Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p.557-562, 2001
Apoptose no tumor venéreo transmissível canino: características morfológicas e evidenciação bioquímica [Apoptosis in the canine transmissible venereal tumor: morphological features and biochemical evidence]
F.G.A. Santos1,2, A.C. Vasconcelos2*, L. Moro2, J.E.S. Nunes2, T.A. Paixão2,3 1
Doutorando em Ciência Animal da Escola de Veterinária da UFMG Laboratório de Apoptose, Instituto de Ciências Biológicas da UFMG Caixa Postal 2486 31270-010 – Belo Horizonte, MG 3 Bolsista de Iniciação Científica (Programa PIBIC/ CNPq)
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Recebido para publicação em 24 de outubro de 2000 Recebido para publicação, após modificações, em 10 de agosto de 2001 *Autor para correspondência E-mail:
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RESUMO Fragmentos de tumor venéreo transmissível canino (TVTC) de ocorrência natural, com localização genital, foram obtidos de cinco animais, machos, adultos, sem raça definida. “Imprints” da superfície de corte em lâmina de microscopia foram fixadas em metanol, coradas pelo Giemsa e submetidas à avaliação citológica. Os fragmentos foram fixados e processados rotineiramente para inclusão em parafina e coloração com HE e Shorr, para confirmação histológica do tumor e identificação da apoptose. Outros fragmentos foram envolvidos com papel alumínio e acondicionados dentro de frascos de vidro em gelo seco, para serem processados no mesmo dia, visando à extração de DNA e eletroforese em gel de agarose. Análises cito e histológica do TVTC mostraram a distribuição e o padrão celular e tecidual característicos dessa neoplasia, sobressaindo-se a presença de vacúolos claros, bem definidos no citoplasma à análise citológica. Pela coloração com Shorr pôde-se identificar células retraídas, com aumento da acidofilia citoplasmática e condensação da cromatina nuclear, às vezes com fragmentação do núcleo e das células, caracterizando apoptose. A coloração pelo Shorr mostrou ser mais eficiente na distinção de células apoptóticas do que a coloração por HE. A eletroforese de DNA em gel de agarose demonstrou a fragmentação internucleossômica do genoma, que pôde ser reconhecida pelo clássico “padrão em escada”. Palavras-chave: Cão, tumor venéreo transmissível, apoptose, regressão tumoral, morte celular programada
ABSTRACT Fragments of canine transmissible venereal tumors, from natural cases and genital localization, were obtained from five adult male mongrel dogs. Imprints of the tumors were fixed, stained by Giemsa and submitted to cytological analysis to confirm the diagnosis. Representative samples of the tumoral tissue were fixed, embedded in paraffin and processed routinely for microscopic examination. Sections were stained with hematoxylin - eosin and Shorr. Another set of fragments was packed and maintained in dry ice, until DNA could be extracted for agarose gel electrophoresis. Cytological and histological results confirmed the diagnosis of the neoplasia and showed characteristic cellular and tissular patterns, with well-defined clear vacuoles in the cytoplasm. Shorr stained sections showed several shrunken cells, with cytoplasmic acidophilia, chromatin condensation, besides nuclear and cellular fragmentation, typical of
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apoptosis. Shorr was better than hematoxylin - eosin to distinguish apoptotic cells. Agarose gel electrophoresis of DNA showed the internucleosomal fragmentation of the genome, which was recognized as the classic “ladder pattern”. Apoptosis does occur in the natural evolution of canine transmissible venereal tumor. Keywords: Dog, transmissible venereal tumor, apoptosis, tumor regression, programmed cell death
INTRODUÇÃO O tumor venéreo transmissível canino (TVTC) é uma neoplasia contagiosa de células redondas, de ocorrência natural, localizada primariamente na mucosa da genitália externa de cães de ambos os sexos. É transmitido pela transferência de células intactas durante o coito (Cohen, 1978; Calvert, 1983; Calvert, 1984; Kroger et al., 1991; Marchal et al., 1997). Em animais adultos saudáveis essa neoplasia pode regredir espontaneamente. A regressão, com freqüência, está associada ao edema, hemorragia, infiltração de linfócitos e necrose da massa tumoral (Higgins, 1966; Cohen, 1978). Postula-se se a apoptose ou morte celular programada também esteja envolvida como mecanismo alternativo de regressão desse tumor. A apoptose é um mecanismo de eliminação controlada de células, que desempenha um papel oposto ao da mitose (Kerr et al., 1972; Kerr, 1993; Majno & Joris, 1995) na regulação das populações celulares dos animais (Kerr et al., 1972; Kerr, 1993; Staunton & Gaffney, 1998). O objetivo deste trabalho foi caracterizar morfologicamente e evidenciar bioquimicamente a apoptose no TVTC. MATERIAL E MÉTODOS Fragmentos de TVTC, de ocorrência natural e com localização genital, foram obtidos de cinco animais, machos, adultos, sem raça definida (SRD), provenientes do Centro de Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte - MG. “Imprints” do material em lâmina foram fixados em metanol por cinco minutos e corados pelo Giemsa para confirmação citológica da neoplasia. Fragmentos do tumor foram fixados em formol tamponado neutro a 10%, processados rotineiramente e corados em HE e Shorr, para confirmação histológica do tumor e identificação da apoptose. Para a extração do DNA e eletroforese em gel de agarose, outros fragmentos do tumor foram envolvidos em papel alumínio e mantidos em gelo seco até o momento da extração. Posteriormente os fragmentos foram macerados e tratados com tampão lítico TTE (Tris a 10mM, Triton X-100 a 0,25%, EDTA a 1mM). Os lisados (500µl) foram incubados em tubos de microcentrífuga contendo 15µl de proteinase K a 20µg/ml, a 57ºC (durante uma hora). As proteínas foram coaguladas utilizando-se 240µl de clorofórmio, 250µl de fenol e 10µl de álcool isoamílico para cada 500µl do lisado, que passaram pelo vórtex por 10 segundos e pela centrifugação a 12.000 rpm por cinco minutos. O sobrenadante com o DNA (500µl) foi pipetado para outro tubo e acrescentado de 25µl de acetato de sódio a 3M e 1ml de etanol gelado a 96% para precipitação a –20ºC durante a noite. O sedimento de DNA condensado por centrifugação a 12.000 rpm por 20 minutos a 4ºC foi lavado com
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etanol a 70% por duas vezes e seco à temperatura ambiente. O DNA foi ressuspendido em tampão TE (Tris-HCl a 10mM, EDTA a 1mM, em pH 7,4), utilizando-se volumes variáveis conforme o tamanho do “pellet”. Alíquotas de 15µl contendo aproximadamente 1.500ng de DNA de cada tumor foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1,5% em TBE (Tris a 10mM, ácido bórico a 10mM e EDTA a 1mM), a 60v por 1,5 hora. Os géis foram corados com brometo de etídeo e fotografados sob transiluminação com ultravioleta. RESULTADOS E DISCUSSÃO “Imprints” do TVTC corados pelo Giemsa mostraram células predominantemente arredondadas, volumosas, em um arranjo discreto, com padrão quase epitelial, núcleo arredondado ou ovalado. Muitas células apresentavam um nucléolo único, grande, arroxeado e excêntrico. O citoplasma estava levemente corado ou sem cor, finamente granular e continha vacúolos claros bem definidos (Fig. 1A). Esses vacúolos desempenham papel de diagnóstico, conforme indicado por Duncan & Prasse (1979), diferenciando esse tumor de outras neoplasias de células redondas, tais como mastocitoma, histiocitoma e linfossarcoma. A natureza e composição desses vacúolos ainda permanece indefinida. Figuras de apoptose e mitose puderam ser observadas (Fig. 1B e 1C).
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C Fig. 1. A. “Imprint” de TVTC corado pelo Giemsa. Células e núcleos arredondados ou ovalados, contendo nucléolos únicos e excêntricos (cabeça de seta). Citoplasma discretamente corado, finamente granular, contendo vacúolos claros e bem definidos (seta fina). B. Figura de apoptose (estrela). C. Figura de mitose (seta) (1000X).
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Histologicamente o tumor compunha-se de células grandes, redondas ou ovais, de dimensões uniformes. O núcleo era claro e vesicular, contendo nucléolo grande, único e excêntrico. Figuras de mitoses eram freqüentes. O citoplasma era mal definido e corado fracamente (Fig. 2). Infiltrados inflamatórios eram constituídos principalmente por linfócitos, plasmócitos e macrófagos. A caracterização histológica desse tumor foi definida por Novinsky, um veterinário russo, no início do século passado, conforme relatado por Cohen (1978) e Koike et al. (1979). O TVTC é uma neoplasia que pode regredir espontaneamente em torno de três a seis meses (Stewart et al., 1959; Higgins, 1966; Koike et al., 1979; Mizuno et al., 1994), quando atinge de dois a três centímetros (Calvert, 1983; Calvert, 1984). Pela coloração de Shorr obteve-se melhor visualização da morfologia dos núcleos (Fig. 2). Alguns apresentavam-se condensados, hipercromáticos, retraídos e por vezes fragmentados, indicando morte celular por apoptose, ocorrendo isoladamente em células esparsas ou em pequenos grupos de células, com retração citoplasmática e halos claros. Tais achados estão de acordo com Kerr et al. (1972) e Kerr (1993). Para Staunton & Gaffney (1998), a identificação microscópica de apoptose pode ser um processo aparentemente subjetivo e tedioso, mas com persistência podem-se gerar dados importantes para a compreensão da dinâmica dos tumores.
2 Fig. 2. Micrografia de TVTC corado pelo Shorr. Células e núcleos grandes, uniformes, arredondadas ou ovaladas, contendo nucléolos únicos e excêntricos. Estroma escasso. No meio do campo destaca-se uma célula em apoptose (seta), com retração e aumento da acidofilia citoplasmática, condensação da cromatina e fragmentação nuclear (1000X).
A Fig. 3 representa o gel de uma eletroforese do DNA isolado das amostras estudadas do TVTC. Observa-se um padrão de degradação compatível com a fragmentação internucleossômica do genoma. Assim, fragmentos correspondentes de um a três nucleossomos foram identificados como bandas mais intensas e mais distantes da origem das trilhas, principalmente nas amostras 1, 2, 3 e 5. A amostra no 4 foi a única a apresentar menor quantidade de DNA genômico, apesar de também se evidenciar a
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fragmentação internucleossômica. Uma das características bioquímicas da apoptose é a clivagem internucleossômica do genoma, que pode ser reconhecida pelo clássico “padrão em escada”, por meio da eletroforese em gel de agarose. Esses resultados são mencionados por Walker & Gaastra (1983) e Platel (1994).
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3 Fig. 3. Eletroforese em gel de agarose de DNA extraído de cinco amostras diferentes de TVTC. Observar intensa fragmentação internucleossômica do genoma, evidenciado pelo clássico “padrão em escada”.
A apoptose ocorre com freqüência baixa em tecidos saudáveis, pois as células lábeis são eliminadas continuamente para manter o equilíbrio com a proliferação celular. Em tumores pode aparecer aumentada como conseqüência de isquemia discreta, ativação de mecanismo imunocelular ou secreção de citocinas tais como TNFα (fator de necrose tumoral α), granzimas e perforinas (Liles, 1997) pelas células mononucleares do infiltrado. A apoptose ocorre espontaneamente em neoplasias, mesmo não tratadas, e participa de alguns tipos de regressão tumoral induzida terapeuticamente (Kerr, 1993). CONCLUSÕES Apoptose ou morte celular programada é um evento celular presente no tumor venéreo transmissível canino, como verificado morfologicamente e bioquimicamente em todas as amostras deste estudo. Os exames citológicos do TVTC podem contribuir para a identificação morfológica da apoptose, além de serem importantes na confirmação rápida e eficaz do diagnóstico do tumor. A coloração pelo Shorr empregada nos cortes histológicos facilita a identificação morfológica da apoptose, permitindo a rápida visualização da retração celular, da condensação da cromatina e fragmentação nuclear, típicas desse tipo de morte celular.
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