Análises Químicas na Avaliação de Qualidade e Segurança de Alimentos (Tomate, Pera, Maçã) - Relatório de Estágio Curricular

REGIÃO SUL ESPECIALIDADE DE ENGENHARIA AGRONÓMICA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR PARA INSCRIÇÃO COMO MEMBRO EFECTIVO DA ORDEM DOS ENGENHEIROS

Análises Químicas na Avaliação de Qualidade e Segurança de Alimentos (Tomate, Pêra, Maçã)

Autora: Claudia Coelho (Membro Estagiário n.º 2886). Instituição de Acolhimento: Estação Agronómica Nacional - Instituto Nacional de Investigação Agrária e Pescas.

Data de início: 1 de Junho de 2001. Data de finalização: 1 de Setembro de 2004.

RESUMO

A fracção volátil do tomate, das pêras e das maçãs é constituida por várias centenas de compostos, embora apenas uma parte seja responsável pelo aroma dos frutos, contribuindo assim para a sua qualidade. As amostras analisadas incluiram tomate da cultivar para indústria Perfect Peel proveniente de campos de ensaio (Vila Franca de Xira, Azambuja), pêras Rocha armazenadas em câmaras da Cooperativa Agrícola do Cadaval (COOPVAL) e maçãs Bravo de Esmolfe provenientes de um pomar comercial situado na zona de Mangualde. Para caracterizar a sua fracção volátil utilizou-se Cromatografia em Fase Gasosa (CG) acoplada a Espectrometria de Massa (EM) e Microextracção em Fase Sólida (MEFS). A comparação dos perfis cromatográficos obtidos permitiu estabelecer a composição volátil característica das amostras analisadas, bem como salientar diferenças na concentração de certos voláteis. Deste modo, pode-se afirmar que as características sensoriais das amostras serão distintas, pois os compostos que as diferenciam fazem parte dos que mais contribuem para o aroma dos frutos. Os Ensaios Imunológicos são de fácil aplicação e podem ser utilizados como métodos de rastreio em análise de resíduos de pesticidas em produtos agro-alimentares. Analisaram-se amostras de tomate da cultivar Perfect Peel colhidas em campos experimentais localizados nas zonas de Vila Franca de Xira e de Coruche. Os pesticidas pesquisados foram o Clorpirifos, o Clorpirifos-metilo e o Metalaxil. Utilizou-se para o efeito um kit de Ensaios Imunológicos para Clorpirifos (Clorpirifos-metilo determinado por reacção cruzada) e um kit para Metolacloro (Metalaxil determinado por reacção cruzada), sendo os limites de detecção de aproximadamente 0,1 ppb. Os resultados obtidos mostraram que as absorvâncias das amostras (medidas num espectrofotómetro) eram superiores às absorvâncias dos padrões usados nos ensaios. De acordo com o funcionamento dos kits, quanto maior for o valor de absorvância medido menor é a concentração de pesticida presente na amostra, portanto o tomate analisado não apresentava resíduos destes pesticidas ou os níveis presentes nas amostras eram inferiores aos limites de detecção.

Palavras-chave: tomate, pêra, maçã, voláteis, aroma, Cromatografia, Microextracção em Fase Sólida, pesticidas, resíduos, Ensaios Imunológicos, qualidade.

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ÍNDICE Pág. Resumo

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Lista das Figuras

iv

Lista dos Quadros

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Abreviaturas

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1. Introdução

1

2. Revisão Bibliográfica

3

2.1. Tomate

3

2.1.1. Variedades de Tomate

4

2.1.2. Índices de Qualidade Industrial

5

2.1.3. Utilização

6

2.1.4. Valor Nutricional

7

2.1.5. Aroma e Flavor do Tomate

8

2.1.6. Processamento Industrial do Tomate 2.2. Pêra Rocha e Maçã Bravo de Esmolfe 2.2.1. Aroma das Pêras e Maçãs

10 13 14

2.3. Análise de Compostos Voláteis por Microextracção em Fase Sólida, Cromatografia em Fase Gasosa e Espectrometria de Massa 2.4. Análise de Resíduos de Pesticidas por Ensaios Imunológicos 3. Materiais e Métodos

17 20 23

3.1. Análise de Compostos Voláteis por Microextracção em Fase Sólida, Cromatografia em Fase Gasosa e Espectrometria de Massa

23

3.1.1. Tomate

23

3.1.2. Pêra Rocha e Maçã Bravo de Esmolfe

23

3.2. Análise de Resíduos de Pesticidas em Amostras de Tomate por Ensaios Imunológicos 4. Resultados e Discussão

24 28

4.1. Análise de Compostos Voláteis por Microextracção em Fase Sólida, Cromatografia em Fase Gasosa e Espectrometria de Massa

28

4.1.1. Tomate

28

4.1.2. Pêra Rocha

34

4.1.3. Maçã Bravo de Esmolfe

37

4.2. Análise de Resíduos de Pesticidas em Amostras de Tomate por Ensaios

40

Imunológicos 5. Conclusão

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ii

6. Referências Bibliográficas

45

7. Agradecimentos

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ANEXO I – Funções e responsabilidades desempenhadas durante o Estágio Curricular ANEXO II – Membro efectivo da Ordem dos Engenheiros inscrito na Especialidade

49

de Engenharia Agronómica

51

ANEXO III – Comunicações, trabalhos publicados, certificados de participação em cursos e acções de formação profissional

52

iii

Lista das Figuras Pág. Figura 1 – Refractómetro (modelo portátil)

5

Figura 2 – Consistómetro Bostwick

6

Figura 3 – Representação esquemática do processamento industrial do tomate

11

Figura 4 - Concentração de compostos voláteis por MEFS

18

Figura 5 – Cromatógrafo de Fase Gasosa acoplado a Espectrómetro de Massa para análise de compostos voláteis

20

Figura 6 – Esquema da interacção anticorpo-antigénio

21

Figura 7 – Esquema de uma reacção imunoenzimática (ELISA)

22

Figura 8 – Tomate cv. Perfect Peel (Estação Experimental António Teixeira – INIAP)

25

Figura 9 – Estrutura química dos pesticidas analisados

25

Figura 10 – Constituição do kit de Metolacloro

26

Figura 11 – Suporte com base magnética utilizado para a separação dos reagentes durante a reacção imunoenzimática

27

Figura 12 – Cromatograma (ionograma de corrente total) de uma amostra de tomate para indústria (cv. Perfect Peel) do campo experimental de Azambuja, obtido por MEFS-CG-EM

28

Figura 13 – Espectro de massa do composto volátil 6-metil-5-hepteno-2-ona (pico cromatográfico 17) (A) e espectro de massa da 6-metil-5-hepteno-2-ona da biblioteca de espectros NIST62 (B)

29

Figura 14 – Espectro de massa do composto volátil hexanal (pico cromatográfico 8) (A) e espectro de massa do hexanal da biblioteca de espectros NIST62 (B)

29

Figura 15 – Comparação dos perfis cromatográficos (ionogramas de corrente total) obtidos na análise por MEFS-CG-EM dos compostos voláteis de tomate para indústria (cv. Perfect Peel) de dois campos experimentais

32

Figura 16 – Comparação entre os perfis cromatográficos (ionogramas de corrente total) obtidos na análise por MEFS-CG-EM dos compostos voláteis de tomate e produtos derivados

33

Figura 17 – Cromatograma de pêra Rocha (clone 1) armazenada em atmosfera controlada

34

Figura 18 – Áreas médias dos picos cromatográficos de alguns dos compostos voláteis característicos do aroma da pêra

35

Figura 19 – Cromatogramas de pêras Rocha (clone 1) armazenadas em atmosfera controlada

36

iv

Figura 20 – Cromatograma de maçã Bravo de Esmolfe (ionograma de corrente total) obtido na análise dos compostos voláteis por MEFS-CG-EM

38

Figura 21 - Comparação dos perfis cromatográficos de duas amostras de maçã Bravo de Esmolfe correspondentes a colheitas sucessivas

39

Figura 22 – Absorvâncias médias dos padrões de Clorpirifos

40

Figura 23 – Absorvâncias médias de uma das amostras de tomate cv. Perfect Peel colhida no campo experimental de Coruche (Am1) fortificada com os vários padrões de Clorpirifos e o controlo

41

Figura 24 – Aspecto final do ensaio imunológico com o kit de Metolacloro (antes da medição das absorvâncias no espectrofotómetro)

42

Figura 25 – Absorvâncias médias dos padrões de Metolacloro (kit de Metolacloro) e das amostras de tomate cv. Perfect Peel

43

Figura 26 - Absorvâncias médias dos padrões de Clorpirifos (kit de Clorpirifos) e das amostras de tomate cv. Perfect Peel

43

v

Lista dos Quadros

Pág. Quadro 1 – Características tecnológicas de variedades de tomate para concentrado

5

Quadro 2 – Composição do tomate maduro

7

Quadro 3 – Alguns compostos voláteis existentes no tomate fresco

8

Quadro 4 – Alguns compostos voláteis existentes nas pêras e maçãs

15

Quadro 5 – Tipos de fibras, natureza do revestimento e aplicações

19

Quadro 6 - Índice de semelhança (IS) e tempo de retenção (tr) de alguns dos compostos voláteis identificados numa amostra de tomate para indústria (cv. Perfect Peel)

30

Quadro 7 – Aromas característicos de alguns compostos voláteis existentes nas amostras de tomate analisadas

31

Quadro 8 – Alguns compostos voláteis detectados nos cromatogramas de pêra Rocha e aromas característicos

35

Quadro 9 – Compostos voláteis detectados nos cromatogramas de maçã Bravo de Esmolfe e seus aromas característicos

38

vi

ABREVIATURAS AN

Atmosfera Normal

AC

Atmosfera Controlada

CG

Cromatografia em Fase Gasosa

COOPVAL

Cooperativa Agrícola do Cadaval

ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assays

EM

Espectrometria de Massa

INIAP

Instituto Nacional de Investigação Agrária e Pescas

LMR

Limite Máximo de Resíduos

MEFS

Microextracção em Fase Sólida

PARIPIPI

Programa de Apoio à Reforma das Instituições Públicas ou de Interesse Público de Investigação

vii

1. Introdução O consumidor de frutas e hortícolas, estabelece como critérios mais importantes de selecção o estado de maturação, a frescura, o sabor e o aspecto. Tem-se verificado que apesar de as características externas dos frutos determinarem a escolha do consumidor, estas não são uma garantia da qualidade sensorial interna que é determinada pelo sabor, aroma e consistência. A Cromatografia em Fase Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa é uma técnica instrumental frequentemente utilizada para estabelecer perfis cromatográficos dos compostos voláteis aromáticos que constituem os alimentos, o que fornece indicações quanto ao aroma e sabor característicos dos mesmos. Hoje em dia, é quase obrigatório recorrer a algum tipo de produto fitofarmacêutico para o controlo de pragas ou doenças das culturas agrícolas, de modo a obter uma produção rentável. Os consumidores têm revelado algumas preocupações com a possibilidade de existirem resíduos de pesticidas nos alimentos em quantidades que possam afectar a sua saúde, por isso, tem-se verificado um interesse cada vez maior em produtos agrícolas provenientes de agricultura biológica e/ou protecção integrada. Para verificar e confirmar a segurança alimentar dos produtos hortofrutícolas podese recorrer a métodos cromatográficos (Cromatografia em Fase Gasosa, Cromatografia em Fase Líquida) ou a métodos imunológicos que aplicam princípios de ELISA. Deste modo, pode-se assegurar a comercialização de produtos alimentares com níveis de resíduos inferiores aos Limites Máximos de Resíduos (LMRs) estabelecidos por Lei para cada produto. O trabalho apresentado neste Relatório de Estágio Curricular foi desenvolvido no âmbito de uma Bolsa de Investigação atribuida pela Estação Agronómica Nacional INIAP, ao abrigo do Projecto B – PARIPIPI - INIAP: Valorização da Qualidade e Promoção da Segurança Alimentar e da Preservação do Ambiente na Produção Hortofrutícola. Apresenta-se em primeiro lugar uma breve revisão bibliográfica respeitante ao tomate, à pêra Rocha e à Maçã Bravo de Esmolfe. De seguida, mencionam-se algumas técnicas cromatográficas e de preparação de amostras utilizadas na análise de compostos voláteis responsáveis pelo aroma, e faz-se referência a métodos utilizados na análise de resíduos de pesticidas.

1

No que diz respeito à parte experimental, procedeu-se à caracterização da composição volátil do tomate, da pêra Rocha e da maçã Bravo de Esmolfe através de Cromatografia em Fase Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa, e à análise de resíduos de pesticidas em amostras de tomate para indústria por Ensaios Imunológicos de ELISA. No Anexo I encontra-se uma descrição pormenorizada das funções e responsabilidades desempenhadas durante o Estágio Curricular. Os Anexos II, III e IV incluem, respectivamente, o Curriculum Vitae, a declaração da entidade onde o Estágio Curricular foi realizado e a indicação de um membro efectivo da Ordem dos Engenheiros inscrito na mesma Especialidade de Engenharia. No Anexo V podem ser consultadas comunicações apresentadas em seminários e congressos, trabalhos publicados, bem como certificados de participação em cursos e acções de formação profissional.

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2. Revisão Bibliográfica 2.1. Tomate O tomateiro (Lycopersicum esculentum P. Miller) é originário da região do Equador/ Perú e terá chegado ao México sob a forma de planta silvestre, onde os índios Aztecas o cultivaram, melhoraram e transformaram em planta de valor alimentar (Gould, 1974; Gardé e Gardé, 1988; Esquinas-Alcazar e Viñals, 1995; Costa, 2000). O termo “tomate” parece ter tido origem na América do Sul e deriva da palavra azteca “xitomate” ou “zitotomate”. As tribos selvagens do México usavam a palavra “tomatl” quando se referiam a esta planta (Gould, 1974; Esquinas-Alcazar e Viñals, 1995). No século XVI, o tomateiro foi trazido para a Europa, sendo, provavelmente, os italianos os primeiros europeus a cultivá-lo e a utilizá-lo na alimentação (Gould, 1974). A primeira variedade introduzida na Itália era de frutos amarelos, o que justifica o nome que lhe foi dado - “Pomi d’Oro” ou “Pomodoro” (Maçã de Ouro). Posteriormente, tornou-se popular também na França com o nome de “Pomme d’Amour” (Maçã do Amor). Em poucos anos, a cultura do tomateiro começou a ser efectuada em diferentes países da Europa, no entanto, foi considerado mais como uma planta medicinal ou ornamental do que como uma planta alimentar. Só dois séculos mais tarde é que a utilização do tomate na alimentação se começou a generalizar (Gould, 1974; EsquinasAlcazar e Viñals, 1995). Actualmente, o tomateiro é uma das espécies mais cultivadas em todo o mundo, sendo das culturas hortícolas a que apresenta mais modalidades de uso: consumo directo, massas, caldas, sumos, molhos (Gardé e Gardé, 1988). Durante o crescimento do fruto, o conteúdo em matéria seca diminui devido à incorporação rápida de água. A acumulação de amido durante o período de crescimento tem influência no conteúdo final de sólidos solúveis totais. Os açúcares, principalmente, glucose e frutose, representam cerca de metade da matéria seca, ou 65% dos sólidos solúveis totais do fruto maduro. O conteúdo em açúcares varia entre 1,7% e 4% do peso fresco do fruto e os sólidos solúveis totais entre 4% e 9%. O conteúdo em açúcares é superior nas paredes do que nos lóculos do fruto (Lapuerta, 1995). Os ácidos orgânicos vão-se acumulando no fruto durante o seu desenvolvimento, preferencialmente nos lóculos. O ácido málico e o ácido cítrico representam 13% da matéria seca e são os ácidos orgânicos mais importantes do tomate. O pH do sumo do fruto maduro oscila entre 4 e 4,8 (Lapuerta, 1995). 3

2.1.1. Variedades de tomate As variedades de tomate apresentam características exteriores (forma, tamanho, cor) e interiores (sabor, textura, firmeza) muito distintas. Há variedades destinadas para consumo em fresco ou para processamento industrial (Niclos, 1995), sendo o número de variedades conhecido bastante elevado e com tendência a aumentar devido ao trabalho dos melhoradores que procuram variedades mais produtivas, de melhor qualidade e resistentes a doenças (Gould, 1974; Gardé e Gardé, 1988).

Variedades para Consumo em Fresco As cultivares altamente produtivas e que produzem frutos de tamanho uniforme são as mais utilizadas. Uma das características mais importantes é a precocidade, pois os primeiros frutos a surgir no mercado são mais valorizados (Niclos, 1995). No entanto, Gardé e Gardé (1988) mencionam que nem sempre é possível conciliar precocidade com produtividade e qualidade elevadas. Em geral, as cultivares precoces são menos produtivas e possuem menor qualidade do que as que amadurecem mais tarde, quando a temperatura e intensidade luminosa atingem níveis óptimos para induzir a formação de frutos com sabor, aroma e aspecto mais adequados às preferências dos consumidores. Alguns exemplos de variedades de tomate utilizadas para consumo em fresco são: Daniela, Trust, Luxor, Tradiro, Empire e Boss.

Variedades para Processamento Industrial As variedades de tomate para indústria, como Sonato, Prize Red, Top Cross, Perfect Peel, Spark e Forum, entre outras, podem ser usadas para a produção de concentrado ou pelado (tomate enlatado inteiro sem pele) (Niclos, 1995). Certas variedades possuem dupla aptidão, podendo ser usadas tanto para concentrado como para pelado, ou até para consumo em fresco. Os frutos das variedades para concentrado podem ser quadrados, ovais ou redondos (Niclos, 1995), com peso que pode variar entre 60 e 130 g. Quanto às variedades para pelado, os frutos podem ter forma de pêra ou de cilindro (formas que facilitam a remoção da pele), e peso entre 30 e 60 g (Niclos, 1995). O tomate utilizado para concentrado é colhido mecanicamente, enquanto o tomate para pelado é colhido à mão. Tal acontece, devido às exigências superiores de qualidade e apresentação dos frutos (produto final) quando o tomate é enlatado inteiro.

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No tomate para uso industrial, as características de qualidade externa (forma, cor e tamanho) continuam a ser importantes, tal como acontecia no tomate para consumo em fresco, no entanto, outras características relativas à qualidade interna, como a acidez, conteúdo em açúcares (sólidos solúveis) e matéria seca são mais relevantes (Niclos, 1995) (Quadro 1).

Quadro 1 - Características tecnológicas de variedades de tomate para concentrado (adaptado de Rincon, 1995). Variedade Castone Mystro Cannery Row Nemador Brigade Centurion Nema 1400

Sólidos Solúveis (ºBrix) 6,70 6,40 6,70 6,30 6,80 6,80 6,60

pH 4,53 4,29 4,46 4,40 4,30 4,28 4,35

Acidez Total 0,30 0,36 0,35 0,36 0,43 0,41 0,34

Consistência (Bostwick) 4,20 4,06 4,01 4,35 4,51 4,19 5,84

2.1.2. Índices de Qualidade Industrial O índice que mais afecta o rendimento da fábrica é o conteúdo em sólidos solúveis totais ou ºBrix medido através de refractómetros (Figura 1). O ºBrix define-se como percentagem de sacarose em solução a 20 ºC. Tem-se verificado que, a maioria das variedades apresentam um ºBrix entre 4,5 e 5,5. O conteúdo em sólidos solúveis depende da cultivar utilizada, das condições climáticas durante o período de maturação, e da rega (volume total de água, momento de corte da rega). Estes factores podem causar variações do ºBrix de 4 a 7 para a mesma cultivar (Niclos, 1995).

Figura 1 – Refractómetro (modelo portátil)

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De um modo geral, o pH do sumo varia entre 4,2 e 4,4. Se for superior, a esterilização do produto na fábrica pode ser afectada (Gould, 1974). A consistência (ou textura) é um factor essencial a ter em consideração, principalmente na produção de ketchup, e depende da inactivação, mais ou menos rápida, das enzimas pectinolíticas. Quando é medida num concentrado com 12 ºBrix, através da utilização de consistómetros Bostwick (Figura 2), verifica-se que a maioria das variedades possuem viscosidades entre 4 e 8 cm. A acidez total e os açúcares redutores são parâmetros a ter em consideração, pois influenciam o sabor do fruto. A acidez pode variar entre 0,35 e 0,40 g/ 100 cm3 de sumo e os açúcares redutores entre 2,5 e 3,0 g/ 100 cm3.

Figura 2 – Consistómetro Bostwick

2.1.3. Utilização O tomate para indústria apresenta uma grande diversidade de utilizações, entre as quais se podem destacar: tomate pelado (enlatado inteiro sem pele), sumos, molhos, purés, sopas, pastas, concentrado, ketchup, tomate em pó e tomate em cubos (Gould, 1974; Niclos, 1995). O sumo de tomate é constituido por líquido e polpa que se obtem por pressão do fruto maduro, ao qual se retiraram previamente as peles e as sementes. Pode incluir sal, açúcar, condimentos, ácido cítrico e especiarias. O sumo também pode aparecer no mercado sob forma concentrada (Gould, 1974; Niclos, 1995). O puré, a pasta e o concentrado de tomate são obtidos a partir do fruto maduro, triturado e concentrado (Gould, 1974). A diferença entre cada um destes produtos é estabelecida pelo conteúdo em sólidos solúveis que se deve situar nos limites seguintes:  sumo de tomate - mínimo de 4,5 ºBrix. 6

 puré de tomate - entre 5 e 12 ºBrix.  pasta de tomate - entre 12 e 18 ºBrix.  concentrado de tomate e sumo de tomate concentrado – superior a 18 ºBrix. O ketchup pode ser feito directamente a partir do sumo de tomate, após a eliminação das sementes, peles e ‘coração’, ou a partir do concentrado de polpa, adicionando-lhe açúcar, vinagre, sal, cebolas ou alhos, e especiarias (Gould, 1974; Niclos, 1995). De acordo com Niclos (1995), o tomate em pó (desidratado) pode ser consumido como sumo ou pode ser usado como ingrediente para sopas. Deve possuir boa capacidade de conservação e dispersar-se rapidamente em água, originando um produto semelhante ao original no que se refere a sabor, cor, propriedades físicas e químicas.

2.1.4. Valor Nutricional O tomate fresco é muito rico em vitamina C. Além desta vitamina, também fazem parte da constituição do fruto outras vitaminas e sais minerais, como a vitamina A, a tiamina, a riboflavina, a niacina, o ferro, o cálcio e o fósforo (Gould, 1974; Frenkel e Jen, 1989; Lapuerta, 1995) (Quadro 2). Verifica-se que, de um modo geral, a composição química e o valor nutricional do tomate fresco e dos produtos processados é bastante semelhante. De acordo com Cameron e Esty (1950), os sumos de tomate processados industrialmente retêm 89% da tiamina, 96% da riboflavina e 98% da niacina presentes no produto inicial. As maiores perdas ocorridas na produção de sumo de tomate são de ácido ascórbico, visto que cerca de 20% da vitamina C se degrada durante o processamento (Frenkel e Jen, 1989). Quadro 2 - Composição do tomate maduro (adaptado de Lapuerta, 1995) Componente Matéria Seca (g) Vitamina A (UIs) Vitamina B1 (g) Vitamina B2 (g) Ácido Nicotínico (mg) Ácido Fólico (g) Vitamina C (mg) Potássio (mg) Fósforo (mg) Cálcio (mg) Magnésio (mg)

Gama de valores (por 100g de tomate maduro) 4,71 - 8,30 833 - 1667 16 - 80 20 - 78 3,0 - 8,5 7,4 - 8,6 8,4 - 59 92 - 376 7,7 - 53 4,0 - 21 5,2 - 20,4

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Componente Sódio (mg) Ferro (mg) Alumínio (mg) Boro (mg) Cobre (mg) Chumbo (mg) Manganês (mg) Zinco (mg) Cloro (mg) Cinzas (g)

Gama de valores (por 100g de tomate maduro) 1,2 - 32,7 0,35 - 0,95 0,5 - 2,95 0,04 - 0,13 0,05 - 0,2 0,02 - 0,05 0,04 - 0,3 0 - 0,25 24 - 69 0,51 - 0,70

2.1.5. Aroma e Flavor do Tomate A fracção volátil do tomate é constituída por várias centenas de compostos: hidrocarbonetos, éteres, fenóis, aldeídos, alcóois, cetonas, ésteres, lactonas, compostos sulfurados, aminas e uma vasta gama de moléculas heterocíclicas (Lapuerta, 1995). No entanto, apenas alguns são responsáveis pelo aroma do tomate e dos produtos processados, contribuindo assim para a sua qualidade e apreciação pelo consumidor. O tomate fresco e os produtos derivados do seu processamento industrial não apresentam perfis de compostos voláteis idênticos. No tomate fresco, avaliações de paineis sensoriais associaram flavores desejáveis com a presença de n-hexanal, trans-2hexanal, cis-3-hexenal, 2-isobutiltiazol, -ionona e 6-metil-5-hepteno-2-ona (Moretti e Sargent, 1987; Frenkel e Jen, 1989) (Quadro 3). De acordo com Buttery et al. (1988), os voláteis que mais contribuem para o aroma em tomate fresco são: cis-3-hexenal, -ionona, hexanal, -damascerona, 1-penten-3-ona, 3-metilbutanal, trans-2-hexenal, 2-isobutiltiazol, 1-nitrofeniletano e trans-2-heptenal. Quadro 3 – Alguns compostos voláteis existentes no tomate fresco (adaptado de Buttery et al., 1988) Composto Volátil cis-3-hexenal -ionona hexanal -damascenona 1-penteno-3-ona 3-metilbutanal trans-2-hexenal 2-isobutiltiazol

Concentração (ppb) 12.000 4 3.100 1 520 270 270 36

Aroma característico tomate, cítrico balsâmico, frutado, floral penetrante, forte, relva ameixa, maçã, tomate ------doce, amendoado, frutado, folhas, maçã, ameixa folhas de tomate, ranço, amargo

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Composto Volátil trans-2-heptenal 6-metil-5-hepteno-2-ona cis-3-hexenol salicilato de metilo geranilacetona -ciclocitral geranial linalol 1-penteno-3-ol trans-2-pentenal hexanol

Concentração (ppb) 60 130 150 48 57 3 12 2 110 140 7

Aroma característico pungente, verde herbáceo, oleoso, frutado, floral fresco, relva verde menta, fragrante, especiarias, doce suave, rosa, magnolia menta, frutado, verde ---refrescante, floral, cítrico, limão, laranja, doce manteiga, doce pungente, maçã, laranja, tomate alcoólico, medicinal

Quando se ingere um alimento, a interacção estabelecida entre o sabor, aroma e textura do mesmo, origina uma sensação a que se denomina flavor. O flavor resulta de compostos responsáveis pelo sabor, que, de um modo geral, não são voláteis à temperatura ambiente e de compostos responsáveis pelo aroma (voláteis). No entanto, existem compostos com a capacidade de causar ambas as sensações referidas (Belitz e Grosch, 1999). Durante o processamento industrial, a fracção carbonilo sofre mudanças acentuadas. A fracção monoaldeído (principalmente o trans-2-hexenal) predomina em tomates frescos, enquanto os carbonilos cíclicos (principalmente o furfural) e os dicarbonilos representam a maioria do conteúdo total de carbonilos existente em polpa de tomate (Frenkel e Jen, 1989). O isobutiltiazol, muito importante para o flavor, não sofre grandes alterações com o calor utilizado nos processos industriais de transformação do tomate. Outros voláteis, como o hexanal e o hexanol (Frenkel e Jen, 1989) sofrem alterações pelo calor. De acordo com Belitz e Grosch (1999), durante o aquecimento da polpa de tomate dá-se a formação de sulfureto de dimetilo, o aumento da concentração de –damascerona e –ionona, e a diminuição de cis-3-hexenal e hexanal. Na tecnologia dos derivados de tomate o “aroma a cozido ou queimado” é de grande importância na avaliação da qualidade dos produtos. Os compostos responsáveis pelo aroma e sabor a cozido são o sulfureto de dimetilo e o sulfureto de hidrogénio (Nunes, 1991). Verificou-se que a sensação de aroma originada pelos produtos industriais de tomate sujeitos a tratamentos térmicos, resulta da presença de sulfureto de dimetilo e da sua interacção com outros componentes voláteis (acetaldeído, isovaleraldeído, hexanal) que também sofrem alterações durante o processamento.

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Além dos compostos voláteis, os compostos não voláteis, como açúcares (glucose e frutose), ácidos orgânicos (cítrico e málico), aminoácidos livres (ácido glutâmico, g-aminobutírico, glutamina e ácido aspártico) influenciam directamente o flavor do tomate e dos seus derivados (Moretti e Sargent, 2000). Frenkel e Jen (1989) verificaram que o flavor melhorava consideravelmente, com o aumento do teor em açúcares e ácidos orgânicos. A escolha de variedades de tomate adequadas para o processamento industrial, a determinação de índices de maturação, a formulação dos produtos processados, os períodos de armazenamento, os aditivos químicos e resíduos de pesticidas existentes no fruto exercem uma influência determinante no flavor dos derivados de tomate (Gould, 1974). O processamento industrial não altera significativamente as qualidades sensoriais do produto original (tomate fresco). Assim sendo, as características qualitativas do tomate fresco são o factor determinante da qualidade do produto final processado (Frenkel e Jen, 1989).

2.1.6. Processamento Industrial do Tomate Na produção de concentrado de tomate, as fases de laboração incluem: recepção e classificação, lavagem, escolha, concentração, esterilização e enchimento, embalagem, armazenagem e expedição (Gould, 1974; Canada, 1993) (Figura 3). Os veículos que transportam o tomate desde o campo até à indústria transformadora são pesados, tanto à entrada (peso bruto), como à saída (tara). Por diferença, calcula-se a quantidade de tomate existente em cada carrada (Bentes, 1994). De seguida, retiram-se duas amostras (de cerca de 20 Kg) por carrada, em pontos diferentes, através de uma sonda accionada por uma grua. Determina-se então o ºBrix e realiza-se uma classificação qualitativa das amostras que são separadas em diferentes classes. O pagamento do tomate é feito com base nestes dois parâmetros (Gould, 1974; Bentes, 1994; Ballesteros, 1995). O tomate é descarregado hidraulicamente para tanques de armazenagem, em que a água é tratada com cloro, podendo ser ou não recirculada. Os sistemas de descarga, armazenagem em tanques de espera e transporte para a fábrica devem ser concebidos de forma a evitar perdas de sumo. Dos tanques, o tomate é transportado, por arrastamento em água através de calhas, para tapetes rolantes que se encontram dispostos num plano inclinado. Segue em transportadores de rolos, passando por bicos aspersores de água a pressão elevada. O 10

espaço existente entre os rolos permite eliminar impurezas e tomate verde de pequenas dimensões (Gould, 1974; Bentes, 1994). O produto é então encaminhado para tanques de espera, onde permanece antes de entrar nas linhas de produção que o conduzem às mesas de escolha. Nestas os operários vão eliminando folhas, pedúnculos, tomate verde, podre e bichado, sem interesse para o processamento (Gould, 1974; Canada, 1993; Bentes, 1994).

Matéria-prima (Recepção, Lavagem e Escolha)

“Cold Break”

“Hot Break”

Trituração

Trituração e Choque Térmico (90 ºC)

Tanques de espera Pré-aquecimento a 65ºC

Refinação (em crivos) e Concentração (em evaporadores)

Esterilização Enchimento (latas de 3 e 5 Kg) e Arrefecimento

Enchimento Asséptico (sacos de plástico de 5 e 200 Kg)

Figura 3 – Representação esquemática do processamento industrial do tomate

Após a escolha, se o produto é do tipo ‘Hot Break’, o tomate é encaminhado para um equipamento denominado ‘Super Hot Break’ através de uma bomba de transporte que o tritura ligeiramente. A trituração propriamente dita realiza-se no interior do circuito de aquecimento, quando o produto se encontra a uma temperatura de 90 ºC a 95 ºC. Tais valores de temperatura asseguram uma inactivação enzimática rápida e completa,

o

que

permite

conservar

as

pectinas

existentes

no

tomate

e,

consequentemente, preservar a consistência do produto final (Gould 1974; Nunes, 1991; Bentes, 1994; Martin et al., 1996). Uma vez inactivado do ponto de vista enzimático, o produto é então arrefecido rapidamente numa câmara de vácuo, passando à fase

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seguinte (refinação). O arrefecimento rápido permite diminuir a deterioração da qualidade organoléptica do produto. Quando o produto é do tipo ‘Cold Break’, o tomate é triturado primeiro através de trituradores ou desintegradores, sendo depois conduzido para tanques de espera. Posteriormente, sofre um pré-aquecimento a cerca de 65 ºC a 70 ºC por intermédio de pré-aquecedores tubulares. Estes são constituidos por uma série de tubos horizontais em aço inoxidável, à volta dos quais circula vapor. No ‘Cold Break’ os complexos enzimáticos dispõem de mais tempo de actuação. Por este motivo, os produtos obtidos são menos consistentes. No entanto, a degradação da cor e de factores nutricionais, como a vitamina C, é menor do que a verificada no ‘Hot Break’ (Gould, 1974; Nunes, 1991; Bentes, 1994). A operação seguinte denomina-se crivagem, ou refinação, e consiste na separação de sementes e peles do sumo por acção de uma força centrífuga. As peles e sementes são prensadas para lhes retirar todo o sumo. Depois de secas, constituem um subproduto denominado repiso que é utilizado em rações para animais. Os extractores de sumo (passadores) são constituidos por 2 ou 3 crivos, cuja combinação depende do produto que se quer obter (Bentes, 1994). A operação de concentração de soluções é realizada por meio de evaporadores que podem ser contínuos (de duplo e triplo efeito) ou descontínuos (‘Boules’) (Gould, 1974; Canada, 1993; Bentes, 1994). Depois desta operação, procede-se à esterilização do concentrado em permutadores tubulares, com o objectivo de destruir a flora microbiana existente. O concentrado sofre ainda um arrefecimento, sendo então embalado assepticamente em sacos de plástico de 5 e 200 Kg (enchimento a frio ou ‘cold-filling’) ou colocado em latas de 3 e 5 Kg, e depois arrefecido em água à temperatura ambiente (enchimento a quente ou ‘hot-filling’). O arrefecimento das latas é feito em túneis com aspersores e, em seguida, por circulação de ar. Esta fase decorre durante aproximadamente 2 a 3 horas, procedendo-se depois ao armazenamento do produto. Nesta altura, a temperatura no centro da lata deverá ser menor ou igual a 45 ºC para prevenir a degradação das propriedades organolépticas do produto, como textura, sabor, aroma e cor.

12

2.2. Pêra Rocha e Maçã Bravo de Esmolfe Pêra Rocha A pereira Rocha (Pyrus communis L.) foi obtida casualmente no concelho de Sintra há aproximadamente 150 anos. A árvore-mãe desta cultivar, que produzia frutos de excelente qualidade, terá surgido numa propriedade designada por ‘Fazenda do Rocha’ pertencente a Pedro António Rocha, razão pela qual se tornou conhecida pelo nome de ‘Rocha’. Foi a partir dos garfos dessa árvore que a variedade se espalhou (Castilho, 1937; Silva, 1991 e 1996; Produtos Tradicionais Portugueses, 2001). A cultura desta nova cultivar estendeu-se inicialmente aos concelhos de Mafra e Lourinhã, e posteriormente a toda a Região do Oeste (concelhos de Torres Vedras, Cadaval, Bombarral, Óbidos, Peniche, Caldas da Rainha e Alcobaça) (Silva, 1991 e 1996). Verifica-se que nos pomares de pereiras há um predomínio de pêra Rocha, estando mais de 90% desta área localizada no Ribatejo e Oeste. Os frutos são partenocárpicos, com ligeira carepa típica dispersa pela epiderme. A sua forma é predominantemente oblonga, apresenta cor amarela clara, com pigmentação homogénea, por vezes com carepa típica unida na base e dispersando-se pela superfície. A polpa é branca, macia, granulosa, doce, muito suculenta e de aroma ligeiramente acentuado. A pêra Rocha possui uma boa aptidão para a conservação e elevada resistência ao transporte (Castilho, 1937; Produtos Tradicionais Portugueses, 2001). Em 1992, aproximadamente 60% dos pomares de pereiras apresentavam baixas densidades de cultivo, inferiores a 800 árvores/ha. Tratava-se de pomares de sequeiro com sistema de condução em vaso (Silva, 1996). Sendo a fruticultura uma actividade cada vez mais virada para uma economia de mercado, tornou-se imperioso reconverter os pomares tradicionais em plantações mais intensivas conduzidas com maior rigor técnico e aproveitando melhor o terreno (Silva, 1991). O aumento das densidades de plantação implica a necessidade de um maior número de plantas produzidas e um aumento da eficiência dos sistemas de propagação vegetativa (Silva, 1996). Em relação ao ano de 1998, observam-se pomares mais jovens (5-9 anos) e uma área menor em plena maturidade (10-24 anos) (http://da.online.pt/news, 2004). A propagação convencional de pereira é realizada por enxertia em porta-enxertos francos ou em marmeleiros (Cydonia oblonga L.) propagados por estacaria. Quando a enxertia é efectuada em marmeleiros, as árvores resultantes são de menor dimensão, mais homogéneas e entram em produção mais cedo do que as enxertadas em franco (Baviera et al., 1989). 13

Maçã Bravo de Esmolfe A maçã Bravo de Esmolfe (Malus domestica Borkh.) é conhecida desde o século XVIII, sendo originária da aldeia de Esmolfe (Penalva do Castelo). Esta cultivar terá sido obtida a partir de uma árvore de crescimento espontâneo, cujos frutos eram particularmente apreciados. Com os garfos retirados dessa árvore realizaram-se enxertos (porta-enxertos: EMLA 9, Pajam’s), o que permitiu a distribuição desta variedade a outros locais (Cavalheiro et al., 2001; Produtos Tradicionais Portugueses, 2001). Assim, a cultura da maçã Bravo de Esmolfe abrange a área geográfica dos concelhos de Manteigas, Seia, Gouveia, Celorico da Beira, Fornos de Algodres, Guarda, Pinhel, Covilhã, Belmonte, Fundão, Arganil, Tábua, Oliveira do Hospital, Tondela, Santa Comba Dão, Carregal do Sal, Nelas, Mangualde, Penalva do Castelo, Sátão, Aguiar da Beira, Viseu, São Pedro do Sul, Vila Nova de Paiva, Castro Daire, Trancoso, Sernancelhe, Penedono, Moimenta da Beira, Tarouca, Lamego e Armamar (Produtos Tradicionais Portugueses, 2001). A área da maçã Bravo de Esmolfe tem vindo a aumentar, correspondendo a um incremento de 2,8% para 5% no total nacional, fixando-se, em 2002, em 709 ha (http://da.online.pt/news, 2004). Trata-se de uma maçã que apresenta uma conservação prolongada, sendo bastante aromática. A polpa é branca, macia, sumarenta e doce, características que fazem da maçã Bravo de Esmolfe uma das favoritas dos consumidores. A data de colheita e as condições de conservação influenciam bastante os atributos de qualidade e o “tempo de prateleira” do produto após a saída das câmaras (Cavalheiro et al., 2001). 2.2.1. Aroma das Pêras e Maçãs A fracção volátil das pêras e das maçãs é constituida por várias dezenas de compostos que permitem avaliar a sua qualidade organoléptica (Quadro 4). A produção e emissão de compostos voláteis durante a maturação dos frutos é determinada por vários factores: época de colheita, duração do período de conservação e composição atmosférica das câmaras de conservação (Mattheis et al., 1998). A armazenagem de frutos em condições de Atmosfera Controlada (baixo nível de oxigénio e elevado de dióxido de carbono) é utilizada com o objectivo de aumentar o período de conservação. As baixas temperaturas (próximas de 0 °C), os baixos níveis de oxigénio e elevados de dióxido de carbono reduzem significativamente a actividade respiratória, a produção de compostos voláteis e as perdas de firmeza e de clorofila 14

(Stow, 1984; Brackmann et al., 1993; Mattheis et al., 1998; Plotto et al., 1999). Mattheis et al. (1998) referem que a conservação em AC tem como consequência uma redução notável da emissão de ésteres característicos do amadurecimento das pêras e maçãs. A informação relativa à fracção volátil responsável pelo aroma das pêras é escassa em comparação com outros frutos, no entanto, já foram identificados 79 compostos voláteis que incluem ésteres, alcoóis, hidrocarbonetos, aldeídos e cetonas (Suwanagul e Richardson, 1998). O grupo dos ésteres é o mais importante, representando 60% a 98% dos compostos voláteis produzidos pelas pêras. De acordo com Suwanagul e Richardson (1998), o acetato de hexilo e o 2,4-decadienoato de etilo são compostos que contribuem bastante para o aroma e flavor característicos das pêras. Os alcoóis (2-metil-1-butanol, 1-pentanol, 1-heptanol, 1-octanol) são o segundo grupo mais importante de compostos dos perfis aromáticos das pêras, representando cerca de 1,5 a 14% do total de voláteis (Suwanagul e Richardson, 1998). Quadro 4 – Alguns compostos voláteis existentes nas pêras e maçãs (adaptado de Suwanagul e Richardson, 1998; Plotto et al., 2000) Composto Volátil acetato de etilo propanoato de etilo acetato de propilo 1-propanol * butanoato de etilo 2-metilbutanoato de metilo º propanoato de propilo hexanal 1-butanol 2-metilbutanoato de etilo acetato de butilo acetato de 2-metilbutilo º 2-metil-1-propanol * acetato de isoamilo * propanoato de butilo acetato de 3-metil-2-butenilo º 3-metilbutanol º trans-2-hexenal hexanoato de metilo 2-metilbutanoato de propilo º

Aroma característico ananás, etéreo doce, frutado, etéreo, rum, fragrante odor forte a aipo álcool, doce morango, banana, ananás doce, morango, frutado frutado maçã, verde medicinal doce, morango, maçã, pêra, laranja Gala, verniz para unhas banana, gala penetrante, vinho frutado, banana, doce, fragrante frutado, maçã frutado, doce Óleo, whiskey maçã, verde, folhas, frutado, especiarias ananás, etéreo muito doce, morango

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Composto Volátil 1-hexanol butanoato de butilo hexanoato de etilo 1-pentanol acetato de cis-3-hexenilo º acetato de hexilo butanoato de pentilo butanoato de heptilo 6-metil-5-hepteno-2-ona acetato de heptilo 1-octanol * octanal º hexanoato de butilo butanoato de hexilo 2-metilbutanoato de butilo octanoato de etilo * 2-metilbutanoato de hexilo 1-heptanol * hexanoato de hexilo -farneseno 2,4-decadienoato de etilo *

Aroma característico alcoólico, medicinal maçã, banana, ananás ananás, morango, vinho forte, um pouco doce, balsâmico forte, verde, frutado Gala, maçã madura, pêra frutado, maçã, banana doce, verde, chá frutado, pungente, herbáceo, doce, floral fragrante, lenhoso, cítrico, pêra, damasco penetrante, gorduroso, ceroso, cítrico gorduroso, cítrico maçã verde doce, frutado, ananás frutado, maçã frutado, floral, banana, ananás, brandy, pêra maçã, toranja, doce, frutado, verde, forte fragrante, madeira, oleoso morango, verde, vegetal doce, suave verde, frutado, pêra, maçã

* referido apenas nas pêras º referido apenas nas maçãs

Ao contrário do que acontece com outras pomóideas como as maçãs, as pêras produzem quantidades muito pequenas de aldeídos. Suwanagul e Richardson (1998) mencionam que o hexanal e o trans-2-hexenal foram os únicos aldeídos encontrados nos perfis das pêras. No caso das maçãs, foram identificados aproximadamente 300 compostos voláteis que incluem ésteres, alcoóis, aldeídos, ácidos orgânicos e cetonas, dos quais os mais importantes são o acetato de 2-metilbutilo, o acetato de butilo, o acetato de hexilo e o 1-butanol (Mattheis et al., 1998; Fellman et al., 2000; Plotto et al., 2000). Brackmann et al. (1993) mencionam que o acetato de butilo e o acetato de hexilo representam 60% da produção total de compostos voláteis dos frutos maduros. Apesar de os perfis de compostos voláteis variarem com a cultivar, verificaram-se algumas semelhanças entre várias cultivares de macieira no caso de ésteres como acetato de etilo, acetato de butilo, acetato de 2-metilbutilo, acetato de hexilo, butanoato de hexilo e 2-metilbutanoato de butilo, entre outros (Fellman et al., 2000).

16

Os compostos voláteis que mais contribuem para o aroma frutado característico das maçãs incluem o acetato de hexilo e o acetato de butilo, descritos como tendo aroma a maçã Gala madura, e também o 2-metilbutanoato de butilo e o 2-metilbutanoato de hexilo com aromas frutados e de maçã (Plotto et al., 2000).

2.3. Análise de Compostos Voláteis por Microextracção em Fase Sólida, Cromatografia em Fase Gasosa e Espectrometria de Massa O aroma contribui para a definição da qualidade e é caracterizado pelo conjunto de compostos voláteis aromáticos presentes nos produtos hortofrutícolas. A Cromatografia em Fase Gasosa é uma técnica instrumental que permite realizar a separação dos compostos voláteis e estabelecer perfis cromatográficos, em que cada pico cromatográfico corresponde a uma substância volátil com um aroma característico. Para obter estes perfis cromatográficos tem sido utilizada a detecção por Espectrometria de Massa que permite realizar análises qualitativas, bem como quantitativas, dos compostos voláteis separados. A Microextracção em Fase Sólida (MEFS) é uma técnica de extracção e préconcentração de compostos voláteis e não voláteis presentes em amostras de água, ar, produtos agro-alimentares e fluidos biológicos, em que a aplicação de solventes orgânicos não é necessária ou é muito reduzida (Pawliszyn, 1997). Esta técnica utiliza fibras de sílica fundida revestidas com um material polimérico absorvente. As fibras podem ser colocadas directamente em contacto com as amostras por imersão (MEFSdirecta) ou no espaço de cabeça (MEFS-espaço de cabeça) (Figura 4). Os compostos com afinidade para o revestimento são retidos e separados dos restantes compostos constituintes da matriz. Alguns dos factores que afectam a eficiência de extracção dos compostos voláteis das amostras são: o tipo de revestimento polimérico da fibra, o tempo de exposição, a temperatura de exposição e o volume da amostra (Pawliszyn, 1997).

17

A

Espaço de Cabeça

B Figura 4 – Concentração de compostos voláteis por MEFS: A - Fibra e suporte para Microextracção em Fase Sólida; B – Fibra de MEFS em contacto com o espaço de cabeça do frasco estanque que contem a amostra a analisar

Os materiais adsorventes utilizados para revestir as fibras de MEFS são indicados para grupos de compostos com diferentes características. Os revestimentos comercializados e exemplos de compostos com maior afinidade para cada um deles encontram-se no Quadro 5. O tempo de exposição da fibra deverá permitir que a maior parte dos compostos existentes sejam adsorvidos pelo revestimento polimérico, atingindo-se o equilíbrio entre a amostra e o revestimento de forma que o método não seja sensível a pequenas variações no tempo de exposição.

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Quadro 5 – Tipos de fibras, natureza do revestimento e aplicações (adaptado de Supelco, 2000) Designação

Natureza do revestimento

Compostos

PDMS

Polidimetilsiloxano

PDMS/DVB

Polidimetilsiloxano/Divinilbenzeno

PA PDMS PDMS CW/DVB

Poliacrilato Polidimetilsiloxano Polidimetilsiloxano Carbowax/Divinilbenzeno

CAR/PDMS

Carboxeno/Polidimetilsiloxano

Voláteis de baixo peso molecular Voláteis, aminas e compostos nitroaromáticos Semivoláteis polares Não polares de peso molecular elevado Semivoláteis não polares Álcoois e compostos polares Gases e compostos de baixo peso molecular

DVB/CAR/PDMS

Divinilbenzeno/Carboxeno/ Polidimetilsiloxano

Voláteis e semivoláteis (Aromas)

O processo de adsorção dos compostos pela fibra é prejudicado quando as temperaturas de exposição são elevadas, pois a solubilidade dos compostos hidrofóbicos aumenta. De acordo com Pawliszyn (1997), verifica-se que tempos de exposição longos diminuem a sensibilidade a variações de temperatura. O volume da amostra e a concentração inicial dos compostos influenciam a quantidade que é adsorvida pela fibra: extracções sucessivas implicam uma diminuição da concentração dos compostos na amostra a analisar. Pawliszyn (1997) menciona que numa fase inicial a adsorção dos compostos aumenta rapidamente com o aumento do volume da amostra, permanecendo depois relativamente constante para volumes elevados. Para se proceder à concentração dos compostos voláteis existentes nas amostras colocam-se as mesmas em frascos estanques que permitem manter os compostos voláteis libertados no espaço de cabeça (Figura 4). Quando se coloca a fibra em contacto com o espaço de cabeça do frasco que contem a amostra dá-se a extracção e concentração

dos

compostos

voláteis

que

ficam

retidos

no

revestimento.

Posteriormente, essa fibra é colocada em contacto com o interior do injector do cromatógrafo e os compostos voláteis sofrem uma dessorpção térmica devido às elevadas temperaturas, o que permite a análise instrumental (Figura 5).

19

Injector

Figura 5 – Cromatógrafo de Fase Gasosa acoplado a Espectrómetro de Massa para análise de compostos voláteis

A temperatura do injector deve ser elevada o suficiente para volatilizar os compostos adsorvidos na fibra sem que ocorra a sua degradação térmica. O tempo que a fibra permanece no injector deverá permitir a dessorpção da totalidade dos compostos voláteis das amostras.

2.4. Análise de Resíduos de Pesticidas por Ensaios Imunológicos Os Ensaios Imunológicos têm sido utilizados em análise de resíduos de vários tipos de contaminantes e podem ser quantitativos, semiquantitativos ou qualitativos. Este tipo de ensaios é geralmente usado em análise de contaminantes presentes em água, solo e alimentos (Skerrit, 1995 e Herzog, 1997). A aplicação de métodos imunológicos para a determinação de resíduos pesticidas tem suscitado cada vez mais interesse (Skerrit, 1995). Apesar de a análise de resíduos de pesticidas em produtos agro-alimentares ser normalmente feita por Cromatografia em Fase Gasosa ou Líquida, verificou-se que os Ensaios Imunológicos também podem ser usados como métodos de rastreio, sendo os resultados positivos confirmados por análise instrumental. Os métodos imunológicos baseiam-se na interacção estabelecida entre um analito ou um derivado do analito (antigénio) e um anticorpo do analito-alvo, como tal podem ser utilizados em qualquer tipo de análise de resíduos (Figura 6). O baixo custo da análise 20

por amostra, bem como a sensibilidade e selectividade elevadas são vantagens apresentadas por estes métodos de análise em relação às técnicas instrumentais (Lucas et al., 1995). A resposta de cada anticorpo é específica, no entanto, pode haver na amostra antigénios semelhantes ao analito-alvo que se vão ligar ao mesmo anticorpo originando interferências no método de análise que se denominam reacções cruzadas. Estas reacções cruzadas podem ser interessantes quando se estão a analisar resíduos de pesticidas, pois permitem identificar a presença de grupos de pesticidas com características químicas semelhantes existentes numa dada amostra.

Figura 6 – Esquema da interacção anticorpo – antigénio (adaptado de fate.clu-in.org)

A forma de realizar o teste de análise pode ser variável, desde uma microplaca constituida por 96 micropoços, a tubos de ensaio, papel de filtro, membranas e tubos capilares. A microplaca permite a análise simultânea de um elevado número de amostras e padrões (Emon, 2001). Para visualizar a reacção ocorrida entre o anticorpo e o antigénio (analito-alvo) pode-se recorrer a diversos tipos de marcadores: enzimas, radioactividade,

fluorescência,

fosforescência,

quimioluminescência

e

bioluminescência. Os Ensaios Imunológicos mais frequentemente usados em aplicações ambientais recorrem a marcadores enzimáticos acoplados a substratos colorimétricos, ou seja, baseiam-se em princípios de ELISA (Figura 7). A quantificação é realizada por medição

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da intensidade da coloração, velocidade da reacção, ou medições electroquímicas (Herzog, 1997).

Figura 7 – Esquema de uma reacção imunoenzimática (ELISA) (adaptado de Herzog, 1997)

De acordo com Emon (2001), o modo de acção dos ensaios imunoenzimáticos pode ser a ligação directa do anticorpo ao analito-alvo, ou a competição indirecta entre o anticorpo e o analito-alvo. Os ensaios realizados por métodos de competição indirecta são geralmente usados para moléculas pequenas, como os pesticidas, sendo a concentração de pesticida presente na amostra inversamente proporcional ao desenvolvimento do sinal (coloração, velocidade da reacção).

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3. Materiais e Métodos 3.1. Análise de Compostos Voláteis por Microextracção em Fase Sólida, Cromatografia em Fase Gasosa e Espectrometria de Massa 3.1.1. Tomate Na análise dos compostos voláteis característicos do tomate utilizaram-se amostras de frutos da cultivar para indústria Perfect Peel, de uma polpa comercial de tomate (em embalagem Tetrapak) e de sumo de tomate (em lata). As amostras de tomate cv. Perfect Peel foram colhidas em campos experimentais localizados nas zonas de Vila Franca de Xira e de Azambuja, enquanto as de polpa e de sumo de tomate foram obtidas no mercado local. Os campos de ensaio mencionados diferiam nas técnicas culturais aplicadas durante o desenvolvimento da cultura (esquema de fertilização, regas, aplicação de produtos fitofarmacêuticos) e no tipo de solo (arenoso em Vila Franca de Xira e franco-argiloso na Azambuja). Cada amostra de tomate (cerca de 30 g) foi introduzida num frasco Schott (estanque) de 100 mL, procedendo-se à concentração dos compostos voláteis existentes no espaço de cabeça por MEFS durante 60 minutos à temperatura ambiente. Utilizou-se para o efeito uma fibra de MEFS da Supelco constituida por Divinilbenzeno, Carboxeno e Polidimetilsiloxano (DVB/ CAR/ PDMS).

3.1.2. Pêra Rocha e Maçã Bravo de Esmolfe Analisaram-se frutos de 3 clones de pereira Rocha: clone 1, 2 e 4 (porta-enxerto BA29). As pêras foram colhidas num pomar comercial na zona de Alcobaça e armazenadas em câmaras da Cooperativa Agrícola do Cadaval (COOPVAL) durante 6 meses, em Atmosfera Normal (AN) ou Atmosfera Controlada (AC). As condições das câmaras de conservação eram as seguintes: temperatura de –0,5 a 0°C; Humidade Relativa de 92% a 95%; e no caso da AC, 3% de oxigénio e 2% de dióxido de carbono. A Estação Nacional de Fruticultura Vieira da Natividade tem um programa de selecção clonal que inclui vários clones e porta-enxertos, a partir do qual foram escolhidos os 3 clones referidos por apresentarem características mais promissoras. As pêras Rocha foram retiradas das câmaras e colocadas à temperatura ambiente. As amostras foram analisadas depois de permanecerem em “condições de prateleira” durante 24 horas e 7 dias. Cada amostra era constituida por um conjunto de fatias de 4 23

pêras cortadas em pequenos pedaços (cerca de 25g). Analisou-se ainda uma amostra de pêra do clone 2 à qual se adicionou Cálcio (Cloreto de Cálcio), com o objectivo de melhor preservar a qualidade e firmeza dos frutos. Quanto às maçãs Bravo de Esmolfe, analisaram-se frutos provenientes de um pomar comercial de Mangualde. Fizeram-se duas colheitas sucessivas separadas por um intervalo de uma semana, de modo a avaliar a evolução dos compostos voláteis durante a fase final de amadurecimento dos frutos. As amostras de maçã para análise (cerca de 25g) foram obtidas através de um conjunto de fatias de 7 maçãs Bravo de Esmolfe cortadas em porções pequenas. Como foi referido para as amostras de tomate, as amostras de pêra e maçã também foram introduzidas em frascos estanques de 100 mL, procedendo-se então à concentração dos compostos voláteis existentes no espaço de cabeça por MEFS, com o mesmo tipo de fibra (Divinilbenzeno, Carboxeno, Polidimetilsiloxano), durante 30 minutos à temperatura ambiente. As análises cromatográficas (CG-EM) das amostras de tomate, pêra Rocha e maçã Bravo de Esmolfe foram realizadas num cromatógrafo Shimadzu QP-5000, com coluna J&W DB-1701P de 30m de comprimento e 0,25 mm de diâmetro interno. O revestimento desta coluna é constituído por metilpolisiloxano com 14% de cianopropilfenil de baixa/média polaridade. O programa de temperaturas utilizado foi o seguinte: 40ºC durante 5 min, rampa a 5ºC/min até 230ºC, 10 min a 230ºC. Os compostos foram dessorvidos no injector do cromatógrafo a 250ºC, no modo “split”. A interface estava a 250ºC e a detecção foi feita na gama de m/Z de 30 a 300. O fluxo do gás transportador (hélio) foi de 7 mL/min. Os espectros de massa dos compostos separados foram comparados com os da biblioteca NIST62 através do software Class5k. 3.2. Análise de Resíduos de Pesticidas em Amostras de Tomate por Ensaios Imunológicos Com o objectivo de verificar a aplicabilidade dos métodos imunológicos em amostras de tomate, analisaram-se frutos da cultivar Perfect Peel (para indústria) colhidos em campos experimentais localizados nas zonas de Vila Franca de Xira e Coruche (Estação Experimental António Teixeira – INIAP) (Figura 8). Analisaram-se 26 amostras de tomate que foram conservadas a – 20 ºC até à realização da análise, sendo usada acetona para extracção dos pesticidas.

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Os pesticidas analisados, e que tinham sido aplicados na cultura, foram os insecticidas Clorpirifos e Clorpirifos-metilo (organofosforados usados para a lagarta do tomate), e o fungicida Metalaxil (fenilamida para combater o Míldio) (Guia dos Produtos Fitofarmacêuticos, 2001) (Figura 9).

Figura 8 – Tomate cv. Perfect Peel (Estação Experimental António Teixeira – INIAP)

A

B

C

Figura 9 – Estrutura química dos pesticidas analisados (A - Clorpirifos; B – Clorpirifos-metilo; C – Metalaxil)

Para a análise dos pesticidas mencionados anteriormente utilizaram-se kits de Ensaios Imunológicos da empresa Strategic Diagnostics. Utilizou-se um kit para Clorpirifos (Clorpirifos-metilo determinado por reacção cruzada) e um kit para Metolacloro (Metalaxil determinado por reacção cruzada). As instruções de utilização dos kits mencionavam que o limite de quantificação do kit de Clorpirifos era de 0,22 ppb, enquanto que o limite de detecção era de 0,10 ppb. O kit de Metolacloro tinha 25

limite de quantificação de 0,10 ppb e limite de detecção 0,05 ppb. O funcionamento destes kits de Ensaios Imunológicos baseia-se em princípios de ELISA (ver secção 2.4.). Os kits utilizados eram constituídos por: Conjugado Enzimático (pesticida-alvo associado a uma enzima), Partículas Magnéticas (anticorpos específicos para o pesticida em análise ligados a partículas magnéticas), Solução Colorimétrica (peróxido de hidrogénio e cromogénio), Solução de Paragem (ácido sulfúrico – 2 M), vários padrões com diferentes concentrações do pesticida em análise e um controlo para verificação do funcionamento do kit (Figura 10).

Figura 10 – Constituição do kit de Metolacloro

Durante a realização das análises, as amostras de tomate (extractos) foram colocadas em tubos de poliestireno aos quais se adicionou o Conjugado Enzimático e as Partículas Magnéticas. O pesticida presente no Conjugado Enzimático e o pesticida livre (que pode existir na amostra) competem para os locais de ligação dos anticorpos. Após o período de incubação recomendado nos kits, aplicou-se um campo magnético (Figura 11) para manter as partículas magnéticas nos tubos de ensaio, enquanto se realizou a decantação dos reagentes não ligados. A eventual presença do pesticida foi detectada pela adição de substrato enzimático (peróxido de hidrogénio) e de cromogénio (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina) a todos os tubos. Como estes kits se baseiam em reacções imunoenzimáticas de competição indirecta, quanto menor for a concentração de pesticida (antigénio) presente na amostra, maior será quantidade de Conjugado Enzimático (análogo do pesticida ligado a uma 26

enzima) que se liga aos locais activos dos anticorpos resultando em maior formação de cor. Portanto, neste tipo de testes o desenvolvimento da coloração é inversamente proporcional à concentração de pesticida existente na amostra.

Figura 11 – Suporte com base magnética utilizado para a separação dos reagentes durante a reacção imunoenzimática

As leituras (em absorvâncias) da coloração desenvolvida foram realizadas num espectrofotómetro Beckman DU-70 da Beckman Instruments, a comprimento de onda fixo de 450 nm.

27

4. Resultados e Discussão 4.1. Análise de Compostos Voláteis por Microextracção em Fase Sólida, Cromatografia em Fase Gasosa e Espectrometria de Massa 4.1.1. Tomate Das análises cromatográficas de várias amostras de tomate para indústria provenientes de campos de ensaio situados em Vila Franca de Xira e na Azambuja, obtiveram-se cromatogramas com perfis semelhantes ao apresentado na Figura 12.

Figura 12 – Cromatograma (ionograma de corrente total) de uma amostra de tomate para indústria (cv. Perfect Peel) do campo experimental de Azambuja, obtido por MEFS-CG-EM (o quadro 6 apresenta a identificação de alguns compostos)

Os compostos voláteis das amostras foram identificados através da comparação dos seus espectros de massa com os espectros da biblioteca NIST62 existente no Espectrómetro de Massa (detector acoplado ao Cromatógrafo de Fase Gasosa utilizado para analisar as amostras). As Figuras 13 e 14 mostram a comparação entre os espectros de massa de 2 compostos voláteis presentes nas amostras de tomate, e que contribuem bastante para o seu aroma característico, com os espectros de massa da biblioteca de espectros. No Quadro 6 apresenta-se o índice de semelhança (IS) de alguns compostos voláteis das amostras com o espectro de biblioteca, bem como os seus tempos de retenção (tr). 28

A

B

Figura 13 – Espectro de massa do composto volátil 6-metil-5-hepteno-2-ona (pico cromatográfico 17) (A) e espectro de massa da 6-metil-5-hepteno-2-ona da biblioteca de espectros NIST62 (B)

A

B

Figura 14 – Espectro de massa do composto volátil hexanal (pico cromatográfico 8) (A) e espectro de massa do hexanal da biblioteca de espectros NIST62 (B)

29

Quadro 6 - Índice de semelhança (IS) e tempo de retenção (tr) de alguns dos compostos voláteis identificados numa amostra de tomate para indústria (cv. Perfect Peel) Nº do pico 1 2 3 4 5 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 22 24 25 27 28 30

Composto Volátil

IS (%)

tr (min)

2-metilfurano 1-penteno-3-ona pentanal 1,3,5-cicloheptatrieno 2-metil-1-butanol trans-2-pentenal hexanal trans-2-hexenal heptanal terpinoleno 2-pentilfurano limoneno sabineno 2-heptenal 6-metil-5-hepteno-2-ona 2-isobutiltiazol cis-geraniol trans-2-octenal 6-metilheptanoato de metilo 2-nonenal decanal citral 2,4-dodecadienal geranilacetona

92 90 94 89 88 88 92 95 89 89 92 92 91 92 93 89 89 95 89 85 84 87 88 88

2.775 5.085 5.225 6.430 7.825 8.140 8.915 11.760 12.615 13.615 14.130 14.830 15.105 15.305 15.765 16.665 17.430 18.490 18.965 21.460 21.985 24.690 25.485 28.490

Alguns dos compostos voláteis mais importantes para a caracterização do aroma do tomate são o hexanal (8), o trans-2-hexenal (10), a 6-metil-5-hepteno-2-ona (17), o 2-isobutiltiazol (18) e a geranilacetona (30). Trata-se de compostos voláteis que, de um modo geral, possuem aromas característicos a relva, folhas de tomate, frutado e floral (Quadro 7). Os compostos voláteis dão origem a aromas diferentes consoante a concentração em que se encontram nas amostras e podem contribuir para um aroma diferente daquele que caracteriza o composto isolado. Assim, pode-se afirmar que é o conjunto de todos os compostos voláteis aromáticos constituintes do tomate que originam o seu aroma e sabor característicos.

30

Quadro 7 – Aromas característicos de alguns compostos voláteis existentes nas amostras de tomate analisadas (adaptado de Flavors and Fragances, 1996) Composto Volátil sulfureto de dimetilo (31) 2-butanona (32) trans-2-pentenal (7) hexanal (8) trans-2-hexenal (10) 2-furancarboxaldeído (35) heptanal (11) 2-pentilfurano (13) limoneno (14) 2-heptenal (16) 6-metil-5-hepteno-2-ona (17) 2-isobutiltiazol (18) cis-geraniol (19) trans-2-octenal (21) linalol (37) decanal (25) citral (27) geranilacetona (30)

Aroma característico vegetal, couve etéreo pungente, verde, maçã, laranja, tomate penetrante, forte, relva doce, fragrante, amendoado, frutado, folhas, maçã, ameixa, vegetal doce, madeira, amêndoa, fragrante, pão cozido oleoso, forte, madeira, penetrante, doce, frutado, noz feijão verde, metálico, vegetal quente, herbáceo, hortelã-pimenta verde, pungente herbáceo, verde, oleoso, pungente, frutado, doce, floral folhas de tomate, metálico, pungente, amargo rosa, doce, floral, frutado verde, herbáceo, especiarias refrescante, leve, floral, cítrico, limão, laranja, fragrante, doce penetrante, doce, ceroso, floral, cítrico limão suave, rosa, verde, magnolia

A comparação dos perfis de tomate da cv. Perfect Peel proveniente dos campos experimentais de Vila Franca de Xira e da Azambuja, que diferiam quanto ao tipo de solo e práticas culturais aplicadas (fertilização, rega, produtos fitofarmacêuticos), permitiu observar diferenças apreciáveis nas concentrações de alguns compostos voláteis, as quais estão assinaladas na Figura 15. Os compostos voláteis que diferenciam as amostras de tomate analisadas são: pentanal (3), heptanal (11), terpinoleno (12), limoneno (14), sabineno (15), 2-heptenal (16), 2-isobutiltiazol (18), trans-2-octenal (21) e geranilacetona (30). Estes voláteis estavam presentes em concentrações superiores nas amostras do campo experimental de Vila Franca de Xira. Quanto ao campo experimental da Azambuja, verificou-se que as amostras apresentavam concentrações mais elevadas dos compostos 2-metilfurano (1) e cis-geraniol (19).

31

Figura 15 - Comparação dos perfis cromatográficos (ionogramas de corrente total) obtidos na análise por MEFS-CG-EM dos compostos voláteis de tomate para indústria (cv. Perfect Peel) de dois campos experimentais: A- Vila Franca de Xira, B- Azambuja; os picos cromatográficos numerados correspondem a compostos voláteis aromáticos, alguns dos quais são referidos no texto

É previsível que os frutos colhidos em cada um dos campos de ensaio apresentem características sensoriais diferentes, dado que os compostos voláteis mencionados possuem aroma associado (Quadro 7) e, por isso, podem contribuir para o aroma do tomate. Outros compostos, nomeadamente, 1-penteno-3-ona (2), trans-2-pentenal (7), hexanal (8) e 6-metil-5-hepteno-2-ona (17) apresentavam concentrações semelhantes nas amostras de ambos os campos experimentais em estudo. Na Figura 16 comparam-se os perfis cromatográficos de polpa e sumo de tomate com o perfil cromatográfico do fruto. Como se pode verificar, o perfil cromatográfico correspondente ao tomate (cromatograma A) apresenta maiores concentrações de vários compostos voláteis, entre os quais: pentanal (3), hexanal (8), heptanal (11), 2-pentilfurano (13), 2-isobutiltiazol (18), cis-geraniol (19), trans-2-octenal (21), citral (27) e geranilacetona (30). Nos perfis cromatográficos do sumo de tomate e da polpa de tomate (cromatogramas B e C, respectivamente) identificaram-se outros compostos voláteis que não foram detectados no cromatograma do tomate, como o sulfureto de dimetilo (31), o acetato de etilo (31), a 2-butanona (32), o 3-metilbutanal (33), o 32

2-metilbutanal (33), o 2-furancarboxaldeído (furfural) (35) e o linalol (37). O 2-furancarboxaldeído tem um aroma caracterizado pelos descritores doce, madeira, amêndoa, fragrante e pão cozido (Quadro 6), e surge em maior concentração na polpa de tomate devido ao processamento industrial que recorre a temperaturas elevadas em determinadas fases (ver secção 2.1.6.). É de referir que os picos cromatográficos 31 (acetato de etilo/ sulfureto de dimetilo) e 33 (2-metilbutanal/ 3-metilbutanal) correspondem a compostos não totalmente separados.

Figura 16 - Comparação entre os perfis cromatográficos (ionogramas de corrente total) obtidos na análise por MEFS-CG-EM dos compostos voláteis de tomate e produtos derivados: ATomate cv. Perfect Peel (Vila Franca de Xira), B- Sumo de tomate, C- Polpa de tomate; os picos cromatográficos numerados correspondem a compostos voláteis aromáticos, alguns dos quais são referidos no texto

As condições de processamento industrial, principalmente as temperaturas elevadas, vão causar alterações apreciáveis na fracção volátil dos produtos derivados de tomate. Por esta razão, é importante avaliar qual a contribuição relativa que as substâncias voláteis aromáticas presentes na matéria-prima e os compostos formados durante o processamento têm nas características organolépticas e na qualidade dos produtos processados do tomate.

33

4.1.2. Pêra Rocha Após a análise por CG-EM das amostras de pêra Rocha provenientes das câmaras de conservação obtiveram-se perfis cromatográficos semelhantes ao apresentado na Figura 17 (os picos cromatográficos, assinalados por números, correspondem a compostos voláteis com as características aromáticas referidas no Quadro 8).

Figura 17 - Cromatograma de pêra Rocha (clone 1) armazenada em atmosfera controlada (AC)

A análise das amostras de pêra realizada 24 horas após a saída das câmaras permitiu verificar que os perfis cromatográficos dos compostos voláteis eram diferentes para pêras conservadas em AC e AN, e também para os clones de pêra Rocha. A Figura 18 mostra que os compostos voláteis acetato de hexilo (9), butanoato de hexilo (12) e 2,4-decadienoato de etilo (20) têm picos cromatográficos maiores (maiores áreas) em amostras de AC, o que significa que estão presentes em maior quantidade nessas pêras. O acetato de butilo (4) tem área superior no clone 1 de AC (AC1), no clone 2 de AN com adição de Cálcio (AN2+Ca) e no clone 2 de AC (AC2), em relação às amostras restantes. Outros compostos, como o acetato de etilo (1) e o 1-butanol (3) são mais importantes em amostras de AN, embora tenha sido mencionado que a conservação dos frutos em câmaras de AC exerce um efeito inibidor na produção de compostos voláteis (Plotto et al., 1999; Stow, 1984).

34

Quadro 8 – Alguns compostos voláteis detectados nos cromatogramas de pêra Rocha e aromas característicos (adaptado de Flavors and Fragances, 1996) Composto Volátil acetato de etilo (1) acetato de propilo (2) 1-butanol (3) acetato de butilo (4) trans-2-hexenal (5) acetato de amilo (6) 1-hexanol (7) propanoato de hexilo (8) acetato de hexilo (9) acetato de heptilo (10) 1-octanol (11) butanoato de hexilo (12) octanoato de etilo (13) decanoato de etilo (17) -farneseno (19) 2,4-decadienoato de etilo (20)

Aroma característico ananás odor forte a aipo medicinal maçã (Gala), verniz maçã, verde, gorduroso, frutado, folhas, especiarias frutado, banana alcoólico maçã maçã (Gala) madura, pêra fragrante, lenhoso, oleoso, cítrico, pêra, damasco penetrante, gorduroso, cítrico doce, frutado, ananás frutado, floral, banana, ananás, brandy, pêra doce, noz doce, suave frutado, verde, pêra, maçã

6.00E+08

5.00E+08

Áreas médias

AC1 AC2

4.00E+08

AC4 AN1 3.00E+08

AN2 AN2+Ca AN4

2.00E+08

1.00E+08

0.00E+00

acetato de etilo (1)

1-butanol (3)

acetato de butilo (4)

acetato de hexilo (9)

acetato de heptilo (10)

butanoato de 2,4hexilo (12) decadienoato de etilo (20)

Compostos Voláteis

Figura 18 – Áreas médias dos picos cromatográficos de alguns dos compostos voláteis característicos do aroma da pêra. Legenda das amostras: AC1- clone 1 de AC; AC2- clone 2 de AC; AC4- clone 4 de AC; AN1- clone 1 de AN; AN2- clone 2 de AN; AN2+Ca- clone 2 de AN com adição de Cálcio; AN4- clone 4 de AN

35

De um modo geral, as concentrações dos compostos voláteis eram mais elevadas na amostra à qual se tinha adicionado Cálcio (AN2+Ca), em comparação com amostra sem adição de Cálcio (AN2) e com as outras amostras de AN (AN1 e AN4) (Figura 18). As características dos frutos (aspecto, firmeza, sabor e aroma) retirados das câmaras e conservados à temperatura ambiente modificam-se bastante no período de uma semana. Observaram-se alterações importantes nos perfis cromatográficos dos compostos voláteis responsáveis pelo aroma nas pêras que permaneceram 7 dias à temperatura ambiente (Figura 19). Essas alterações traduziram-se, nomeadamente, por maiores concentrações (picos cromatográficos maiores) dos compostos acetato de heptilo (10), butanoato de hexilo (12), acetato de 3-hexeno-1-ol (14), cis-4-decenoato de etilo (16), decanoato de etilo (17), 2,4-decadienoato de metilo (18), -farneseno (19) e 2,4-decadienoato de etilo (20) nas amostras analisadas após 7 dias em “condições de prateleira”. As amostras referidas apresentavam ainda alguns compostos voláteis que não tinham sido detectados nas pêras analisadas 24 horas após a saída das câmaras, como o octanoato de etilo (13) e o 4-decenoato de metilo (15).

Figura 19 - Cromatogramas de pêras Rocha (clone 1) armazenadas em atmosfera controlada: A- 7 dias em “condições de prateleira”; B- 24h em “condições de prateleira”

36

Verificou-se também que o clone 1 de AC tinha compostos voláteis em maior quantidade do que os clones 2 e 4 de AC. Nas pêras conservadas em AN as diferenças entre clones não eram tão evidentes, excepto no caso da amostra à qual tinha sido adicionado o Cálcio. Pode-se concluir que a adição de Cálcio aos frutos favorece a produção de compostos voláteis aromáticos, o que deverá melhorar a sua qualidade organoléptica. Os compostos voláteis responsáveis pelo aroma, se forem apreciados isoladamente, têm aromas característicos e ocorrem nos frutos em proporções bastante diferentes. O aroma duma pêra ‘Rocha’ resultará da sua actuação simultânea sobre os nossos sensores olfactivos, o que nos dará a sensação de “aroma da pêra”.

4.1.3. Maçã Bravo de Esmolfe Alguns dos compostos voláteis mais importantes para a caracterização do aroma da maçã são: acetato de etilo (3), propanoato de etilo (4), 2-metilbutanoato de metilo (6), butanoato de etilo (9), acetato de butilo (10), butanoato de propilo (14), trans-2-hexenal (14), propanoato de butilo (15), butanoato de butilo (21), hexanoato de etilo (21) acetato de hexilo (22) e acetato de heptilo (29) (Figura 20). Os compostos referidos possuem um aroma individual característico, por exemplo, o propanoato de etilo tem um aroma doce, frutado e fragrante, o hexanoato de etilo cheira a ananás, morango e vinho, enquanto que o acetato de hexilo cheira a maçã madura e pêra (Quadro 9). É o conjunto de todos os compostos voláteis aromáticos constituintes da maçã Bravo de Esmolfe que originam o seu aroma e flavor únicos. Os picos cromatográficos 14 (butanoato de propilo/ trans-2-hexenal) e 21 (butanoato de butilo/ hexanoato de etilo) correspondem a compostos voláteis não totalmente separados. Conforme já foi referido, realizaram-se duas colheitas de maçãs Bravo de Esmolfe com uma semana de intervalo, de modo a avaliar a evolução dos compostos voláteis durante o amadurecimento dos frutos.

37

Figura 20 – Cromatograma de maçã Bravo de Esmolfe (ionograma de corrente total) obtido na análise dos compostos voláteis por MEFS-CG-EM. Os compostos característicos da maçã foram numerados pela ordem em que foram surgindo no cromatograma Quadro 9 – Compostos voláteis detectados nos cromatogramas de maçã Bravo de Esmolfe e seus aromas característicos (adaptado de Flavors and Fragances, 1996) Composto Volátil acetato de etilo (3) propanoato de etilo (4) 2-metilbutanoato de metilo (6) butanoato de etilo (9) acetato de butilo (10) 2-metilbutanoato de etilo (11) butanoato de propilo (14) trans-2-hexenal (14) propanoato de butilo (15) 1-hexanol (17) butanoato de butilo (21) hexanoato de etilo (21) acetato de hexilo (22) acetato de cis-2-hexeno-1-ol (23) 2-metilbutanoato de butilo (24) hexanoato de propilo (26) heptanoato de etilo (27) acetato de heptilo (29) acetato de octilo (32) octanoato de etilo (34) -farneseno (42)

Aroma característico ananás, etéreo doce, frutado, rum, fragrante doce, morango, frutado morango, banana, ananás gala, verniz p/ unhas doce, morango intenso, rançoso, adocicado maçã, folhas, frutado, especiarias frutado, maçã alcoólico, medicinal maçã, banana, ananás ananás, morango, vinho gala, maçã madura, pêra doce, verde, fresco, banana, maçã frutado, maçã vinho, queijo vinho, brandy, frutado fragrante, lenhoso, cítrico, pêra, damasco frutado, floral, jasmim, herbáceo frutado, floral, banana, ananás, brandy, pêra doce, suave

38

A comparação dos cromatogramas de maçãs Bravo de Esmolfe provenientes das 2 colheitas mostra a existência de diferenças apreciáveis na concentração de alguns compostos voláteis (Figura 21). O acetato de etilo (3), o propanoato de etilo (4), o 2-metilbutanoato de etilo (11), o hexanoato de etilo (21), o heptanoato de etilo (27), o hexanoato de butilo (33) e o -farneseno (42) apresentavam picos cromatográficos com maiores áreas na 2.ª colheita (cromatograma B – Figura 21), enquanto os picos de acetato de hexilo (22), 2-metilbutanoato de butilo (24) e 2-metilbutanoato de hexilo (36) eram mais pequenos.

doce (42)

Figura 21 - Comparação dos perfis cromatográficos de duas amostras de maçã Bravo de Esmolfe correspondentes a colheitas sucessivas: A e B (1 semana mais tarde). Encontram-se assinalados compostos com aroma característicos

Deste modo, pode-se afirmar que durante o amadurecimento dos frutos alguns compostos voláteis diminuem de concentração enquanto a maioria aumenta, tendo esta evolução como consequência o estabelecimento do perfil aromático característico da maçã Bravo de Esmolfe. Através da técnica de MEFS-CG-EM e do estudo da relação existente entre os perfis cromatográficos e as características organolépticas mais apreciadas pelos consumidores,

39

pode-se tentar estabelecer a altura de colheita mais adequada para a obtenção do melhor aroma, sabor e flavor dos frutos.

4.2. Análise de Resíduos de Pesticidas em Amostras de Tomate por Ensaios Imunológicos No caso do pesticida Clorpirifos (kit de Clorpirifos) realizaram-se ensaios de validação do método, em que alíquotas de uma das amostras de tomate (do campo de ensaio de Coruche) foram fortificadas com quantidades conhecidas de Clorpirifos (250 L) para avaliar a recuperação. Como se pode verificar na Figura 22, as absorvâncias médias dos padrões de Clorpirifos vão diminuindo com o aumento da concentração dos mesmos, ou seja, de acordo com o funcionamento do kit, a formação de cor é inversamente proporcional à concentração do pesticida, conforme já foi referido nas secções 2.4. e 3.2.

1

Absorvâncias médias

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Pd0

Pd1

Pd2

Controlo

Pd3

Padrões de Clorpirifos

Figura 22 – Absorvâncias médias dos padrões de Clorpirifos. Legenda: Pd0 – Padrão 0 (0 ppb); Pd 1 – Padrão1 (0,22 ppb); Pd2 – Padrão 2 (1,0 ppb); Pd3 – Padrão 3 (3,0 ppb); Controlo (1,8 ppb)

Quando se fortificou a amostra de tomate com a mesma quantidade dos vários padrões e do controlo fornecidos pelo kit de Clorpirifos, e se compararam as absorvâncias obtidas com as absorvâncias da amostra sem fortificação (Figura 23) verificou-se que a absorvância diminui à medida que se vai adicionando à amostra padrões de maior concentração. A amostra sem fortificação tinha absorvância média bastante superior aos valores de absorvância média obtidos para as várias fortificações 40

efectuadas, o que é indicativo de maior formação de cor na amostra sem adição de pesticida.

1.0000 0.9000 Absorvâncias médias

0.8000 0.7000 0.6000 0.5000 0.4000 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000 Am1+Pd0

Am1+Pd1

Am1+Pd2

Am1+Controlo

Am1+Pd3

Am1

Amostras

Figura 23 – Absorvâncias médias de uma das amostras de tomate cv. Perfect Peel colhida no campo experimental de Coruche (Am1) fortificada com os vários padrões de Clorpirifos e o controlo. Legenda: Pd0 – Padrão 0 (0 ppb); Pd 1 – Padrão1 (0,22 ppb); Pd2 – Padrão 2 (1,0 ppb); Pd3 – Padrão 3 (3,0 ppb); Controlo (1,8 ppb)

Na Figura 24 pode-se observar a fase final do ensaio imunológico realizado com o kit de Metolacloro, após a paragem de formação de cor e imediatamente antes da medição das absorvâncias no espectrofotómetro. Nesta figura nota-se que o Padrão 0 (0 ppb de Metolacloro) apresenta uma coloração mais intensa, enquanto o Padrão 3 (5,0 ppb de Metolacloro) é caracterizado por menor formação de cor. Mais uma vez se confirma que quanto menor for a concentração de pesticida, mais intensa será a coloração desenvolvida durante o ensaio e, portanto, maior será o valor de absorvância medido no Espectrofotómetro.

41

Figura 24 – Aspecto final do ensaio imunológico com o kit de Metolacloro (antes da medição das absorvâncias no espectrofotómetro)

Da análise das Figuras 25 e 26 pode-se afirmar que, de um modo geral, as leituras de absorvância obtidas para as amostras de tomate eram superiores às absorvâncias dos padrões. Todas as amostras apresentavam absorvâncias superiores à absorvância do Padrão 1 (0,1 ppb para o padrão de Metolacloro; 0,22 ppb para o padrão de Clorpirifos), ou seja, tinham uma coloração mais intensa do que a coloração do Padrão 1 no final do ensaio. Algumas das amostras apresentavam ainda valores de absorvância mais elevados do que os valores obtidos para o Padrão 0 que era o que não tinha pesticida. Pode-se, então, concluir que as amostras analisadas não apresentavam resíduos dos pesticidas referidos ou que os níveis presentes nas mesmas eram inferiores aos limites de quantificação dos kits (0,22 ppb para o Clorpirifos; 0,84 ppb para o Clorpirifosmetilo e 0,66 ppb para o Metalaxil). Os Limites Máximos de Resíduos (LMRs) permitidos por lei para o Clorpirifos e Clorpirifos-metilo são de 0,5 ppm, enquanto que para o Metalaxil o LMR é de 0,2 ppm. Deste modo, pode-se afirmar que o tomate analisado é adequado para o consumo. Visto que os resultados obtidos foram negativos para todas as amostras analisadas, não necessitam de ser confirmados por análise instrumental (Cromatografia em Fase Gasosa ou Cromatografia em Fase Líquida).

42

1.6

Absorvância média

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2

Am. 52

Am. 51

Am. 50

Am. 49

Am. 48

Am. 47

Am. 46

Am. 45

Am. 40

Am. 39

Am. 38

Am. 37

Am. 36

Am. 35

Am. 34

Am. 33

Am. 19A

Am. 19B

Am. 15A

Am. 15B

Am. 13A

Am. 13B

Am. 7A

Am. 7B

Am. 1A

Am. 1B

Pd 3

Controlo

Pd 2

Pd 1

Pd 0

0

Figura 25 – Absorvâncias médias dos padrões de Metolacloro (kit de Metolacloro) e das amostras de tomate cv. Perfect Peel (os padrões correspondem às barras azuis e as amostras às barras vermelhas). Legenda: Pd0 – Padrão 0 (0 ppb); Pd 1 – Padrão1 (0,1 ppb); Pd2 – Padrão 2 (1,0 ppb); Pd3 – Padrão 3 (5,0 ppb)

1.4

Absorvância média

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2

Am. 24

Am. 23

Am. 22

Am. 21

Am. 20

Am. 19

Am. 18

Am. 17

Am. 12

Am. 11

Am.10

Am. 9

Am. 8

Am. 7

Am. 6

Am. 5

Am. 19A

Am. 19B

Am. 15A

Am. 15B

Am. 13A

Am. 13B

Am. 7A

Am. 7B

Am. 1A

Am. 1B

controlo

pd3

pd2

pd1

pd0

0

Figura 26 - Absorvâncias médias dos padrões de Clorpirifos (kit de Clorpirifos) e das amostras de tomate cv. Perfect Peel (os padrões correspondem às barras azuis e as amostras às barras vermelhas). Legenda: Pd0 – Padrão 0 (0 ppb); Pd 1 – Padrão1 (0,22 ppb); Pd2 – Padrão 2 (1,0 ppb); Pd3 – Padrão 3 (3,0 ppb)

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5. Conclusão A comparação dos perfis cromatográficos obtidos para as amostras de tomate, pêra Rocha e maçã Bravo de Esmolfe permitiu determinar a composição volátil característica das amostras analisadas, além de possibilitar a identificação de diferenças na concentração de alguns compostos voláteis. Os compostos voláteis têm aromas característicos e formam-se em proporções bastante diferentes. O aroma característico de um dado alimento resulta da sua actuação simultânea, o que nos permite ter a sensação de ‘aroma do tomate’, ‘aroma da pêra’ ou ‘aroma da maçã’. Verificou-se que durante o amadurecimento das pêras e das maçãs alguns compostos voláteis diminuiram de concentração, enquanto outros aumentaram. Esta evolução deu origem a perfis aromáticos característicos. Deste modo, a técnica de MEFS-CG-EM, bem como o estudo da relação existente entre os perfis cromatográficos e as características organolépticas mais apreciadas pelos consumidores permitirão determinar a época de colheita mais oportuna para a obtenção do melhor aroma, flavor e sabor dos frutos. É de salientar que a utilização de técnicas de avaliação instrumental, como Cromatografia acoplada a Espectrometria de Massa, em conjunto com a avaliação sensorial (aroma, sabor, flavor) dos produtos agro-alimentares fornece informações adicionais para um controlo de qualidade mais eficaz. A possibilidade de haver resíduos de produtos fitofarmacêuticos nos alimentos é algo que preocupa os consumidores em geral, assim sendo, é de interesse a aplicação de técnicas analíticas que permitam avaliar a qualidade e segurança de vários tipos de alimentos. Os Ensaios Imunológicos são uma boa opção, pois permitem a realização de um elevado número de análises em simultâneo, e possuem sensibilidade e selectividade elevadas. Este tipo de ensaios permite separar as amostras com níveis de resíduos superiores aos LMRs, das que não apresentam pesticidas detectáveis ou apresentam níveis inferiores aos LMRs. Apenas os resultados positivos (se existirem) serão confirmados por análise instrumental, o que torna o processo analítico mais rápido e menos dispendioso.

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6. Referências Bibliográficas Ballesteros, F.R. (1995) Postcosecha del tomate para consumo en fresco. In: Nuez, F. (ed.) El Cultivo del Tomate. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid, pp. 589-623. Baviera, J.A., García, J.L. e Ibarra, M. (1989) Commercial in vitro micropropagation of pear cv. Conference. Acta Horticulturae 256: 63-68. Belitz, H.-D. e Grosch, W. (1999) Food Chemistry (2ª ed.). Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany. Bentes, D.J.V.R.O. (1994) O Enchimento Asséptico no Concentrado de Tomate. Relatório do Trabalho de Fim de Curso de Engenharia Agro-Industrial. Universidade Técnica de Lisboa. Instituto Superior de Agronomia. Brackmann, A., Streif, J e Bangerth, F. (1993) Relationship between a reduced aroma production and lipid metabolism of apples after long-term controlled-atmosphere storage. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 118(2): 243-247. Brimelow, C.J.B. (1987) Measurement of tomato paste colour: investigation of some method variables. In: Jowitt, R., Escher, F., Kent, M., McKenna, B. e Roques, M. (eds.) Physical Properties of Foods - 2. Elsevier Science Publishing Co., Inc., England, pp. 295-317. Buttery, R.G, Teranishi, R., Flath, R.A., Ling, L.C. (1988) Fresh tomato volatiles - composition and sensory studies. In: Teranishi, R., Buttery, R.G. e Shahidi, F. (eds.) Flavor Chemistry Trends and Developments. American Chemical Society, Washington, pp. 212-222. Cameron, E.J. e Esty, J. (1950) Canned Foods in Human Nutrition. National Canners Association, Wachington. (cit. Frenkel e Jen, 1989). Canada, J.S.B. (1993) Concentrado de Tomate Embalado Assepticamente. Trabalho de Síntese. Instituto Politécnico de Beja. Escola Superior Agrária. Castilho, A. (1937) Pereiras Portuguesas (Subsídios para a Pomologia Portuguesa). Gazeta das Aldeias 1737: 9-10. Cavalheiro, J., Santos, A., Silvestre, A., Pirra, A., Recasens, I., Larrigaudière, C. e Maldonado, E. (2001) Efeito da composição gasosa na qualidade das maçãs Bravo de Esmolfe armazenadas em câmaras comerciais de atmosfera normal e controlada. In: Actas do IV Congresso Ibérico de Ciências Hortícolas, Cáceres, pp. 447-453. Costa, J.M.G. (2000) A cultura do tomateiro - características, exigências edafo-climáticas e principais tipos e cultivares. Gazeta das Aldeias 3084: 25-27. Emon, J.M.V. (2001) Immunochemical applications in environmental science. Journal of AOAC International 1(84): 125-133. Esquinas-Alcazar, J. e Viñals, F.N. (1995) Situacion taxonomica, domestication y difusion del tomate. In: Nuez, F. (ed.) El Cultivo del Tomate. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid, pp. 15-42. Fellman, J.K., Miller, T.W., Mattinson, D.S. e Mattheis, J.P. (2000) Factors that influence biosynthesis of volatile flavour compounds in apple fruits. HortScience 35(6): 1026-1033. Flavors and Fragances. (1996) International Edition. New Naturals. Aldrich.

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7. Agradecimentos

O trabalho foi realizado na Estação Agronómica Nacional (Oeiras) no âmbito do Projecto B - PARIPIPI - INIAP: Valorização da Qualidade e Promoção da Segurança Alimentar e da Preservação do Ambiente na Produção Hortofrutícola.

Gostava de agradecer também ao Professor Luís Vilas Boas (Instituto Superior Técnico/ Instituto de Tecnologia Química e Biológica) como meu orientador de projecto.

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ANEXO I - Funções e responsabilidades desempenhadas durante o Estágio Curricular Pesquisa/ revisão bibliográfica referente à aplicação de metodologias de análise química e análise de resíduos de pesticidas em diversas bases de dados: Chemical Abstracts, Food Science and Technology Abstracts, CAB, Current Contents, Base Bibliográfica Cooperativa para as Ciências Agronómicas (CERES) e Internet (de Junho de 2001 a Agosto de 2004).

Operação de vários equipamentos de análise: Cromatógrafo de Fase Gasosa acoplado a Espectrómetro de Massa (de Junho de 2001 a Agosto de 2004); Espectrofotómetro (de Outubro de 2002 a Junho de 2003); Electroforese Capilar (de Novembro de 2002 a Agosto de 2003); Cromatógrafo de Fase Gasosa acoplado a um sistema de Extracção Sorptiva em Barra de Agitação (SBSE ou Twister – na terminologia anglo-saxónica) (de Setembro de 2003 a Fevereiro de 2004).

Utilização da técnica Microextracção em Fase Sólida (MEFS) nos ensaios de avaliação da composição volátil de vários tipos de amostras: tomate, pêra ‘Rocha’, maçã ‘Bravo de Esmolfe’ e maçã ‘Casanova’ (de Julho de 2001 a Agosto de 2004).

Análise e comparação de perfis cromatográficos de amostras de tomate, maçã Bravo de Esmolfe, maçã Casanova e pêra Rocha para determinar a composição em substâncias voláteis responsáveis pelo aroma característico das amostras (de Julho de 2001 a Agosto de 2004). Técnicas de preparação de amostras (homogeneização no ‘Ultraturrax’, extracção com solventes, filtração, centrifugação, evaporação à secura) (de Setembro de 2002 a Julho de 2004).

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Aplicação de Ensaios Imunológicos para a análise de resíduos de pesticidas em amostras de tomate para indústria (de Outubro de 2002 a Junho de 2003).

Deslocações a campos de ensaio (Vila Franca de Xira, Azambuja e Coruche) com o objectivo de recolher amostras de tomate representativas para a realização de ensaios de avaliação de qualidade (composição volátil) e de resíduos de pesticidas (de Agosto a Setembro de 2001; Agosto a Outubro de 2002; Agosto a Setembro de 2003).

Participação em provas de análise sensorial de sumos, nectáres de fruta e refrigerantes como um dos elementos do painel de provadores (de Setembro de 2001 a Janeiro de 2004). Participação nas Jornadas Técnicas do Projecto “Valorização da Qualidade e Promoção da Segurança Alimentar e da Preservação do Ambiente na Produção Hortofrutícola”: Jornadas Técnicas do Tomate para Indústria, Salvaterra de Magos, 19 de Maio de 2004; Jornadas Técnicas das Pomóideas, Alcobaça, 25 de Maio de 2004; onde foi co-autora de comunicações que apresentou oralmente (ver Anexos II e V).

(Nota: as funções referidas foram desenvolvidas ao longo de períodos de duração variável durante todo o Estágio Curricular, repetindo-se e intercruzando-se na maioria das vezes).

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ANEXO II - Membro efectivo da Ordem dos Engenheiros inscrito há mais de 5 anos na Especialidade de Engenharia Agronómica

Indicação de um membro efectivo da Ordem dos Engenheiros inscrito há mais de 5 anos na Especialidade de Engenharia Agronómica que pode fornecer elementos e/ou informações para a apreciação do Curriculum Vitae, bem como da documentação anexa:

Engº José Constantino Sequeira Membro Efectivo da Ordem dos Engenheiros Especialidade: Engenharia Agronómica (Instituto Superior de Agronomia

–

Universidade Técnica de Lisboa)

Cédula Profissional nº 30170 Inscrito na Região Sul da Ordem dos Engenheiros com o nº 21133

Data: 13 de Julho de 1993.

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ANEXO III - Comunicações, trabalhos publicados, certificados de participação em cursos e acções de formação profissional

Certificados Documento 1 - Curso de Produção Integrada em Vinha Documento 2 - Curso de Formação Avançada em Ecologia e Utilização de Plantas Ornamentais Documento 3 - Curso de AutoCAD 2002 Documento 4 - Curso de Formação Profissional Iniciação aos Sistemas de Informação Geográfica Documento 5 - Curso de Ética e Deontologia Profissional (Ordem dos Engenheiros) Documento 6 - Acção de formação em Validação de Instrumentos e Métodos em Cromatografia Documento 7 - Curso de Protecção Integrada em Pomóideas promovido por APAMIM Documento 8 - ‘First Certificate in English’ Documento 9 - Russo I + II (Nível Elementar) do CIAL

Publicação Documento 10 – Volatile compounds of ‘Rocha’ pear clones after storage under regular or controlled atmospheres (Maduración y Post-recolección de Frutos y Hortalizas).

Comunicações Documento 11 - Caracterização da composição volátil da maçã ‘Bravo de Esmolfe’ por MEFSCG-EM (3º Encontro Nacional de Cromatografia). Documento 12 - Análise de resíduos de pesticidas em tomate de indústria por ensaios imunológicos (6º Encontro de Química dos Alimentos). Documento 13 - Comparação de Perfis Cromatográficos de Tomate e Produtos Derivados (2º Encontro Nacional de Cromatografia). Documento 14 - Comparação de Perfis Cromatográficos de Azeites Monovarietais e Respectivas Matérias Primas (2º Encontro Nacional de Cromatografia).

Conferências e Seminários Documento 15 - Jornadas Técnicas do Tomate para Indústria. Documento 16 - Jornadas Técnicas das Pomóideas. Documento 17 - Qualidade e Segurança Alimentar (Instituto Superior de Agronomia). Documento 18 - Os Produtos Animais e a Segurança Alimentar (Instituto Superior de Agronomia).

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