Artigo OriginalGorla, / Original Article F.A. et al.
Avaliação do Emprego da Técnica NIRS para a Determinação de Cafeína em Café Solúvel Use of NIRS Technique for Caffeine Determination in Instant Coffee
Felipe Augusto Gorlaa*; Jéssica Gubany Sanchesa; Ana Lúcia de Souza Madureira Felíciob; Suzana Lucy Nixdorfa a Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Exatas, Departamento de Química, PR, Brasil Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Ciência de Alimentos, Londrina, PR, Brasil
b
*E-mail:
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Resumo A cafeína é um alcaloide presente no café que apresenta efeitos benéficos à saúde. Sua determinação em café solúvel pelo método normalizado (ISO 10.095) emprega a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou do inglês HPLC), técnica amplamente utilizada por ser precisa e exata. Entretanto, sua aplicação exige preparo da amostra, analista treinado, equipamento sofisticado, e implica no uso contínuo da fase móvel, o que a torna dispendiosa e gera grandes volumes de resíduos. Em contrapartida, a espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS) surge como uma alternativa interessante para o controle de qualidade. É rápida - não demanda basicamente preparo das amostras – é simples, barata e não destrói a amostra. Como um método secundário, pode ser utilizada, desde que estabelecido o modelo de calibração para o equipamento. No presente estudo foi estabelecido um modelo de calibração para o NIRS, tendo sido aplicadas as técnicas de HPLC e NIRS na determinação do teor de cafeína de cafés solúveis. Através da utilização do teste t de student pareado, foi comprovado que não há diferenças significativas entre as técnicas, em nível de 95% de confiança. Desta forma, verificou-se a potencialidade do uso da técnica NIRS em análises de rotina, onde critérios como: agilidade; redução de custos com reagentes, mão de obra e perda de produto; minimização de retrabalho e geração de resíduos são primordiais, em complementação à técnica de HPLC, utilizada na confirmação dos teores de cafeína como método primário. Palavras-chave: Cafeína. Café. HPLC. NIR.
Abstract Caffeine is an alkaloid present in coffee that has beneficial health effects. Its determination in soluble coffee by normalized method (ISO 10.095) employs high performance liquid chromatography (HPLC), a widely used technique due to its precision and accuracy. However its application requires criteria for sample preparation; trained analyst; sophisticated equipment; and continuous use of mobile phase, which make it expensive and generates large volume of waste. In contrast, near infrared spectroscopy (NIRS) emerges as an interesting alternative for quality control. It is fast, simple, non-expensive, and harmless for the sample. It could be used as a secondary method, provided that the calibration model is established for the device. In present study a calibration model for NIRS was established by NIRS and HPLC techniques for determination of caffeine contents in soluble coffee. The Student t test showed that there are no significant differences at 95% of confidence level between the techniques. Therefore, the potentiality of NIRS uses in routine analysis was verified, where features such as agility; reagent cost, manpower and product loss reduction; and minimal rework and waste generation are fundamental, in complement to HPLC technique used as the primary method in the confirmation of caffeine. Keywords: Caffeine. Coffee. HPLC. NIRS.
1 Introdução O café é um dos produtos básicos mais valiosos, sendo a segunda bebida mais popular do mundo e a segunda commodity geradora de riquezas, permanecendo atrás somente do petróleo (DIAS, 2009). O Brasil é o maior produtor e exportador mundial, ocupando o segundo maior mercado consumidor (ABIC, 2012). No País, o café é a segunda bebida mais consumida do mercado interno, ficando atrás apenas da água, seguida de refrigerantes e leite (NAKAMURA, 2009). É uma bebida bastante apreciada tanto por seu sabor, quanto por seus efeitos estimulantes. Neste quesito, a cafeína, quimicamente conhecida por 1,3,7-trimetilxantina, é o ingrediente mais ativo do café. Essa substância pertence ao grupo de compostos das metilxantinas, como a teobromina e a teofilina. As xantinas são substâncias capazes de estimular UNOPAR Cient. Exatas Tecnol., Londrina, v. 12, n. 1, p. 45-49, Nov. 2013
o sistema nervoso, produzindo certo estado de alerta de curta duração (ALVES; BRAGAGNOLO, 2002). A cafeína é também encontrada em alguns remédios, como analgésicos, termogênicos, antigripais, em chás e em outras bebidas compostas por cola, cacau e chocolate. Por estar presente em diversos produtos e em mais de 60 espécies de plantas, pode-se dizer que a cafeína é, seguramente, a substância psicoativa mais popular do mundo (RICHARDS, GLASS, 1994; BALLONE, MOURA, 2008). Seus efeitos fisiológicos na saúde humana incluem estimulação do sistema nervoso central, dos músculos cardíacos, do sistema respiratório e da secreção de ácido gástrico. Também é considerada como um diurético fraco e relaxante muscular (JAMES, 1991). A teobromina (3,7-dimetilxantina) é encontrada, sobretudo, em produtos de cacau, e tem ação diurética, enquanto a teofilina 45
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(1,3-dimetilxantina), encontrada em algumas variedades de chás, tem predominantemente efeito broncodilatador (HARKINS et al., 1998). Tamanha importância justifica o interesse em métodos analíticos eficazes. Numerosos métodos tais como espectrofotometria, titulometria e cromatografia gasosa (CG) ou líquida de alta eficiência (CLAE ou do inglês HPLC) são usados para a determinação destes alcalóides (ALVES; BRAGAGNOLO, 2002). A desvantagem da espectrofotometria e titulometria é que não apresentam seletividade (RIBEIRO, VOLPATO, 2005), importante para matrizes complexas como o café, enquanto a CG exige derivatização (De MARIA, MOREIRA, 2007). A vantagem do sistema de HPLC na análise destes compostos inclui eficiência, sensibilidade e especificidade (NAIK, 2001). Além disso, a técnica HPLC permite a quantificação de cada composto em uma única corrida cromatográfica (ALVES; BRAGAGNOLO, 2002). A cromatografia líquida de alta eficiência é a técnica normalizada pela ISO, considerada eficiente como técnica primária na quantificação destes alcalóides, utilizando coluna C-18 e detecção UV-VIS em 272 nm com eluição isocrática (ISO 10.095, 1992). No entanto, o HPLC apresenta desvantagens devido a diversos fatores, tains como: custo elevado, emprego de reagentes de alta pureza (grau HPLC); geração de grandes quantidades de resíduos líquidos orgânicos pela vazão contínua de eluentes; preparo minucioso das amostras; analista especializado, além de demandar tempo analítico e ser considerada uma técnica destrutiva, uma vez que não há possibilidade de reaproveitamento das amostras (De MARIA, MOREIRA, 2007; CAMARGO, TOLEDO, 1998). Em contrapartida, a espectroscopia no infravermelho próximo (NIRS), um tipo de espectroscopia vibracional que emprega fótons com energia entre 2,65 x 10-19 a 7,96 x 1020 J – o suficiente para intensificar a vibração das ligações entre os átomos – vem ganhando espaço entre as técnicas mais utilizadas, especialmente quando aliada a tratamentos matemáticos (PIZARRO et al., 2007). A técnica NIRS apresenta como vantagens ser rápida (cerca de um minuto ou menos para a leitura de cada amostra), não destrutiva, não invasiva, ter grande poder de penetração do feixe de radiação, ser quase universal (detecta qualquer molécula que contenha ligações O-H, C-H, N-H ou S-H) e exigir um mínimo preparo de amostras (PASQUINI, 2003). Como desvantagem, é importante ressaltar que a NIRS é uma técnica secundária, e, portanto, faz-se necessária a calibração do equipamento através de um modelo de calibração, construído à partir de dados obtidos por uma técnica primária. Uma vez estruturado o modelo, é possível a análise simultânea de vários parâmetros pela comparação entre os espectros (PASQUINI, 2003). Além disso, para se aplicar a técnica NIRS, é necessário um conhecimento de quimiometria, uma vez que utiliza 46
métodos matemáticos e estatísticos para definir ou selecionar as condições ótimas de medidas e experiências, visando a obtenção do máximo de informações com um número reduzido de experimentos, a partir da análise de dados químicos (BRUNS, FLAIGE, 1985). 2 Material e Métodos 2.1 Materiais Foram utilizados para a as análises um padrão de cafeína (Merck, Darmstadt, Alemanha), óxido de magnésio pesado (Merck, Darmstadt, Alemanha), metanol grau HPLC (J. T. Baker, Xalostoc, México) e água ultrapura obtida através de um sistema Milli-Q®(Millipore, MA, EUA). As 26 amostras de café solúvel spray-dried utilizadas neste estudo foram fornecidas por uma indústria produtora de café solúvel da região de Londrina, Paraná, Brasil. 2.2 Determinação por HPLC Os teores de cafeína foram determinados empregando o método normatizado ISO 10.095, utilizando o HPLC como método primário. Pesou-se 1,0000 ± 0,0001 g da amostra de café solúvel e 4,00 g de óxido de magnésio pesado. Posteriormente, ambos foram adicionados a um erlenmeyer de 500 mL, previamente tarado. Ao erlenmeyer, adicionouse 100 mL de água ultrapura Milli-Q®(Millipore, MA, EUA), e levou-se à fervura em chapa aquecedora (Cientec, Brasil) por 15 minutos. Após o resfriamento, a tara inicial evaporada foi reconstituída com adição da água ultrapura. O conteúdo foi então, passado em papel filtro faixa branca (Whatman™ Springfield Mill, UK) pregueado, e o filtrado por membrana 0,22 µm de nylon (GVWP 02500, Millipore, MA, EUA). A análise foi feita em um sistema de cromatografia líquida Waters®, empregando fase móvel água: metanol (70:30, v/v) com vazão 0,7 mL min-1, impulsionada por uma bomba Waters 515; a injeção de 20,0 µL foi realizada pelo auto-amostrador Waters 717 Plus. Foi utilizada uma coluna de fase reversa Nova-Pak C18 (60Å, 4,0 µm, 4,6 mm X 150 mm, Waters, EUA). A temperatura da coluna foi mantida a 28 ºC. O detector UV-VIS Waters 2487 foi ajustado para o comprimento de onda 272 nm. Os cromatogramas foram adquiridos e integrados pelo software Empower 1.0, interfaceado via Waters bus SAT/ IN Module. 2.3 Determinação por NIRS Para a análise no infravermelho próximo, pesou-se 2,50 ± 0,1 g de cada amostra, que foram acondicionadas em celas de quartzo comerciais denominadas células spinning. Vale ressaltar que as amostras não foram pré-processadas, nem sofreram algum tipo de abertura ou preparo. Os espectros foram obtidos através do posicionamento da cela no caminho óptico, fechando-se da íris e efetuando-se a varredura espectral na faixa de 1000 a 2400 nm. O equipamento utilizado foi um Near-infrared XM 1100 series da FOSS com módulo de UNOPAR Cient. Exatas Tecnol., Londrina, v. 12, n. 1, p. 45-49, Nov. 2013
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teste “t” de student pareado, que permite avaliar se há ou não diferenças significativas entre os valores obtidos pelas técnicas (SKOOG, 2006). Desta forma, este teste foi aplicado para avaliar a ocorrência de diferenças significativas entre os teores de cafeína obtidos por HPLC e NIRS.
detecção por reflectância difusa XDS Rapid Content Analyzer. O tempo total por análise foi de 60 segundos. 2.4 Análise dos dados O software utilizado para o registro dos espectros do infravermelho próximo foi o ISIScan (FOSS, Hilleroed, Dinamarca). Para a análise multivariada dos espectros, foi utilizado o software WinISI II V 1.05 (FOSS, Hilleroed, Dinamarca). A correção da interferência do tamanho das partículas no espectro foi realizada através da derivação de segunda ordem. Uma comparação entre as técnicas pode ser realizada por vários tratamentos estatísticos, como o
3 Resultados e Discussão A determinação do teor de cafeína para as amostras de café solúvel foi inicialmente efetuada por HPLC/UV-VIS (cromatograma ilustrado na Figura 1) empregando o método primário ISO 10.095 normalizado, considerando-se o valor médio de 3 determinações.
Figura 1: Cromatograma típico de amostra de café solúvel utilizado na quantificação da cafeína (2,81 minutos). 350 000 300 000 250 000
AUFS
200 000 150 000 100 000 50 000 0
0
1
3
2
Tempo (min)
Para a quantificação dos teores por esta técnica, utilizouse uma curva de calibração construída a partir de padrões, na faixa dinâmica de trabalho de 0,05 a 5,00 gcafeína 100 gcafé-1, representada na Equação 1.
4
5
y = 2,33x106 – 3,53x104, r = 0,99987
(1)
Posteriormente, as mesmas amostras foram analisadas no NIRS, gerando os espectros apresentados na Figura 2.
Figura 2: Sobreposição dos espectros NIR para as 26 amostras de café solúvel, com a varredura de 1000 a 2400 nm 0,7 0,6
Log (1/R)
Log (1/R)
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
λ/nm Com o objetivo de atenuar os efeitos da granulometria sobre a reflectância difusa e, em concomitância, ajustar a UNOPAR Cient. Exatas Tecnol., Londrina, v. 12, n. 1, p. 45-49, Nov. 2013
linha de base, foi efetuada a derivada segunda nos espectros, resultando no gráfico apresentado na Figura 3. 47
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Figura 3: Derivada segunda dos espectros NIR das 26 amostras de café solúvel 0,00020
Derivada Segunda
Derivada Segunda
0,00015 0,00010 0,00005 0,00000 -0,00005 -0,00010 -0,00015 -0,00020 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400
λ/nm A partir da análise multivariada da derivada segunda dos espectros NIR, os teores de cafeína foram determinados, através da Equação 2, correspondente ao modelo de calibração para predição de cafeína. y = Σ1i Bi .A
(2)
onde, A corresponde ao valor de log R1, e B é o coeficiente para comprimentos de onda específicos, respectivamente. Os valores B, juntamente com os comprimentos de onda correspondentes são apresentados na Tabela 1. Tabela 1: Valores do parâmetro B da Equação 2 utilizada na predição dos teores de cafeína por NIRS Parâmetro B
Comprimento de onda (nm)
-1,2339
1188
6,2438
1196
1,6580
1204
-11,5290
1356
-7,1810
1364
4,6503
1436
-4,1463
1444
-6,4398
1468
4,3717
1476
3,5059
1484
-0,0077
1492
-1,1731
1500
-0,0938
1508
-14,7107
1916
1,2619
1924
Modo Vibracional* 2º OT νCH3
CB CH3 CB CH2 + Ar
1º OT νNH
2º OT νC=O
* OT: Overtone; CB: Combinação de bandas; Ar: Aromático; ν: estiramento axial
Tabela 2: Teores de cafeína médios obtidos por HPLC e NIRS (N = 3) e desvio entre as técnicas Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
HPLC (%) (m/m) 3,57 2,98 3,21 3,31 3,29 3,31 3,27 3,31 3,48 3,23 3,04 3,40 3,37 3,45 3,27 3,3 3,35 3,27 3,18 3,45 3,60 3,55 3,39 2,75 3,42 3,01
NIRS (%) (m/m) 3,43 3,23 3,28 3,26 3,50 3,36 3,20 3,39 3,38 3,32 3,19 3,45 3,53 3,50 3,50 3,41 3,53 3,31 3,03 3,45 3,40 3,53 3,57 2,60 3,27 3,08
d(HPLC-NIR) 0,14 - 0,25 - 0,07 0,05 - 0,21 - 0,05 0,07 - 0,08 0,10 - 0,09 - 0,15 - 0,05 - 0,16 - 0,05 - 0,23 - 0,11 - 0,18 - 0,04 0,15 0,00 0,20 0,02 - 0,18 0,15 0,15 - 0,07
Para a aplicação do teste t de student pareado, efetuou-se a média e o desvio padrão das diferenças entre as medidas, empregando as Equações 3 e 4. (3)
Após a determinação do teor de cafeína pelas duas técnicas, calculou-se a diferença entre os valores obtidos, apresentados na Tabela 2. 48
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onde di é o valor de desvio da amostra, dmédio é o valor médio dos desvios, sd é o desvio padrão dos desvios amostrais e N é o número de amostras. Foi formulada a hipótese de que, não há diferença significativa entre as técnicas, denominada hipótese nula (H0 ). Comparou-se o t tabelado em nível de 95 % de confiança com 25 graus de liberdade (ttab = 2,160) com o t calculado (tcalc) através da Equação 5.
tcalc = dsmédio = -1,4076 d
/√N
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de teobromina, teofilina e cafeína em chás por cromatografia líquida de alta eficiência. Rev. Bras. Cienc. Farm., v.38, n.2, p. 237-243, 2002. BALLONE, G.J.; MOURA, E.C. Cafeína. Disponível em: , 2008. Acesso em: 29 set. 2012. BRUNS, R. E.; FLAIGE, J. F. G. Quimiometria. Quím. Nova, v.8, n.2, 1985. Disponível em: . Acesso em: 29 set. 2012. CAMARGO, M.C.R.; TOLEDO, M.C.F. Teor de cafeína em cafés brasileiros. Ciênc. Tecnol. Aliment., v.18, n.4, 1998. Disponível em: . Acesso em: 8 out. 2012.
Uma vez que -ttab< tcalc
