POLIMORFISMOS NA REGIÃO PROMOTORA DO GENE PGH EM SUÍNOS DE RAÇAS DIVERGENTES

POLIMORFISMOS NA REGIÃO PROMOTORA DO GENE PGH EM SUÍNOS DE RAÇAS DIVERGENTES1 AMAURI ARIAS WENCESLAU2, PAULO SÁVIO LOPES 3, SIMONE ELIZA FACIONI GUIMARÃES 4, LUIZ LEHMANN COUTINHO5, FREDERICO DE CASTRO FIGUEIREDO6, LILIAN GIOTTO ZAROS7, MARCELO MARQUES ZERILLO8

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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

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Doutor em Genética e Melhoramento Animal - Universidade Federal de Viçosa – Departamento de Zootecnia, Av. Ph Holfs, s/n CEP: 36571-000 Viçosa, MG, Brasil

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Doutorando em Zootecnia - Universidade Federal de Viçosa – Departamento de Zootecnia, Av. Ph Holfs, s/n CEP: 36571-000 Viçosa, MG, Brasil

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Pós-graduando em informática e professor da FACTU, Unaí - MG

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Pesquisadora Visitante -- Universidade Federal de Viçosa – Departamento de Zootecnia, Av. Ph Holfs, s/n CEP: 36571000 Viçosa, MG, Brasil

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Estudante de graduação em Zootecnia - Universidade Federal de Viçosa – Departamento de Zootecnia, Av. Ph Holfs, s/n CEP: 36571-000 Viçosa, MG, Brasil

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Bolsista UNIEMP - Universidade de São Paulo-Esalq – Laborátorio de Biotecnologia Animal, Av. Pádua Dias, 11 CEP: 13418-900 Piracicaba, SP, Brasil

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Professor assistente do Departamento de Ciências Biológicas da UESB - BA

R ESUMO : Desenvolveu-se um conjunto de procedimentos computacionais que viabilizam vários cálculos envolvidos no desenho e escolha de oligonucleotídeos de DNA ou “primers”, que são utilizados na técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). O PCRSYS – Sistema Aplicado à Reação em Cadeia da Polimerase – é uma ferramenta que auxilia o geneticista em pesquisas e estudos de genes já seqüenciados ou que estão sendo seqüenciados, disponibilizando um banco de dados importante para as pesquisas nas áreas de biotecnologia animal ou vegetal. Os cálculos executados pelo sistema permitem desenhar e escolher “primers” utilizados na PCR com rapidez e precisão, aumentando as chances de êxito no processo, reduzindo o tempo do experimento e evitando o desperdício de materiais de preço bastante elevado. O sistema atendeu adequadamente aos objetivos propostos que foram comprovados no Laboratório de Biotecnologia Animal do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa, onde “primers” desenhados e escolhidos com o auxílio desse “software”, amplificaram fragmentos de vários genes com especificidade e boa produtividade, justificando-se, assim, a sua utilização em outras análises.

PALAVRAS-CHAVE: Bioinfomática, biotecnologia, DNA, oligonucleotídeos, PCR, sistema computacional. SOFTWARE DEVELOPMENT FOR DESIGN AND CHOICE OF PRIMERS – PCRSYS

ABSTRACT:A computer procedures was developed to allow a lot of several calculations involved in the primers design and choice which are used in the polymerase chain reaction technique (PCR). PCRSYS – Polymerase Chain Reaction Applied System - it is a new geneticist tool used in researches and studies of sequencing genes allowing an important databases for the animal or vegetable researches in the biotechnology area. Quickly and accurate evaluations made by the system above allow to design and to choose primers used in PCR, increasing the success in the process, reducing the time of the experiment and avoiding the material losses. The system was appropriate to the proposed objectives, which were proven in the “Laboratório de Biotecnologia Animal of Universidade Federal de Viçosa – Brazil”, where primers were designed and chosen by the PCRSYS. These primers have amplified several genes fragments with high specificity and good productivity, showing a possible use in further analyses.

KEYWORDS: Bioinformatics , biotecnology, DNA, primer, PCR, software INTRODUÇÃO A técnica chamada de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi concebida por Kary Mullis e colaboradores na década de 80 e causou uma revolução na biologia, tanto na pesquisa visando o entendimento de processos biológicos fundamentais como nas áreas envolvendo diagnósticos e melhoramento de plantas e animais. A técnica permite que o DNA de uma região selecionada no genoma seja amplificado um bilhão de vezes, desde que pelo menos parte de sua seqüência nucleotídica já seja conhecida para projetar dois oligonucleotídeos de DNA sintéticos, também chamados de “primers”, cada um complementar a uma das fitas da dupla-hélice de DNA e posicionados em lados opostos da região a ser amplificada. Um fator importante que influencia a qualidade da PCR é o desenho e a escolha adequada dos “primers”, por isso algumas considerações devem ser observadas para garantir o anelamento correto entre eles e a seqüência alvo de DNA (RYCHLIK, 1993). Dentre elas destacam-se: os “primers” escolhidos devem ter uma seqüência única dentro da região a ser amplificada; devem possuir temperatura de anelamento (Tm) similar; devem anelar em sítios espaçados entre 100 a 600 pares de base (pb), a composição de bases e o comprimento dos “primers” devem ser mantidos em padrões pré-estabelecidos e, a estabilidade de duplex determinada de maneira precisa, por meio do cálculo da energia livre de formação de duplex (?G). Os cálculos dos fatores citados são complexos e tornam-se inviáveis se não forem totalmente automatizados e, principalmente, a escolha incorreta de “primers” acarreta prejuízos consideráveis. Portanto, foi proposto o desenvolvimento de um “software” que calcule tais fatores para otimizar os trabalhos em laboratórios de biotecnologia animal e vegetal.

MATERIAL E MÉTODOS O método utilizado para o cálculo do ?G é uma simplificação do método de BRESLAUER et al. (1986), descrito por RYCHLIK (1993). O cálculo da Tm foi baseado na fórmula empírica proposta por WU et al., (1991). No desenvolvimento do sistema foi utilizada a técnica de análise estruturada (GANE e SARSON, 1995), e os seguintes recursos computacionais: Software Sistema Operacional Microsoft Windows 98; Ferramenta Case - PowerDesigner 6.0: Ferramenta de análise e modelagem de dados, que facilita a criação de aplicações e bancos de dados eficientes de alta qualidade. Linguagem de Programação – Delphi 5: O Delphi é uma ferramenta RAD (Rapid Application Development) que facilita o desenvolvimento de aplicações Cliente/Servidor, utilizando a linguagem Object Pascal (OLIVEIRA e MEDEIROS, 2000). Possui o tratamento baseado em formulários e orientado a objetos. Além disso, possui um compilador rápido, com suporte a banco de dados e integração com programação em Windows. O Delphi 5 apresenta ainda suporte à automação OLE (vinculação e embutimento de objeto), tipo de dados variante, herança visual de formulários, suporte a interfaces e componente modelo de objeto ou COM (component object model). Sistema Gerenciador de Banco de Dados - Microsoft Access 97: O Access permite o gerenciamento de bancos de dados relacional, um modelo de integridade referencial e regras de validação para tabela, possui definição para cada campo na tabela, tanto de formato quanto de padrão. O Access evita atualizações ou eliminações inconsistentes devido à integridade referencial e suporta todos os tipos de campos necessários (VIESCAS, 1998). Para a execução do sistema são necessários os recursos: Hardware Mínimo-Microcomputador de 100 MHz, 16 MB de memória RAM, disco rígido de 800 MB, placa de vídeo de 2 MB, monitor color SVGA, drive de disquete de 1.44 MB, teclado e mouse; Impressora jato de tinta colorida; Software Sistema Operacional Microsoft Windows 98; DAO (Data Access Object) versão 3.5 – Conjunto de arquivos que permitem o acesso ao banco de dados Access 97 (gratuito através de download); Pessoal - Os profissionais qualificados que terão capacidade para operá-lo são geneticistas e pesquisadores da área de biotecnologia animal ou vegetal. Estratégia de teste

Para verificar a confiabilidade das operações efetuadas pelo Sistema, todo o conjunto de dados, com seus respectivos cálculos, foram realizados e conferidos manualmente. Os dados utilizados nas simulações foram fornecidos pelos colaboradores do projeto, pertencentes ao Laboratório de Biotecnologia Animal, do Departamento de Zootecnia, da Universidade Federal de Viçosa.

R ESULTADOS E DISCUSSÃO O PCRSYS – Sistema Aplicado a Reação em Cadeia da Polimerase – é uma ferramenta que auxilia o geneticista em pesquisas e estudos de genes já seqüenciados ou que estão sendo seqüenciados. Os cálculos executados pelo sistema permitem ao geneticista desenhar “primers” para utilizá-los na PCR , com rapidez e precisão, reduzindo o tempo do experimento e evitando o desperdício de materiais de preço bastante elevado. Sua interface amigável com escolha de idioma e facilidade de uso é de grande valia para seus usuários que contam ainda com possibilidades de importação e exportação de dados (Figura 1). A arquitetura cliente/servidor que foi utilizada na sua construção permite que o sistema seja operacionalizado em rede, tornando possível sua utilização por vários pesquisadores ao mesmo tempo, compartilhando informações entre si. O sistema conta também com um cadastro de endereços da Internet, criando um banco de dados com os endereços relevantes e que servem de fonte de pesquisas e importação de seqüências de genes. Um exemplo das telas de interfaces é apresentado Tela 4 - Menu Arquivos na Figura 2. Os testes realizados no Laboratório de Biotecnologia Animal, do Departamento de Zootecnia, da Universidade Federal de Viçosa, utilizando o “software” para desenhar “primers” para amplificar fragmentos de genes de suínos, como por exemplo: Hormônio de Crescimento, Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-I, Fator Miogênico 5 e Leptina, foram eficientes (FERREIRA et al., 2000). A escolha inadequada dos “primers” para PCR pode causar resultados inespecíficos, o que implica em perda de reagentes químicos, horas de trabalho de técnicos especializados e o uso de equipamentos laboratoriais.

CONCLUSÕES O sistema atendeu adequadamente aos objetivos propostos, ou seja, calculou com precisão vários parâmetros utilizados para desenhar “primers” para PCR. Novas implementações serão desenvolvidas no sistema para aprimorar a detecção de seqüências candidatas a “primers” e, também, para análise de homologia entre seqüências de DNA.

R EFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRESLAUER, K.J., FRANK, R., BLOCKER, H., MARKEY, L.A. 1986. Predicing DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 3746-3750. FERREIRA, W.J., WENCESLAU, A.A., GUIMARÃES, S.E.F. et al. 2000. Procedimentos computacionais para auxiliar à seleção de primers. CONGRESSO NACIONAL DE GENÉTICA, 46, 2000, Águas de Lindóia. Anais... Águas de Lindóia: SBG, 2000, 23(3):247. GANE, C., SARSON, T. Análise Estruturada de Sistemas. Rio de Janeiro: LTC, 1995, 257p. OLIVEIRA, A., MEDEIROS, M. Delphi 5 - conceitos básicos. Florianópolis: Advanced, 2000, 224p. RYCHLIK, W. 1993. Selection of primer for polymerase chain reaction. In: Methods in molecular biology. Ed. White, B.A. Totowa, NJ: Humana Press, p.31-40.

Figura 1– Resolução do produto de PCR referente ao fragmento da região promotora do gene PGH em suínos, em gel de poliacrilamida a 5%. Padrão 1Kb: marcador de peso molecular 1 Kb DNA Ladder, Life Techonologies; canaletas 1 e 2 região promotora estudada

Heterozigoto: TATA1 e TATA2

Homozigoto: TATA1

Figura 2 – Eletroferogramas do seqüenciamento automático da região TATA-box dos animais da população estudada. O da esquerda representa um animal heterozigoto (N: picos A e T), e o da direita mostra um animal homozigoto para o alelo TATA2