Avaliação de Óleos Essenciais de Plantas Medicinais no Controle de Meloidogyne graminicola em Arroz Irrigado

Ricardo B. Steffen, Zaida I. Antoniolli, Veridiana K. Bosenbecker, Gerusa P.K. Steffen, Manoeli Lupatini, Ângela D. Campos & César B. Gomes ARTIGO

Avaliação de Óleos Essenciais de Plantas Medicinais no Controle de Meloidogyne graminicola em Arroz Irrigado* Ricardo B. Steffen1, Zaida I. Antoniolli2, Veridiana K. Bosenbecker3, Gerusa P.K. Steffen1, Manoeli Lupatini1, Ângela D. Campos4 & César B. Gomes4 Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor. Universidade Federal de Santa Maria (RS) Brasil. PPG em Ciência do Solo, Centro Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), 97105-900 Santa Maria (RS) Brasil. 2 Departamento de Solo, UFSM, Santa Maria (RS) Brasil. 3 Universidade Federal de Pelotas, C. Postal 354, 96010-900 Pelotas (RS) Brasil. 4 Embrapa Clima Temperado, C. Postal 403, 96001-970 Pelotas (RS) Brasil. Autor para correspondência: bemfica- [email protected] *

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Recebido para publicação em 22 / 09 / 2007. Aceito em 20 / 03 / 2008 Editado por Mário Inomoto

Resumo - Steffen, R.B., Z.I. Antoniolli, V.K. Bosenbecker, G.P.K. Steffen, M. Lupatini, A.D. Campos & C.B. Gomes. 2008. Avaliação de óleos essenciais de plantas medicinais no controle de Meloidogyne graminicola em arroz irrigado. Dez óleos essenciais de plantas medicinais (Lavandula angustifolia, Cymbopogon citratus, Eucalyptus globulus, Mentha piperita, Rosmarimus officinalis, Matricaria chamomilla, Ocimum basilicum, Achyrocline satureioides, Origunum vulgare e Foeniculum vulgare) foram avaliados para o controle de Meloidogyne graminicola. Em uma primeira etapa foi avaliado o efeito dos óleos sobre a eclosão e a mortalidade de juvenis de segundo estádio de M. graminicola em biotestes in vitro. Os óleos que apresentaram maiores percentagens de mortalidade (L. angustifolia e C. citratus) foram posteriormente pulverizados em plantas de arroz irrigado ‘BR IRGA-410’ ou aplicados ao solo (500 ppm), em experimento conduzido em casa-de-vegetação. Decorridos 65 dias da inoculação, avaliou-se o efeito de ambos os óleos sobre a reprodução de M. graminicola e a atividade de enzimas de resistência nas plantas. Foi verificado que as plantas pulverizadas com os óleos de L. angustifolia e C. citratus e inoculadas com o nematóide apresentaram menor número de galhas e tiveram redução média de 68 % na reprodução de M. graminicola, independentemente do modo de aplicação do óleo. Observou-se menor atividade enzimática de peroxidase nas plantas inoculadas e pulverizadas com os óleos, o que pode ter afetado de alguma forma os níveis de resistência do arroz ao nematóide. Palavras-chaves: nematóide das galhas, controle alternativo, Oryza sativa. Summary - Steffen, R.B., Z.I. Antoniolli, V.K. Bosenbecker, G.P.K. Steffen, M. Lupatini, A.D. Campos & C.B. Gomes. 2008. Evaluation of essential oils of medicinal plants for the control of Meloidogyne graminicola in flooded rice. Ten essential oils of medicinal plants (Lavandula angustifolia, Cymbopogon citratus, Eucalyptus globulus, Mentha piperita, Rosmarimus officinalis, Matricaria chamomilla, Ocimum basilicum, Achyrocline satureioides, Origunum vulgare and Foeniculum vulgare) were evaluated for the control of Meloidogyne graminicola. The nematicidal and nematostatic activity of these oils on the hatching and the mortality of the second stage juveniles were first evaluated in vitro. Thereafter, the essential oils that showed the higher nematode mortality percentage values in the in vitro experiments (L. angustifolia and C. citratus) were sprayed on the leaves of flooded rice ‘BR IRGA-410’ or the soil (500 ppm) in greenhouse conditions. Sixty five days after the inoculation, the effect of the oils on the M. graminicola reproduction and the activity of enzymes related to plant resistance were evaluated. It was verified

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that the rice plants sprayed with essential oils and further inoculated with the nematode showed smaller gall and egg numbers, resulting in 68 % reduction of M. graminicola reproduction, independently of the oil application method. Lower peroxidase activity in the plants inoculated and sprayed with both oils was observed, suggesting some effect on rice resistance to the nematode. Key words: root-knot nematode, alternative control, Oryza sativa.

Introdução Dentre os fitonematóides causadores de danos em lavouras de arroz irrigado, Meloidogyne graminicola Golden & Birchfield é considerado um dos mais limitantes em países asiáticos (Bridge & Page, 1982; Sharma et al., 2001; Padgham et al., 2004), podendo causar perdas de 20 a 90 % na produção (Netscher & Erlan, 1993; Prot & Matias, 1995). Embora no Brasil ainda não se disponha de dados sobre perdas causadas pelo nematóide em arroz irrigado, sabe-se que está amplamente distribuído no Rio Grande do Sul e que as plantas atacadas, freqüentemente, apresentam crescimento lento, raquitismo, clorose das folhas, floração precoce, muitas galhas nas raízes e morte das plantas logo após a emergência (Sperandio & Monteiro, 1991; Steffen et al., 2007). Medidas de controle como a utilização de cultivares resistentes são as mais efetivas e de menor custo aos produtores, entretanto, não há disponibilidade de genótipos resistentes no mercado brasileiro. Em países asiáticos, um dos métodos mais utilizados no controle de M. graminicola é a aplicação de produtos químicos no solo (Decker, 1981) ou no tratamento de sementes (Krishna-Prasad & Rao, 1982; Padgham et al., 2004). Entretanto, além desses produtos serem pouco efetivos no controle do nematóide, apresentam custos elevados e podem deixar resíduos, prejudicando a saúde humana e o meio ambiente (Oka et al., 2000). Esforços têm sido concentrados na integração de medidas alternativas, visando a uma agricultura mais limpa, por meio de insumos naturais contra fitopatógenos (Costa et al., 2000; Campanhola & Bettiol, 2003; Lopes et al., 2005). Dentre as práticas de controle estudadas, extratos de sementes (Khurma & Singh, 1997; Dias et al., 2000), exsudatos vegetais (Rocha & Campos, 2004) e óleos essenciais (Lorimer et al., 1996; Oka et al., 2000; Lopes et al., 2005; Bosenbecker, 2006) têm sido freqüentemente relatados.

Os óleos essenciais são potencialmente úteis no manejo de doenças de plantas cultivadas (Isman, 2000; Salgado et al., 2003). O efeito desses óleos sobre a eclosão e desenvolvimento do nematóide das galhas tem sido comprovado por vários pesquisadores (Abid et al., 1997; Isman, 2000; Oka et al., 2000; Oka, 2001; Bosenbecker, 2006). Os compostos presentes nos óleos essenciais podem atuar diretamente sobre o patógeno ou serem indutores de resistência, neste caso envolvendo a ativação de mecanismos de defesa latentes das plantas (Hammerschmidt & Dann, 1997; Schwan-Estrada et al., 2003). Segundo Campos (2001), resultados experimentais têm demonstrado evidências de que os mecanismos de resistência induzidos internamente estão envolvidos com uma perturbação geral na planta causada pelo parasita. Tal reação ocorre pela ativação de vários mecanismos de defesa que culminam em mudanças físicas e químicas, principalmente alterações enzimáticas envolvendo a peroxidase e polifenoloxidase, enzimas relacionadas ao metabolismo de fitoalexinas (Heitefuss, 1982; Heitefuss, 1997). Compostos produzidos pela planta, durante o processo da doença têm mostrado um papel crucial na resistência ao organismo invasor (Nandakumar et al., 2001). Até o presente momento, a maioria dos estudos com plantas medicinais envolvendo o controle do nematóide das galhas tem sido realizada quase que exclusivamente in vitro. Além disso, são raros os relatos de trabalhos com a utilização de óleos essenciais no controle de M. graminicola. Assim, teve-se por objetivo neste trabalho: a) avaliar in vitro o efeito de dez óleos essenciais de plantas medicinais sobre a eclosão e mortalidade de juvenis de segundo estádio de M. graminicola; b) investigar o potencial destes óleos no controle deste nematóide em arroz irrigado em condições de casa-de-vegetação; c) avaliar a atividade enzimática de peroxidase e polifenoloxidase das plantas pulverizadas com os óleos essenciais. Nematologia Brasileira 127 Piracicaba (SP) Brasil

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Material e Métodos O trabalho foi dividido em duas etapas. Na primeira, foi estudado o efeito nematostático e nematicida in vitro de diferentes óleos essenciais de plantas medicinais sobre a eclosão e mortalidade de juvenis de segundo estádio (J2) de M. graminicola. Na segunda etapa do estudo, foi avaliado, sob condições de casa-de-vegetação, o potencial dos óleos essenciais no controle de M. graminicola em arroz irrigado e também sobre a atividade de algumas enzimas de resistência dessas plantas. 1) Inóculo de M. graminicola. Foi utilizado como inóculo uma população pura de M. graminicola (fenótipo esterase VS1) (Carneiro & Almeida, 2001) mantida em arroz irrigado ‘BR IRGA-410’ em vaso com solo esterilizado, em casa-de-vegetação. Os ovos de M. graminicola foram obtidos a partir de raízes de arroz infectadas com o nematóide, conforme técnica de Hussey e Barker (1973). Parte da suspensão dos ovos foi incubada em funil de Baermann modificado (Christie & Perry, 1951) em B.O.D. a 26 ºC por 36 h, para obtenção dos J2 do nematóide. 2) Obtenção dos óleos essenciais. Os óleos essenciais foram extraídos pela técnica do arraste por vapor d´água, no aparelho de Clevenger modificado (Serafini & Cassel, 2001), utilizando-se folhas frescas de Lavandula angustifolia Mill. (alfazema), Cymbopogon citratus (DC) Stapf. (capim cidrão), Eucalyptus globulus Labill. (eucalipto glóbulo), Mentha piperita L. (hortelã), Rosmarimus officinalis L. (alecrim), Matricaria chamomilla L. (camomila), Ocimum basilicum L. (manjericão), Achyrocline satureioides (Lam.) DC. (marcela), Origunum vulgare L. (orégano) e Foeniculum vulgare Mill. (funcho). Os óleos essenciais foram solubilizados em dimetil sulfóxido (DMSO) de acordo com o método descrito por Lorimer et al. (1996) na proporção 1:1 (10 μl de óleo essencial + 10 μl de DMSO). Em 10 μl da suspensão óleo-DMSO, foi adicionada água destilada na proporção 1:9 (10 μl de óleo-DMSO + 90 μl de água), obtendo-se a mistura óleo essencial-DMSOágua, que foi utilizada para a condução dos testes de eclosão e mortalidade. 3) Avaliação in vitro da atividade nematostática e nematicida de diferentes óleos essenciais sobre M. graminicola.

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3.1) Efeito de óleos essenciais sobre a eclosão de J2 de M. graminicola. Para condução do teste da eclosão, alíquotas de 20 μl de água destilada contendo 50 ovos de M. graminicola foram colocados em cavidades individuais de uma placa de Elisa, adicionando-se a cada cavidade, 20 μl da mistura óleo essencial-DMSO-água destilada e 60 μl de tampão fosfato salino PBS (1,4 x 10-1 mol / l de NaCl, 7,8 x 10-3 mol / l de Na2HPO4.7H2O, 1,4 x 10-3 mol / l de KH2PO4 e 2,6 x 10-3 mol / l de KCl) a pH 7,0. Como testemunha, foi utilizada água destilada e DMSO 2 % v/v em tampão PBS (50 J2 em 20 μl de água destilada + 78 μl de PBS + 2 μl de DMSO). Em seguida, as placas foram vedadas com filme plástico e incubadas em B.O.D. a 26 oC, no escuro por 12 dias. O ensaio foi conduzido em delineamento experimental inteiramente casualizado com 12 tratamentos (Tabela 1) e quatro repetições. Foi considerado como repetição cada cavidade da placa de Elisa. As avaliações foram realizadas de três em três dias até o 12º. dia após a incubação, contando-se o número de J2 eclodidos sob microscópio estereoscópico, a fim de se determinar a percentagem de eclosão. Através dos dados obtidos, foi calculada a área abaixo da curva do progresso da eclosão (AACPE) de M. graminicola, utilizando-se o programa GW-BASIC 3.20 (Maffia, 1986). A seguir, os valores de percentagem de eclosão (transformados em x + 1 ) e AACPE, obtidos nos diferentes tratamentos, foram submetidos à análise de variância e teste de agrupamento de Scott & Knott (1974) pelo programa Sisvar (Ferreira, 2000). 3.2) Efeito de óleos essenciais na mortalidade de juvenis de segundo estádio de M. graminicola. Neste teste, suspensão de 20 μl de água destilada contendo 50 J2 de M. graminicola foi colocada em um cavidade da placa de Elisa. Em seguida, foi adicionado 20 μl da mistura óleo essencial-DMSO-água destilada e 60 μl do tampão fosfato salino PBS a pH 7,0 conforme descrito no item 3.1. Como testemunhas também foram utilizadas a água destilada e o DMSO 2 % v/v em tampão PBS. Em seguida, as placas foram vedadas com filme plástico e incubadas em BOD a 26 o C no escuro. Este teste foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado e constou de

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Tabela 1 - Mortalidade após 24 e 48 h de incubação, percentagem de eclosão e área abaixo da curva do progresso da eclosão (AACPE) de J2 de M. graminicola expostos à ação de dez óleos essenciais de plantas medicinais aos 12 dias. Espécies vegetal Alfazema Capim cidrão Alecrim Manjericão Hortelã Orégano Camomila Eucalipto Funcho Marcela DMSO*** Água*** CV (%)

Mortalidade (%)** 24 h 48 h 99,16 a* 94,99 a 74,16 b 37,49 d 20,83 e 60,83 c 30,83 d 21,66 e 19,16 e 4,99 f 4,16 f 0,0 g 6,13

100,00 a* 95,82 a 78,33 b 76,66 b 74,99 b 68,33 c 63,33 c 34,16 d 29,99 d 26,66 d 4,99 e 1,66 e 5,05

3º. dia

Eclosão (%)** 6º. dia 9º. dia

12º. dia

2,49 c 12,40 b 0,00 c 12,96 b 10,94 b 5,73 c 13,97 b 8,48 b 10,66 b 2,38 c 26,40 a 29,28 a 29,87

11,35 b 21,07 b 5,50 b 20,02 b 21,40 b 8,65 b 22,56 b 13,89 b 15,55 b 5,43 b 42,90 a 45,41 a 25,04

37,87 b 33,51 b 32,37 b 33,13 b 24,25 b 16,70 b 33,86 b 24,21 b 48,30 b 32,63 b 72,96 a* 74,02 a 19,77

25,75 b 31,99 b 20,24 b 28,69 b 23,60 b 11,79 b 29,84 b 18,44 b 39,05 b 20,11 b 59,81 a 60,06 a 21,85

AACPE 171,84 b 228,04 b 126,52 a 251,26 b 187,78 b 94,96 a 228,04 b 146,02 a 252,24 b 129,13 a 457,17 c 471,36 c 25,86

* Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5 % de probabilidade. ** Valores transformados em arco seno x/100 . *** Testemunhas.

12 tratamentos (dez óleos essenciais e duas testemunhas) e quatro repetições conforme já descrito no ensaio anterior. Decorridas 24 e 48 h da incubação, o número de J2 mortos foi avaliado para determinação da percentagem de mortalidade. No momento da avaliação, foi adicionado 10 μl de NaOH 1N a 1 % em cada cavidade, conforme adaptação da metodologia proposta por Chen & Dickson (2000), na qual foram caracterizados como mortos os J2 que permaneceram com o corpo completamente distendido três minutos após a adição do NaOH. Os valores de percentagem de J2 de M. graminicola mortos foram transformados em arco seno x/100 e, a seguir, submetidos à análise de variância e teste de médias de Scott & Knott (1974) pelo programa Sisvar (Ferreira, 2000). 4) Avaliação do efeito dos óleos essenciais de alfazema e capim cidrão no controle de M. graminicola em arroz irrigado. Plantas de arroz irrigado cultivar BR-IRGA-410 com 30 dias de idade, mantidas em vasos de 700 cm3 com solo esterilizado, em casa-de-vegetação, foram submetidas a dois tratamentos com os óleos essenciais de alfazema e capim cidrão. Os óleos foram dispersos em “Tween 80” a 1 % e aplicados diretamente no solo (10 ml por planta) ou pulverizados na parte aérea das plantas na

concentração de 500 ppm. Após 48 h da primeira aplicação dos óleos, cada planta de arroz foi inoculada com suspensão de 5.000 ovos + J2 de M. graminicola. Posteriormente, foram realizadas oito pulverizações a cada sete dias. Plantas pulverizadas apenas com água foram utilizadas como testemunhas. O experimento seguiu o esquema fatorial 2 x 2 para os tratamentos óleo essencial e modo de aplicação. Cada tratamento foi composto por seis repetições, as quais foram distribuídas em delineamento inteiramente casualizado, sendo o experimento repetido por duas vezes. Sessenta e cinco dias após a inoculação, folhas das plantas de arroz dos diferentes tratamentos foram coletadas para análise da atividade das enzimas peroxidase (PO) e polifenol oxidase (PFO) e determinação do teor de compostos fenólicos, utilizando-se três repetições para cada tratamento. As análises de PO e PFO foram realizadas conforme Campos et al. (2004); a determinação do teor de compostos fenólicos de acordo com método de extração de Swain & Hillis (1959), e identificação pelo método Folin Denis, citado pela AOAC (1970) e Kosuge (1969). Em seguida, o sistema radicular de cada planta foi lavado e avaliado quanto à massa fresca, número de galhas (transformados em x + 1), número de ovos e fator de reprodução do nematóide (FR = população final / população inicial). A seguir, Nematologia Brasileira 129 Piracicaba (SP) Brasil

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os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, sendo as médias dos tratamentos comparadas entre si pelo teste de Duncan a 5 % de probabilidade.

Resultados e Discussão 1) Efeito de óleos essenciais de plantas medicinais sobre a eclosão de J2 de M. graminicola. Todos os óleos essenciais estudados apresentaram efeito nematostático sobre os ovos de M. graminicola, inibindo em média 55 % da eclosão dos J 2 (Tabela 1). Bosenbecker (2006), avaliando o efeito in vitro dos óleos de funcho e hortelã sobre a eclosão de J2 de M. javanica, também observou efeito nematostático semelhante. Oka et al. (2000), testando o efeito de diferentes óleos essenciais sobre ovos de M. javanica e M. incognita, também verificaram redução na eclosão dos J2 quando foram utilizados os óleos de orégano, manjericão, alecrim e alfazema nas concentrações de 1.000 ppm. Entretanto, quando foram utilizados os óleos de funcho, hortelã e capim cidrão, Oka et al. (2000) verificaram menor percentagem de J2 eclodidos (0,6 - 7,5 %), sendo tais diferenças atribuídas à menor concentração do produto ativo usada neste ensaio. A evolução da eclosão dos J2 ao longo do tempo pode ser melhor visualizada pela AACPE, em que os óleos essenciais de orégano, eucalipto, marcela e alecrim proporcionaram os menores valores, o que refletiu em inibições significativamente maiores da eclosão de M. graminicola (Tabela 1). Entretanto, quando a eclosão dos J2 foi avaliada separadamente ao 6, 9 e 12º. dia, não foi possível detectar diferenças significativas entre os diferentes óleos. Estes resultados corroboram aqueles apresentados por Salgado & Campos (2003) e Bosenbecker (2006). O comportamento observado deve-se provavelmente ao fato dos óleos essenciais serem compostos por substâncias instáveis na presença de luz ou calor e apresentarem volatilização dos compostos ativos presentes, sendo que, à medida que diminuiu a concentração dos compostos na mistura, diminuiu também a ação inibitória destes sobre a eclosão dos J2 . 2) Efeito de óleos essenciais na mortalidade de J2 de Meloidogyne graminicola . Todos os óleos

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essenciais estudados neste trabalho apresentaram efeito nematicida significativo sobre a mortalidade de J 2 de M. graminicola. As maiores percentagens de mortalidade do nematóide foram obtidas com os óleos essenciais de alfazema e capim cidrão 24 e 48 h após a exposição dos J2 (Tabela 1). A alta toxidade destes dois óleos sobre M. graminicola pode ser devida à presença de substâncias bioativas como o cineol, citral, geraniol e linalol em sua constituição, pois tais compostos possuem ação bactericida, inseticida e antisséptica (Serafini et al., 2001; Simões et al., 2003). Bosenbecker (2006) e Oka et al. (2000), avaliando o efeito do óleo essencial de hortelã sobre M. javanica, com 24 h de exposição, encontraram índices de mortalidade de 76 a 78 %, como os resultados obtidos neste ensaio (Tabela 1). De acordo com Chatterjee et al. (1982), Sangwan et al. (1990) e Oka et al. (2000), a presença do eugenol nos óleos essenciais de manjericão e hortelã está associada ao efeito nematicida sobre J2 de M. incognita, M. exigua e M. javanica. Nos tratamentos em que foram utilizados os óleos essenciais de alecrim, manjericão e hortelã, também foi verificado efeito nematicida a M. graminicola de 78, 77 e 75 %, respectivamente (Tabela 1). Segundo Martins et al. (1994), o manjericão apresenta, no seu conjunto de princípios ativos, os componentes chavicol, eugenol, estragol e timol, dos quais o efeito nematicida do eugenol foi comprovado por Bala & Sukul (1987). Foi observado que o aumento do período de exposição dos J2 aos diferentes óleos essenciais, de 24 para 48 h, proporcionou aumentou do percentual de mortalidade de M. graminicola quando foram aplicados os óleos de manjericão, hortelã, camomila, eucalipto, funcho e marcela (Tabela 1). Abid et al. (1997) avaliando o efeito in vitro do extrato aquoso de Eucalyptus camaldulensis Dehnh e de outras 59 espécies vegetais sobre M. javanica, verificaram que a grande maioria destes aumentou sensivelmente o percentual de J2 mortos com o aumento do período de exposição de 24 para 48 h. Da mesma forma, Mojumder et al. (2002) testando o efeito in vitro do extrato de “neem” (Azadirachta indica A. Juss.) sobre J2 de M. incognita, constataram aumento da mortalidade dos juvenis com

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48 h de exposição. Possivelmente, a maior ação dos óleos deve-se ao aumento do período de contato com o organismo ou a fragilidade do nematóide devido à inanição durante esse período, o que pode ter alterado sua fisiologia, tornando-o mais vulnerável a agentes externos. O maior efeito residual foi observado nos tratamentos onde foram utilizados os óleos de manjericão, hortelã, marcela e camomila, nos quais a mortalidade dos juvenis aumentou mais de 50 % com 48 h de exposição dos juvenis de M. graminicola aos óleos (Tabela 1). Embora os óleos de camomila, orégano, eucalipto, marcela e funcho tenham exibido alguma atividade sobre a mortalidade dos J2 do nematóide testado, foram menos eficientes que os demais. Trabalhos citados na literatura fazem alusão ao efeito desses óleos no controle de Meloidogyne spp. in vitro e in vivo (Oka et al., 2000; Bosenbecker, 2006) quando testados sobre outras espécies do nematóide das galhas, obtendo-se maiores efeitos nematicidas que aqueles observados neste trabalho. Entretanto, estudos adicionais são necessários para verificar se há especificidade entre o óleo e a espécie do nematóide testada. Considerando-se que ao final do 12º. dia de avaliação não houve diferença significativa entre todos os óleos analisados quanto à percentagem de eclosão, optou-se por realizar os testes in vivo utilizando-se apenas os tratamentos (óleo de alfazema e capim cidrão) que apresentaram os maiores percentuais de mortalidade. 3) Avaliação do efeito dos óleos essenciais de alfazema e capim cidrão no controle de Meloidogyne graminicola em arroz irrigado. Todos os óleos essenciais testados proporcionaram redução significativa no número de galhas e FR de M.

graminicola nas plantas de arroz irrigado, independentemente do modo de aplicação, suprimindo em média, 68% da reprodução do nematóide (Tabela 2). Verificou-se que tanto a aplicação direta do óleo no solo como a sua pulverização foliar resultou na supressão de M. graminicola. Esses resultados indicam que pode ter ocorrido efeito direto dos óleos de alfazema e capim cidrão sobre a eclosão dos ovos e sobrevivência dos J2 do nematóide no solo, conforme observado nos testes in vitro (Tabela 1). Desta forma, sugere-se que estes óleos além de terem efeito antibacteriano e contra insetos (Serafini et al., 2001; Simões et al., 2003), parecem ter também alguma ação nematicida. Embora tenha sido observada redução da reprodução do nematóide, não foi detectado efeito dos tratamentos sobre o peso da matéria fresca das plantas de arroz (Tabela 2). Estes resultados foram confirmados quando o mesmo ensaio foi repetido nas mesmas condições, onde o tratamento das plantas com óleos de alfazema e capim limão foi efetivo no controle do nematóide, independentemente do modo de aplicação (Tabela 2). A redução do número de galhas e fator de reprodução de M. graminicola, obtida pela pulverização foliar das plantas de arroz com ambos os óleos, indica que alguma modificação na planta pode ter induzido algum tipo de resistência a esse nematóide (Tabela 2). De acordo com Lopes et al. (2005), os compostos aplicados nas plantas podem ser liberados via exsudação das raízes, atuando contra os nematóides. Bosenbecker (2006), em estudos quanto à ação de óleos essenciais em batata (Solanum tuberosum L.), verificou que o óleo de funcho aplicado na parte aérea das plantas proporcionou redução de 85 % na

Tabela 2 - Massa fresca, número de galhas e fator de reprodução (FR) de M. graminicola em plantas de arroz irrigado cultivar BR IRGA410 tratadas com óleos essenciais de alfazema e capim cidrão independentemente do modo de aplicação (via parte aérea ou via solo). Tratamento Capim cidrão Alfazema Testemunha*** CV (%)

Massa fresca (g) Ensaio 1 Ensaio 2 13,32 a* 14,89 a 18,38 a 15,61

21,26 a 19,59 a 19,16 a 10,99

Galhas (nº.**) Ensaio 1 Ensaio 2 54,5 a 58,0 a 169 b 23,51

180,00 a 169,30 a 220,00 b 16,85

FR Ensaio 1

Ensaio 2

1,48 a 1,73 a 5,02 b 17,08

2,13 a 1,89 a 4,24 b 34,85

*Médias seguidas de mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. ** Valores transformados em x + 1 . ** Plantas pulverizadas com água destilada. Nematologia Brasileira 131 Piracicaba (SP) Brasil

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população final de M. javanica. Roy et al. (1993) analisando o efeito da pulverização de Acacia auriculiformis (A. Cunn) em plantas de tomateiro, também observaram que a aplicação via foliar resultou em inibição da formação de galhas. A redução de galhas e FR de M. graminicola observada neste trabalho pode ser explicada pela alteração significativa dos níveis de PO no arroz (Tabela 3), indicando modificações no metabolismo das plantas após a aplicação dos óleos de capim cidrão e alfazema. Entretanto, outras enzimas de resistência deveriam ser estudadas para melhor explicar esta associação, pois estudos desenvolvidos em outros patossistemas têm demonstrado alguma correlação entre atividade de enzimas como a β-1,4 endoglucanase e resistência da planta a fitonematóides (Davis et al., 2002). Considerando-se os resultados obtidos neste trabalho, verifica-se grande potencial quanto ao uso de óleos essenciais no manejo integrado de M. graminicola em pequenas áreas com arroz irrigado, principalmente por não existerem cultivares com resistência ao nematóide. Dessa forma, são necessários estudos adicionais para validar o uso destes produtos visando a agricultura mais sustentável e sem efeitos deletérios ao homem e ao ambiente.

Agradecimentos Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pelas bolsas de estudos, ao FIPE / UFSM e FAPERGS pelos recursos financeiros e à Embrapa Clima Temperado pela oportunidade de realização do trabalho.

Literatura Citada ABID, M., M.I. CHOUDHARY, M.A. MAQBOOL & A.U. RAHMAN. 1997. Preliminary screening of some plants for their nematicidal activity against Meloidogyne javanica. Nematologia Mediterrânea, 25: 155-157. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. 1970. Official Methods of the Association of Official Analytical Chemists. 11th .ed. Washington, 1015 p. BALA, S.K. & N.C. SUKUL. 1987. Systemic nematicidal effect of eugenol. Nematropica, 17 (2): 219-222. BOSENBECKER, V.K. 2006. Efeitos de óleos essenciais de plantas bioativas no controle de Phytophthora infestans e Meloidogyne javanica em batata (Solanum tuberosum L.). (Tese de Doutorado). Universidade Federal de Pelotas (RS), 65 p. BRIDGE, J. & S.L.J. PAGE. 1982. The rice root-knot nematode, Meloidogyne graminicola, on deep water rice (Oryza sativa subsp. indica). Revue Nematologie. 5 (2): 225-232. CAMPANHOLA, C. & W. BETTIOL. 2003. Métodos Alternativos de Controle Fitossanitário. Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, 279 p. CAMPOS, A.D. 2001. Indução do metabolismo de resistência à antracnose (Colletotrichum lindemuthianum) do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). (Tese de doutorado). Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 88 p. CAMPOS, A.D., A.G. FERREIRA, M.M.V. HAMPE, I.F. ANTUNES, N. BRANCÃO, E.P. SILVEIRA, V.A. OSÓRIO & E. AUGUSTIN. 2004. Atividade de peroxidase e polifenoloxidase na resistência de feijão à antracnose. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, 39 (7): 637-643. CARNEIRO, R.M.D. & M.R.A ALMEIDA. 2001. Técnica de eletroforese usada no estudo de enzimas dos nematóides de galhas para identificação de espécie. Nematologia Brasileira, 25 (1): 35-44. CHATTERJEE, A., N.C. SUKUL, S. LASKAR & S.C. JUMDAR. 1982. Nematicidal principles from species of lamiaceae. Journal of Nematology, 14 (1): 118-120. CHEN, S.Y. & D.W. DICKSON. 2000. A technique for

Tabela 3 - Atividade das enzimas peroxidase (PO), polifenol-oxidase (PFO) (UE / min.mg tecido) e teores médios de compostos fenólicos (CF) em plantas de arroz irrigado cultivar BR IRGA-410 tratadas ou não com óleos essenciais de alfazema e capim cidrão e inoculadas com M. graminicola, independentemente da forma de aplicação (via parte aérea ou solo). Tratamento

PO

PFO

CF

Capim cidrão Alfazema Testemunha** CV (%)

0,35 a* 0,38 a 0,74 b 34,96

0,26 a 0,28 a 0,29 a 23,40

0,09 a 0,08 a 0,09 a 10,78

*Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. **Plantas pulverizadas com água destilada. 132 Vol. 32(2) - 2008

Avaliação de Óleos Essenciais de Plantas Medicinais no Controle de Meloidogyne graminicola em Arroz Irrigado

determining live second-stage juveniles of heterodera glycines. Journal of Nematlogy, 32: 117-121. CHRISTIE, J.R. & V.G. PERRY. 1951. Removing nematodes from soil. Proceedings of Helminthological Society of Washington, 18: 106-108. COSTA, M.J.N., V.P. CAMPOS, L.H. PFENNING, & D.F. OLIVEIRA. 2000. Patogenicidade e reprodução de Meloidogyne incognita em tomateiros (Lycopersicon esculentum) com aplicação de filtrados fúngicos ou extratos de plantas e de estercos de animais. Nematologia Brasileira, 24 (2): 219-226. DAVIS, E.L., R.S. HUSSEY, T.J. BAUM, J. BAKKER, A. SCHOTS, M.N. ROSSO & P. ABAD. 2002. Nematode parasitism genes. Ann. Rev. Phytopathology, 38: 365396. DECKER, H. 1981. Plant Nematodes and their Control. Phytonematology. New Delhi Amerind Publishing, 540 p. DIAS, C. R., A.V. SCHWAN, D.P. EZEQUIEL, M.C. SARMENTO & S. FERRAZ. 2000. Efeito de extratos aquosos de plantas medicinais na sobrevivência de juvenis de Meloidogyne incognita. Nematologia Brasileira, 24 (2): 203-210. FERREIRA, D.F. 2000. Sistemas de análise estatística para dados balanceados. UFLA / DEX / SISVAR, Lavras MG, 145 p. HAMMERSCHMIDT, R. & E.K. DANN. 1997. Induced resistance to disease. In: RECHCIGL, N.A. & J.E. RECHCIGL. Environmentally Safe Approaches to Crop Disease Control. CRC - Lewis Publishers, Boca Raton (EUA), p. 177-199. HEITEFUSS, I. 1997. General principles of host-parasite interactions. In: HARTLEB, H., R. HEITEFUSS & H. HOPPE. Resistance of Crop Plants against Fungi. Fischer, Jena-Stuttgart-Ltibeck-Ulm (Germany), p. 1932. HEITEFUSS, I. 1982. General review of active defense mechanisms in plant against pathogens. In: WOOD, R.K.S. Active Defense – Mechanisms in Pants. NATO Advanced Study Institutes Series. Series A: Life Science, vol. 37. Plenum Press, New York, 30 p. HUSSEY, R.S. & K.R.A BARKER. 1973. Comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. Including a new technique. Plant Disease Reporter, 57 (12): 1025-1028. ISMAN, M.B. 2000. Plant essential oils for pest and disease management. Crop Protection, 19: 603-608. KOSUGE, T. 1969. The role of phenolics in host response to infection. Annual Review Phytopathology, Palo Alto, 7: 195-222. KRISHNA-PRASAD, K.S. & Y.S. RAO. 1982. Effect of few systemic pesticides as soil treatments on the growth and development of Meloidogyne graminicola in rice roots. Indian Journal of Nematology. 12: 14-21. KHURMA, U.R. & A. SINGH. 1997. Nematicidal potential of seed extracts: in vitro effects on juvenile mortality

and egg hatch of Meloidogyne incognita and M. javanica. Nematologia Mediterranea, 25: 49-54. LOPES, E.A., S. FERRAZ, L.G. FREITAS, P.A FERREIRA & D.X. AMORA. 2005. Efeito dos extratos aquosos de mucuna preta e de Manjericão sobre Meloidogyne incognita e M. javanica. Nematologia Brasileira, 29 (1): 67-74. LORIMER, S.D., N.B. PERRY, L.M. FOSTER & E.J. BURGESS. 1996. A nematode larval motility inhibition assay for screening plant extracts and natural products. Journal of Agricultural of the Food Chemistry, 44: 2842-2845. MAFFIA, A.L. 1986. Programa para cálculo de área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) GWBASIC 3.20. Departamento de Fitopatologia / Universidade Federal de Viçosa (MG). MARTINS, E.R., D.M. CASTRO, D.C. CASTELLANI, & J.E. DIAS. 1994. Plantas Medicinais. Universidade Federal de Viçosa (MG), 220 p. MOJUMDER, V., A. KAMRA & P. DUREJA. 2002. Effect of neem extracts on activity and mortality of secondstage juveniles of Meloidogyne javanica. Nematologia Mediterranea, 30: 83-84. NANDAKUMAR, R., S. BABU, R. VISWANATHAN, T. RAGUCHANDER & R. SAMIYAPPAN. 2001. Induction of systemic resistance in rice against sheath blight disease by Pseudomonas fluorescens. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, 33: 603-612. NETSCHER, C. & X. ERLAN. 1993. Root-knot nematode Meloidogyne graminicola, parasitic rice in Indonesia. AfroAsian Journal of Nematology, 3: 90-95. OKA, Y., S. NACAR, E. PUTIEVSKY, U. RAVID, Z. YANIV & Y. SPIEGEL. 2000. Nematicidal activity of essential oils and their components against the rootknot nematode. Nematology, 90 (7): 710-715. OKA, Y. 2001. Nematicidal activity of essential oil components against the root-knot nematode Meloidogyne javanica. Nematology, 3 (2): 159-164. PADGHAM, J.L., J.M. DUXBURY, A.M. MAZID, G.S. ABAWI & M. HOSSAIN. 2004. Yield loss caused by Meloidogyne graminicola on lowland rainfed rice in Bangladesh. Journal of Nematology, 36 (1): 42-48. PROT, J.C. & D.M. MATIAS. 1995. Effects of water regime on the distribution of Meloidogyne graminicola and other root-parasitic nematodes in a rice field toposequence and pathogenicity of M. graminicola on rice cultivar UPL R15. Nematologica, 41: 219-228. ROCHA, F.S. & V.P. CAMPOS. 2004. Efeito de exsudatos de cultura de células de plantas em juvenis de segundo estádio de Meloidogyne incognita. Fitopatologia Brasileira, 29 (3): 294-299. ROY, D., S.P. SINHABABU, N.C. SUKUL, S. GARAI & B.P. DAS. 1993. Nematicidal principle from the funicle of Acacia auriculiformis. Indian Journal of Nematology, 23: 152-157. SALGADO, S.M.L. & V.P. CAMPOS. 2003. Extratos

Nematologia Brasileira 133 Piracicaba (SP) Brasil

Ricardo B. Steffen, Zaida I. Antoniolli, Veridiana K. Bosenbecker, Gerusa P.K. Steffen, Manoeli Lupatini, Ângela D. Campos & César B. Gomes

naturais na patogenicidade e reprodução de Meloidogyne exigua em cafeeiro e de Meloidogyne incognita raça 3 em feijoeiro. Nematologia Brasileira, 27 (1): 41-48. SALGADO, S.M.L., V.P. CAMPOS, M.G. CARDOSO & A.P.S. SALGADO, 2003. Eclosão e mortalidade de juvenis de segundo estádio de Meloidogyne exigua em óleos essenciais. Nematologia Brasileira, 27 (1): 17-22. SANGWAN, N. K., B.S. VERMA, K.K. VERMA & K.S. DHINDSA. 1990. Nematicidal activity of some essential oils. Pesticide Science, 28: 331-335. SCHWAN-ESTRADA, K.R.F., J.R. STANGARLIN & M. E. S. CRUZ. 2003. Uso de plantas medicinais no controle de doenças de plantas. Fitopatologia Brasileira, 28: 54-56, Suplemento. SCOTT, A.J. & M. KNOTT. 1974. Cluster analysis method for grouping means in the analysis of variance. Biometrics, 30: 507-512. SERAFINI, L. A. & E. CASSEL. 2001. Produção de óleos essenciais: uma alternativa para a agroindústria nacional. In: SERAFINI, L. A.; N.M. BARROS & J.L. AZEVEDO. Biotecnologia na Agricultura e na Agroindústria. Agroindústria, Guaíba, p. 333-377. SERAFINI, L.A., N.M. BARROS & J.L. AZEVEDO. 2001. Biotecnologia na Agricultura e na Agroindústria.

134 Vol. 32(2) - 2008

Agropecuária, Guaíba, 463 p. SHARMA, S.B., S. PANDE, M. SAHA, K.K. KAUSHAL, M. LAL, M. SINGH, M. KHAJAN SINGH, R. POKHAREL & R.P. UPRETI. 2001. Plant-parasitic nematodes associated with rice and wheat-based cropping systems in Nepal. International Journal of Nematology, 11: 35-38. SIMÕES, C.M.O., E.P. SCHENKEL, G. GOSMANN, J.C.P. MELLO, L.A. MENTZ & P.R. 2003. Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. 5ª. ed. Editora UFRGS e Editora UFSC, Porto Alegre e Florianópolis, 1102 p. SWAIN, T. & W.C. HILLIS. 1959. The phenolic constituents of Prunus domestica. Journal of the Science of Food and Agriculture, London, 10: 63-68. SPERANDIO, C. A. & A.R. MONTEIRO 1991. Ocorrência de Meloidogyne graminicola em arroz irrigado no Rio Grande do Sul. Nematologia Brasileira, 15 (1): 24. STEFFEN, R.B., Z.I. ANTONIOLLI, G.P. KIST, M. LUPATINI & C.B. GOMES. 2007. Caracterização bioquímica do nematóide das galhas (Meloidogyne spp.) em lavouras de arroz irrigado na região central do Rio Grande do Sul. Ciência e Natura, 29 (1): 37-46.