. P. 214. 93. Robert L. Action des oligomeres procyanidoliques sur la permeabilite de la paroi vasculaire. Etude par morphologie quantitative // Path Biol. 1990. Vol. 6, № 38. P. 608—616. 94. Rohdea A., De Ryckea R., Beeckmana T. ABI3 affects plastid differentiation in dark-grown arabidopsis seedlings // Plant Cell. 2000. Vol. 12. P. 35—52. 95. Saito N., Tatsuzawa F., Nishiyama A. et al. Acylated cyanidin 3-sambubioside-5-glucosides in Matthiola incana // Phytochemistry. 1995. Vol. 38, № 4. P. 1027—1032. 96. Schmucker T. Anthocyan im Holz der Rotbuche // Naturwissenschaften. 1947. Vol. 34. P. 91. 97. Selinger D. A., Chandler V. L. A mutation in the pale aleurone color 1 gene identifies a novel regulator of the maize anthocyanin pathway // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 5—14. 98. Shichijo C., Hamada T., Hiraoka M. et al. Enhancement of redlight-induced anthocyanin synthesis in sorghum first internodes by moderate low temperature given in the pre-irradiation culture period // Planta. 1993. Vol. 191. P. 238—245. 99. Sharma V., Banerji D. Enhancement of Hill activity by anthocyanid under both white incandescent and green irradiation // Photosynthetic. 1981. Vol. 25, № 4. P. 540—542. 100. Singh A., Tamil M., Sharma R. Sunlight-induced anthocyanin pigmentation in maize vegetative tissues// Journal of Experimental Botany. 1999. Vol. 50, № 339. P. 1619—1625. 101. Stapleton A. E., Walbot V. Flavonoids can protect maize DNA from the induction of ultraviolet radiation damage // Plant Physiology. 1994. Vol. 105. P. 881—889. 102. Steponkus P. L., Lanphear F. O. The relationship of anthocyanin content to cold hardiness of Hedera helix // HortScience. 1969. Vol. 4. P. 55—56. 109

É·‚‡ 3

103. Takahashi A., Takeda K., Ohnishi T. Light-induced anthocyanin reduces the extent of damage to DNA in UV-irradiated Centaurea cyanus cells in culture // Plant Cell Physiology. 1991. Vol. 32. P. 541—547. 104. Tignor M. E., Davies F. S., Sherman W. B. et al. Rapid freezing acclimation of Poncirus trifoliata seedlings exposed to 10 degrees C and long days // HortScience. 1997. Vol. 32. P. 854—857. 105. Timberlake C. F. Anthocyanins: occurence, extration and chemistry // Food Chemistry. 1980. № 5. P. 69—80. 106. Trull M. C., Guitinan M. J., Lynch J. P. et al. The response of wild type and ABA mutant Arabidiopsis thaliana plants to phosphorus starvation // Plant cell and environment. 1997. Vol. 20, № 1. P. 85—92. 107. Wang L., Wessler S. R. Role of mRNA secondary structure in translational repression of the maize transcriptional activator Lc // Plant Physiol. 2001. Vol. 125, № 3. P. 1380—1387. 108. Wiebold B. The color purple // Integrated pest and management newsletter. Columbia University of Missouri. 2000. Vol. 10, № 4. Art. 3. P. 1. 109. Woodall G. S., Dodd I. C., Stewart G. R. Contrasting leaf development in the genus Syzygium // Journal of Experimental Botany. 1998. Vol. 49, № 318. P. 79—87. 110. Woodall G. S., Stewart G. R. Do anthocyanins play a role in UV protection of the red juvenile leaves of Syzygium? // Journal Exp. Bot. 1998. Vol. 49. P. 1447—1450. 111. Yamasaki H. A Function of Colour // Trends in plant Science. 1997. Vol. 2. P. 7—8. 112. Yamasaki H., Sakihama Y., Ikehara N. Flavonoid-peroxidase reaction as a detoxification mechanism of plant cells against H2O2 // Plant Physiol. 1997. Vol. 115. P. 1405—1412. 113. Yamasaki H., Uefuji H., Sakihama Y. Bleaching of the red anthocyanin induced by superoxide radical //Arch. Biochem. Biophys. 1996. Vol. 332. P. 183—186.

110

áÄäãûóÖçàÖ

В данной монографии представлен подробный анализ научных работ и результаты многолетних исследований авторов, посвященных изучению влияния экологических факторов на антиоксидантную систему растений, в частности на активность антиоксидантных ферментов и уровень неферментативных антиоксидантов — антоцианов. В настоящее время уже не вызывает сомнения тот факт, что антиоксидантной системе принадлежит важная роль в формировании адаптационных возможностей организма, повышении его устойчивости к действию неблагоприятных факторов окружающей среды. Вместе с тем механизмы ответной реакции антиоксидантов при стрессе до сих пор остаются малоизученными и требуют проведения дальнейших исследований. Кроме того, интенсивное изучение как природных, так и синтетических антиоксидантов, осуществляемое в последние годы, ведет к тому, что число веществ с антиоксидантными свойствами увеличивается с каждым днем, а следовательно, исследования антиоксидантов будут оставаться актуальными еще долгое время. В связи с этим в дальнейшем авторы планируют продолжить исследования природных антиоксидантов по нескольким направлениям. В частности, будут продолжены работы по исследованию влияния экологических факторов на другие группы антиоксидантов (например, на биофлавоноиды, каротиноиды, глютатион, витамин Е); планируется и более подробное изучение механизмов действия антиоксидантной систем, в том числе на субклеточном уровне; составление банка данных и выявление растений — гиперпродуцентов антиоксидантных веществ. 111

Научное издание Чупахина Галина Николаевна Масленников Павел Владимирович Скрыпник Любовь Николаевна

ПРИРОДНЫЕ АНТИОКСИДАНТЫ (ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ) Монография Редактор Л. Г. Ванцева. Корректор Л. Г. Владимирова Оригинал-макет подготовлен Е. В. Мироновой Подписано в печать 07.06.2011 г. Бумага для множительных аппаратов. Формат 60×90 1/16. Гарнитура «Таймс». Ризограф. Усл. печ. л. 7,0. Уч.-изд. л. 4,5. Тираж 300 экз. Заказ 138. Издательство Балтийского федерального университета им. Иммануила Канта 236041, г. Калининград, ул. А. Невского, 14

112

Lihat lebih banyak...

Comentários

Copyright © 2017 DADOSPDF Inc.