Ostachuk AI - Proyecto de Tesis Doctoral en Biotecnología (2004)

Agustín I. Ostachuk

Expresión de una proteína de fusión ScFv-E2T en células CHO-K1 y plantas transgénicas de alfalfa para el direccionamiento selectivo a células presentadoras de antígenos INTRODUCCIÓN

La Diarrea Viral Bovina (DVB) es una enfermedad infecciosa de distribución mundial que afecta al ganado bovino y se manifiesta por estomatitis erosiva aguda, gastroenteritis y diarrea. La infección en vacas gestantes puede producir muerte embrionaria, aborto, anomalías congénitas, terneros débiles e infección persistente (Baker, 1987). Las pérdidas económicas son significativas. Los animales persistentemente infectados se infectan con una cepa no citopatogénica del virus en los primeros 120 días de gestación, y constituyen una de las principales fuentes de diseminación del virus. El agente causal de la DVB es el virus de la diarrea viral bovina (VDVB). El VDVB es un miembro del género Pestivirus y pertenece a la familia Flaviviridae (Paton, 1995). Es un virus envuelto pequeño de ARN simple cadena positiva de 12.5 Kb que codifica para una poliproteína de alrededor de 4.000 aminoácidos, que luego es clivada para dar las distintas proteínas estructurales y no estructurales maduras. El virus codifica para cuatro proteínas estructurales: la proteína C, que forma la nucleocápside, y las glicoproteínas Erns, E1 y E2, que se encuentran en la envoltura. La glicoproteína E2 es la proteína que media la unión de la partícula viral a su célula blanco y es la que contiene los principales sitios antigénicos para la producción de anticuerpos neutralizantes, que son los que juegan un papel preponderante en el fenómeno de protección frente a la infección. En consecuencia, E2 constituye una excelente herramienta para ser utilizada como inmunógeno en vacunas experimentales a subunidad. La mayoría del ganado bovino está expuesto a la infección con VBDV a lo largo de su vida. Los programas de vacunación son herramientas importantes para el control y la prevención contra la infección (van Oirschot y col., 1999). Las vacunas actualmente en uso son vacunas tradicionales a virus inactivo o atenuado. Existen dudas acerca de la efectividad de estas vacunas para el control de la infección por VBDV. En consecuencia, el uso de proteínas inmunodominantes de VBDV en la forma de vacunas a ADN o a subunidad proteica ha ganado amplio interés (Bolin y col., 1996). Las vacunas a subunidad son las vacunas más seguras que pueden ser desarrolladas, a la vez que permiten la discriminación entre animales infectados y vacunados. El problema del uso de este tipo de vacunas es el de

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diseñar una vacuna que induzca una respuesta inmune protectiva a un costo práctico para aplicaciones veterinarias. Una alternativa para resolver este problema es incrementar la inmunogenicidad de la vacuna resultante (Wang y col., 2004; Lunde y col., 2002; Demangel y col., 2005). Un evento central en el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa es la activación de células T CD4+ por parte de células presentadoras de antígenos (CPAs). Las CPAs presentan péptidos antigénicos a células T CD4+ en un contexto de moléculas MHC clase II. En consecuencia, una forma de obtener una respuesta inmune específica más intensa es incrementar el número de complejos MHC-péptido sobre la superficie de las CPAs. Esto es posible direccionando antígenos a las CPAs, fusionándolos a anticuerpos específicos contra marcadores de superficie de las CPAs. En este trabajo se proyecta el desarrollo de una proteína de fusión entre un anticuerpo de simple cadena (ScFv), específico contra una región conservada de las moléculas MHC clase II, y una forma truncada de la glicoproteína E2 (E2T) de VDVB, sin su dominio transmembrana. Otra alternativa para enfrentar el problema del costo de las vacunas a subunidad es el uso de plantas transgénicas como vector para la expresión del antígeno viral. Las plantas presentan varias ventajas como sistema para la producción de vacunas a subunidad: son económicas, requieren únicamente luz, agua y minerales; son fácilmente adaptables a operaciones en gran escala; poseen un mínimo riesgo de contaminación con potenciales patógenos humanos o de animales; los productos que en ellas se producen pueden no requerir purificación y pueden ser administrados oralmente, simplificando la entrega y reduciendo el costo final (Walmsley y col., 2003). Las plantas forrajeras utilizadas para el pastoreo constituyen el blanco óptimo para el desarrollo de vacunas animales utilizando plantas transgénicas. La alfalfa (Medicago sativa L.) es la forrajera más importante de la Argentina. En promedio se producen 30 millones de toneladas de materia seca / año con un valor de producción de forraje transformado en carne de aproximadamente $1000 millones, o $2500 millones en leche (Hijano y Navarro, 1995). Los estudios hasta ahora realizados han probado que la expresión de antígenos en plantas transgénicas es una estrategia válida para el desarrollo de vacunas. Numerosas plantas transgénicas para la expresión de antígenos virales se han desarrollado en los últimos años (Walmsley y col., 2000; Mason y col., 1992; Ehsani y col., 1997; McGarvey y col., 1995; Wigdorovitz y col., 1999; entre otros). La utilización de las plantas como inmunógeno

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experimental por vía parenteral y oral resultó efectivo en la protección de animales de experimentación frente a la descarga viral. Sin embargo, varias cuestiones restan por resolver. Los niveles de producción de antígenos en plantas transgénicas obtenidas por transformación nuclear son bajos. Cabe mencionar, la expresión de subunidades B de Escherichia coli enterotoxigénica, 0.01% de proteína soluble total (PST) (Haq y col., 1995); la expresión de la proteína superficial de la envoltura del virus de la hepatitis B, 0.01% PST (Mason y col., 1992); y la expresión de la glicoproteína B del citomegalovirus humano, 0.02% PST (Tackaberry y col., 1999). En consecuencia, el incremento en los niveles de producción de la proteína de interés es unos de los desafíos más grandes a los que se enfrenta esta nueva tecnología. Las estrategias llevadas a cabo en nuestro laboratorio tendientes a enfrentar este problema estuvieron principalmente dirigidas hasta la fecha a desarrollar métodos que faciliten la selección de las plantas que presentan los más altos niveles de expresión de la proteína de interés. Se desarrolló un método experimental basado en la fusión del gen de interés al gen reportero glucuronidasa A (gus A), lo cual permite la selección de las plantas transgénicas por la actividad enzimática de la –glucuronidasa (GUS) (Dus Santos y col., 2002). En orden de mejorar la expresión de la proteína heteróloga, la secuencia de ADN fue adaptada de manera de contener los codones comúnmente encontrados en plantas. Esta metodología permitió alcanzar niveles de expresión de la proteína heteróloga del orden de 0.1% de proteína soluble total. Una alternativa para incrementar los niveles de expresión en plantas transgénicas es el uso de promotores más fuertes. El promotor 35S del virus del mosaico del coliflor (CaMV) ha sido ampliamente utilizado en biotecnología vegetal (Williamson y col., 1989). Por otra parte, el virus del mosaico de los vasos de la mandioca (CsMV) es un pararetrovirus que infecta las plantas de mandioca en Brasil. El virus contiene un promotor que dirige la expresión constitutiva de altos niveles de genes heterólogos en diferentes plantas, órganos y tejidos de las mismas (Verdaguer y col., 1996). Estos resultados indican un potencial uso del promotor para aumentar y mejorar los niveles de expresión de proteínas heterólogas en plantas transgénicas. En conclusión, este proyecto propone desarrollar dos estrategias novedosas para el desarrollo de vacunas a subunidad contra VBDV: 1) Direccionamiento del antígeno viral a células presentadoras de antígenos. 2) Expresión del antígeno viral en plantas transgénicas de alfalfa.

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OBJETIVOS

El objetivo general del trabajo es contribuir a la investigación y el desarrollo de vacunas a subunidad contra VBDV. Se proponen dos estrategias diferentes para el desarrollo del trabajo. A continuación se enumeran las mismas con sus respectivos objetivos específicos:

ESTRATEGIA 1: Direccionamiento del antígeno viral a células presentadoras de antígenos (CPA):  Expresión de las glicoproteínas E2T y ScFv-E2T en células CHO-K1.  Evaluación de los niveles de producción e inmunogenicidad de las proteínas heterólogas.  Estudio del mecanismo de presentación de las proteínas recombinantes y de la respuesta inmune diferencial generada por las mismas.

ESTRATEGIA 2: Expresión del antígeno viral en plantas transgénicas de alfalfa:  Construcción de plantas transgénicas de alfalfa que expresen las glicoproteínas E2T y ScFv-E2T bajo el control del promotor del virus del mosaico de los vasos de la mandioca (CsVMV).  Evaluación de los niveles de producción e inmunogenicidad de las proteínas heterólogas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Construcción del anticuerpo de simple cadena (ScFv). El gen codificante para el ScFv será generado por PCR a partir del ADNc correspondiente a un anticuerpo monoclonal de ratón (1F12) que reconoce moléculas MHC clase II de cerdo.

Clonado de una forma truncada de la glicoproteína E2 de VBDV (E2T). ARN total de células MBDK infectadas con VBDV (cepa NADL) se aislará y retrotranscribirá por técnicas estándares. Una forma truncada de E2 sin su dominio transmembrana (E2T) será amplificado a partir del ADNc obtenido y clonado en el vector pGEM-T Easy (Promega).

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Una versión modificada de E2T, sin codón de inicio en el extremo 5´ de la secuencia, será amplificado y clonado al extremo 3´ de ScFv de manera de obtener ScFv-E2T.

Transfección y selección de líneas celulares estables de CHO-K1 productoras de las proteínas recombinantes. Las regiones codificantes de E2T y ScFv-E2T serán subclonadas en el vector de expresión pcDNA 3.1 (Invitrogen). Células CHO-K1 serán transfectadas con los vectores de expresión usando lípidos catiónicos (LipofectAMINE 2000, Invitrogen). Veinticuatro horas post-transfección, las células serán subcultivadas en presencia del antibiótico de selección Geneticina (Invitrogen). La obtención de clones que expresen establemente los transgenes se hará por el método de dilución al límite. Los clones positivos serán amplificados y congelados en nitrógeno líquido.

Western blot. Las proteínas presentes en sobrenadantes de cultivos, lisados celulares o proteínas purificadas serán separadas en un SDS-PAGE, transferidas a una membrana de PVDF, incubadas con un anticuerpo monoclonal comercial específico para E2 de VBDV, y luego con un anticuerpo anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa. La detección se realizará por quimioluminiscencia (Perkin Elmer).

ELISA. Las placas serán sensibilizadas overnight a 4°C con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-E2. Las muestras serán adicionadas a la dilución correspondiente e incubadas 1 h a 37°C. Como primer anticuerpo se utilizará en primera instancia el suero de animales bovinos seropositivos para VBDV. Como segundo anticuerpo se empleará un anticuerpo anti-IgG bovina acoplado a peroxidasa. La reacción se visualizará usando ABTS (Sigma) y midiendo la absorbancia a 405 nm.

Purificación de las proteínas recombinantes por cromatografía de afinidad de metales iónicos (IMAC). Las proteínas recombinantes serán purificadas a partir de los sobrenadantes de las líneas celulares estables de CHO-K1 por IMAC. Se utilizará para ello la resina Ni-NTA de Qiagen. La elución se logrará con concentraciones crecientes de imidazol. La pureza y la concentración proteica se determinarán por SDS-PAGE y por tinción con Coomasie blue usando una curva de BSA.

Unión de ScFv-E2T y E2T a la superficie de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). PBMCs serán aislados a partir de sangre heparinizada usando Ficoll-

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Paque Plus (Amersham). 5  105 células serán usadas por ensayo e incubadas con: 1) proteínas recombinantes (0,5 ug, 30 min. a 4°C); 2) anticuerpo monoclonal anti-E2 (30 min. a 4°C); 3) anticuerpo anti-IgG de ratón acoplado a FITC (30 min. a 4°C). El análisis será realizado usando un citómetro de flujo FACScan y el software CellQuest (BD Biosciences).

Proliferación de células T in vitro por CPAs bovinas. PBMCs provenientes de animales bovinos immunizados serán cultivados in vitro. Las células no adherentes serán utilizadas como fuente de células T. Las células adherentes serán usadas como CPAs y se incubarán con distintas concentraciones molares de antígeno. Luego se adicionarán los linfocitos y las células se co-cultivarán por 4 días. Al día 3, las células serán tratadas por 18 hs. con [H]timidina (1 Ci/well). Las células serán cosechadas usando un cosechador

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semiautomático (Skatron Instruments), y la cantidad de 3[H]timidina incorporada se determinará en un contador de centelleo Wallac 1414 Winspectral (Perkin Elmer).

Evaluación de la respuesta inmune inducida por RT-PCR en tiempo real (Taqman). Los primers y sondas para la detección de citoquinas relevantes serán diseñados empleando el programa Primer Express 3.0 (Applied Biosystems). PBMCs provenientes de animales bovinos immunizados serán cultivados in vitro. Las células no adherentes serán utilizadas como fuente de células T. Las células adherentes serán usadas como CPAs y se incubarán con las proteínas recombinantes E2T y ScFv-E2T. Luego se adicionarán los linfocitos y las células se co-cultivarán por distintos tiempos (2 a 18 hs.). El ARN total de las células se purificará utilizando el RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen). El ADNc se obtendrá utilizando la enzima Supersript II (Invitrogen), de acuerdo a las indicaciones del proveedor. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizarán en un equipo (Applied Biosystems).

Construcción del plásmido binario para la expresión de transgenes en plantas transgénicas de alfalfa. El plásmido binario comercial pBI 121 (Clontech) será modificado de manera de dirigir la expresión de transgenes bajo el promotor CsVMV. En consecuencia, el gen GUS será reemplazado por un sitio de clonado múltiple y el promotor 35S se intercambiará por el promotor CsVMV.

Producción de plantas transgénicas de alfalfa. Las regiones codificantes de E2T y ScFvE2T serán clonadas en el plásmido binario y se utilizarán para la obtención de plantas transgénicas de alfalfa por el método de transformación mediado por Agrobacterium

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tumefaciens (Shetty y col., 1993). Brevemente, se generarán Agrobacterium tumefaciens recombinantes por electroporación con las construcciones obtenidas (Wen-Jun y col., 1989) y se infectarán pecíolos derivados de plantas de alfalfa (genotipos C23 y 1917) con las mismas. Posteriormente, los pecíolos serán cultivados in vitro en condiciones adecuadas para la obtención de plantas transgénicas.

Immunización de animales bovinos. Animales bovinos serán immunizados con distintas dosis de E2T y ScFv-E2T, producidas en células CHO-K1 y plantas transgénicas de alfalfa. Las vacunas serán preparadas en adyuvante oleoso y se inocularán por vía subcutánea.

FACTIBILIDAD DEL DESARROLLO DEL PLAN DE TESIS

El plan de trabajo propuesto se llevará a cabo en el Instituto de Virología del Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agrarias (CICVyA), INTA, Castelar, Buenos Aires. El laboratorio cuenta con 7768 m2 de instalaciones divididas en las siguientes secciones: a) cultivo de tejidos, b) vacunas experimentales, c) biología molecular, d) inmunología viral, e) diagnóstico viral. Cada sección se encuentra herméticamente aislada, con presión de aire filtrado controlada, vacío y aire centrales, cámara de 4°C, cámara de 37°C, cuarto oscuro e instalaciones para trabajo con radioactivos. El equipo general del laboratorio cuenta con espectrofotómetros, cicladores, balanzas de precisión, equipos de electroforesis y transferencia, fuentes de poder, analizador de imágenes, transiluminador, lectores de placas de ELISA, centrífugas, ultracentrífugas, microcentrífugas, agitadores, flujos laminares, horno de hibridación, contador de centelleo, incubadores de CO2, equipos de microscopía óptica y de fluorescencia, congeladoras de 20°C, -70°C y -180°C, equipo de fotografía, etc. Para el empleo de animales de experimentación se cuenta con boxes de aislamiento para más de 100 bovinos, con aire filtrado y todas las instalaciones y servicios requeridos para su clasificación como P-3A. Además se cuenta con instalaciones para albergar a 1000 cobayos, 100 conejos y 2000 ratones, animales que son provistos por el bioterio central del CICVyA. La parte de biotecnología vegetal será desarrollada en las instalaciones del Instituto de Genética "Ewald A. Favret" (IGEAF), CICVyA, INTA (Castelar). El mismo se encuentra completamente equipado para el desarrollo de tareas de transformación de plantas de alfalfa: flujos laminares, agitadores, cañón génico, cicladores, equipos para electroforesis y

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transferencia, congeladoras, etc. El IGEAF cuenta a su vez con un invernáculo de 50 m2 con temperatura controlada y con cámaras Fitotron con luz y temperatura controlada. Los recursos financieros requeridos para la realización del trabajo provienen de dinero asignado por la institución (INTA) para tal fin y de proyectos de colaboración con el grupo español del Dr. José Escribano (INIA, Madrid, España).

REFERENCIAS

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