Alimentos

PRACTICA N° 02:
Cuantificación de Mesófilos, coliformes y Stafilococcus aureus
I.-INTRODUCCION:
El crecimiento de poblaciones microbianas puede medirse de diferentes maneras. Algunos métodos determinan el número de células y otros la masa total de la población, que a menudo es directamente proporcional al número de células. La magnitud de la población normalmente se registra como el número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido. Como las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayoría de los métodos de cuantificación se basan en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas; después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. En estos métodos se utilizan una serie de diluciones, y así ce puede determinar con facilidad el número de bacterias en la muestra original. Para contar las poblaciones microbianas en alimentos sólidos se realiza un homogenizado en una licuadora de alimentos y 9 partes de agua.
Sin embargo ninguno de los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los métodos básicos utilizados para investigar el número "total" de microorganismos:
Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células viables.
Técnica en profundidad; Sucesivas diluciones del inoculo se van colocando en Placas de Petri estériles y se van mezclando con el agar fundido que fue vertido posteriormente. Las colonias subsiguientes crecerán en medio del agar.
Técnica en superficie; primero se deja solidificar el agar y luego se realiza la siembra por toda la superficie haciendo uso de un asa de Drigalsky.
Técnica por goteo; se realiza utilizando una micropipeta.
Método del número más probable (NMP):
De gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables.
Técnicas de reducción de colorantes:
Para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora.
Recuento microscópico directo (DMC):
Tanto para células viables como para las no viables.
El recuento en placa es el método más utilizado y más recomendado por la Comisión Internacional sobre Especificaciones Microbiológicas en los Alimentos (ICMSF). Se basa en la cuantificación de la población microbiana presente en alimentos sólidos o líquidos, sembrando en profundidad o en superficie. La mayoría de alimentos no son estériles, sino que contienen una población microbiana, que varía en número, dependiendo del alimento. Es por eso que al alimento se le realizan diluciones para su cuantificación, ya que podría presentar un recuento tan alto que sería imposible realizar su conteo. Se utilizan las diluciones logarítmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), las cuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicando por el factor de dilución, que es el inverso de la dilución. La dilución inicial siempre será 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestra va a depender del tipo de alimento y de los parámetros que existan, pero lo importante que se guarde relación: 1+9 es decir 1 parte de alimento y 9 partes de diluyente.
El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de – 34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:
Los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura: psicrótofos
Los que crecen entre 20 – 30º C, con una temperatura óptima de crecimiento está entre 30 – 40º C: mesófilos
Los que crecen por encima de los 45º C: termófilos
Las bacterias aerobias mesófilas o también llamadas bacterias heterotróficas (heterótrofas) se definen como aquellas bacterias que usan compuestos de carbono orgánico como fuente de energía y el carbono para su crecimiento, en contraposición con las bacterias autotróficas que utilizan los compuestos inorgánicos como fuente de energía y el CO2, como fuente de carbono. Se considera que dependiendo del cultivo, se pueden determinar: mesófilos aerobios y facultativos viables, utilizando Agar Plate Count; proteolíticos utilizando agar leche; lipolíticos, utilizando agar tributirina; coliformes utilizando agar EMB o VRBD. Los mesófilos se incuban a 37°C por 24 a 48 horas.
En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima.
Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar:
Excesiva contaminación de la materia prima.
Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración.
La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos.
La inmediata alteración del producto.
El recuento de mesófilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos


OBJETIVOS:
Efectuar la numeración de bacterias aerobias mesófilas viables en el pescado.
Determinar la cantidad de microorganismos (Staphylococcus) que hay en la muestra de Pescado.







MATERIALES:
Muestra:
Biológicos :
Muestra: jurel salado

Laboratorio :
Agar MacConkey ( coliformes)
Agar Plate count (mesofilos)
Agar Manitol Salado (Staphylococcus aureus)
Diluyente: Agua Destilada.
Frascos estériles
Licuadora Esteril.
Cuchillo Esteril
Picador Limpio
Balanza Analitica
Tubos de dilución
Pipetas de 1 y 10 mL
Espátulas de Drigalsky
Placas Petri.
Gradilla.
Mechero.
Estufa con Temperaturas: 37°C.




PROCEDIMIENTO:
Tomar una muestra de pescado de 1kg aproximadamente.
Utilizando un picador separar la cabeza y cola; y seccionar el cuerpo en trozos.
Pesar 50 gr. De la muestra que será colocada en un matraz o un frasco estéril y completar con 450 ml de solución salina para completar 500 ml de solución.
Colocar la mezcla anterior de la solución salina con el pescado en la licuadora y licuar a 3000 rpm durante 1 minuto, para homogenizar la muestra.
Preparar diluciones de la muestra: Donde se tomaran 10 ml del homogenizado y se verterá en 90 ml de agua destilada estéril con lo que lograremos la dilución 10-1; proceder con las siguientes diluciones hasta llegar a 10-6.
Sembrar las diluciones en placas Petri conteniendo agar manitol salado, para ello se realizara el sembrado en superficie y profundidad de las ultimas 3 diluciones, inoculando 0.1ml si es en superficie y 1ml si es en profundidad.
Incubar a una temperatura de 37°C durante 24 horas.
Lectura de resultados: Se tomaran las placas con colonias contables con un rango de crecimiento entre 20 – 200 colonias.
El resultado será dado tomando en cuenta la dilución y en UFC/ml.

Pesar 50 grDe muestraPesar 50 grDe muestraRESULTADOS:
Pesar 50 gr
De muestra
Pesar 50 gr
De muestra
Preparación de la Muestra de 50gr.
















La muestra que es colocada en un frasco estéril y completar con 450 ml de agua destilada (con fines practicos) para completar 500 ml de solución.











Colocar la mezcla anterior de la solución salina con el pescado en la licuadora y licuar a 3000 rpm durante 1 minuto, para homogenizar la muestra.








Preparar diluciones de la muestra hasta llegar a 10-6.









Sembrar las diluciones en placas Petri conteniendo agar Plate Count para el recuento de messofilos, para ello se realizara el sembrado de 0.1ml en superficie y será distribuido con la espátula de Drigalsky y 1ml en profundidad
de las ultimas 3 diluciones 10-4 10-5 10-6


Incubar a 37°C x 24 horas y realizar la lectura de los resultados.



El resultado para el recuento de mesófilos fue Positivo





Resultado del Recuento de Colonias en cada Dilución.

SIEMBRA SUPERFICIE
10-4
115
10-5
55
10-6
20







Sembrar las diluciones en placas Petri conteniendo agar Mac Conkey para el recuento de coliformes, para ello se realizara el sembrado de 0.1ml en superficie y será distribuido con la espátula de Drigalsky y 1ml en profundidad de las ultimas 3 :10-4 10-5 10-6




Incubar a 37°C x 24 horas y realizar la lectura de los resultados.

El resultado para el recuento de coliformes fue NEGATIVO

Sembrar las diluciones en placas Petri conteniendo agar Manitol Salado para el recuento de Staphyloccocus aureus, para ello se realizara el sembrado de 0.1ml en superficie y será distribuido con la espátula de Drigalsky y 1ml en profundidad de las ultimas 3 :10-4 10-5 10-6



El resultado para el recuento es Positivo debido a la coloración característica amarilla.
Observación microscópica de las colonias positivo para Staphylococcus aureus.



SIEMBRA SUPERFICIE
10-4
30
10-5
20
10-6
5

CONCLUSION:
El pescado si es apto para el consumo humano puesto que no tiene presencia de coliformes y Staphyloccocus aureus esta dentro de los niveles aptos para el consumo humano.








BIBLIOGRAFIA:
CHANS R., G. (2002). Estafilococos. Obtenido en http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2017.pdf
L. ORTIZ, M. (2003) Material didáctico de Microbiología de Alimentos: Investigación y Recuento de Staphylococcus aureus. Obtenido en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_m icrolimentos.htm
THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.
Microbiología de los Alimentos, FRAZIER W. C. y D. C. WESTHOFF. Edit. Acribia - Zaragoza. 4ta Edición.
Microbiología Moderna de los Alimentos, JAY James M. Editorial Acribia Zaragoza. 4ta Edición
Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos. Obtenido en http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/patogNOMStaphylococcusaureus_17365.pdf
Determinación y aislamiento de Staphylococcus aureus. Obtenida en http://www.bdigital.unal.edu.co/13943/1/1663-7509-1-PB.pdf