Obtenção de Biofilmes a partir de Queratina de Penas de Frango

ISSN 1517-7076

Revista Matéria, v. 10, n. 1, pp. 8 – 13, Março de 2005 http://www.materia.coppe.ufrj.br/sarra/artigos/artigo10644

Obtenção de Biofilmes a partir de Queratina de Penas de Frango G.R.P. MOORE, S.M. MARTELLI, P.D. ANDREO, C.A. GANDOLFO, R.F.A. MACHADO, A. BOLZAN, J.B. LAURINDO Universidade Federal de Santa Catarina Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos Caixa Postal 476 – CEP 88040-900 – Florianópolis – SC e-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected] RESUMO A indústria de processamento de aves produz uma grande quantidade de penas que são usualmente utilizadas na formulação de ração animal. A queratina é uma proteína fibrosa encontrada neste tipo de resíduo, a qual pode ser classificada como um polímero natural tridimensional. O objetivo desse trabalho é a obtenção de filmes biodegradáveis a partir da queratina extraída das penas de frangos, como uma alternativa para agregar valor a este subproduto do processamento. A extração da queratina das penas foi realizada utilizando-se uma solução contendo uréia, mercaptoetanol, surfactante e água a 50ºC e pH 9,0. Após essa extração, foi realizada uma filtração, onde os resíduos insolúveis foram separados. O 2-mercaptoetanol e a uréia foram removidos da mistura por diálise, resultando na agregação da cadeia de polipeptídeos de resíduos de cisteína, obtendo-se um gel branco e opaco, que posteriormente foi liofilizado. O teor de proteína foi determinado pelo método do biureto, onde obteve-se 10% p/v. O rendimento percentual de queratina obtido foi de 90%, em relação à massa inicial de penas secas, valor semelhante ao encontrado na literatura. Os filmes foram preparados através de soluções filmogênicas de queratina usando a técnica de “casting”, usando-se o glicerol como plastificante (0,01- 0,09g/g de queratina). Ensaios de tração mostraram que a presença do glicerol diminuiu a tensão de ruptura dos filmes de 16 para 1,28 MPa e aumentou o alongamento dos mesmos de 1,74% para 19,27%. A higroscopicidade dos filmes de queratina, com diferentes concentrações de glicerol foi caracterizada através da determinação experimental de isotermas de sorção de umidade, utilizando soluções salinas saturadas a 35ºC. As isotermas de sorção de umidade mostraram que, o conteúdo de umidade nos filmes aumentou com o aumento da concentração de glicerol. Os filmes obtidos mostraram boa resistência mecânica, embora apresentem baixa resistência à umidade. Palavras chaves: Queratina, penas, filmes biodegradáveis.

Obtainment of Biofilms From Chicken Feather Keratin ABSTRACT The chicken processing industry produces a large amount of feather which is often employed to formulate animal feed. Keratin are fibrous proteins found in this kind of residue and can be classified as a three-dimensional polymer. The aim of this work is the obtention of biodegradables films using keratin extracted from chicken feather, as an alternative to add value to this by-product. Keratin was performed with a solution of urea, 2-mercaptoethanol, surfactant and water at 50ºC, at pH 9.0. Insoluble residues were separed by filtration and 2-mercaptoethanol and urea were removed by dialysis, resulting in polypeptids chains aggregater and in cysteine residues, produzing a white and opaque gel, which was liofilized later. Protein content found by biuret method was 10% (w/v). Keratin yield was 90 wt % of initial dry feather mass, similar to the literature values. Films were made of keratin filmogenic solutions by casting, using glycerol as plasticizer (0,01- 0,09g/g keratin). Glicerol decreased the tensile strength from 16 to 1.28 MPa and increased elongation from 1.74 to 19.27%. Keratin films hygroscopocity, with different glycerol concentrations, were determinated by moisture sorption isotherm, using salt satured solutions at 35ºC. The moisture sorption isotherns showed that the moisture content of the films increased with higher concentration of glycerol. Obtained films have shown good mechanical prorperty resistence however moisture has been low. Keywords: Keratin, feather, films, biodegradables.

Autor Responsável: J. B. LAURINDO

MOORE, G.R.P., MARTELLI, S.M.P., ANDREO, D., GANDOLFO, C.A., MACHADO, R.F.A., BOLZAN, A., LAURINDO, J.B., Revista Matéria, v. 10, n. 1, pp.8 – 13, Março de 2005.

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INTRODUÇÃO

Nos últimos 15 anos, a produção de frangos de corte aumentou em média 5% anualmente. Na União Européia mais de 77000 toneladas de penas são geradas pela indústria avícola. As penas são compostas principalmente de queratinas, sendo estas uma classe de proteínas estruturais que atualmente são utilizadas na forma hidrolisada, como aditivo na ração animal [5]. Atualmente, vem crescendo o interesse no desenvolvimento de novos materiais com aplicação ambientalmente sustentável, a partir de resíduos de proteínas. O uso de biopolímeros (polissacarídeos, lipídeos e proteínas) na fabricação de materiais biodegradáveis e filmes comestíveis cresceram consideravelmente nos últimos vinte anos [2]. Os filmes biodegradáveis proporcionam vantagens ecológicas sob as embalagens poliméricas convencionais, por serem biodegradáveis. Filmes à base de proteínas têm sido usados como protetores de medicamentos na indústria farmacêutica como cápsulas de gelatina, revestimento de salsichas e aplicações em embalagens descartáveis. Existem três categorias em que os filmes podem ser classificados: hidrocolóides (contendo proteínas, polissacarídeos ou alginatos), lipídeos (constituídos de ácidos graxos e acetilglicerol) e compósitos (produzido pela combinação de duas categorias) [1]. As proteínas são heteropolímeros com propriedades termoplásticas, constituídas de aminoácidos polares e nãopolares, que são capazes de formar numerosas ligações intermoleculares, as quais permitem uma ampla variação nas propriedades funcionais dos materiais resultantes [4]. Apesar da queratina de penas ser um recurso abundante e de baixo custo, pouca atenção vem sendo para aplicação na área de biofilmes. A queratina é uma proteína fibrosa encontrada no cabelo, lã, unhas, penas e outras camadas epiteliais. Uma característica importante da queratina é a ocorrência de uma grande quantidade de pontes dissulfeto quando comparada à maioria das outras proteínas estruturais em vertebrados, tais como colágeno, elastina e proteínas miofibrilares. Por causa desta quantidade extensiva de ligações dissulfeto cruzadas e uma alta quantidade de aminoácidos hidrofóbicos, queratinas são insolúveis tanto em solventes polares como a água, e em solventes apolares. Somente podem ser extraídas se as pontes dissulfeto e pontes de hidrogênio forem quebradas. Para obtenção de filmes à base de queratina, uma solução estável de queratina é necessária. Vários procedimentos estão descritos na literatura para extrair queratinas de lã e cabelo. Alguns métodos envolvem à cisão simultânea de ligações peptídicas (hidrólises ácidas e básicas), redução de pontes dissulfeto com soluções de sulfato de sódio alcalino ou a combinação de tratamentos enzimáticos e químicos com o uso de hidróxido de amônio. Processos sem cisões peptídicas significativas, em que somente pontes dissulfeto são rompidas, incluem sulfitólises ou oxidação de pontes dissulfeto com ácido perfórmico [6, 7, 8]. Yamauchi et al. [10] utilizaram um processo brando para extrair queratina de lã, o qual envolve o uso de tióis, como o 2-mercaptoetanol, para reduzir as pontes dissulfeto em soluções concentradas de uréia em pH moderadamente alcalino. Quando a queratina da lã é solubilizada, seguindo este procedimento, uma solução estável é obtida. A remoção do 2-mercaptoetanol e da uréia desta solução por diálise resultam na agregação das cadeias polipeptídicas de queratina e na reoxidação dos resíduos de cisteína, rendendo um gel branco e opaco. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de filmes a base de queratina de penas de frangos e a caracterização das suas propriedades mecânicas de tração e alongamento e a higroscopicidade. 2

MATERIAIS E MÉTODOS

As penas de frangos foram fornecidas por uma indústria avícola local, com teor de umidade de 10%. Os reagentes utilizados para a preparação dos filmes foram uréia (Nuclear), 2-mercaptoetanol (Vetec), sódio lauril sulfato (Nuclear), éter de petróleo (Nuclear) e glicerol (Nuclear). As membranas de diálise utilizadas foram da Spectra/Por-1, com ponto de corte de 8000 a 10000 Daltons. A dosagem de proteínas foi realizada pelo método colorimétrico do Biureto. 2.1

Extração de Queratina

As penas previamente lavadas, segundo a norma ASTM(D584) foram moídas em moinho de facas marca Tecnal, modelo TE-648. Este material foi desengordurado com éter de petróleo por 12h, em um extrator de soxhlet. 2.2

Solução Filmogênica

A solução filmogênica contendo 10% (p/v) de queratina foi preparada de acordo com o procedimento de Yamauchi [10]. Assim, 9g de penas foram imersas em 100mL de água destilada contendo 8M de uréia, 0,26M de sódio lauril sulfato e 1,66M de 2-mercaptoetanol. A mistura foi agitada a 50ºC e mantida a pH 9,0, durante 1h com atmosfera inerte de nitrogênio e posteriormente filtrada. O filtrado foi dialisado com água destilada durante três dias consecutivos.

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MOORE, G.R.P., MARTELLI, S.M.P., ANDREO, D., GANDOLFO, C.A., MACHADO, R.F.A., BOLZAN, A., LAURINDO, J.B., Revista Matéria, v. 10, n. 1, pp.8 – 13, Março de 2005.

2.3

Preparação dos Filmes

Os filmes foram preparados por “casting” seguido da secagem da solução filmogênica. A concentração de plastificante em relação ao teor de proteína variou de 1-9g de glicerol /100 g de proteína. A secagem dos filmes deu-se em estufa com ventilação a 30ºC durante 24 h. 2.4

Propriedades Mecânicas

Os filmes foram previamente condicionados por uma semana a 35ºC e umidade relativa (UR) de 75% antes de serem submetidos a ensaios de tração em texturômetro TA-XT2i Stable Micro System. As propriedades mecânicas dos filmes foram avaliadas quanto à tensão de ruptura (σ), alongamento (Є) e módulo de elasticidade (E). 2.5

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

As micrografias das amostras foram realizadas utilizando um microscópio eletrônico de varredura (Philips XL30) com metalizador para recobrir as amostras com uma fina camada de ouro. 2.6

Isotermas de Sorção

A determinação das isotermas de sorção de umidade foi realizada pelo método estático, com soluções salinas. Os filmes foram condicionados a diferentes atmosferas obtidas com soluções salinas saturadas. Os sais NaOH, MgCl2 , K2CO3, Mg(NO3)2, NaNO2, NaCl, KCl foram escolhidos, de maneira a se obter umidades relativas na faixa de 6 a 96%, a uma temperatura de 35ºC. As amostras foram pesadas periodicamente até atingirem peso constante. O modelo de GAB (equação 1) foi utilizado para ajustar os dados experimentais das isotermas de sorção, sendo que A, B e C são parâmetros de GAB. Os dados de sorção foram determinados em triplicatas.

W =

3 3.1

( A.B .C . Aw ) ((1 − C . Aw ) + (1 + (( B − 1).C . Aw ))

(1)

RESULTADOS E DISCUSSÃO Propriedades Mecânicas dos Filmes

Os filmes sem plastificante mostraram-se quebradiços e com baixa capacidade de alongamento, ocasionada provavelmente pela maior agregação das cadeias de proteína. O comportamento da tensão de ruptura dos filmes em relação à concentração de glicerol, está apresentado na Tabela 1, onde pode-se notar que o incremento do glicerol de 1 a 9 ( g glicerol/ g proteína ) reduziu a tensão de ruptura dos filmes em até 8,4 vezes. Porém, a ação do glicerol aumentou o alongamento dos filmes em até 18 vezes. Estes resultados estão de acordo, com trabalhos que estudaram o efeito da concentração do glicerol em outros filmes protéicos [3, 4, 9].

Tabela 1- Efeito da concentração do glicerol nas propriedades mecânicas dos filmes de queratina. Propriedades mecânicas Glicerol (g /g de proteína)

Tensão de ruptura (MPa)

Alongamento (%)

Módulo de Young (MPa/%)

0.00 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09

16,57± 5.49 6,33 ± 0,67 7,64 ± 0,58 5,34 ± 0,74 5,41 ± 0,49 1,97 ± 0.19

1,74 ± 0,24 11,86 ± 2,63 13,81 ± 2.36 19,75 ± 4,07 30,49 ± 7,71 31,92 ± 4,51

10,18 ± 7,08 2,00 ± 0,75 2,11 ± 0,60 1,20 ± 0,21 0,94 ± 0,60 0,21 ± 0,02

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MOORE, G.R.P., MARTELLI, S.M.P., ANDREO, D., GANDOLFO, C.A., MACHADO, R.F.A., BOLZAN, A., LAURINDO, J.B., Revista Matéria, v. 10, n. 1, pp.8 – 13, Março de 2005.

Os resultados de tensão de ruptura dos filmes de queratina indicaram que estes possuem maior resistência mecânica à tração do que filmes de proteína de soja, proteína de amendoim, proteínas de soro de leite, proteína de glúten e proteína de lã citados na literatura [3, 4, 5, 10]. No entanto, os filmes de queratina apresentam menor tensão de ruptura que os filmes de proteína miofibrilar [9]. Segundo a teoria clássica dos polímeros, os plastificantes atuam diminuindo as forças intermoleculares entre as cadeias de macromoléculas adjacentes e provocando redução da temperatura da transição vítrea [9]. Conseqüentemente, a tensão de ruptura diminui e a deformação na ruptura aumenta, com o incremento da concentração de plastificante. Segundo Janghud et al. [4], o glicerol é um dos melhores plastificantes para filmes protéicos. O alto ponto de ebulição, à solubilidade em água e a miscibilidade com a proteína são algumas das características que conferem ao glicerol boas propriedades para aplicação em polímeros em solução aquosa.

Figura 1: Superfície morfológica de filmes de queratina (MEV), A) Superfície do filme de queratina sem glicerol; B) filme de queratina com 1 (g glicerol/ proteína); C) filme de queratina com 9 (g glicerol/g proteína).

3.2

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Nas Figuras 1a e 1b são mostrados detalhes da morfologia da superfície de filmes de queratina com e sem glicerol para um aumento de 1000 vezes, obtidos da microscopia eletrônica de varredura (MEV). A figura 1c mostra um corte transversal do filme de queratina com 9 (g glicerol/ g proteína). Pode-se observar através das Figuras 1 a e 1b que a estrutura granular dos filmes analisados tornouse mais homogênea, à medida que aumentou-se a concentração de glicerol. A figura 1c mostra que os filmes não possuem uma estrutura interna homogênea, apresentando falhas.

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3.3

Isotermas de Sorção de Umidade

As isotermas de sorção de umidade dos filmes de queratina com diferentes concentrações de glicerol estão apresentados na Figura 2, onde pode-se observar que o modelo de GAB ajustou-se satisfatoriamente às isotermas determinadas. 4 3,5 3

W(gw/gss)

2,5 2 1,5 1 0,5 0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

GAB7%

SEMPLASTIFICANTE

0,9

1

aw GLICEROL1%

GAB1%

GLICEROL5%

GAB5%

GLICEROL7%

GABSEMPLASTIFICANTE

Figura 2: Isotermas de sorção de filmes de queratina sem plastificante e com 1, 5, e 7g de glicerol por 100 gramas de proteínas. Na Tabela 2 apresentam-se os valores das constantes da equação de GAB determinados por regressão não linear. As isotermas mostraram claramente que o glicerol aumentou a sorção de água pelos filmes. Quanto maior a concentração de glicerol utilizada na dispersão filmogênica, maior a quantidade de água adsorvida por estes filmes no equilíbrio, em comparação aos filmes obtidos sem plastificante. Tabela 2: Valores das constantes da equação de GAB a 35ºC calculados por regressão não linear para filmes de queratina com diferentes concentrações de glicerol. Glicerol

Parâmetros de GAB (1)

(g /g de proteína) A -

B

C

R2

0,004295 1335574,652 0,95585 0,99

0,01

0,450365

55561537

0,660443 0,97

0,05

0,601132

6060650

0,799043 0,95

0,07

1,054401

5467068

0,726667 0,96

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MOORE, G.R.P., MARTELLI, S.M.P., ANDREO, D., GANDOLFO, C.A., MACHADO, R.F.A., BOLZAN, A., LAURINDO, J.B., Revista Matéria, v. 10, n. 1, pp.8 – 13, Março de 2005.

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CONCLUSÃO a)

A presença de glicerol diminuiu a tensão máxima de ruptura dos filmes e paralelamente aumentou o alongamento máximo atingido pelos mesmos. Assim, é possível controlar a resistência à tração e o alongamento dos filmes através da concentração de plastificante na dispersão filmogênica utilizada no “casting”. b) O plastificante tornou a superfície do filme mais homogênea em comparação aos filmes preparados a partir de dispersões de queratina sem plastificante. c) O glicerol aumentou, consideravelmente a higroscopicidade dos filmes de queratina de penas de frango. d) Uma análise de custos comparativa, deve ser realizada entre os diferentes tipos de proteína usados para a obtenção de filmes, a qual poderá resultar em indicativos úteis para uma futura produção em escala industrial.

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AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao apoio financeiro fornecido através do projeto Perdigão-FINEP/CTAGRO/ FNDCT n0 0.1.02-0104.00. 6

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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