Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia

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Apostila de Aulas Práticas Bacteriologia Nutrição

Raquel de Souza Sant’Anna (Monitora da Disciplina de Bacteriologia em 2007)

Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira (Professor Adjunto de Bacteriologia) 2007

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Apresentação O aprendizado teórico e prático de microbiologia, incluindo a bacteriologia, é muito importante para o profissional da área de nutrição. As áreas de atuação em controle microbiológico de alimentos, treinamento de manipuladores, tecnologia na produção de alimentos, entre outras, exigem um profundo conhecimento desta disciplina. A apostila é o material de apoio às aulas práticas disponibilizado aos alunos. Esta contém explicações teóricas e práticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma clara e didática. A disciplina já possuía uma apostila de aulas práticas desde 2001, mas é necessária constante renovação para que os assuntos sejam abordados de maneira atualizada e direta para despertar o interesse dos alunos. Cada assunto apresenta uma introdução contendo a teoria do tema abordado, assim como a sua aplicação e importância no exercício da profissão, objetivando o melhor entendimento do tema, dos materiais a serem utilizados, da execução e dos resultados obtidos. No final de cada assunto o aluno poderá tirar as suas conclusões da prática executada e encontrará algumas questões de fixação. A apostila apresenta, também, figuras ilustrando a atividade a ser realizada, facilitando a compreensão do aluno. Finalmente procurou-se acentuar a importância e aplicação de cada prática no contexto das atividades de um nutricionista de modo a estimular o aprendizado. Esperamos que você, aluno, aproveite ao máximo este recurso didático! Lembre-se, qualquer dúvida, não hesite em perguntar ao seu professor ou aos monitores! Os autores.

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Índice

Como trabalhar no laboratório de microbiologia ................................................................. 1 Assunto 1: Meios de cultura e Técnicas de Semeadura ..................................................... 5 Assunto 2: Bactérias no Ambiente .................................................................................... 15 Assunto 3: Controle Microbiano ........................................................................................ 18 Assunto 4: Coloração de Gram ......................................................................................... 27 Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos – TSA (Antibiograma) ................... 34 Assunto 6: Cocos Gram positivos ..................................................................................... 41 Assunto 7: Coloração de Zihel-Neelsen (Visualização de Bactérias Espiraladas)............ 52 Assunto 8: Bacilos Gram-negativos .................................................................................. 59 Assunto 9: Contagem em Placa e Técnica do Número Mais Provável (NMP).................. 69 Bibliografia ........................................................................................................................ 80

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Como trabalhar no laboratório de microbiologia É importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um laboratório de microbiologia em geral, não importando se o microorganismo estudado será uma bactéria, um fungo ou um vírus.

Cuidados fundamentais Alguns experimentos que nós realizaremos podem ser perigosos se você manipular os materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente. São necessárias algumas medidas de segurança quando se trabalha com microorganismos e substâncias químicas, além de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos cortantes e outros materiais. Se você tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, não hesite em chamar o professor ou o monitor para te auxiliar.

Procedimentos de Precaução e Segurança O laboratório de microbiologia é um lugar onde culturas de microorganismos são manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em conjunto com boas técnicas assépticas, num local de trabalho limpo e organizado. Também como técnicas assépticas, todos os materiais que serão utilizados serão esterilizados para eliminar todos os microorganismos presentes ali, e deve-se tomar muito cuidado para não haver recontaminação deste material com microorganismos do ambiente. Geralmente, os microorganismos estudados não são patogênicos, mas ainda assim, devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como se fosse potencialmente patogênico, lembrando que muitos microorganismos que geralmente não são patogênicos podem causar doenças oportunistas. Cada estudante deve aprender e praticar as práticas assépticas no laboratório. Isto é importante para prevenir a contaminação de suas mãos, cabelos e roupas com material contaminado, além de evitar a contaminação do seu trabalho e proteger seus colegas que estarão trabalhando na bancada ao lado. A importância da assepsia e desinfecção apropriadas está descrita na apostila e será observada em uma das aulas práticas. Em geral, todos os procedimentos de segurança e precauções tomados no laboratório de microbiologia se resumem em: 1 – restringir os microorganismos presentes em culturas e amostras aos recipientes (vidros ou sacos de coleta, placas ou tubos) quando da sua coleta, crescimento (incubação) ou sua análise; 2 – prevenir a contaminação com microorganismos ambientais (normalmente presentes nas mãos, cabelos, roupas, superfícies e no ar) das amostras e culturas analisadas, o que pode interferir nos resultados obtidos. Mãos e superficies devem ser higienizados e tratadas com anti-sépticos e desinfetantes corretos, jalecos devem ser utilizados, cabelos compridos devem ser presos para trás, e as áreas de trabalho devem estar livres de objetos desnecessários. Lembre-se que na hora de transferir os microorganismos ou culturas não devemos utilizar a boca (por exemplo, para pipetar). 1

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia A conduta pessoal no laboratório de microbiologia deve ser sempre observada. O monitor ou professor deve ser sempre consultado caso haja algum problema.

Conduta geral no laboratório 1 – Sempre identifique e confira o seu material antes de iniciar os trabalhos no laboratório. 2 – Antes de entrar no laboratório, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papéis e outros itens que não serão utilizados na aula prática. 3 – Para entrar no laboratório, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferência limpo e branco. 4 – No início e no final de cada aula prática, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada com uma solução desinfetante própria. Este espaço deve ser mantido limpo e arrumado durante o decorrer de toda a aula prática. 5 – Antes de começar devemos lembrar: - prenda seu cabelo comprido para trás, longe da chama do Bico de Bunsen; - não use jóias e acessórios durante a aula prática; - mantenha seus dedos, lápis, caneta e qualquer objetos longe da sua boca; - não fume, coma ou beba nada no laboratório; - não fique andando pelo laboratório, pois atividades desnecessárias podem causar acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminação. 6 – Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.) 7 – Anote todos os detalhes da aula prática e faça os exercícios de fixação de cada assunto. 8 – Se você está em dúvida quanto ao procedimento, confira na apostila. Se a dúvida persistir, chame o professor ou monitor. Evite tirar dúvidas com os colegas de outros grupos. 9 – Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer, chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha desinfetante sobre o local (superfícies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha. 10 – Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra. 11 – Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratório em quaisquer circunstâncias. 12 – antes de sair do laboratório, cuidadosamente lave e faça a anti-sepsia em suas mãos. Lembre-se de lavar seu jaleco para a próxima aula prática.

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Como trabalhar com o microscópio Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios:

- Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para mantê-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o pó e a multiplicação de fungos (Obs: as capas devem ser lavadas periodicamente). - Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas. - Jamais comer ou beber próximo ao equipamento. - Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na base, ou com as duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada. - Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com papel de filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina; em de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio.

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: à Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique exatamente no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para evitar o choque com a lamínula. à Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macrométrico muito lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalização com o micrométrico. à O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face da objetiva e a parte superior da lamínula, diminui quando a ampliação é aumentada. à Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva de menor aumento. à Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, suspenda o tubo e coloque uma gota de óleo no centro da operação; o óleo deve ter o mesmo índice de refração da objetiva; à Abaixe o tubo até colocar a lente frontal em contato com a gota de óleo ainda convexa, até a mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem aparecer, complete a focalização com o micrométrico.

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Assunto 1: Meios de cultura e Técnicas de Semeadura Introdução O estudo de bactérias exige o prévio isolamento e identificação, para tanto, são utilizados diversos meios de cultura diferentes. Meio de cultura é uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de microorganismos. A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. As exceções são as ricketsias, clamídias, Mycobacterium leprae e Treponema, que são parasitos intracelulares obrigatórios. Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados em culturas de células e ovos embrionados. Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência de um determinado número de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação. A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura. Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios, cultura e material utilizado) requer certos cuidados para evitar a contaminação. Esses procedimentos são denominados técnicas assépticas.

Fundamentação teórica ®

Meios de Cultura

Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas:

Naturais

São aqueles encontrados na natureza, de origem vegetal (p.ex.: pedaço de batata, de abóbora) ou animal (p.ex.: gema de ovo, pedaço de carne) São aqueles fabricados em laboratório, constituído de substâncias químicas, podendo ser definidos ou indefinidos (complexos)

Quanto à composição Definidos Artificiais Indefinidos

Quanto

ao

estado Líquido

Possui composição definida, ou seja, se conhece qualitativa e quantitativa sua composição. A sua composição real não é conhecida, apenas é feita uma estimativa qualitativa. Por exemplo: meios suplementados com sangue, gema de ovo, alimentos...

São desprovidos de Agar à caldo

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia físico

Semi-sólido

Apresentam em sua composição até 1% de Agar.

Sólido

Apresentam em sua composição de 1,5 a 2,5% de Agar.

Simples

Só possui os nutrientes básicos para o crescimento das bactérias em geral.

Enriquecido

Além dos nutrientes básicos possui elementos nutritivos a mais, como fatores promotores de crescimento (sangue...), mas não é específico.

De enriquecimento

É suplementado com nutrientes específicos para o microorganismo que se deseja pesquisar. Além disso, possui nutrientes agentes inibidores de determinados microorganismos, mas não permite o isolamento da bactéria, pois é um meio líquido. Por exemplo: aminoácidos (lisina à Salmonella)

Quanto à finalidade e Seletivo características

Diferencial

Indicadores

De estoque

®

Possui agentes inibidores de determinados microorganismos. Permite a identificação e isolamento da bactéria, pois é um meio sólido (permite a visualização de UFCs). Por exemplo: Agar EMB à inibe Gram+ Permite a diferenciação de diferentes microorganismos. Por exemplo: a diferenciação de bactérias fermentadoras e não fermentadoras da lactose no Agar EMB. Possuem agentes que indicam determinadas reações no meio, para a determinação do metabolismo das bactérias. Por exemplo: ferro no meio à pode indicar a produção de H2S pelo enegrecimento do meio. (sulfeto ferroso) *** geralmente o agente é um indicador de pH Meios onde são estocadas culturas puras para posterior utilização. Geralmente são meios semisólidos.

Técnicas de Semeadura

As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de materiais, meios e culturas. As técnicas de assepsia incluem: è fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsia das mãos ANTES e DEPOIS de qualquer trabalho. (1) 6

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia è trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen. (2) è esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas bacteriológicas) ANTES e DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis. (3) è flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo desejado será inoculado. (4)

De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação. A transferência de inóculo de um meio para outro também é denominada genericamente como repique. A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação: ·

Semeadura em meios sólidos Estria sinuosa: semear com alça ou agulha bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). Objetivo: obtenção de intensa massa de microorganismos

Meio inclinado em tubos

ou

Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, fazendo uma linha reta, com cuidado de não ferir o Agar, partindo da base para a extremidade do bizel (superfície inclinada do meio). 7

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Objetivo: obtenção microorganismos.

de

pequena

massa

de

Picada Central: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas. Meio em camada alta

Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas.

Meio em placa de Petri

Pour-plate ou disseminação (método em profundidade): Transferir 1 ml da cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares. Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado também para análise de microorganismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após o endurecimento da primeira camada. Estria simples: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A estria pode ser realizada em movimento de zigzag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta). Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio gema de ovo, sangue...), e produção de pigmentos. Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos: à em 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, 8

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ou

girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante. à em 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio. Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria. Spread-plate ou distensão: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou alça bacteriológica / swab / alça Drigalsky. Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana. Esta técnica é muito utilizada na realização de antibiogramas.

·

Semeadura em meios semi-sólidos Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em algumas técnicas. Além disso, o meio também é utilizado para estocar culturas puras.

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Semeadura em meios líquidos Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou líquido) é introduzida no meio líquido, com agitação da alça, para maior difusão dos microorganismos (da alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar o tubo a 30° e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o tubo retornar à posição original o inóculo se difundirá no meio. Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em meio líquido.

Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è executar e determinar a finalidade das principais técnicas de semeadura de bactérias em diferentes meios (líquidos, semi-sólidos e sólidos), tanto em tubos quanto em placas; è caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um; è identificar e executar as técnicas de assepsia em laboratório.

Material Para a atividade prática serão utilizados: - Placa de Petri com Agar - Tubo com Agar inclinado - Placa de Petri estéril - Tubo com Agar semi-sólido - Tubo com Agar em camada alta - Cultura bacteriana em caldo e em Agar - Amostra de água em tubo (para a técnica do pour plate) - Pipetas estéreis - Alça e agulha bacteriológicas

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Execução da prática ®

A partir de cultura em placa:

- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colônia com auxílio de uma alça bacteriológica e transferir para o tubo com caldo, através do processo de difusão.

®

A partir de cultura em caldo:

- a partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculações: 1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com caldo, através da técnica de difusão. 2. Com auxílio de uma alça ou agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar inclinado, através da técnica de estria (sinuosa ou reta). 3. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para a placa com Agar, através da técnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias). 4. Com auxílio de uma agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar semisólido, através da técnica de picada central.

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®

A partir da amostra de água:

- com o auxílio de uma pipeta estéril, transferir 1 ml da amostra de água para uma placa estéril e adicionar o meio fundido, realizando a técnica do pour plate.

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. Observar e interpretar o crescimento nos meios, destacando aquele empregado no isolamento de colônias (esgotamento em estrias).

Exercícios de fixação 1. Qual a diferença entre os meios “de enriquecimento” e “seletivo”? 2. Qual a finalidade da técnica do “spread plate” ou técnica do espalhamento? 3. Por que não devemos cruzar as estrias na técnica do esgotamento em estrias? 4. Por que devem ser realizadas as técnicas assépticas? 5. Por que utilizamos diferentes meios durante a análise de um determinado material (p.ex.: alimento)? 6. Para uma cultura que esteja guardada há muito tempo (sob refrigeração), qual o tipo de meio devemos utilizar para retornar a utilizá-la numa atividade prática? 7. Para determinar a presença de um microorganismo específico num material que esteja muito contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar?

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Observações

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Assunto 2: Bactérias no Ambiente Introdução A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes. A exposição de alimentos, sua manipulação e conservação incorretas, são fatores que levam à sua contaminação por microorganismos. Os microorganismos podem ter relação com o alimento de três formas: è adicionados intencionalmente: são aqueles que provocam alterações desejáveis nos alimentos, como os lactobacilos, que fermentam o leite, transformando-o em iogurte, queijo (etc). è deterioradores: durante o seu desenvolvimento, estes microorganismos causam mudanças desagradáveis nos alimentos, tornando-os impróprios para o consumo, como os coliformes, que deterioram alimentos como queijos frescais, leite (etc). è patogênicos: podem colonizar o alimento e representam um risco à saúde de quem ingerir este alimento (com o microorganismo ou com toxinas formadas por este), como Salmonella sp., Staphylococcus aureus e outros.

Fundamentação teórica As bactérias estão presentes em todos os ambientes. Muitas vezes, sua presença não é prejudicial, como os microorganismos que colonizam a nossa pele e o nosso trato gastrintestinal. Algumas vezes esta presença é até benéfica, como a utilização de microorganismos na indústria de alimentos na produção de alimentos fermentados, como diversas bebidas. Quem nunca ouviu falar em alimentos pré e pró bióticos? São alimentos que contém em sua composição microorganismos vivos que, quando no nosso organismo, causam reações benéficas (como auxiliar a regulação do trânsito gastrintestinal), ou estimulam os microorganismos da nossa microbiota normal a exercer seu papel benéfico no nosso organismo (como a produção de vitamina K pelas bactérias do nosso trato gastrintestinal). Mas, nem sempre a relação alimento x microorganismos x homem é benéfica. Diversos microorganismos têm a capacidade de nos causar doenças, até mesmo os microorganismos da nossa microbiota normal (em casos de redução da atividade imunológica, causando doenças oportunistas), e muitos casos podem ser veiculados por alimentos. É importante ressaltar que os alimentos por si só não são fontes de contaminação, mas podem veicular esta contaminação adquirida, podendo causar doenças. As principais fontes de contaminação são o solo e a água, as plantas, os utensílios utilizados na preparação do alimento (contaminação cruzada), o trato gastrintestinal do homem e de animais, os próprios manipuladores de alimentos, a ração animal, a pele dos animais, e até o ar. A indústria de alimentos vem crescendo e a preocupação com a obtenção de alimentos com qualidade tanto do ponto de vista tecnológico (o alimento deve ser nutritivo, competitivo, aceitável no mercado, etc.) quanto microbiológico (segurança alimentar) está cada vez mais desenvolvida. O nutricionista tem papel fundamental nesse controle, pois a manipulação, preparo e conservação inadequados estão freqüentemente associados a doenças (intoxicações ou infecções) microbianas. O manipulador de alimentos deve ter treinamento constante para que não contamine o alimento com técnicas e hábitos anti-higiênicos. 15

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia É dever do nutricionista conhecer os riscos associados à precariedade no cuidado com os alimentos para melhor orientação e supervisão das atividades de qualquer UAN (Unidade de Alimentação e Nutrição), restaurante ou indústria, evitando a disseminação de doenças através dos alimentos.

Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è constatar a presença de bactérias no ambiente; è compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e manipulação de alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais ou por portadores de microorganismos patogênicos; è diferenciar fontes de contaminação e veículos de contaminação; è comentar sobre o papel de bactérias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos.

Material - 2 Placas de Petri com Agar - swab estéril

Execução da prática ®

Bactérias no ambiente:

- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da área de segurança. Cada grupo deixará a placa em exposição por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos)

- após o tempo de exposição, a placa deve ser tampada novamente.

®

Bactérias nas superfícies:

- 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes - em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificação de bactérias em diversas superfícies, de acordo com o diagrama representado a seguir:

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Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. Observar e interpretar o crescimento nos meios.

Exercícios de fixação 1. Qual o papel do nutricionista na qualidade microbiológica dos alimentos? 2. Por que é necessário tomar medidas de controle no ambiente em que se preparam e/ou manipulam alimentos? 3. O que é contaminação cruzada? 4. Os alimentos podem ser considerados fonte de contaminação? 5. Quais são as principais fontes de contaminação dos alimentos?

Observações

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Assunto 3: Controle Microbiano Introdução Como já vimos, as bactérias estão em quase todos os ambientes e superfícies, e não é desejável que muitos materiais se contaminem com elas, como os alimentos, os utensílios utilizados na sua preparação, medicamentos, e outros. Para tanto, podemos aplicar diversos métodos de controle microbiano. O crescimento microbiano é fortemente influenciado por fatores ambientais (fatores extrínsecos), quais sejam: temperatura ambiental, umidade relativa do ambiente, composição gasosa do ambiente. O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir / impedir a multiplicação de microorganismos existente em ambientes, utensílios, e superfícies vivas ou inanimadas. A conservação de alimentos envolve sempre o uso de uma ou mais técnicas empregadas no controle microbiano.

Fundamentação teórica Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e compreender seu modo de ação, é importante que alguns conceitos muito utilizados sejam definidos: è Desinfecção: redução do número de microorganismos em uma matéria inanimada (ambientes, superfícies, objetos, alimentos) è Sanitização: igual a desinfecção (termo utilizado na indústria de alimentos) è Esterilização: destruição total de microorganismos em um material è Anti-sepsia: redução do número de microorganismos em matéria viva (pele) è Assepsia: conjunto de técnicas e/ou medidas assépticas, que visam a não contaminação de algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo) Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios de controle microbiano, que pode ser feito através de agentes químicos ou físicos.

®

Controle Microbiano por Agentes Físicos · Calor Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor úmido.

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia É o método mais empregado para destruição de microorganismos devido ao seu baixo custo de aplicação, fácil aplicação, eficácia e praticidade. Calor seco

Modo de ação: Flambagem Oxidação de - Definição: contato direto do material a ser tratado com o fogo. É componentes esterilizante celulares - Aplicação: materiais metálicos (p.ex.: alça bacteriológica) Forno ou estufa - Definição: o material é submetido a uma temperatura de 170 – 180°C por 1 – 2 horas. É esterilizante - Aplicação: vidrarias e metais (material cirúrgico) Incineração - Definição: queima total do material. É esterilizante. - Aplicação: materiais descartáveis (principalmente materiais hospitalares)

Calor úmido

Modo de ação: Pasteurização Desnaturação de - Definição: aplicação de calor inferior a 100°C. É desinfetante (não componentes elimina formas esporuladas). Pode ser classificada em: celulares à lenta: 63°C / 30 minutos à rápida: 72°C / 15segundos - Aplicação: diversos alimentos são pasteurizados, como sucos, leite, etc. Fervura - Definição: aplicação de calor a 100°C por 15 minutos. É desinfetante (não elimina formas esporuladas). - Aplicação: alimentos em geral, p.ex.: leite Autoclavação - Definição: aplicação de calor a 121°C a uma pressão de 1 atm, por 15 – 30 minutos. - Aplicação: materiais, meios, utensílios. Diversos alimentos são tratados por este processo, p.ex.: alimentos enlatados (apertização). Esterilização - Definição: aplicação de calor maior que 100°C. Alimentos denominados UAT (UHT) são submetidos a uma temperatura de 140 – 150°C por 2 – 4 segundos e rapidamente resfriados e acondicionados em recipientes estéreis. - Aplicação: diversos alimentos, como o leite UAT

O calor úmido é mais eficaz que o calor seco, pois a água é melhor condutora de calor quando comparada com o ar.

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Radiações

Não ionizantes

Luz Ultravioleta - possui atividade máxima num comprimento de onda de 260 nm - é desinfetante - geralmente é utilizado em ambientes - não é penetrante à desinfecção apenas superficial - a lâmpada tem vida útil de 200 horas (aproximadamente) - age no DNA microbiano, gerando mutações letais

Ionizantes

Radiação Gama - é esterilizante - mais energético que UV, atua num comprimento de onda menor - age ionizando componentes celulares, levando à morte - muito utilizado em produtos hospitalares descartáveis - seu uso nas indústrias de alimentos está crescendo - possui baixo poder de penetração à desinfecção apenas superficial

·

Filtração

Clarificante

- retém as impurezas grosseiras - é desinfetante

Esterilizante

- possui poros iguais ou menores que 1 mm, podendo reter, inclusive, alguns vírus.

·

Outros

Pressão osmótica

Adição de NaCl - também conhecida como salga - reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo microbiano. Também pode causar lise osmótica da célula bacteriana. - muito utilizada em produtos cárneos (carne seca, pescado) Adição de outros sólidos (açúcares) - utilizado na fabricação de compotas e alimentos em calda - reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo microbiano - muito empregado para conservação de frutas e hortaliças

Dessecação

- retirada umidade do alimento em maior ou menor grau - reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo microbiano

Liofilização

- aplicação de dessecação em vácuo (pressão negativa) - reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo microbiano - seu emprego na indústria de alimentos é crescente

Baixas temperaturas

Refrigeração 20

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - temperatura entre 0 e 10°C - reduz a atividade metabólica de alguns microorganismos (mesófilos e termófilos) Congelamento - temperaturas inferiores a 0°C - impede a atividade metabólica da maioria dos microorganismos - em alguns casos, causa a morte dos microorganismos

®

Controle Microbiano por Agentes Químicos

· Álcool Etílico É um dos métodos químicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo custo, relativa eficácia e fácil aplicação. Pode ser usado como desinfetante ou anti-séptico. Possui maior atividade germicida quando hidratado (60 – 70%), pois nessa condição possui maior poder penetrante. O álcool absoluto possui poder bacteriostático, enquanto o álcool hidratado a 70% possui poder bactericida. São apontados diversos mecanismos de ação para o etanol: - ação detergente: solvente de lipídeos - ação desidratante: retira água das células - ação desnaturante: agindo sobre proteínas celulares · Fenóis e Derivados O fenol é um desinfetante fraco, porém é utilizado como um desinfetante de referência para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto é mais ativo que o fenol. Atua como desnaturantes de componentes protéicos Dentre os cresóis, o mais importante é a creolina, uma mistura de cresóis muito utilizada para pisos e sanitários. O hexaclorofeno é muito utilizado na antissepsia cirúrgica. · Halogênios Os principais halogênios utilizados no controle microbiano são o Cloro e o Iodo. è Cloro: É usado como desinfetante de águas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de ação é dado pela reação: Cl2 + H2O à HCl + HClO O ácido hipocloroso é instável, se decompondo espontaneamente em HCl + 1/2 O2, que eliminará os microorganismos através de oxidação de componentes celulares. è Iodo: reage de forma irreversível com aminoácidos aromáticos de proteínas celulares (fenilalanina e tirosina), desnaturando-as. Devido à grande possibilidade de alergias, seu uso 21

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia como anti-séptico na prática cirúrgica vem diminuindo, sendo substituído por clorexidine e similares. · Detergentes catiônicos Alteram a permeabilidade da membrana. É mais ativo contra Gram negativos. Exemplo: compostos quaternários de amônio à cloreto de benzalcônio. · Sais de Metais Pesados Os metais pesados agem na inativação de enzimas, por sua alta afinidade por apoproteínas. Os principais metais pesados utilizados no controle microbiano são: è Mercúrio (Hg): já foi muito utilizado como anti-séptico, mas seu uso está decaindo devido ao risco de intoxicação por absorção cutânea. è Sulfato de Cobre (CuSO4): utilizado como desinfetante para águas de recreação è Nitrato de Prata (AgNO3): é um anti-séptico altamente eficiente contra gonococos, que causam oftalmia em recém-nascidos e gonorréia em adultos com vida sexual ativa. · Ácidos Tanto os ácidos orgânicos quanto os inorgânicos são muito utilizados na conservação de alimentos. São mais utilizados os ácidos fracos, e na forma de sal, pois assim apresentam maior solubilidade. A atividade antimicrobiológica dos ácidos fracos é atribuída a sua forma não dissociada (HA), pois esta penetra através da membrana tornando-se ionizada após alcançar o interior da célula. A concentração intracelular destes ácidos orgânicos altera o funcionamento normal do gradiente envolvido no sistema de transporte da membrana celular. A concentração da forma não dissociada do conservante químico no alimento é determinada pelo pKa (pH n qual 50% da molécula está na forma dissociada) do ácido e do pH do meio, como mostra a fórmula a seguir:

Portanto, a concentração da forma não dissociada aumenta com a elevação da acidez do alimento, ou seja, o pH do alimento deve ser menor que o pKa, de forma a garantir alta concentração da forma não dissociada. Os valores de pKa da maioria dos ácidos encontra-se na faixa de pH entre 3,0 e 5,0. O pKa é usado na medição de sua eficiência no alimento em determinado pH. Exemplos de ácidos orgânicos utilizados na indústria de alimentos: ácido tartárico (tartarato de sódio, tartarato potássio), ácido cítrico (citrato de sódio, citrato de potássio), ácido propiônico (propionato de cálcio).

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia · Álcalis Os principais álcalis utilizados são o NaOH, o KOH e o Ca(OH)2. O NaOH, principalmente, está presente nos sabões, conferindo-lhes relativa ação anti-séptica. · Corantes básicos São mais eficiente contra Gram-positivos. Exemplo: Cristal Violeta, Azul de Metileno. · Redutores Reduzem compostos celulares, levando as células à morte. Aldeídos e derivados: formaldeído e formalina são utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas causam irritações cutâneas. · Oxidantes Oxidam componentes celulares levando à morte das células. São muito utilizados como desinfetantes. Exemplo: Ozônio, água oxigenada, permanganato de potássio, peróxido de zinco. Óxido de etileno (gás): é um agente alquilante, age inativando proteínas e ácidos nucléicos. À temperatura de 52°C o óxido de etileno passa do estado líquido para o gasoso. Seus vapores são utilizados para esterilização de materiais de borracha ou plástico. · Antimicrobianos Possuem ação seletiva contra microorganismos, ao contrário dos anteriores. São um método biológico de controle microbiano. Serão abordados num próximo assunto.

Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiológico; è descrever os agentes físicos e químicos utilizados no controle microbiano; è entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilização, diferenciando calor úmido de calor seco è compreender as diferenças encontradas na ação dos diferentes métodos de anti-sepsia utilizados.

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Material - Culturas bacterianas - 2 Placas de Petri com Agar - Soluções anti-sépticas - Gaze estéril - Tripé e tela de amianto - Recipiente com água em ebulição

Execução da prática ®

Agentes Químicos

- dividir uma placa de Petri com Agar em 4 quadrantes - semear os 4 quadrantes da seguinte forma: - 1º quadrante: um aluno encosta o dedo suavemente no Agar - 2º quadrante: outro aluno lava o dedo com água e sabão por 1 minuto, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo - 3º quadrante: outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool etílico a 70%, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo - 4º quadrante: um outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool iodado, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo

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®

Agentes Físicos - calor

- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espaço respectivo ao tempo 0 - para os próximos espaços, colocar as culturas em banho-maria fervente até atingir o tempo especificado: - 5 minutos à reinocular - 10 minutos à reinocular - 20 minutos à reinocular

- Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. - Observar e interpretar o crescimento nos meios.

Exercícios de fixação 1. Qual a diferença entre anti-sepsia e assepsia? 2. Qual o modo de ação do calor seco? E do calor úmido? Qual o mais eficaz? 3. Qual é o tipo de calor mais utilizado para a indústria de alimentos? Por quê? 4. Por que o álcool etílico utilizado como desinfetante e anti-séptico deve ser hidratado? 5. Qual o mecanismo de ação dos ácidos utilizados na conservação de alimentos? 6. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou estufas de esterilização, também possuem ação esterilizante?

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Observações

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Assunto 4: Coloração de Gram Introdução Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso não faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma coloração diferencial. Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de bactérias. Entre estes, o mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas seqüências de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão das bactérias em 2 grandes grupos. O primeiro grupo, que retém a cor do primeiro corante (o cristal violeta), é denominado Gram positivo. O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retém a cor do segundo corante utilizado (fucsina) e é denominado Gram negativo. Uma solução de iodo (lugol) é utilizada como mordente (um composto químico que fixa um corante ou outra substância ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolúvel) para a primeira etapa da coloração. Há também um agente descorante entre a utilização de um e outro corantes. Pode-se utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descoloração desejada. O álcool etílico a 95% é um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa. Geralmente utiliza-se uma mistura de álcool etílico e acetona (95:5), obtendo uma velocidade de descoloração intermediária. A maioria dos cocos é Gram positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que são os únicos Gram negativos. Assim também acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Os víbrios são Gram-negativos. A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma.

Fundamentação teórica A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias e como estas serão coradas de forma distinta. As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa camada de glicoproteína. Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar uma colônia previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir para uma lâmina limpa. Se for utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma gota/alçada de solução salina a 0,9%, homogeneizando-a. É importante que o esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da coloração, seja possível a visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de fixar 27

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia o esfregaço na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada se perca durante as etapas da coloração. Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o esfregaço. O corante, então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é Gram positiva ou Gram negativa. Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactéria. O álcool tem papel fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o esfregaço corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactérias: à as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano serão desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos, impedindo a saída do complexo CV-I e tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I). à as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima desta camada encontra-se uma outra, de caráter lipídico (rica em LPS, lipoproteínas e outros componentes). Essa camada lipídica, em contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada de peptidoglicano desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula descorada neste momento. É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se restar algum resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente, e os resultados poderão ser alterados. O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as células Gram positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrará na parede das células Gram negativas, corando-as de vermelho. Esta coloração é utilizada para a maioria das bactérias, mas há algumas que não se coram por este método, como as micobactérias, as bactérias espiraladas e as bactérias que não possuem parede celular. Para estes, há outros métodos de coloração, como o método de ZihelNeelsen, o de Fontana-Tribondeau e o método de visualização em campo escuro. Alguns fatores podem influenciar nos resultados obtidos na coloração: à Os corantes empregados na técnica, se não filtrados, podem deixar resíduos (cristais) na lâmina. à Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta diferenciação da bactéria pelo álcool. à A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-negativas. Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à membrana e parede da célula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes. Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula.

Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de:

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia è executar a técnica da coloração de Gram; è utilizar a objetiva de imersão; è relacionar a composição química da parede celular das bactérias com os corantes de Gram; è compreender a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material submetido a exame microbiológico; è descrever as formas, arranjos e coloração das bactérias.

Material - Lâminas - Culturas bacterianas em meio líquido e sólido - Alças e agulhas - Bateria da coloração de Gram (corantes cristal de violeta e fucsina, lugol, álcool, água) - Papel de filtro - Óleo de cedro (óleo de imersão) - Microscópio - Bico de Bunsen

Execução da prática ® Etapas

Preparo e fixação do esfregaço Observações

Transferir uma alçada da cultura ou uma colônia Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes da placa para uma lâmina de microscópio limpa. culturas deve-se observar alguns detalhes: è de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia, espalhando-a pela lâmina à isso evitará a observação de colônias diferentes na lâmina e que seja coletado um inóculo muito carregado, o que dificultará a visualização das células coradas. è de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada e espalhá-la na lâmina à isso evita que seja coletado um inóculo muito carregado. Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Para o inóculo coletado de caldo não é Se tiver sido colhida colônia da placa, adicionar necessário adicionar solução salina. Mas para colônia coletada de placa é necessário fazer a salina estéril para facilitar o espalhamento. diluição na lâmina, evitando que o esfregaço 29

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia fique muito concentrado o que dificulta a visualização das células coradas ao microscópio.

Passar a lâmina com o esfregaço sobre a chama É importante fixar o esfregaço para que este não do Bico de Bunsen, até que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a completamente seco. utilização de um e outro corantes

®

Coloração do esfregaço

Etapas da Coloração

O que está acontecendo na parede da bactéria?

Cobrir o esfregaço com solução de Cristal O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os Violeta por cerca de 1 minuto. tipos de células (Gram + e Gram -)

A seguir, lavar em água corrente com o A lavagem com água é importante após cada pissete. etapa para que uma substância utilizada não interfira na ação da próxima. Nesse caso, a lavagem serve para retirar o excesso de corante.

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Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco O Lugol é uma solução de Iodo e funciona como por cerca de 1 minuto. mordente neta etapa da coloração, ou seja, ele fixa o corante Cristal Violeta na parede da célula, pois forma um complexo grande: o CV-I

Novamente lavar com água, e então lavar com O álcool absoluto, ou solução de álcool-acetona, álcool absoluto até que não saia mais corante funciona como diferenciador da coloração: da lâmina (10 – 15 segundos). è nas Gram +, o álcool desidrata a matriz glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os poros da parede e impedindo a saída do complexo CV-I, corando a célula de roxo:

è nas Gram -, o álcool dissolve a membrana externa, de caráter lipídico (lipoproteínas, fosfolipídeos, LPS), fazendo com que o complexo CV-I saia da parede, deixando a célula descorada e com os poros da matriz glicoproteica abertos:

Lavar com água corrente em abundância, É importante prestar com bastante atenção nesta 31

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia para que não reste álcool sobre a lâmina.

etapa, pois se restar algum álcool na lâmina a coloração não prosseguirá, já que o próximo corante não se fixará na lâmina.

Cobrir o esfregaço com fucsina por cerca de A fucsina age de diferentes formas nas 30 segundos. diferentes células: è nas Gram +, os poros estão reduzidos, impedindo que a fucsina penetre na parede celular, não alterando a cor roxa:

è nas Gram -, os poros da camada de peptidoglicano estão abertos, permitindo que a fucsina penetre na célula, corando-as de vermelho:

Lavar com água e secar suavemente com Após secar suavemente a lâmina, observar ao papel. microscópio na objetiva de imersão (100x), com óleo de cedro/mineral e identificar a célula corada.

Para decorar!!! Vi Lulu Ali A Fumar (Cristal Violeta) (Lugol) (Álcool) (Água) (Fucsina)

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Exercícios de fixação 1. Em que se baseia o método da coloração de Gram? 2. Por que o álcool é considerado como agente diferenciador da coloração de Gram? 3. Qual é o papel do mordente (lugol)?

Observações

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Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos – TSA (Antibiograma) Introdução O sucesso na terapêutica antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da sensibilidade do agente à droga utilizada. Algumas bactérias apresentam um perfil de sensibilidade previsível e constante, no entanto muitas outras são altamente suscetíveis ao desenvolvimento ou aquisição de resistência a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso adequado e criterioso de antimicrobianos é muito importante para prevenção da seleção de amostras bacterianas multirresistentes. O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o esclarecimento objetivo do perfil de sensibilidade do patógeno e a utilização de drogas eficazes no tratamento. O antibiograma ou TSA é indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo infeccioso, mas principalmente àqueles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na terapia não seja previsível como por exemplos: S. aureus, bacilos gram-negativos não fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactérias) etc. A seleção dos antimicrobianos para a realização dos antibiogramas de rotina deve seguir alguns princípios. Uma das estratégias adotadas é o reconhecimento que alguns agentes antimicrobianos podem ser agrupados em classes, baseando-se no seu espectro de atividade. Assim, um só representante de classe necessita ser testado, a não ser quando dentro de uma mesma classe de antimicrobianos não exista a possibilidade de equivalência.

Fundamentação teórica Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é inibido, in vitro, por uma concentração três, ou mais vezes, inferior àquela que o antimicrobiano atinge no sangue, caso contrário ela é considerada resistente. O meio termo (bactérias moderadamente resistentes) é dado por aquela cujo crescimento é inibido por concentrações intermediárias. Na interpretação dos resultados, consideramos as bactérias intermediariamente resistentes como resistentes. A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente. A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo método de difusão em placa com discos impregnados com as drogas. - Método de Diluição (MIC): No método de diluição, concentrações variadas do antibiótico, obtidas pela diluição em Caldo ou Agar, são inoculadas com o microrganismo. A concentração mais baixa do antibiótico que evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 horas é a concentração inibitória mínima, é a medida da sensibilidade. - Método da Difusão do Disco: Nos testes pelo método de difusão, discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados uniformemente na superfície do Agar semeado com o microrganismo. Forma-se, então, um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a partir do disco para o Agar com conseqüente inibição do crescimento do microorganismo sensível ao determinado (os) antibiótico (os). Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os métodos de difusão com disco (de Bawer e Kirby) têm preferência sobre os de diluição para os testes de rotina, mas é indispensável que sejam, rigorosamente padronizados, pois a presença de algumas 34

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia substâncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibição. Para minimizar os riscos de resultados errôneos, utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este é um meio padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se ressaltar que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma coloração de Gram antes de qualquer TSA para a confirmação da pureza da cultura. A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de inibição (zona sem crescimento em volta dos discos de antibiótico). O tamanho do halo sozinho não é uma medida quantitativa da atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que quanto maior o halo, mais potente seja o antibiótico. Por essa razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos produzidos por antibióticos não relacionados são falsos e não devem ser realizados. Deve-se interpretar a sensibilidade de acordo com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação aos dados da tabela de interpretação do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica. Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com sua ação na célula bacteriana: Sítio de ação

Mecanismo de ação

Classes de antimicrobianos

Antimicrobianos - agem na etapa da síntese da parede que - b-lactâmicos (penicilina, que atuam a nível ocorre externamente à membrana plasmática monobactâmicos) da parede celular - impedem a união de cadeias peptídicas - aumentam atividade das autolisinas - se ligam à face externa da membrana Antimicrobianos que atuam a nível da membrana citoplasmática

- possuem NH3+ (fica na superfície da - Polimixinas (não reagem membrana, formando poros) e Ag+ (se insere com fosfatídeos de colina na membrana) na sua molécula das células animais) - desorganizam a membrana plasmática - provocam a saída de componentes celulares

Antimicrobianos - aminoglicosídeos e tetraciclinas: se ligam à que atuam a nível subunidade 30s do ribossomo, tornando-o dos ribossomos não funcional, impedindo a incorporação de aminoácidos - cloranfenicol, lincomicina e clindamicina: se ligam à subunidade 50s do ribossomo, impedindo a união de novos aminoácidos - eritromicina: se liga à subunidade 50s do ribossomo e impede a translocação

Aminoglicosídeos (estrptomicina, gentamicina) - Tetraciclinas (tetraciclina, doxiciclina) - Cloranfenicol - Macrolídeos (eritromicina Estreptograminas (lincomicina, clindamicina)

Antimicrobianos - metronidazol: é reduzido, se tornando tóxico que atuam a nível e quebrando a molécula de DNA do DNA - rifampicina: combinam-se com RNApolimerases, bloqueando a transcrição do DNA - derivados quinolônicos: inibem a ação das girases

- Metronidazol - Derivados quinolônicos (ácido naxadílico, ciprofloxacino) - Macrolídeos (rifampicinas)

Antimicrobianos que atuam a nível do metabolismo intermediário

- sulfonamidas: bloqueiam a síntese de ácido - Sulfonamidas fólico (competem com o PABA) - Trimetoprina - trimetoprina: interfere na síntese de purinas, metionina, serina e timina 35

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Na escolha do antimicrobiano a ser utilizado, devem ser avaliados os seguintes critérios: toxicidade seletiva, bactericida, amplo espectro, não deve ser alergênico, não deve provocar efeitos colaterais e não devem ter microorganismos resistentes. É necessário que se observe o tempo mínimo para uso do agente antimicrobiano, para evitar a seleção de microrganismos resistentes. Graças ao uso descuidado de agentes antimicrobianos, a taxa de casos de microrganismos multirresistentes vem aumentando nos últimos anos. Um exemplo é o tratamento da tuberculose, que consiste na administração de uma combinação de antibióticos (2 a 3) por um longo período (6 meses). O abandono precoce do tratamento acaba por selecionar cepas MDR (multi drug resistent). Durante a execução da prática utilizaremos a Escala Mac Farland, que consiste num método de quantificação de microorganismos através de turbidez. A escala é preparada com ácido sulfúrico e cloreto de bário em diversas concentrações, que reagem formando cloreto de bário obtendo diversos graus de turbidez. A concentração aproximada de microorganismos é dada conforme a leitura de absorbância realizada, de acordo com a tabela a seguir. Geralmente utilizamos uma concentração de microrganismos equivalentes ao padrão 0,5 da escala MacFarland, ou seja, 1,5x108/ml. Padrão da 1 escala MacFarland

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Concentração 300 aproximada de microrganismos (x106/ml)

600

900

1.200

1.500

1.800

2.100

2.400

2.700

3.000

O Nutricionista deve conhecer bem a funcionalidade dos antibiogramas e dos antibióticos que são utilizados para o tratamento de infecções a partir do conhecimento à sensibilidade das bactérias aos mesmos, para então acompanhar a dieta do indivíduo, fazendo as devidas modificações necessárias devido as inúmeras interações fármaco-nutrientes e a biodisponibilidade dos fármacos, sem esquecer as possíveis deficiências de vitaminas e minerais que podem vir a acontecer devido as introdução de alguns antibióticos.

Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è conceituar antibiograma (TSA) e identificar os grupos ou quadros clínicos nos quais o antibiograma é indicado; è diferenciar os métodos de diluição (CIM ou MIC) do método de difusão e descrever as etapas para a realização deste último; è compreender a influência de alguns fatores no diâmetro do halo e inibição; è ler e interpretar resultados possíveis de um antibiograma; è citar alguns grupos microbianos aonde o TSA deve ser feito através de outras técnicas. 36

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Material - Cultura bacteriana - Tubo com solução salina estéril - Swab estéril - Tubo no 0,5 da escala de Mac Farland - Pipeta estéril - Placa de Agar Mueller-Hinton - 4 discos de antibióticos diferentes - Pinça - Régua graduada

Execução da prática - ajustar a densidade do inóculo acrescentando a cultura à solução salina até esta se igualar à turvação do tubo 0,5 da escala de Mac Farland (lembrando que o ajuste é feito por turbidez, e não pela cor que o caldo se apresenta).

- embeber o swab na suspensão bacteriana padronizada e inocular na placa de Mueller-Hinton de modo a obter um crescimento confluente (estriar em pelo menos 3 direções)

37

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - aguardar um tempo para que o Agar absorva o inóculo (mais ou menos 10 minutos) e, com o auxílio de uma pinça estéril, colocar os discos de antibióticos sobre o Agar, pressionando levemente cada disco para que este fique aderido ao meio. Deixar entre eles e deles à borda da placa um espaço não inferior a 15 mm.

Incubar 18-24 horas a 35o C. Medir com régua o diâmetro do halo de inibição, comparar com os dados da tabela e expressar seus resultados.

®

Meios utilizados na prática

Agar Mueller-Hinton Composição do Meio (g/L) Infusão desidratada de carne Caseína hidrolisada Amido Agar

Observações 300,0 17,5 1,5 17,0

pH do meio: 7,4 ± 0,2 O meio não apresenta nenhum agente seletivo ou inibidor que possa interferir nos resultados do Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos.

® Limites para Interpretação do Antibiograma com 32 Antimicrobianos de uso corrente na Terapêutica Clínica Antimicrobiano

Símb.

Conc. disco

Diâmetro do Halo de Inibição Resistente

Intermediário

Sensível

BB

30 mcg

≤ 14

15-18

≥ 17

Ampicilina ao testar microorganismos AP gram-negativos e enterococos

10mcg

≤ 11

12-13

≥ 14

Ampicilina ao testar estafilococos e AP microorganismos sensíveis à penicilina G

10 mcg

≤ 20

21-28

≥ 29

Ampicilina ao testar Haemophilus sp.

10 mcg

≤ 19

-

≥20

Amicacina

AP

38

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Ácido Nalidíxico

NA

30 mcg

≤ 13

14 -18

≥ 19

Bacitracina

BC

10 un.

≤8

9-12

≥13

Carbenicilina ao testar Proteus sp. e CR E. coli

100 mcg

≤ 17

18-22

≥ 23

Carbenicilina ao testar Pseudomonas CR aeruginosa

100 mcg

≤ 13

14-16

≥ 17

Cefalotina ao relatar sensibilidade a CF todas as cefalosporinas

30 mcg

≤ 14

15-17

≥ 18

Cefoxitina

-

≤ 14

15-17

≥ 18

Clindamicina ao relatar sensibilidade à CI clindamicina e à lindomicina

2 mcg

≤ 14

15-16

≥ 17

Cloranfenicol

CO

30 mcg

≤ 12

13 -17

≥ 18

Colistina

CL

10 mcg

≤8

9-10

≥ 11

Eritromicina

EL

15 mcg

≤ 13

14-17

≥ 18

Estreptomicina

ET

10 mcg

≤ 11

12 -14

≥ 15

Gentamicina

GN

10 mcg

≤ 12

13-14

≥ 15

Konanilcina

KN

30 mcg

≤ 13

14-17

≥ 18

Nalidíxico ácido

AN

30 mcg

≤ 13

14-18

≥ 19

Neomicina

NO

30 mcg

≤ 12

13-16

≥ 17

Nitrofurantoína

NT

300 mcg

≤ 14

15-16

≥ 17

Novoblocina

NV

30 mcg

≤ 17

18-21

≥ 22

Oxocilina

OX

6 mcg

≤9

10-13

≥ 14

Penicilina G. ao testar Estafilococos

PN

10 un.

≤ 20

21-28

≥ 29

outros PN

10 un.

≤ 11

12-21

≥ 22

CT

Penicilina G. ao microorganismos

testar

Penicilina G.

PL

500 un.

≤8

0-11

≥ 12

Polimixina

-

-

≤8

09-11

≥ 12

Sulfa-Trimetropim

STX

30 mcg

≤ 10

11-15

≥ 16

+ SFT

25 mcg

≤ 10

11 -15

≥ 16

Sulfazotrim Trimetoprim)

(Sulfamotoxazol

Sulfonamidas

SF

300 mcg

≤ 12

13-16

≥ 17

Tetraciclina

TT

30 mcg

≤ 14

15-18

≥ 19

Tobramicina

TB

10 mcg

≤ 12

13-14

≥ 15

Vancomicina

VC

30 mcg

≤9

10-11

≥ 12

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Exercícios de fixação 1. Qual a diferença entre os métodos de difusão e impregnação em discos? 2. Por que o método de impregnação do antimicrobiano em discos é mais utilizada? 3. Qual a importância da inoculação ser realizada de modo correto, permitindo crescimento confluente? 4. Podemos comparar os halos de inibição obtidos com antimicrobianos diferentes ou em diferentes concentrações?

Observações

40

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Assunto 6: Cocos Gram positivos Introdução Os principais gêneros de Cocos Gram positivos de interesse na área de saúde são o Staphylococcus e o Streptococcus, membros da família Micrococcaceae. Em ambos os gêneros, podemos encontrar espécies que compõem a microbiota normal de diversas pessoas, como Staphylococcus epidermidis e Enterococcus (antigamente denominado Streptococcus faecalis), mas também existem espécies altamente patogênicas, como Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. É importante ressaltar que os enterococos não são considerados como estreptococos, mas um gênero à parte. Como este gênero foi por muito tempo estudado como sendo parte do gênero Streptococcus, ainda hoje é comum estuda-lo junto com este, identificando as principais diferenças entre ambos. São gêneros bastante parecidos, causadores de doenças denominadas piogênicas (com produção de pus), a principal diferença entre ambos é a produção de catalase por Staphylococcus. Ambos os gêneros, Staphylococcus e Streptococcus, são importantes na área de alimentos já que podem ser veiculados por alimentos.

Fundamentação teórica ®

Staphylococcus

As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos, que quando vistos ao microscópio aparecem na forma de cachos de uva. São anaeróbias facultativas, com maior crescimento em condições aeróbias, quando produzem catalase. São amplamente distribuídos na natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves (encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe). De todas as espécies existentes, as de maior interesse humano são Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, e Staphylococcus saprophyticus. Para diferenciação d a espécie, utilizamos as provas de fermentação do manitol, da coagulase, DNAse, sensibilidade à novobiocina e redução de nitrato. A espécie S. aureus é a que está mais freqüentemente associada a doenças estafilocócicas, sendo de origem alimentar ou não, está geralmente envolvida em infecções humanas (de origem comunitária e hospitalar) e apresenta uma freqüência de 30 a 40% de portadores na população. São bactérias mesófilas, com crescimento na faixa de 7ºC a 47,8ºC, e as toxinas são produzidas entre 10ºC e 46ºC, com ótimo entre 40ºC e 45ºC. Quanto mais baixa for a temperatura, mais tempo será necessário para produzir enterotoxinas. São bactérias tolerantes a concentrações de 10% a 20% de NaCl, sendo este um fator de estimulação da produção da coagulase. Também são tolerantes a altas concentrações de nitratos. Crescem em faixa de pH de 4 a 9,8, com ótimo entre 6 e 7. E possuem capacidade de crescer em valores de atividade aquosa inferior à muitas bactérias, até entre 0,86-0,83.

41

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia São inibidos pela presença de corantes do tipo azul de metileno e violeta de genciana. Crescem em meio de Agar simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colônias são redondas, elevadas, opacas e de coloração amarelo dourado a branca. A intoxicação por S. aureus é causada quando se ingerem alimentos onde haja a toxina pré-formada, que só é liberada em concentrações entre 105 a 106 UFC/ g do alimento. Logo, se for controlada a proliferação do microorganismo não haverá risco de intoxicação. As enterotoxinas produzidas por S. aureus são proteínas simples, higroscópicas, facilmente solúveis em água e soluções salinas, resistentes a tripsina, quimiotripsina, renina, papaína e pepsina, e algumas cepas são resistentes até a vancomicina. São também termorresistentes. É importante observar esse detalhe, já que a maioria dos alimentos sofre um tratamento térmico durante o processamento, mas se já houver a toxina formada no alimento, esta não será inativada. Como já foi dito, mecanismo de prevenção deve ser feito no sentido de evitar a proliferação do microorganismo para a não formação das enterotoxinas, o que pode ser feito através da manutenção dos alimentos sob refrigeração, ou manter os alimentos a uma temperatura ≥ 60ºC pós-preparo. As principais provas para identificação das principais espécies de Staphylococcus estão descritas na tabela a seguir: Provas Bioquímicas

S. aureus

S. epidermidis

S. saprophyticus

Cocos Gram-positivos

+

+

+

Pigmentação Colonial

Amarela ou Branca

Branca

Branca

Catalase

+

+

+

Coagulase

+/-

-

-

Fermentação do Manitol

+

-

-

DNAse

+

-

-

Sensibilidade a Novobiocina

R

S

R

+

-

Redução de Nitratos

®

Streptococcus

As bactérias do gênero Streptococcus também são cocos Gram-positivos, mas dispostos em pares ou fileiras, ao contrário de Staphylococcus. Outra diferença entre Streptococcus e Staphylococcus é a não produção de catalase por Streptococcus. Fazem parte da microbiota normal (sendo encontrados principalmente na orofaringe), apesar disso, muitos deles são responsáveis por uma variedade de manifestações clínicas, sendo considerados importantes agentes infecciosos tanto para o homem quanto para os animais. A maioria necessita de meios enriquecidos, geralmente pela adição de sangue para o crescimento. São utilizadas dois tipos de classificação para diferenciar as espécies: potencial hemolítico (a, b e g) e os grupos de Lancefield (determinado por um carboidrato da parede celular), cujos principais grupo são o A e o B. O gênero apresenta espécies de interesse médico como: Streptococcus viridans, Streptococcus b hemolíticos do Grupo A (S. pyogenes) e do grupo B (S. agalactiae) e Streptococcus pneumoniae. Os enterococos pertencem atualmente a um gênero separado e possuem características peculiares: são resistentes a variações de temperatura (15-45ºC) e a

42

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia pressão osmótica (até 6,5 % de NaCl). São membros da microbiota normal do trato gastrintestinal de diversas pessoas. O gênero Streptococcus é composto de bactérias anaeróbias facultativas, com maior crescimento em atmosfera com 10% de CO2. Possuem atividade hemolítica, fator importante para a classificação das cepas patogênicas em a (hemólise parcial), b (hemólise total) e g (anemolítico). Os estreptococos a hemolíticos apresentam zonas de hemólise, possuindo hemácias íntegras na parte mais interna junto a colônia, e hemólise maior na parte mais externa. Freqüentemente, aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise (devido a alteração da hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana e conseqüente liberação de biliverdina e bilirrubina), que originou a qualificação "estreptococos do grupo esverdescente" ou Streptococcus viridans. Os Streptococcus pneumoniae, principais agentes bacterianos de pneumonia, apresentam hemólise a, uma colônia puntiforme com um aprofundamento no ápice da colônia (parecendo um pequeno vulcão). Os estreptococos b hemolíticos produzem uma zona de hemólise total, não se observando hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas O e S. A hemolisina O é destruída pela ação do oxigênio atmosférico e, portanto, só demonstrada em colônias crescidas em profundidade no Agar sangue. A hemolisina S é estável ao oxigênio do ar e produz hemólise mesmo nas colônias crescidas na superfície do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessária a semeadura do germe pela técnica em profundidade ("pourplate") , ou a realização de perfurações ("stabs") nos quadrantes de esgotamento ou a incubação em atmosfera pobre em oxigênio (técnica da jarra com vela). Os estreptococos g não produzem hemólise, são anemolíticos, isso significa que não têm capacidade lítica nenhuma sobre as hemácias. Muitas das espécies saprófitas são deste grupo. Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de enriquecimento. O meio de seletivo específico para estreptococos mais usado é o Caldo Hitchens-Pike. Um meio alternativo para enriquecimento é o Caldo Tioglicolato de Sódio, adequado para o crescimento de bactérias, inclusive aquelas microaerófilas e anaeróbias. O meio clássico de isolamento de estreptococos é o Agar Sangue aonde pode-se observar o perfil hemolítico dos mesmos. As colônias de estreptococos isoladas em Agar Sangue são puntiformes (< 1mm de diâmetro), transparentes à luz transmitida e peroladas à luz refletida. Na identificação de estreptococos além do perfil hemolítico, utilizam-se outras provas auxiliares para a identificação das principais espécies. O esquema abaixo apresenta estas provas:

43

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Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è compreender o papel dos manipuladores de alimentos como potenciais reservatórios de S. aureus produtores de enterotoxinas; è caracterizar e compreender o modo de ação dos meios utilizados para o isolamento de Staphylococcus (Chapman ou A. Manitol Salgado) e Streptococcus (Agar Sangue); è caracterizar e compreender as provas básicas de identificação e diferenciação de Staphylococcus e Streptococcus (catalase, coagulase e DNAse), compreendendo o mecanismo de ação destas.

Material ®

Isolamento de anfibiontes das vias aéreas superiores

- swabs estéreis - tubo com solução salina - Agar Chapman - Caldo Tioglicolato (ou Hitchens-Pike).

®

Identificação de Staphylococcus e Streptococcus I

44

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Agar sangue - Caldo simples ou BHI - Agar inclinado - Agar DNAse - dessecador com vela.

®

Identificação de Staphylococcus e Streptococcus II

- reativo para catalase (H2O2) - reativo para DNAse (HCl 1N) - reativo para coagulase (plasma sangüíneo) - tubo controle positivo - lâminas - conjunto de coloração de Gram.

Execução da prática ®

Isolamento de anfibiontes das vias aéreas superiores

- colher material da nasofaringe (fossas nasais) com o auxílio de swab previamente umedecido em solução salina estéril e inocular o meio Chapman com a técnica de esgotamento em estria e incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema a seguir:

- colher material da orofaringe (tonsilas palatinas/amídalas) com o auxílio de swab previamente umedecido em solução salina estéril e inocular o meio de Tioglicolato e incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema a seguir:

45

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®

Identificação de Staphylococcus e Streptococcus I

- observar o crescimento típico ou não de S.aureus no meio de Chapman e inocular colônia isolada em caldo BHI, Agar DNAse e Agar inclinado e incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema abaixo:

- inocular por esgotamento o crescimento do meio Tioglicolato em placas de Agar sangue e incubar a 37oC por 24 horas em microaerofila pela técnica da vela, conforme o esquema abaixo:

®

Identificação de Staphylococcus e Streptococcus II

- utilizando os reativos próprios, fazer as leituras das provas de catalase (H2O2), DNAse (HCl 1N) e coagulase (plasma de coelho citratado)

46

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OBSERVAÇÃO: As principais provas bioquímicas utilizadas para a identificação de bactérias do gênero Staphylococcus são: à Fermentação do Manitol: a primeira prova a ser realizada, já na primeira etapa da prática. É verificada no meio de Chapman, ou Agar Manitol Salgado, que contém o indicador de pH vermelho de fenol. Quando o microorganismo utiliza o manitol como fonte de carbono (fermentando-o), produz ácido no meio, reduzindo o pH e alterando a cor do indicador de vermelho (laranja) para amarelo. Caso o microorganismo seja isolado em Agar Sangue, a prova pode ser realizada em Caldo Vermelho de Fenol suplementado com 1,0% de manitol. à Prova da Catalase: se destina a verificação da presença da enzima catalase, uma superoxidodismutase. A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio com formação de água e oxigênio molecular (H2O2 + catalase à H2O + ½ O2). A prova pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue, pois este possui catalase, levando a resultados falso-positivos. A verificação da produção dessa enzima por determinada bactéria pode ser feita adicionando-se peróxido de hidrogênio (H2O2 a 30%) à cultura em meio sólido ou líquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Se o microorganismo produzir catalase, o resultado positivo será visto como desprendimento de gás sobre colônia (borbulhamento). Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de um crescimento em Agar Sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma gota de peróxido em uma área do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre uma colônia a ser testada. Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais rápido e intenso sobre a colônia. à Prova da Coagulase: Verifica a capacidade do microrganismo em coagular o plasma através da enzima coagulase. A coagulase estafilocócica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e coagulase livre. A coagulase ligada converte fibrinogênio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulação, e pode ser detectada em teste direto em lâmina, utilizando-se da suspensão de Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos circulares e observando-se a formação de coágulo no tempo de 1-2 minutos. Pode se tornar mais sensível o 47

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia teste em tubo, por este detectar tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a prova de escolha. A coagulase livre reage com o fator de coagulação do plasma, o CRF, formando uma substância semelhante, mas não idêntica à trombina, que converte fibrinogênio em fibrina. Para o teste utilizamos plasma citratado humano ou de coelho, estéril, diluído na proporção 1:5 em solução salina; a reação ocorre volume a volume (0,5ml de plasma + 0,5 ml da cultura) a 37º C. Estudos recentes demonstraram que a produção da enzima coagulase se intensifica quando o germe é crescido em meio contendo alta concentração de NaCl. Desta forma, aconselha-se a utilização de colônias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado (Chapman), este procedimento aumentaria a sensibilidade do teste. Semear uma alçada do germe em estudo em um tubo contendo o plasma diluído e incubar a 37ºC. Devem ser feitas leituras periódicas a cada30 minutos por um período de até 4 horas e uma leitura final após 24 horas, pois algumas espécies produzem também fibrinolisina, que dissolve o coágulo formado. A menor coagulação é considerada prova positiva. Aconselha-se, também utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus, previamente conhecida, como comprovação do teste. à Prova da DNAse: Verifica a capacidade do microorganismo utilizar DNA como fonte energética, através da produção da enzima DNAse. O meio utilizado (Agar DNAse) possui DNA em sua composição. O microorganismo é semeado em forma de “spot” ou estria reta simples. Após o crescimento, adiciona-se ao meio HCl 1N, que vai revelar o resultado. O HCl precipitará todo o DNA presente no meio (lembrando que o DNA e proteína e desnatura em presença de ácidos). Se o microorganismo produzir DNAse, terá degradado todo o DNA ao redor do crescimento, e não haverá precipitação. Quando colocado contra o fundo escuro, pode-se ver claramente o meio turvo e um halo claro (translúcido) ao redor do crescimento. à Sensibilidade a Novobiocina: Este teste não será realizado na aula prática, mas é muito utilizado na rotina de laboratório. Esta prova é diferenciadora de espécie, pois apenas S. epidermidis é resistente a este antimicrobiano. O teste é realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Novobiocina com concentração de 5 mg/ml. Após a incubação verificar o tamanho do halo de inibição e comparar com uma tabela específica. - caracterizar a presença de colônias típicas de Streptococcus e seu eventual padrão hemolítico no meio de Agar sangue.

- preparar lâminas com esfregaço de amostra coletada do Agar Inclinado (Staphylococcus) e do Agar Sangue (Streptococcus), corar pelo método de Gram e observar em microscopia. 48

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OBSERVAÇÃO: Há provas bioquímicas que podem ser utilizadas na identificação de Streptococcus, embora nós não as utilizemos na aula prática. Estas são: à Sensibilidade a Optoquina: Esta prova é diferenciadora de espécie (S. pneumoniae e S. viridans). O teste é realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Optoquina. Após a incubação verificar o tamanho do halo de inibição. Considerar como sensível um halo de inibição de raio maior que 2 cm. à Bile solubilidade: Esta prova é utilizada para identificar se o microorganismo é capaz de resistir à presença de bile no meio. Dentre os estreptococos, apenas os enterococos são capazes de solubilizar a bile no meio. A prova é realizada conforme esquema que se segue: A 1,0 mL de cultura em caldo, adicionar uma gota de vermelho de fenol. Acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rósea). Adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sódio ou bílis. Incubar juntamente com um tubo sem bílis a 37º C por 3 horas. à Sensibilidade a Bacitracina: Esta prova identifica os Streptococcus do grupo A, poisestes são sensíveis, enquanto outros Streptococcus não grupo A são resistentes a este antimicrobiano. O teste é realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Bacitracina com concentração de 0,04U. Após a incubação em baixa tensão de O2, verificar o tamanho do halo de inibição. Considerar como sensível um halo de inibição de raio maior que 2 cm. à Crescimento a 56°C: Para evitar dúvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), submeter a cultura a um aquecimento de 56º C por 30 minutos. Somente os enterococos resistem a esse tratamento. à Crescimento em Agar Chapman: Esta prova também diferencia os enterococos, pois estes toleram a alta concentração de NaCl presente no meio, como acontece com os estafilococos. à Crescimento em Agar EMB: Outra prova para identificação de enterococos, pois estes suportam a presença de corantes como o azul de metileno (que é inibidor para a maioria dos Gram positivos).

®

Meios utilizados na prática

Agar Chapman Composição do Meio (g/L) Extrato de carne Peptona Manitol Cloreto de sódio Vermelho de fenol Agar

Observações 1,0 10,0 10,0 75,0 0,025 15,0

pH do meio: 7,5 ± 0,2 Este meio possui agentes seletivo (NaCl a uma concentração de 7,5%), indicador (vermelho de fenol) e diferencial (manitol). Ou seja, além de restringir o crescimento de 49

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia bactérias não halófilas, permite a diferenciação de microorganismo fermentadores de manitol, o que é indicado pela viragem da cor do indicador de pH Vermelho de fenol, de laranja para amarelo.

Caldo Tioglicolato de Sódio Composição do Meio (g/L) Extrato de levedura Triptona Glicose Toglicolato de sódio Cloreto de sódio L-cistina Resazurina Agar

Observações 5,0 15,0 5,5 0,5 2,5 0,5 0,001 0,75

pH do meio: 7,1 ± 0,2 Esse meio é adequado para o cultivo de microorganismos aeróbios e anaeróbios. A resazurina é um agente indicador de oxidação, em presença de O2 o meio adquire coloração avermelhada.

Agar Sangue Composição do Meio (g/L) Triptona Peptona neutralizada Extrato de levedura Cloreto de sódio Sangue de carneiro Agar

Observações 14,0 4,5 4,5 5,0 7,0 12,5

pH do meio: 7,3 ± 0,2 O meio é altamente nutriente, além de ser suplementado com sangue, o que o torna um meio muito utilizado em etapas de enriquecimento e para visualização de propriedades hemolíticas de diversos microorganismos. Como na possui agentes seletivos, deve ser manipulado com bastante cuidado.

Caldo BHI (Brain Heart Infusion) Composição do Meio (g/L)

Observações

Sólidos de infusão de cérebro de bezerro Sólidos de infusão de coração de boi Proteose peptona Glicose Cloreto de sódio Fosfato dissódico

pH do meio: 7,4 ± 0,2 12,5 5,0 10,0 2,0 5,0 2,5

Este é um caldo de infusão tamponado, altamente rico em nutrientes e que não apresenta nenhum agente seletivo. É muito indicado para o crescimento de estafilococos para verificação de produção de coagulase, pois potencializa essa característica do microorganismo.

Agar DNAse

50

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Composição do Meio (g/L) Triptose Ácido deoxiribonucléico Cloreto de sódio Agar

Observações 20,0 2,0 5,0 12,0

pH do meio: 7,3 ± 0,2 A produção da DNAse no meio é detectada graças ao DNA adicionado. Para a leitura, é necessário adicionar HCL 1 N sobre toda a superfície do meio e aguardar a precipitação. Esta prova é utilizada para identificar estafilococos patogênicos, por estar correlacionada à produção de coagulase.

** O Caldo simples (TSB) e o Agar inclinado (TSA) são meios simples, sem nenhum nutriente de enriquecimento ou nenhum componente inibidor ou indicador, por isso, suas composições não serão estabelecidas aqui. Caso haja interesse, disponibilizamos os Manuais de Meios aos alunos.

Exercícios de fixação 1. Qual a finalidade do Agar Chapman na primeira etapa da aula prática? 2. De que maneiras podemos diferenciar os estreptococos dos enterococos? 3. Qual o método de classificação de estreptococos foi utilizada na aula? Em que estase baseia? 4. Quais as principais provas para identificação bioquímica de estafilocococs e quais os seus fundamentos? 5. Qual a finalidade da técnica da “Jarra com Vela”?

Observações

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Assunto 7: Coloração de Zihel-Neelsen (Visualização de Bactérias Espiraladas) Introdução Algumas bactérias não se coram pelo método de coloração de Gram, pelo simples fato de apresentarem composição da parede celular diferenciada das bactérias Gram positivas e Gram negativas. Entre estas bactérias estão as micobactérias, como o Mycobacterium tuberculosis, um bacilo álcool-ácido resistente de importância médica, por ser o causador da tuberculose humana e o Mycobacterium bovis, de grande interesse na nutrição por causar tuberculose em bovinos, sendo esta uma zoonose veiculada por alimentos. As micobactérias penetram pela mucosa da orofaringe e do trato digestivo chegando aos nódulos mesentéricos e a partir daí pode se disseminar para outros tecidos e órgãos, quando inaladas podem provocar tuberculose pulmonar idêntica à causada pelo Mycobacterium tuberculosis. A coloração de Ziehl-Neelsen é a técnica mais utilizada na identificação das micobactérias e de bactérias álcool-ácido resistentes em geral, como as bactérias espiraladas.. Muitas bactérias espiraladas estão associadas a doenças humanas: Leptospira (leptospirose); Treponema (sífilis) e Borrelia (doença de Lyme). Como são microrganismos muito delgados e recobertos por uma bainha protéica, a coloração de Gram não é útil na sua visualização. Para tanto são empregados métodos de impregnação com sais de prata (método de Fontana-Tribondeau) que permite sua observação em microscopia de campo claro e a observação direta em microscopia de campo escuro. A presença de bacilos álcool-ácido resistentes no escarro é forte sugestão de tuberculose pulmonar. Além disso, sangue colhido do lóbulo da orelha ou material colhido da própria lesão indica o diagnóstico da lepra (Mycobacterium leprae). Faz parte da prática do Nutricionista conhecer o assunto e atentar para a importância na orientação do consumo de leite pasteurizado, de origem conhecida e inspecionado, pois as infecções causadas por essas bactérias são graves.

Fundamentação teórica O gênero Mycobacterium contém grande número de espécies, as patogênicas de maior importância para o homem são Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium bovis. Com exceção da Mycobacterium leprae (que só pode ser cultivado em cultura de células), as micobactérias podem ser cultivadas em laboratório (in vitro), em meio de cultura seletivo. As bactérias desse gênero são bacilos finos, diferentes das demais bactérias em várias propriedades, a começar pela parede celular que é composta de ácidos graxos de cadeia longa (ácidos micólicos) e ceras (ésteres de ácidos graxos). São aeróbias estritas, possuindo tropismo pela árvore respiratória. Não são produtoras de esporos e possuem crescimento lento, graças à composição de sua parede celular, de caráter altamente lipídico, dificultando a absorção de nutrientes. Por esse mesmo motivo as micobactérias não se coram pela Coloração de Gram. Sua parede celular rica em substâncias lipídicas, como ceras e ácidos graxos de cadeia longa, dificulta a penetração dos corantes utilizados neste método. A velocidade de crescimento e a temperatura ótima para seu crescimento são variáveis.

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia São bactérias intracelulares facultativos que se proliferam no interior de macrófagos. São resistentes ao hidróxido de sódio, ácido sulfúrico e a certos anti-sépticos. Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra Tuberculose, a interpretação da lâmina pode ser: Negativo (-)

Ausência de BAAR em 100 campos microscópicos

Positivo (+)

Menos de 1 bacilo/campo em 100 campos

Positivo (++)

1 a 10 bacilos/campo em 50 campos

Positivo (+++)

Mais de 10 bacilos/campo em 20 campos

Na técnica da coloração de Ziehl-Neelsen, aliam-se a utilização de calor e agentes químicos mais fortes, como a fucsina fenicada e a solução de álcool etílico-ácido clorídrico (97:3), que possibilitam que a célula se core, podendo ser visualizada no microscópio. Além disso, a utilização destes fatores agressivos também elimina quaisquer contaminantes biológicos (outras bactérias) que possam existir no esfregaço, aumentando a possibilidade de visualização e confirmação das micobactérias. Para a visualização de bactérias espiraladas pode-se utilizar um artifício que aumenta a espessura das mesmas permitindo assim a sua observação. Isto é conseguido através da impregnação da superfície da bactéria com sais de prata que uma vez aquecidos sofrem oxidação e conseqüente escurecimento. A utilização de microscopia de campo escuro também permite a visualização direta das bactérias. O campo escuro é conseguido pelo uso de um condensador especial que faz com que os raios luminosos penetrem na objetiva apenas pelos seus bordos de modo que a iluminação das partículas se faça por reflexão e não transmissão. Desse modo apenas as partículas presentes são iluminadas contrastando com um findo escuro. Através desta visualização se faz possível inclusive a realização do diagnóstico por soroaglutinação microscópica (microaglutinação) na leptospirose.

Objetivo Após a realização da atividade prática você será capaz de: è executar a técnica da coloração de Zihel Neelsen; è diferenciar a coloração de Zihel Neelsen da coloração de Gram; è relacionar a composição química da parede celular das micobactérias com os corantes de Zihel; è diferenciar BAAR e BNAAR; è compreender o princípio do método de Fontana Tribondeau;

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia è diferenciar microscopia de campo claro e campo escuro e associar a importância desta última na observação de espiroquetas.

Material - Lâminas com esfregaços fixados de escarro de paciente com tuberculose - Fucsina de Zihel - Azul de metileno - Solução de álcool (97%) e ácido clorídrico (3%) - Água - Papel de filtro - Óleo de cedro - Microscópio - Bico de Bunsen

Execução da prática ® Etapas

Preparo e fixação do esfregaço Observações

Transferir uma alçada da cultura ou uma Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes colônia da placa para uma lâmina de culturas deve-se observar alguns detalhes: microscópio limpa. è de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia, espalhando-a pela lâmina à isso evitará a observação de colônias diferentes na lâmina e que seja coletado um inóculo muito carregado, o que dificultará a visualização das células coradas. è de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada e espalhá-la na lâmina à isso evita que seja coletado um inóculo muito carregado.

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Se Para o inóculo coletado de caldo não é tiver sido colhida colônia da placa, adicionar necessário adicionar solução salina. Mas para salina estéril para facilitar o espalhamento. colônia coletada de placa é necessário fazer a diluição na lâmina, evitando que o esfregaço fique muito concentrado o que dificulta a visualização das células coradas ao microscópio.

Passar a lâmina com o esfregaço sobre a É importante fixar o esfregaço para que este não chama do Bico de Bunsen, até que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a completamente seco. utilização de um e outro corantes

®

Coloração do esfregaço

Etapas da Coloração

O que está acontecendo na parede da bactéria?

Cobrir o esfregaço com solução fucsina Nesse momento, a fucsina não penetra na fenicada. parede da célula, pois sua composição altamente lipídica impede a difusão do corante. Esta coloração é muito mais agressiva que a coloração de Gram. Note que a fucsina utilizada é cerca de 5x mais concentrada que a utilizada no método de Gram.

Aquecer intermitentemente até a emissão de O aquecimento torna a parede lipídica mais vapores e manter por mais 5 minutos sem fluida, permitindo a entrada do corante na parede deixar que entre em ebulição. da célula.

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Lavar rapidamente com água.

Essa etapa é realizada para que não haja excesso de corante sobre o esfregaço na próxima etapa.

Lavar a lâmina inclinada a 45° com solução de álcool etílico:ácido clorídrico (97:3) até que não haja mais desprendimento de corante (aproximadamente 2 minutos).

A solução álcool-ácida é responsável por fixar o corante na parede da célula, impedindo sua saída. Como essas bactérias são álcool-ácido resistentes, não há dissolução da parede, mesmo esta tendo alto caráter lipídico.

Lavar o esfregaço com solução de álcool É importante que esta etapa seja realizada, pois etílico:ácido clorídrico (97:3) até que não haja se restar algum corante na lâmina, o próximo mais desprendimento de corante. corante a ser utilizado não se fixará na lâmina, não cumprindo seu papel.

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Cobrir o esfregaço com corante Azul de È importante que esta etapa seja realizada, pois Metileno por 30 segundos. se restar algum corante na lâmina, o próximo corante a ser utilizado não se fixará na lâmina, não cumprindo seu papel..

Lavar com água e secar suavemente com Após secar, observar no microscópio, objetiva de papel. imersão (100x), com óleo de cedro/mineral.

Comparando com a coloração de Gram: Coloração de Gram

Coloração de Zihel Neelsen

Principal corante

Cristal violeta

Fucsina fenicada

Fixador do corante

Lugol

Álcool:ácido clorídrico

Corante de contraste

Fucsina

Azul de metileno

Exercícios de fixação 1. Em que se baseia o método da coloração de Zihel Neelsen? 2. Por que os corantes desse método são mais agressivos que os utilizados no método de Gram (por exemplo, a fucisna é 5x mais concentrada)? 3. Por que os BAAR não se coram bem pelo método de Gram?

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Observações

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Assunto 8: Bacilos Gram-negativos Introdução As bactérias Gram negativas são de grande importância, pois abrangem as enterobactérias, e dentro deste grupo podemos citar dois subgrupos de grande destaque na área de alimentos: os coliformes fecais e totais, que indicam contaminação do alimento por manipulação inadequada. A família Enterobacteriaceae é uma das mais importantes famílias bacterianas, a ela pertencem muitos dos patógenos mais importantes para o homem e para os animais. Estes patógenos estão entre os principais agentes de infecção hospitalar e constituem a principal causa de infecção intestinal em muitos países. Além disso, quando patógenos de animais, são importantes porque causam perdas econômicas e porque os animais se apresentam como reservatório de patógenos humanos São de grande importância na nutrição porque indicam contaminação de origem fecal, já que seu habitat é o Trato Gastrintestinal de animais e do homem, de onde, via alimentos e água, se disseminam no meio, contaminando homens e outros animais. Os gêneros de maior importância são: à Escherichia * à Shigella à Salmonella à Yersinia à Enterobacter * à Citrobacter * à Klebsiella * Os gêneros sublinhados são enteropatógenos (causadores de doenças intestinais) e os gêneros assinalados compõem o grupo dos coliformes fecais, indicadores de contaminação fecal. Dentre estes só E. coli tem como habitat primário o TI do homem e de animais. Os demais também estão presentes em outros ambientes como vegetais e solo, onde persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella. A espécie E. coli é tão variável que existem sorotipos patogênicos e não patogênicos, e até da flora normal. Os principais microorganismos utilizados para indicar a qualidade microbiológica de alimentos são os coliformes fecais e totais. Visto a grande importância das enterobactérias na formação e atuação do nutricionista, enfocaremos estas bactérias na aula prática.

Fundamentação teórica O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminação de origem fecal foi proposto uma vez que este microorganismo é encontrado no trato intestinal do homem e de animais de sangue quente. O indicador ideal de contaminação fecal deveria ser de rápida e fácil detecção, ser facilmente distinguível de outros microorganismos da microbiota do alimento, ter como hábitat exclusivo o trato intestinal do homem e de outros animais, ocorrer em números muito altos nas fezes, entre outras características importantes. 59

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia O grupo dos coliformes totais é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a 35-37ºC, por 48 horas. Deste grupo, apenas a E. coli tem como hábitat primário o trato intestinal do homem e de animais. A presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos, já que outras espécies (Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella) não são de origem fecal. O grupo dos coliformes fecais são microorganismos pertencentes ao grupo dos totais, diferenciando-se pela capacidade de fermentar lactose com produção de gás em temperatura de 44-45ºC. Nessas condições, a maioria das cepas de E. coli são positivas, enquanto as outras bactérias possuem apenas algumas cepas com essa característica. A pesquisa de coliformes fecais ou de E. coli nos alimentos fornece informações sobre as condições higiênicas do produto e indicação da presença de patógenos. Quanto maior a concentração de coliformes fecais na amostra analisada, maior o risco de haver patógenos entéricos naquela amostra (água, alimentos, etc.). Em alimentos vegetais frescos, o único indicador válido de contaminação fecal é a E. coli, já que os demais indicadores de contaminação fecal são encontrados naturalmente nesse tipo de alimento. Em alimentos de origem animal, presença de coliformes indica manipulação sem cuidados higiênicos ou armazenamento inadequado. Em alimentos processados, a presença de um número considerável de coliformes indica processamento inadequado ou recontaminação pósprocesso, e a possível presença de microorganismos patogênicos e toxigênicos. É importante ressaltar que os alimentos não são fonte de contaminação, e sim veículos. A contaminação provém do TI do animal (POA) e do solo (POV - neste caso, sendo apenas superficial), por isso diz que as enterobactérias causam DVAs (Doenças Veiculadas por Alimentos). A pesquisa de enteropatógenos em alimentos normalmente requer várias etapas para que seja possível o isolamento do mesmo. Podemos citar a pesquisa de Salmonella. A legislação prevê a ausência deste patógeno em 25g da amostra, visto a sua alta virulência. Normalmente a pesquisa de Salmonella envolve as seguintes etapas: a) pré-enriquecimento: feito em meio líquido não seletivo, visa permitir a recuperação de bactérias injuriadas como conseqüência de algum processamento realizado no alimento (congelamento, salga, etc...): meio usado à caldo lactosado b) enriquecimento seletivo: feito em meios líquidos seletivos, visa aumentar a proporção de Salmonella em relação ao restante da microbiota e facilitar seu posterior isolamento: meios usados à Caldo Tetrationato, Caldo Selenito-Cistina. c) plaqueamento seletivo: em meios seletivo-indicadores sólidos, é a fase de isolamento. Uma grande diversidade de meios foi desenvolvida para este fim. A maioria deles apresenta lactose como açúcar de diferenciação: meios usados à Agar EMB, Agar MacConkey, Agar Entérico de Hektoen, Agar SS, etc... d) triagem: visa uma identificação preliminar de colônias suspeitas selecionadas nos meios de isolamento, utilizando um ou dois meios que permitem a realilzação de 2 ou mais provas bioquímicas simultaneamente: meios usados à Agar TSI, Agar LIA. e) confirmação bioquímica: visa uma identificação completa do gênero através de uma série de provas bioquímicas: produção de urease em Caldo Uréia; determinação do tipo de fermentação da glicose - provas VM e VP em caldo glicosado; utilização do citrato em Agar Citrato de Simmons; produção de indol em Água Peptonada ou Triptonada; motilidade em meio semisólido; etc... f) confirmação sorológica: visa confirmar a identificação através de uma reação de aglutinação utilizando um anti-soro polivalente contra o antígeno O de Salmonella .

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Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è Compreender o papel das enterobactérias como agentes de toxinfecções alimentares; è Caracterizar e compreender o modo de ação do meio EMB utilizado para o isolamento de bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e não fermentadores da lactose; è Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactérias; è Caracterizar as provas básicas de triagem e confirmação bioquímica para identificação e diferenciação de enterobactérias compreendendo seu mecanismo de ação.

Material ®

1º dia: isolamento de enterobactérias

- tubo de caldo Triptona de Soja (TSB) com crescimento de enterobactéria - placa de Agar BEM

®

2º dia: identificação bioquímica (IMVC e provas complementares)

- tubo com Agar TSI; - tubo com Agar Citrato de Simmons - tubo com Meio SIM; - tubo com água peptonada ou caldo triptonado; - tubo com caldo CL ou MRVP; - tubo com caldo uréia; - tubos com para provas de fermentação (Vermelho de Fenol suplementado com Glicose – com tubo de Durhan, Lactose e Manitol)

®

3º dia: interpretação das provas bioquímicas e complementares)

- Reativo de Kovacs - Vermelho de Metila - a-naftol VM - solução de KOH

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Execução da prática ®

1º dia: isolamento de enterobactérias

- inocular o Agar EMB com a cultura pela técnica de esgotamento em estrias

Após a execução da inoculação, incubar o meio a 37°C por 24 - 48 horas.

®

2º dia: identificação bioquímica (IMVC e provas complementares)

- observar o crescimento obtido e anotar as características das colônias, comparando com os dados da tabela abaixo: Característica colonial

Gêneros (ou espécies)

- colônias transparentes ou de cor âmbar

Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia

- colônias com brilho verde metálico à luz refletida Escherichia coli e centro negro à luz transmitida - colônias maiores que as de E. coli , mucosas, Enterobacter, Klebsiella confluentes, com centro escuro à luz transmitida - inocular os meios de triagem e confirmação bioquímica usando as seguintes técnicas: - Agar TSI: picada central até o fundo do tubo e estria no bizel; - Agar Citrato de Simmons: estria sinuosa ou reta na superfície; - Meio SIM: picada central até o meio do tubo; - Caldos Uréia, Glicose, Lactose, Manitol, Clark Louis (ou Caldo MRVP), e Água Peptonada (ou Água Triptonada): difusão.

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®

3º dia: interpretação das provas bioquímicas e complementares)

- utilizando os reativos próprios, quando necessário, e segundo orientação do professor, fazer as leituras das provas bioquímicas. OBSERVAÇÃO: - os reativos necessários para a prática são: - Reativo para verificação de Indol: Reativo de Kovac’s à paradimetilaminobenzaldeído; - Reativo para prova de Vermelho de Metila (VM): Corante Vermelho de Metila; - Reativos para prova de Voges Proskauer (VP): VP1 à a-naftol e VP2 à KOH

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - conferir os resultados obtidos nas provas bioquímicas e compará-los com a tabela abaixo, caracterizando a bactéria analisada: Gênero

GLI

LAC

MAN

H2S

MOT

IND

CIT

VM

VP

URE

Salmonella

+

-

+

+

+

-

+

+

-

-

Escherichia

+

+

+

-

+

+

-

+

-

-

Klebsiella

+

+

+

-

-

-

+

-

+

+

Proteus

+

-

-

+

+

+/-

+/-

+

-

+

®

Meios utilizados na prática

Agar EMB (Eosina Azul de Metileno) Composição do Meio (g/L) Peptona Lactose Fosfato dipotássico Eosina Y Azul de metileno Agar

Observações 10,0 10,0 2,0 0,4 0,065 15,0

pH do meio: 6,8 ± 0,2 Neste meio a combinação de eosina e azul de metileno como indicadores promove uma diferenciação entre as colônias de microorganismos que fermentam a lactose e os que não fermentam. As colônias lactosepositivas são negras e possuem halo transparente, e as lactose-negativas são incolores. O meio é inibidor para microorganismos Gram-positivos, graças aos corantes presentes. As colônias apresentam coloração azul-esverdeada e algumas apresentam brilho metálico à luz refletida.

Agar TSI (Tríplice Açúcar Ferro) Composição do Meio (g/L) Extrato de carne Extrato de levedura Peptona Cloreto de sódio Lactose Sacarose Glicose Citrato de ferro Tiossulfato de sódio Vermelho de fenol Agar

Observações 3,0 3,0 20,0 5,0 10,0 10,0 1,0 0,3 0,3 0,024 12,0

pH do meio: 7,4 ± 0,2 Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos, além de sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (H2S), formando sulfeto ferroso. A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo: os açúcares se depositam no fundo, se o microorganismo fermentar apenas a glicose (pequena concentração) a produção de ácido será pequena e apenas o fundo do tubo 64

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia mudará de cor; se o microorganismo fermentar além da glicose a sacarose e/ou a lactose (concentrações 10x maiores que a glicose), a produção de ácido será maior e a viragem de cor será no fundo e no bizel. A produção de H2S é indicada pela cor preta no meio. Como o Agar é inclinado, ocorrem duas reações diferentes: no bizel há metabolismo aeróbio e no fundo há metabolismo anaeróbio, gerando uma série de combinações de resultados possíveis.

Agar Citrato de Simmons Composição do Meio (g/L) Sulfato de magnésio Fosfato monobásico de amônio Fosfato de amônio sódico Citrato de sódio tribásico Cloreto de sódio Azul de bromotimol Agar

Observações 0,2 0,2 0,8 2,0 5,0 0,08 15,0

pH do meio: 7,0 ± 0,2 Nesse meio, o citrato é a única fonte de carbono disponível para o metabolismo da bactéria. Se o microorganismo descarboxilar o citrato, haverá viragem de cor do indicador de pH (azul de bromotimol) de verde para azul brilhante.

Meio SIM (Sulfeto Indol Motilidade) Composição do Meio (g/L) Triptona Peptona Sulfato férrico amoniacal Tiossulfato de sódio Agar

Observações 20,0 6,1 0,2 0,2 3,5

pH do meio: 7,3 ± 0,2 Este é um meio semi-sólido, com concentração de Agar muito baixa (3,5%, ao invés dos 15% que geralmente são adicionados ao meio), o que permite a verificação de motilidade do microorganismo, com crescimento além da área de inoculação. Além disso, a peptona e a triptona são fontes de triptofano, que pode ser metabolizado em indol pelo microorganismo. A produção de indol é verificada ao utilizar o reagente de Kovacs (para-dimetilaminobenzaldeído), com o aparecimento de um anel vermelho na parte superior do tubo. O meio também permite a detecção da produção de H2S, através da reação deste com o sulfato férrico, formando sulfeto ferroso (de cor negra).

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Água Peptonada Composição do Meio (g/L) Peptona Cloreto de sódio

Observações 10,0 5,0

pH do meio: 7,2 ± 0,2 A peptona é fonte de triptofano, que pode ser utilizado pelo microorganismo com produção de indol, que pode ser verificado quando da adição ao meio do Reagente do Kovacs (paradimetilaminobenzaldeído), com o aparecimento de um anel vermelho na parte superior do tubo.

* Água triptonada: a única diferença é a substituição de peptona por triptona, que é melhor fonte de triptofano. Caldo Uréia Composição do Meio (g/L) Peptona Glicose Fosfato dissódico Fosfato monopotássico Cloreto de sódio Vermelho de fenol Solução de uréia a 40%

Observações 1,0 1,0 1,0 20,8 5,0 0,004 50 (ml)

pH do meio: 6,8 ± 0,2 O meio é tamponado, para evitar mudanças bruscas de pH no meio. A produção de urease resulta em alcalinização do meio, o que pode ser verificado através da viragem da cor do meio de salmon (ou laranja claro) para rosa brilhante (pink).

Caldo MRVP (Metil Red Voges Proskauer) Composição do Meio (g/L) Peptona Glicose Tampão fosfato

Observações 5,0 5,0 5,0

pH do meio: 7,5 ± 0,2 O meio tem esse nome porque é utilizado nas provas bioquímicas Vermelho de Metila e Teste de Voges Proskauer, que são provas para verificação do tipo de fermentação realizada pelo microorganismo. à Prova do VM: Algumas bactérias utilizam a glicose com grande formação de ácido (fermentação ácido-mista), de forma que o pH do meio decaia de 6,9 para inferior a 4,4. Outras bactérias produzem menos ácido, reduzindo menos o pH. Essa distinção pode ser feita utilizando o Vermelho de Metila, que apresenta coloração amarela quando em pH > 5,1; e coloração vermelha quando em ph ≤ 4,4. à Prova do VP: A partir da glicose muitos microorganismos formam acetoína 66

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia (acetilmetilcarbinol) e 2,3-butanodiol (diacetil), que pode ser confirmado com a adição do reagente a-naftol seguida de alcalinização do meio com KOH. A coloração do meio muda para vermelho intenso. * Caldo CL: permite a realização das mesmas provas bioquímicas. Caldo para prova de fermentação – Caldo Vermelho de Fenol Composição do Meio (g/L) Peptona de caseína Peptona de carne Cloreto de sódio Vermelho de fenol

Observações 5,0 5,0 5,0 0,018

pH do meio: 7,4 ± 0,2 Esse é um caldo simples utilizado em provas de fermentação de carboidratos, com suplementação do carboidrato específico em uma concentração que varia de 5 – 10%. Se o microorganismo for fermentador do glicídio em questão, haverá produção de ácidos e o pH será reduzido, alterando a cor do indicador de pH vermelho de fenol de salmon (laranja claro) para amarelo.

* carboidratos adicionados para verificação de fermentação: glicose (10%), lactose (10%), manitol (10%)

Exercícios de fixação 1. Por que não podemos dizer que os alimentos são fonte de contaminação? 2. Quais são as provas que compõem o conjunto de provas IMVC? Qual o fundamento de cada prova? 3. Por que o Agar EMB é utilizado na primeira etapa? Qual o seu mecanismo de ação? 4. Por que é importante observar e registrar a cor de cada meio no momento da inoculação e após a incubação?

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Observações

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Assunto 9: Contagem em Placa e Técnica do Número Mais Provável (NMP) Introdução A quantificação de bactérias em alimentos, materiais, manipuladores, equipamentos, bancadas e águas é uma das formas de se avaliar a sua qualidade, permitindo a caracterização dos mesmos como apropriados ou não para consumo ou utilização. Representa, pois uma forma de avaliação do risco que estes representam à saúde. Podemos quantificar os microorganismos de forma direta ou indireta. A forma direta de quantificação é a contagem em placa, e a indireta mais utilizada é a técnica do NMP (Número Mais Provável). A contagem de colônias em placas é uma técnica quantitativa direta aonde cada colônia crescida numa placa de Agar corresponde a uma unidade formadora de colônia (UFC) proveniente do material. A técnica do número mais provável é um método indireto de contagem em meio líquido, onde a partir de uma evidência da presença de uma bactéria ou grupo de bactérias é possível se estimar o número mais provável desta no material analisado. Dentre os muitos microrganismos que podem ser quantificados incluem-se: contagem total de bactérias, coliformes, Staphylococcus coagulase-positivos, Bacillus cereus, etc.

Fundamentação teórica ®

Contagem em Placa

A contagem em placa consiste em nada mais que inocular o microorganismo que se deseja quantificar em um meio sólido não seletivo para que, após incubação adequada, possam ser contadas as colônias, que na verdade chamamos de UFC (unidade formadora de colônia). A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de microorganismos capazes de se multiplicarem e formarem colônias em meios de cultivo apropriados e sob condições de incubação adequadas. Cada colônia desenvolvida é suposta ter sido originada a partir de uma unidade viável, a qual pode ser um organismo ou muitos. Como para uma maior precisão da análise somente deverão ser contadas as placas com número de colônias entre 30 e 300 e devemos fazer a contagem em placa sempre em duplicata ou triplicata. A contagem de bactérias mesófilas é muito utilizada para indicar a qualidade sanitária dos alimentos. Um número elevado de microorganismos indica que o alimento é insalubre, mesmo que haja ausência de patógenos e de alterações físicas (na textura, aroma, sabor) no alimento. É importante ressaltar que todas as bactérias patogênicas são mesófilas (lembrando que os patógenos são capazes de causar doenças no nosso organismo, ou seja, se multiplicar e manter o metabolismo funcionando a temperatura de 37°C – temperatura de mesófilos). Para água potável, a legislação brasileira determina o limite máximo de bactérias heterotróficas de 500UFC/ml.

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®

Técnica do Número Mais Provável

A técnica do NMP é um método de quantificação indireta de microorganismos. Na realidade, não podemos contar UFCs, já que a análise é realizada em meio líquido, o que se faz é comparar o resultado encontrado com tabelas pré-escolhidas, obtendo um resultado aproximado da quantidade de microorganismos na amostra analisada. Estas tabelas possuem são elaboradas a partir de dados estatísticos, com os respectivos intervalos de confiança (95%) para diversas combinações de número de tubos positivos em cada série de diluição. Significa dizer que existe uma probabilidade de 95% de que o número “verdadeiro” de bactérias presentes na amostra se encontre dentro dos intervalos mínimos e máximos em torno do NMP. Muito embora o método dos tubos múltiplos apresente sensibilidade elevada, permitindo a detecção de baixas densidades de bactérias, o NMP não é um valor preciso, e a precisão do teste depende do número de tubos utilizados e dos volumes de amostra inoculados. Este método é muito usado para quantificar coliformes, mas pode ser utilizado para microorganismos em geral, pois o meio utilizado é adaptado ao microorganismo que se deseja quantificar, com agentes seletivos e indicadores.

®

Colimetria em amostra de água

A água é elemento fundamental para a sobrevivência humana. Sua grande utilização no abastecimento público, na recreação, na indústria, no uso doméstico atesta essa importância vital. A água merece atenção especial, pois pode veicular diversos parasitos, como vírus, bactérias, fungos e protozoários, além, de contaminantes químicos. As principais espécies bacterianas não patogênicas veiculadas pela água são Flavobacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella e Chromobacterium. Nas águas de países tropicais há uma maior variedade de microrganismos e o predomínio de mesófilos e termotolerantes. As espécies bacterianas patogênicas de maior importância veiculadas pela água são: Vibrio cholerae, Salmonella spp., Lepstospira sp., Shigella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolítica, Vibrio parahaemolyticus e Aeromonas hydrophila. Como seria muito caro e trabalhoso avaliar diretamente todos os patógenos nas amostras de águas, uma alternativa para a avaliação da qualidade sanitária da água é a pesquisa de bioindicadroes, ou seja, organismos não patogênicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrência de contaminação fecal, evidenciando o risco da presença de patógenos. Fezes humanas contêm de 20-30% de resíduos alimentares não digeridos, sendo o restante constituído de água e bactérias. No indivíduo saudável essas bactérias constituem os habitantes normais do intestino, onde a Escherichia coli é a representante característica. O número desses microrganismos pode atingir 109 células/g de fezes. Assim, a presença de Escherichia coli em alimentos e água é indicativa de contaminação fecal e possibilidade de presença de patógenos entéricos. Microrganismos indicadores de poluição de água são utilizados para monitorar, classificar e restringir o uso das águas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critérios: - Ser aplicável a todos os tipos de água; - Estar presente simultaneamente com os microrganismos patogênicos, com um tempo de sobrevivência igual àquele patógeno entérico mais resistente; - Não reproduzir-se em águas contaminadas, para não resultar em valores aumentados. Não se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismos que atenda a todos esses requisitos, mas há vários que se aproximam das exigências referidas e que são muito úteis.

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia As bactérias empregadas como indicadoras de poluição fecal em águas são: os coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. O indicador microbiológico mais empregado é o grupo dos coliformes. Este e outros indicadores de poluição orientam a margem de segurança sanitária de água potável, da água utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos comestíveis. A Organização Mundial de saúde (OMS) recomenda para águas de recreação um máximo de 100 coliformes fecais por 100 ml de água. · Coleta de Amostras A coleta de amostras para exame microbiológico deve ser feita em garrafas esterilizadas que tenham sofrido tratamento prévio de limpeza e rinsagem com água destilada. è Água clorada: adiciona-se 0,1 mL de tiossulfato de sódio 10% para cada 250 mL de água para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades desinfetantes entre o período da coleta e o momento da inoculação. è Água com alto teor de zinco e cobre: coletar na presença de um agente quelante, de forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais (0,3 mL de EDTA a 15%, pH = 6,5 para cada 120 mL de água). Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espaço livre na garrafa (a amostra deve ocupar 4/5 da garrafa) para facilitar a homogeneização antes da inoculação. As garrafas devem ser mantidas vedadas até o momento da coleta da amostra e deve-se tomar todos os cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar-se contaminações secundárias. ·

Ponto de Coleta

Água da torneira

Abrir a torneira e deixar a água correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a água acumulada na tubulação. Com algodão embebido em álcool, passar na abertura e internamente e em seguida flambar. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos. Abrir o frasco esterilizado e coletar a água. Introduzir água no frasco até cerca de ¾ do seu volume. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratório.

Poços e Cisternas

Preparação do frasco - amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um barbante para facilitar a descida no poço. Descer o frasco dentro do poço sem permitir que o mesmo toque nos lados. Submergir o frasco completamente na água. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da água para criar um espaço de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.

Rios, Lagoas Mares

e Coleta da amostra de água de rios e lagoas - nestes casos, deve-se mergulhar o frasco até uma profundidade de 20cm, com a abertura voltada em direção contrária a corrente, a fim de evitar a contaminação da água com as mãos. Coleta da água do mar - a coleta deve ser feita na região onde as pessoas costumam banhar-se, que corresponde à profundidade aproximada de 1,0m, que é a região das praias mais utilizada para a recreação de contato primário, na maré baixa e 24 horas sem chuvas.

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia · Acondicionamento e Transporte da Amostra para o Laboratório O ideal é a análise iniciar-se até 1 hora após a coleta. Caso isto seja impossível, a amostra deve ser transportada sob refrigeração. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10º C no prazo máximo de até 30 horas após a coleta. Amostras presumivelmente poluídas têm de ser inoculadas no máximo após 6 horas da coleta. Entre o recebimento da amostra e o início da inoculação, a mesma deve ser mantida em geladeira (cerca de 5ºC). · Exames Bacteriológicos da Água O exame bacteriológico da água é feito através de dois processos: Contagem de bactérias heterotróficas viáveis na água e determinação e colimetria (estimativa do número de coliformes). A metodologia padrão empregada no exame bacteriológico da água, para medida do grupo coliforme, inclui a técnica dos tubos múltiplos (NMP).

® Determinação de coliformes pela técnica dos tubos múltiplos - Número Mais Provável (NMP) A técnica do número mais provável consiste no exame de uma série de tubos onde foram inoculados volumes diferentes de amostra. O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em fórmulas de probabilidade. Considerações teóricas e determinações repetidas em grande escala, indicam que este tipo de técnica tende a fornecer valores mais elevados do que o número real. As disparidades tendem a diminuir quando adota-se séries com maior número de tubos em cada diluição. Portanto, a sensibilidade do teste depende do número de tubos adotados. Existem várias tabelas de NMP e a escolha da série a ser adotada é função das características microbiológicas da amostra. Na aula prática, utilizamos o sistema de 3 séries de 3 tubos, com diluições decimais sucessivas. A colimetria consta de 2 etapas: teste presuntivo, onde verificamos a existência de coliformes na amostra analisada, através da fermentação de lactose com produção de gás; e o teste confirmativo, onde podemos verificar se os coliformes da amostra são totais ou fecais. · Teste Presuntivo Inocular a amostra em 3 séries de tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose ou Caldo Lactose, de modo que cada série seja inoculada com um volume de amostra 10 vezes menor que a série anterior. Os tubos devem conter tubos de Durhan invertidos. Após incubação a 35 - 37ºC por 24 - 24 horas, o crescimento com formação de gás significa teste presuntivo positivo para coliformes. Os tubos que não apresentarem formação de gás com 24 horas de incubação, devem ser incubados até 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente inoculados nos meios de confirmação para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos. · Testes de Confirmação Para coliformes totais: A partir dos tubos com formação de gás obtidos na aula anterior, transferir uma alçada para tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile Lactose. Após incubação a 35 – 37º C por 48 horas, a formação de qualquer quantidade de gás constitui teste positivo para coliformes totais. Para coliformes fecais: A partir dos tubos com formação de gás obtidos na aula anterior, transferir uma alçada para tubos contendo caldo EC. Após incubação a 44,5 - 45º C por 24 horas, 72

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia a presença de gás no interior dos tubos de Durhan é considerada reação positiva, indicando contaminação de origem fecal. A ausência de gás, mesmo com evidência de crescimento indica a presença de coliformes de outra fonte que não intestinos de animais de sangue quente. Para completar o teste, podemos estriar uma alçada de cada tubo positivo na estapa confirmativa (dos caldos VBBL e EC) para placas com Agar EMB ], incubando a 35-37°C por 24 horas e analisar a morfologia através da coloração de Gram e observação ao microscópio (bacilos pequenos, Gram negativos, não esporulados) Muitas vezes, a colimetria é seguida de provas bioquímicas para a confirmação e caracterização do coliforme em questão, as mais utilizadas são as provas do teste IMVC, já discutido no assunto anterior (Assunto 8 - Bacilos Gram Negativos). Para E. coli, podemos observar os seguintes resultados: ++-- ou -+--. Para uma explicação do fundamento destas provas veja a prática de identificação de Bacilos Gram negativos.

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Tabela do número mais provável (NMP) Tubos Positivos por:

NMP para 100 mL

10 mL

1 mL

0,1mL

3 tubos

0

0

0

2400

Objetivos Após a realização da atividade prática você será capaz de: è compreender os fundamentos básicos dos métodos de quantificação de bactérias em água e alimentos, diferenciando a contagem direta em placas da enumeração indireta em caldo (NMP); è citar grupos de microorganismos quantificados normalmente em alimentos; è definir colimetria e citar suas fases e aplicações; è compreender a denominação NMP e UFC; èexpressar o resultado de uma contagem direta e uma indireta.

Material - Frasco com amostra de água para análise - Tubos de Caldo Lactose com tubos de Durhan (3 CL Duplo e 6 CL Simples) - 1 pipeta de 10 mL - 1 pipeta de 1 mL - 1 tubo de 9,9 mL de diluente estéril - Placa estéril - 1 tubo com Agar Padrão de Contagem (PCA) previamente fundido

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Execução da prática ®

Primeiro dia

· Contagem em placa - Antes de realizar a técnica, devemos realizar diluições decimais da amostra, para que a chance de obtenção de placas com números de UFC contável (30 - 300) seja maior.

- A técnica utilizada será a do pour plate, ou seja: transferir, com auxílio de uma pipeta estéril, 1 ml da amostra para uma placa de Petri vazia estéril. Adicionar o Agar PCA (padrão para contagem) fundido e resfriado sobre a amostra e homogeneizar suavemente com movimentos circulares, conforme mostra a figura a seguir:

- Deve-se fazer em duplicata a inoculação das diluições 100 (amostra não diluída) e 10-1, ou 10-1 e 10-2. · Técnica do NMP - Homogeneizar por agitação a amostra de água e inocular os tubos de caldo lactosado utilizando as pipetas estéreis, da seguinte forma: - Na primeira série, note que a concentração do caldo é dupla, devemos inocular 10 ml de amostra; 75

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Na segunda série, devemos inocular um volume 10x menos, ou seja, 1 ml; - Na terceira série, devemos inocular um volume 10x menor que o da série anterior, ou seja, 1 ml.

- Incubar as placas e os tubos a 35 – 37°C por 24 – 48 horas

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Segundo dia

- Contar as colônias no Agar, calcular o número médio de colônias obtidas, multiplicar pelo fator de diluição e expressar o resultado em UFC/mL.

OBSERVAÇÃO.: No nosso caso, o fator de diluição, ou fator de correção, será 1, pois o volume inoculado na placa de Petri foi 1 ml. O fator de correção é importante para a expressão do resultado, que deve ser em UFC/ml, pois transforma o resultado obtido em um resultado por 1ml. Muitas vezes na rotina, utilizamos volumes de inóculo diferentes de 1ml, como 0,1ml, ou utilizamos inóculos provenientes de diluições (10-1, 10-2, etc.). Nesse caso, para a expressão do resultado devemos multiplicar o número de UFCs obtido por um número que irá corrigir a distorção do resultado. Uma dica: se o inóculo utilizado for diluído decimalmente, o FD será o inverso da diluição utilizada. Ex.1: se o inóculo utilizado for 0,1ml, qual será o FD? 10, pois 10 x 0,1 = 1ml, ou de outra maneira: 1 ÷ 0,1 = 10. Ex.2: se o inóculo for 1ml da diluição 10-2, qual será o FD? 100, pois 100 x 10-2 = 1, ou de outra maneira 1 ÷ 10-2 = 100. Ex. 3: se o inóculo utilizado for 0,5, qual será o FD? 2, pois 2 x 0,5 = 1, ou de outra maneira 1 ÷ 0,5 = 2. - Proceder à leitura dos tubos positivos no caldo lactose (ou LST) e consultar a tabela para expressar o resultado em NMP/100 mL (teste presuntivo).

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Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Inocular os tubos positivos na colimetria para caldos EC e VBBL através da técnica de difusão (teste confirmativo), conforme o esquema a seguir:

- Incubar os tubos de calo VBBL a 35 – 37ºC por 24- 48 horas e os tubos de caldo EC a 44,5 – 45ºC por 24 – 48 horas.

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Terceiro dia

- Proceder à leitura dos tubos dos caldos EC e VBBL (teste confirmativo), considerando positivos os tubos com formação de gás no tubo de Durhan. Vale a pena lembrar que os coliformes totais serão positivos apenas no caldo VBBL e os coliformes fecais serão positivos em ambos os caldos.

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Meios utilizados na prática

Caldo Lactose Composição do Meio (g/L) Extrato de carne Peptona Lactose

Observações 3,0 5,0 5,0

pH do meio: 6,9 ± 0,2 A lactose presente no meio é o indicador da presença de coliformes, através da verificação da fermentação com produção de gás no tubo de Durhan invertido introduzido no meio.

* podemos substituir o caldo lactose por caldo LST (lauril sulfato triptose), procedendo a incubação e a leitura da mesma forma. Agar Padrão para Contagem (PCA) Composição do Meio (g/L) Triptona Extrato de levedura Glicose Agar

Observações 5,0 2,5 1,0 9,0

pH do meio: 7,0 ± 0,2 Este meio é um meio simples, sem agentes seletivos, inibidores ou indicadores. Ideal para contagem de microorganismos em geral.

Caldo EC (E. coli) Composição do Meio (g/L) Peptona de caseína Lactose Sais biliares Cloreto de sódio Fosfato de potássio dibásico Fosfato de potássio monobásico

Observações 20,0 5,0 1,5 5,0 4,0 1,5

pH do meio: 6,9 ± 0,2 Os sais biliares são responsáveis pela inibição do crescimento da microbiota acompanhante. Além disso, a temperatura de incubação (45,5°C) e a presença de lactose são indicadores para coliformes fecais, pois estes são capazes de fermentar a lactose com produção de gás a esta temperatura. O meio é tamponado para evitar que alterações no pH prejudiquem o resultado.

Caldo VBBL (Verde Brilhante Bile Lactose) Composição do Meio (g/L) Peptona Lactose Bile de boi (purificada) Verde brilhante

Observações 10,0 pH do meio: 7,4 ± 0,2 10,0 20,0 O meio contém 2 agentes seletivos: bile de boi 0,0133 e verde brilhante, que inibem o crescimento de Gram +. Além disso, a lactose tem o papel de 78

Universidade Federal Fluminense Instituto biomédico Departamento de Microbiologia e Parasitologia indicador, pois os coliformes são capazes produzir gás na fermentação da lactose.

Exercícios de fixação 1. Qual a finalidade da colimetria? 2. Qual a diferença entre os métodos diretos e indiretos de quantificação de bactérias? 3. Qual a fundamentação da etapa confirmativa da colimetria? 4. Como se realiza o cálculo das UFCs na contagem em placa? 5. Por que devemos realizar diluições para executar as técnicas de contagem em placa e do NMP?

Observações

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Bibliografia - Vigilância e controle da qualidade da água para consumo humano/ Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde. – Brasília : Ministério da Saúde, 2006. - Brown, A. E. Benson Microbiological Applications – Laboratory Manual in General Microbiology. 8th Edition. The McGraw−HillCompanies, 2001. - Morello, J. A.; Granato, P. A.; Mizer, H. E. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology: Applications to Patient Care. 7th Edition. The McGraw−Hill Companies, 2003. - Harley, J. P. Prescott, L. M. Laboratory Exercises McGraw−HillCompanies, 2002.

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- Trabulsi, L. R.; Althernum, F. Microbiologia. 4ª edição. Editora Atheneu. 2004. - Bossolan, N. R. S. Introdução à Microbiologia. IFSC – LCE – Disciplina Biologia 3. 2002. - Vicente, E. J.; Apostila de Aulas Práticas de Microbiologia. USP – ICM – Disciplina Microbiologia Básica. 2007.

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