A DESCOBERTA DE NOVAS BIOMOLÉCULAS EM PARASITOS DE IMPORTÂNCIA EM SAÚDE PÚBLICA E MEDICINA VETERINÁRIA: UMA AÇÃO MULTIDISCIPLINAR

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A DESCOBERTA DE NOVAS BIOMOLÉCULAS EM PARASITOS DE IMPORTÂNCIA EM SAÚDE PÚBLICA E MEDICINA VETERINÁRIA: UMA AÇÃO MULTIDISCIPLINAR Ana Carolina Ribeiro Gomes Maia* José Eduardo Felga** André Flávio Soares Ferreira Rodrigues*** Eveline Gomes Vasconcelos****

RESUMO A proposta deste trabalho é focalizar como o estudo de proteínas, bem como o conhecimento multidisciplinar que este estudo exige, tem contribuído na descoberta de novos alvos terapêuticos e no desenvolvimento de vacinas contra parasitos. Este artigo também sumariza os trabalhos realizados em Juiz de Fora que somente se tornaram possíveis devido às colaborações efetuadas entre instituições de serviço e saúde e entre instituições acadêmicas e comunidade local, representando a importância da interação de várias áreas do conhecimento. Implicações destes esforços são discutidas. Palavras-chave: Proteína. Terapia. Diagnóstico. Vacina. Disciplinas. Colaborações. ABSTRACT The proposal of this work is to focus as the study of proteins, as well as the knowledge of the inter-related disciplines that this study demands, has been contributing in the discovery of new therapeutic targets and in the development of vaccines against parasites. This article also summarizes the works executed in Juiz de Fora/MG that became only viable due to the collaborations made between health and service institutions, and between academic institutions and local community, representing the importance of the interaction of several knowledge areas. Implications of these efforts are discussed. Keywords: Protein. Therapy. Vaccine. Disciplines. Collaborations.

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Ex- bolsista de Iniciação Científica do Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora, graduada em Ciências Biológicas (CES/JF). ** Especialista em Laboratório de Saúde Pública. *** Doutor em Ciências Veterinárias (UFRRJ), Professor da UFSJ. **** Professora da Universidade Federal de Juiz de Fora, Doutora em Ciências Biológicas (USP).

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INTRODUÇÃO As altas taxas de prevalência e morbidade, a cronicidade e a severidade de doenças parasitárias acarretam graves conseqüências sócio-econômicas. O controle epidemiológico dessas doenças, através da implementação de métodos diagnósticos, medidas profiláticas, vacina e tratamento em massa das populações parasitadas, é de altíssima relevância. As principais endemias parasitárias, como malária, doença de Chagas, leishmanioses, esquistossomose e infecções intestinais que acometem milhões de pessoas no Brasil e no mundo (SILVA, 2003), bem como aquelas de importância em medicina veterinária (VERCRUYSSE et al., 2004) foram recentemente revisadas. O objetivo básico da farmacoterapia no controle das parasitoses pressupõe a redução da prevalência e a prevenção de formas graves da doença. A existência de espécies de parasitos resistentes às drogas e o alto custo dos medicamentos disponíveis, uma vez que o controle da doença geralmente inclui extensas áreas populacionais e requer a necessidade de repetição do tratamento para que este seja efetivo, reforça a necessidade de se desenvolverem novos medicamentos, assim como a necessidade de métodos de controle alternativos, em particular a produção de vacinas (PENIDO; NELSON; COELHO, 1999; BERGQUIST, 1998; VERCRUYSSE et al., 2004; REED; CAMPOS-NETO, 2003). Embora com eficácia limitada, existem algumas vacinas em veterinária que já são comercializadas e/ ou distribuídas por órgãos governamentais de diversos países, tais como aquelas contra Eimeria spp., Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Babesia canis e Boophilus microplus (VERCRUYSSE et al., 2004). Vários candidatos a vacinas (proteínas nativas ou recombinantes) contra malária, leishmaniose, doença de Chagas e esquistossomose humanas têm sido também testados, criandose perspectivas a curto/médio prazo de elaboração de vacinas efetivas para a prevenção destas parasitoses humanas (KNOX et al., 2001; VERCRUYSSE et al., 2004; SCHETTERS, 2005; GOOD, 2005; COLER; REED, 2005). Esses são sinais encorajadores para que se identifiquem novas moléculas e estratégias profiláticas contra as diversas doenças parasitárias que acometem o homem e os animais (VERCRUYSSE et al., 2004). IDENTIFICAÇÃO DE NOVAS BIOMOLÉCULAS A necessidade da interação multidisciplinar em pesquisa básica aplicada para a descoberta de novos recursos terapêuticos e vacinas tem sido enfatizada 32 CES Revista, v. 22

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por diversos autores (KNOX et al., 2001; VERCRUYSSE et al., 2004; COPPEL; BLACK, 2005). Os focos prioritários de pesquisa nestas áreas são definidos por trabalhos epidemiológicos de saúde pública. Quando bem conduzidos, contribuem na identificação dos mecanismos de transmissão de parasitoses humanas e veterinárias em áreas endêmicas e não-endêmicas e também na reformulação de metodologias de controle (SILVA, 2003; KNOX et al., 2001). As metodologias de pesquisa estão cada vez mais sofisticadas e refinadas. A contribuição da biologia celular e da análise ultraestrutural de parasitos através de técnicas de microscopia tem sido fundamental para a localização de antígenos nas diversas fases do ciclo biológico e no entendimento dos mecanismos de interação hospedeiro-parasito (KNOX et al., 2001). Estes estudos têm permitido também a implementação de procedimentos básicos para a manutenção de parasitos in vivo ou em cultura (KNOX et al., 2001). As técnicas de bioquímica básica e de biologia molecular facilitam o fracionamento de misturas complexas e o isolamento de biomoléculas, permitindo a obtenção de antígenos puros em larga escala sem sacrifício de grande número de animais (KNOX et al., 2001; SILVA, 2003). A determinação da seqüência de nucleotídeos e da proteína codificada, com subseqüente expressão em células procariotas e eucariotas, são agora procedimentos básicos da biologia parasitária (KNOX et al., 2001). Projetos de sequenciamento de genomas de várias espécies de parasitos e seus vetores, de interesse humano e em veterinária, estão em curso. Entre eles podemos citar os genomas de Anopheles gambiae, Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Babesia bovis, Neospora canium, Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis, Trichomonas vaginalis, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Brugia malayi, Schistosoma mansoni, Necator americanus, e alguns deles já finalizados (COPPEL; BLACK 2005). As análises de transcriptoma que analisam o modelo de transcrição do mRNA total de cada parasito e do proteoma que analisa quais das proteínas são expressas dentro de um tipo de célula, tecido ou estágio de desenvolvimento, têm progredido e permitirão avanços consideráveis no conhecimento da dinâmica dos processos internos do parasito e sua relação com o hospedeiro (ASHTON; CURWEN; WILSON, 2001). Estes projetos vêm abrindo grandes possibilidades de avanços na compreensão dos mecanismos de patogenicidade parasitária e de seus vetores, assim como para a identificação de alvos específicos para novos medicamentos e vacinas, o que tem levado a um enorme investimento em biotecnologia (ASHTON; 33 Juiz de Fora, 2008

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CURWEN; WILSON, 2001; SILVA, 2003). Estudos imunológicos paralelos visam definir a resposta imune humoral e celular do hospedeiro a antígenos específicos de parasitos, bem como aquela requerida para proteção do hospedeiro e o adjuvante adequado para a formulação de vacinas (REED; CAMPOS-NETO, 2003). As diversas respostas imunológicas a antígenos parasitários tais como a produção de citocinas, polarização do tipo de resposta T helper, regulação de isotipos de anticorpos e a expansão do pool de células de memória T e B, têm sido amplamente estudadas (REED; CAMPOSNETO, 2003). Estes estudos mostraram a complexidade da interação hospedeiroparasito, principalmente no que se refere a resistência ou à susceptibilidade dos hospedeiros às infecções (REED; CAMPOS-NETO, 2003). Por extensão, uma importância crescente tem sido dada aos fatores genéticos, tais como raça, idade e o papel do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) no reconhecimento de antígenos que interferem nas respostas imunológicas. A genética é, portanto, uma área de conhecimento essencial para a compreensão dos determinantes de susceptibilidade ou resistência de hospedeiros humanos ou animais à doenças parasitárias (KNOX et al., 2001). É também importante enfatizar a contribuição da bioinformática, ao estabelecer bases de dados de nucleotídeos e proteínas que podem ser facilmente acessadas via a World-Wide Web (COPPEL; BLACK, 2005). Estas bases de dados e os softwares associados tornaram reais as contribuições da biologia molecular para todos os ramos da biologia celular. Eles disponibilizam as seqüências genômicas e os programas de busca para a comparação entre sequências protéicas e determinação de suas características físico-químicas. Além disso, estes programas permitem a identificação de motivos antigênicos através do conhecimento das moléculas que compõem o Complexo Principal de Histocompatibilidade, da modelagem da estrutura organizacional protéica e análise de sequências de aminoácidos expostas em sua superfície. O mapeamento destes motivos antigênicos permite a subsequente síntese dos fragmentos protéicos de interesse e a avaliação imunológica dos mesmos. Estas informações disponibilizadas à comunidade científica através dos bancos de dados virtuais do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e do Expasy têm contribuído na identificação de novos alvos terapêuticos e moléculas vacinais, bem como para o entendimento dos possíveis mecanismos de controle 34 CES Revista, v. 22

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das bem como para o entendimento dos possíveis mecanismos de controle das parasitoses. Todas estas abordagens multidisciplinares tornam-se evidentes nos trabalhos abaixo citados, usando como exemplo a ATP difosfohidrolase, um novo antígeno que tem sido pesquisado por diversos autores. AS ATP DIFOSFOHIDROLASES DE PARASITOS E INVERTEBRADOS ATP difosfohidrolases (EC 3.6.1.5), encontradas em plantas, mamíferos, invertebrados e parasitos, constituem uma família de proteínas, as NTPDases (ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase), que têm como características em comum a capacidade de hidrolisar nucleosídeos di- e trifosfatados aos monofosfatados correspondentes e a ativação por cátions divalentes (ZIMMERMAN, 1999). Em parasitos, tais como Trichinella spiralis, T. gondii, E. histolytica, T. vaginalis e T. cruzi, estas enzimas estão relacionadas com a virulência e em alguns induzem forte resposta imunológica (BERMUDES et al., 1994; BARROS et al., 2000; AGUIAR et al., 2001; GOUNARIS, 2002; FIETTO et al., 2004). Em invertebrados, a atividade ATP difosfohidrolásica foi associada à glândula salivar de hematófagos onde um papel anti-hemostático tem sido descrito. Acredita-se que a enzima atue diretamente sobre o ADP, inibindo a agregação plaquetária e facilitando a alimentação. A atividade ATP difosfohidrolásica foi detectada na saliva ou no homogeneizado de glândulas salivares do barbeiro Rhodnius prolixus, da mosca tsetsé Glossina austeni, do mosquito Aedes aegypti, dos flebotomíneos Phlebotomus papatasi e Lutzomyia longipalpis, e dos carrapatos Ixodes dammini e Ornithodoros savignyi (CHAMPAGNE, 2004). O Departamento de Bioquímica da UFJF tem caracterizado e purificado ATP difosfohidrolase, em sua forma nativa, em diversos parasitos. Isoformas de ATP difosfohidrolase já foram caracterizadas e purificadas em vermes adultos, esquistossômulos e ovos de S. mansoni (VASCONCELOS et al., 1996; FARIAPINTO et al., 2004) e em formas promastigotas de Leishmania amazonensis (COIMBRA et al., 2002). Através de ensaios imunocitoquímicos ultra-estruturais, foi demonstrado que as enzimas estão localizadas na superfície externa do tegumento de S. mansoni (VASCONCELOS et al.,1993; 1996) e que são secretadas pelos ovos (FARIA-PINTO et al., 2004). Em promastigotas de L. amazonensis, usando os mesmos procedimentos, a enzima foi observada na superfície externa da membrana plasmática, bolsa flagelar e membrana do flagelo (COIMBRA et al., 2002). Através de análises imunológicas, a ATP difosfohidrolase de S. mansoni mostrou-se altamente antigênica (FARIA-PINTO et al., 2004). As seqüências 35 Juiz de Fora, 2008

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de aminoácidos das ATP difosfohidrolases de S. mansoni, T. cruzi, T. gondii e Leishmanias já foram publicadas e disponibilizadas na World-Wide Web1 por outros grupos de pesquisadores, possibilitando o estudo de suas estruturas como anteriormente mencionado (BERMUDES et al., 1994; DeMARCO et al., 2003; FIETTO et al., 2004). É interessante ressaltar a existência de antígenos que são membros de famílias de proteínas altamente conservadas e que são encontrados em todos os tipos de células de procariotos e eucariotos. Apesar disso, estes antígenos induzem resposta imune celular ou humoral altamente específica, dependente do ciclo biológico do parasito e da apresentação de antígenos (REQUENA; ALONSO; SOTO, 2000). Com o intuito de expandir nossos trabalhos, iniciamos a caracterização de ATP difosfohidrolase em outros parasitos escolhidos por sua importância epidemiológica. Devido à necessidade de elaboração de medidas adequadas de controle da ocorrência de hemoparasitos em cães de rua na cidade de Juiz de Fora/MG, Rodrigues, D’Agosto e Daemon (2002) avaliaram 104 cães, sendo 60 procedentes do Setor de Apreensão Animal (SAA) da Usina de Reciclagem da Prefeitura e 44 do Canil da Sociedade Juizforense de Proteção aos Animais (SJPA). O único hemoparasito encontrado foi Babesia canis em 26,92 % dos cães estudados, sendo 28,33 % no SAA e 25% na SJPA, principalmente em cães jovens, não havendo diferenças significativas entre os dois locais. Outros hemoparasitos, tais como Haemobartonella canis e Ehrlichia canis, não foram encontrados neste estudo (RODRIGUES; D’AGOSTO; DAEMON, 2002), embora também sejam de importância epidemiológica em outras regiões do país. A babesiose canina é uma doença parasitária de característica hemolítica, transmitida por carrapatos que causa anemia em decorrência da infecção das hemácias por hematozoários do gênero Babesia. A Babesia canis e a Babesia gibsoni são as duas espécies capazes de infectar o cão e a gravidade dos sintomas clínicos, bem como o comprometimento múltiplo de órgãos, são dependentes da intensidade da hemólise, da patogenicidade da cepa envolvida e de características de susceptibilidade relacionadas ao hospedeiro (O’DWYER, 1996). Os cães, quando infectados, apresentam abatimento, febre, cansaço, urina escura e mucosa de cor amarelada. Se o animal não receber tratamento adequado, sua morte poderá advir. No Brasil, o carrapato trioxeno Rhipicephalus sanguineus é considerado o transmissor da B. canis e Ehrlichia canis, e ele é amplamente distribuído em outras regiões das Américas, Europa, África, Ásia e 1

Disponível em: Acesso em: 06 jul. 2007.

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Austrália (O’DWYER, 1996). Assim, iniciamos em nosso laboratório a caracterização desta proteína em B. canis, com perspectivas de estudos imunológicos, dando relevância ao projeto e nos motivando a sua continuidade. CONSIDERAÇÕES FINAIS A interação de várias áreas de conhecimento, como foi enfatizada neste trabalho, é de relevância e tem contribuído para a descoberta de novas biomoléculas imunogênicas em parasitos, criando perspectivas de aplicação em saúde pública e na medicina veterinária. Nossos trabalhos também têm sido executados com a participação de pesquisadores e alunos da UFJF e de instituições públicas e particulares, como o Centro de Pesquisas René Rachou da Fundação Oswaldo Cruz de Belo Horizonte, Minas Gerais, Instituto Oswaldo Cruz, cidade do Rio de Janeiro, Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora, Minas Gerais, Clínica de Veterinária Manoel Honório, Juiz de Fora, Minas Gerais, Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte, Minas Gerais e Center of Disease Control, Atlanta, EUA. Essa interação entre os grupos tem propiciado cooperações interinstitucionais, governamentais ou não, que permitem a integração das abordagens nas áreas de Parasitologia, Zoologia, Bioquímica, Imunologia, Genética e Bioinformática, promovendo o avanço do conhecimento científico a todos os integrantes dos respectivos núcleos de pesquisa. Além disso, vincula nossos projetos a ações cooperativas entre universidade e empresa, vislumbrando o aproveitamento biotecnológico de biomoléculas em setores ligados à economia nacional, o que tem sido incentivado por fomentadoras de pesquisa. É de relevância lembrar que a universidade tem um papel fundamental na identificação de alunos de graduação com potencial científico e na integração dos mesmos em projetos de pesquisa, estimulando-os à carreira acadêmicocientífica. Além disso, essa participação de alunos é um incentivo para que instituições públicas e privadas criem cursos de pós-graduação stricto sensu de máxima abrangência e de natureza interdisciplinar e interinstitucional. É importante destacar que estes cursos, ao capacitarem um maior número de profissionais, favorecem o desenvolvimento social, econômico e cultural da comunidade e regiões circunvizinhas. Artigo recebido em: 23/11/2006 Aceito para publicação: 12/02/2007 37 Juiz de Fora, 2008

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