BACTÉRIAS RESISTENTES ISOLADAS DE LEITE DE VACA COM MASTITE SUB-CLÍNICA

PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO PARANÁ PRÓ-REITORIA DE GRADUAÇÃO, PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica PIBIC 2013/2014

RELATÓRIO FINAL

BACTÉRIAS RESISTENTES ISOLADAS DE LEITE DE VACA COM MASTITE SUB-CLÍNICA KUNG DARH CHI

CURITIBA JULHO / 2014 i

DIOGENES ADRINO DUARTE SANTANA

KUNG DARH CHI MEDICINA VETERINÁRIA - ECAMV BOLSA PIBIC – PUCPR

BACTÉRIAS RESISTENTES ISOLADAS DE LEITE DE VACA COM MASTITE SUB-CLÍNICA

Relatório Final apresentado ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, e órgãos de fomento, sob orientação do Prof. Kung Darh Chi.

CURITIBA

ii

SUMÁRIO RESUMO ......................................................................................................

iv

LISTA DE FIGURAS .....................................................................................

V

LISTA DE TABELAS ....................................................................................

vi

1 INTRODUÇÃO ...........................................................................................

1

2 OBJETIVO ................................................................................................

3

3 MATERIAIS E MÉTODO ..........................................................................

4

4 RESULTADOS ..........................................................................................

6

4.1 Resistência bacteriana ...........................................................................

7

5 DISCUSSÃO .............................................................................................

8

6 CONCLUSÃO ...........................................................................................

10

REFERÊNCIAS .............................................................................................

11

iii

RESUMO A mastite é uma inflamação da glândula mamaria, caracterizada por alterações físicoquímicos na composição do leite e pelo aumento de células somátic as. Ela se apresenta em duas formas de enfermidade a clínica e a sub-clínica, esta última não possui alterações visíveis mas que resulta em grandes prejuízos. Os microrganismos causadores da mastite bovina são classificados em dois grupos: contagiosos e os ambientais,

as

principias

espécies

de

cada

grupo

respectivamente

são

Staphylococcus aureus e Escherichia coli. O presente estudo teve por objetivo identificar a presença de microrganismos multirresistentes isolados de leite de vacas com mastite sub-clínica. Foram coletados no período de setembro de 2013 a maio de 2014, amostras de leite de 77 animais das raças holandesa e pardo suíço procedentes do Setor de Bovinocultura da Fazenda Experimental Gralha Azul – PUCPR, município de Fazenda Rio Grande, Paraná. Os animais foram selecionados de acordo com os valores de CCS acima de 330.000 células/mL, considerados vacas com mastite subclínica. Um total de 312 amostras foram coletadas, sendo a coleta individual por quarto mamário. As amostras foram processadas no laboratório de microbiologia da Unidade Hospitalar de Animais de Companhia (UHAC) do Hospital Veterinário da PUCPR, o exame microbiológico foi feito de acordo com Philpot, (2002); Nickerson, (2002). O teste de sensibilidade foi feito utilizando os seguintes antimicrobianos: penicilina G, ampicilina, cefalexina, enrofloxacina, estreptomicina, gentamicina, neomicina, sulfonamida e tetraciclina. Do total de 312 amostras inoculadas, 179 (57,37%) resultaram em crescimento com isolamento de 237 agentes bacterianos, e amostras 133 (42,62%) não tiveram crescimento. A principal preocupação da multirresistência dessas bactérias isoladas é que não haverá mais tratamento eficaz para mastite bovina.

iv

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Porcentagem de resistência microbiana frente a 9 antibióticos apresentados pelos apresentados pelos agentes etiológicos isolados de casos de mastite sub-clínica ..........................................................................

7

v

LISTA DE TABELAS Tabela 1.

Agentes etiológicos da mastite sub-clínica isoladas de 179

amostras

que

se

obteve

crescimento

em

ágar

sangue

a

5%...................................................................................................................

6

vi

Relatório Final - PIBIC 13/14

1. INTRODUÇÃO A mastite é uma inflação da glândula mamaria, caracterizada por alterações físico-químicos na composição do leite e pelo aumento de células somáticas (Philpot, 2002; Nickerson, 2002). Essas alterações podem ser causadas na maioria das vezes por microrganismos, principalmente bactérias contagiosas ou ambientais, que entram através do canal da teta resultando um processo inflamatória no interior do úbere e podendo levar a destruição de células epiteliais responsáveis pela composição dos principais constituintes do leite, como consequência além dos problemas da sanidade da vaca, haverá redução da produção de leite e o encurtamento da vida na prateleira do leite processado trazendo assim grandes prejuízos para o rebanho leiteiro industrial (Brito, 2013; Arcuri, 2013). A mastite apresenta em duas formas de enfermidade a clínica e a sub-clínica. Na forma clínica é caracterizado por irregularidades visíveis no úbere e no leite, cuja a seriedade pode variar muito durante o curso da doença (Philpot, 2002; Nickerson, 2002). Já a forma sub-clínica é a mais comum e responsável pelos maiores prejuízos pois não há alteração visível no leite e no úbere (Brito, 2013). Recursos indiretos de diagnostico são necessários para identificar o microrganismo atuante na inflamação (Bueno et al., 2002). Estudos realizados no Brasil mostraram que quartos mamários com mastite subclínica produziram em média 25 a 42% menos leite do que quartos mamários normais. Nos Estados Unidos, estima-se que o custo por vaca/ano devido à mastite seja de aproximadamente US$ 185, o que corresponde a um custo anual de US$1,8 bilhão. Esse valor corresponde a aproximadamente 10% do total de leite vendido pelos produtores. Deste, cerca de dois terços correspondem à redução na produção de leite devido à mastite subclínica (Embrapa, 2013). Os microrganismos causadores da mastite são classificados em dois grupos: contagiosos e os ambientais (Brito, 2013). No grupo das bactérias contagiosas temos como principal as espécies Streptococcus agalactiae, corynebacterium bovis, Mycoplasma bovis e Staphylococcus aureus (Philpot, 2002; Nickerson, 2002), sendo esse o mais comum entre vários rebanhos leiteiros, multirresistentes a antibióticos e além disso são capazes de produzir vários fatores de virulência ao animal e não

1

Relatório Final – PIBIC 13/14

produzir resposta imunológica local (Quinn et al., 2005). E o grupo das bactérias ambientais temos como principal as espécies Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterococcus faecallis, Enterococcus faecium e Escherichia coli (Philpot, 2002; Nickerson, 2002), este tem sido mostrado uma associação entre rebanhos com baixa contagem de células somáticas no volume de leite e incidência aumentada de mastite toxica (Quinn et al., 2005), a pluralidade dos fatores de virulência de E. coli desperta a preocupação com o envolvimento destes mecanismos de virulência em estirpes isoladas de mastite bovina. Estes fatores são constituídos por componentes endotoxinas, ou são representados por diferentes cito ou exotoxinas, assim como propriedades que permitem a multiplicação em meios com restrição de ferro, a multirresistência aos antimicrobianos, ou a colonização (Sussman, 1997). Os antimicrobianos são amplamente utilizados na clínica veterinária. A resistência aos antibióticos é um sério problema do ponto de vista clínico e de saúde pública, devido ao tratamento dos animais tornar seus produtos e derivados fonte para resistência bacteriana na espécie humana (Teuber, 2001). O insucesso do tratamento não se deve apenas à resistência aos antimicrobianos, mas cogita também a capacidade

da

bactéria

sobreviver

intracelularmente,

onde

comumente

o

antimicrobiano não consegue atingir a concentração adequada. As bactérias estão cada vez mais resistentes aos principais princípios ativos como por exemplo, amoxilina, ampicilina, cefalexina, cefalotina, cefoxitina, clindamicina, eritromicina, gentamicina, licomicina, neomicina, norfloxacino, oxacilina, penicilina G, sulfazotrin, tetraciclina e vancomicina, ou seja, tanto antibióticos bacteriostáticos quanto antibióticos bactericidas estão fazendo menos efeito nas espécies de bactérias das espécies Staphulococcus spp., Streptococcus spp. e Corynebacterium spp. (Spinosa, 2014).

2

Relatório Final – PIBIC 13/14

2. OBJETIVOS O

presente

estudo

foi

de

identificar

presença

de

microrganismos

multirresistentes isolados de leite de vacas com mastite sub-clínica.

3

Relatório Final – PIBIC 13/14

3. MATERIAIS E MÉTODO No período de setembro de 2013 a maio de 2014, após análise do relatório do controle leiteiro, foi estipulado que vacas com valores de CCS (contagem de células somáticas) acima de 330.000 células/ml e com mastite sub-clínica seria coletada amostras de leite, das raças Holandesa e Pardo Suíço, procedentes da propriedade Fazenda Experimental Gralha Azul - PUCPR no município de Fazenda Rio Grande, Paraná. No total da pesquisa foram coletadas amostras de leite individual por teto de 77 animais com mastite subclínica, configurando leite de 308 quartos mamários analisados no laboratório de microbiologia da Unidade Hospitalar de Animais de Companhia (UHAC) do Hospital Veterinário da PUCPR, localizada no Campus de São José dos Pinhais no município de São José dos Pinhais, Paraná, para identificar a presença de microrganismos resistentes aos principais antibióticos testados e a prevalência de patógenos no rebanho leiteiro. A coleta, que faz parte do processo de manejo pré-ordenha, está de acordo com o descrito por Philpot, (2002) e Nickerson, (2002). As amostras foram colocadas em tubos estéreis e depois acondicionadas em uma caixa de isopor com gelo para manter a refrigeração até a chegada ao laboratório de microbiologia. Após a semeadura do leite em placas de ágar sangue a 5% e MacConkey, as placas foram para a estufa bacteriológica para serem incubadas a 37%, durante 24 horas (PHILPOT, 2002; NICKERSON, 2002). Posteriormente foi feito a descrição da colônia para aqueles que obtiveram crescimento, foi coletado fragmento da colônia para o BHI (Brain Heart Infusion, composto por nutrientes de cérebro e coração gado) para o cultivo do inoculo puro que será acondicionado na estufa bacteriológica durante 24 horas. Para os exames enzimático que consistir em 3 etapas: a catalase que diferenciam os Streptococcus dos Staphylococcus, coagulase que diferenciam os tipos de estafilococus e oxidase Ajuda a distinguir não fermentadores (oxidase positiva) de enterobactérias (oxidase negativa) (CARTER 1988; SEARS et al. 1993). As amostras estiveram também submetidas aos esfregaços corados por método de gram para identificar os cocos dos bacilos, e os que deram cocos positivos foi feito o teste em ágar manitol que é meio de cultura seletiva para isolamento d Staphlylococcus. O teste de sensibilidade foi feito de acordo com o método descrito

4

Relatório Final – PIBIC 13/14

por Kirby e Bauer (1966) utilizando os seguintes antimicrobianos: penicilina G (PEN), ampicilina (AMP), cefalexina (CFX), enrofloxacina (ENO), estreptomicina (EST), gentamicina (GEN), neomicina (NEO), sulfonamida (SUL) e tetraciclina (TET).

5

Relatório Final – PIBIC 13/14

4. RESULTADOS Foram coletadas no total de 312 amostras de quartos mamários de vacas com mastite sub-clínica, sendo que 179 (57,37%) amostras resultaram em crescimento microbiano e 133 (42,6%) não. Das amostras com crescimento foram isoladas 237 bactérias identificadas em 7 grupos (Tabela 1). . Tabela 1. Agentes etiológicos da mastite sub-clínica isoladas e identificadas. Bactérias Staphylococcus intermedius Staphylococcus aureus Micrococcus sp Escherichia coli Bacillus sp. Streptococcus sp. Klebsiella pneumoniae Total

n 83 52 30 29 27 11 5 237

(%) 35,02 21,94 12,66 12,24 11,39 4,64 2,11 100

4.1. RESISTÊNCIA BACTERIANA A cada coleta mensal se observava que os microrganismos tornaram-se cada vez mais resistentes pelo uso contínuo de antimicrobianos para o tratamento das vacas com alto índice de células somáticas no leite (Costa et al. 1979). Das 237 (100%) bactérias encontradas nas 179 (57,37%) amostras com crescimento em ágar sangue a 5%. O aumento de bactérias resistentes fica demonstrado na Figura 1.

6

Relatório Final – PIBIC 13/14

Figura 1. Porcentagem de resistência microbiana frente a 9 antibiogramas apresentados pelos agentes etiológicos isolados de casos de mastite subclínica 100% 90% 80% 70% 60% 50%

40% 30% 20% 10%

0%

Staphylococcu Staphylococcu s aureus s intermedius

Micrococcus

Escherichia coli

Streptococcus sp.

Klebsiella pneumoniae

Bacillus sp.

PEN*

25%

34%

17%

34%

9,10%

0%

71%

AMP*

21%

28%

30%

14%

9,10%

0%

28%

CFX*

9,60%

14%

23%

14%

18%

0%

57%

ENO*

0%

1,10%

3,30%

0%

18%

0%

0%

EST*

23%

31%

20%

24%

27%

0%

57%

GEN*

5,80%

2,20%

3,30%

7%

18%

0%

14%

NEO*

5,80%

6,70%

3,30%

10%

27%

0%

28%

SUL*

9,60%

4%

3,30%

7%

18%

0%

28%

TET*

9,60%

17%

23%

7%

18%

0%

28%

*Abreviaturas: PEN (Penicilina G), AMP (Ampicilina), CFX (Cefalexina), ENO (Enrofloxacina), EST (Estreptomicina), GEN (Gentamicina), NEO (Neomicina), SUL (Sulfonamida), TET (Tetraciclina).

7

Relatório Final – PIBIC 13/14

5. DISCUSSÃO O resultado do exame laboratorial de microbiologia foi observado que das 312 amostras proveniente de 77 animais, 57,37% (n = 179) apresentaram crescimento bacteriano. Freitas et al. (2005) observou em seu estudo uma frequência de 59,3% de amostras positivas ao exame microbiológico. Em outro estudo realizado por Oliveira et al. (2009) em rebanho leiteiros, foi observado frequência de 60,8% de amostras positivas. Andrade et al. (2009) observaram o crescimento de microrganismos em 90,1% provenientes da região de Curitiba. A frequência mais aproximada do presente estudo foi a de Freitas et al. (2005) e Oliveira et al. (2009), a pesquisa de Andrade et al. (2009) apesar de se tratar da mesma região os resultados foram diferentes ao obtidos neste estudo, essa diferença pode se dever a deficiências no manejo sanitário e a falhas na prática dos métodos de controle da mastite. Os patógenos do gênero Staphylococcus, foram o grupo dominante de bactérias isoladas neste estudo com 56,96%. Tais resultados são similares com estudos de PITKALA et al. (2004) e TENHAGEN et al. (2006). Em relação a prevalência de espécies, o Staphylococcus aureus apresentou 21,94% que são similares com os estudos de PITKALA et al. (2004) e o Staphylococcus intermedius com 35,02% no total de agentes isolados, no entanto esse patógeno não é comum em bovinos e com um percentual mais elevado que os patógenos comumente encontrados na mastite bovina. Isso poderia demostrar uma possível contaminação humana. Em relação á susceptibilidade bacteriana, as espécies Staphylococcus aureus com resistência principalmente a penicilina G (25%) e ampicilina (21%). Os percentuais em rebanhos de São Paulo relatados por Langoni et al. (1991) foram 23,1% para ampicilina e 13,7% para penicilina G; o Staphylococcus intermedius sp. mostrou 34% resistente para ampicilina e 28% para penicilina G. O Streptococcus sp mostrou 27% resistente à neomicina e estreptomicina. Esses patógenos são importantes na epidemiologia da mastite, pois podem causar tanto mastite ambiental, quanto mastite contagiosa. 8

Relatório Final – PIBIC 13/14

O Bacillus sp., embora não seja um agente comumente causador de mastite bovina, ele apresentou 71% de susceptibilidade à ampicilina, 57% para cefalexina e 57% para estreptomicina, e enquanto a Escherichia coli é o agente mais recorrente nos casos de mastite, mostrou 34% resistência para penicilina G e 24% para estreptomicina. O Micrococcus mostrou 30% resistente à ampicilina, 23% para tetraciclina, 23% para cefalexina e 20% para estreptomicina. Com a presença desses patógenos multirresistentes é indicativo de falha no manejo pós-ordenha, onde os animais têm contato com o solo contaminado de dejetos. O Bacillus sp é obiquitário do solo e a E. coli das fezes. A presença da bactéria Klebsiella pneumoniae é indicativo de acúmulo de material orgânico no meio ambiente entre as ordenhas, nas instalações da sala de ordenha e contaminação fecal, apesar de ser um patógeno grave, nos testes de susceptibilidade apresentou 100% sensível aos antibióticos.

9

Relatório Final – PIBIC 13/14

6. CONCLUSÃO Os microrganismos mais frequentes isolados de amostras de leite no rebanho estudado foram o Staphylococcus intermedius e Staphylococcus aureus. Os testes de susceptibilidade

realizados

para

as

espécies

Micrococcus,

Staphylococcus

intermedius e Staphylococcus aureus, Streptococcus sp., Escherichia coli, Bacillus sp. apresentaram maior resistência a ampicilina, penicilina G., cefalexina estreptomicina e a espécie Klebsiella pneuminiae não houve resistência a nenhum antibiótico testado. A principal preocupação da multirresistência dessas bactérias isoladas é que chegará a um ponto em que tratamento da mastite infecciosa não será mais eficaz, prejudicando assim a produção leiteira e a própria sanidade animal. Sendo assim a doença irá se perpetuar sem os métodos de cura eficazes. O alto nível de resistência múltipla apresenta um risco potencial para saúde pública e pode dificultar o tratamento de doenças infecciosas. A persistência da mastite nos rebanhos leiteiros pode ser atribuída pelos seguintes pontos: as práticas de manejo sanitário deficientes, rotinas de ordenha inadequadas, falha na prática dos métodos de controle da mastite. Todos esses pontos são facilmente incrementados quando se tem a devida atenção ao treinamento e capacitação da mão-de-obra de forma permanente, com isso teremos procedimentos adequadas de ordenha e um programa de prevenção da mastite eficientes.

10

Relatório Final – PIBIC 13/14

REFERÊNCIAS PRATA, Luis Francisco. Fundamentos de ciência do leite. Edição Única. Jaboticabal Editora Funep, 2001. 95,127 p. PHILPOT, W. Nelson; NICKERSON, Stephen C. Vencendo a Luta Contra a Mastite. Edição Única. Editora Milkbizz, 2002. 02,42 p. QUINN, P. J. et al. Microbiologia veterinária e doenças infecciosas. Edição Única. Porto Alegre: Artmed, 2005. 55,115 p. KONEMAM, Elmer W. Color atlas and texbook of diagnostic microbiology. Quinta Ediçao. Editora Lippincott, 1997. 582, 747 p. WINN, Washington Jr. Koneman diagnostico microbiológico: texto e atlas colorido. Sexta Ediçao. Guanabara Koogan, 2008. SUSSMAN, M. Escherichia coli: Mechanisms of virulence. Cambridge University Press, UK, 1997. 639p. CARTER, G. R. Fundamentos de bacteriologia e micologia veterinária. São Paulo: Roca, 1988. BRITO, Maria Aparecida; BRITO, José Renaldi; ARCURI, Edna; LANGE, Carla; SILVA, Márcio; SOUZA, Guilherme. Agência de Informação Embrapa. Mastite, Brasília, 2013. Disponível em: < http://www.agencia.cnptia.embrapa.br/Agencia8/AG01/arvore/AG01_202_21720039 247.html >. Acesso em: 29 jan. 2013. LIBERA, Alice Maria Paiva. Avalição de indicadores inflamatórios no diagnóstico da mastite bovina. 2009; 726-731 p. FERREIRA, Luciano Menezes. Variabilidade fenotípica e genotípica de estirpes de Staphilococus aureus isoladas em casos de mastite subclínica bovina. 2006; volume: 36, 1228-1234 p. PITKALA, A.; HAVERI, M.; PYORALA, S.; MYLLYS, V.; HONKANEN-BUZALKI, T. Bovine mastitis in Finland 2001 – prevalence, distribution of bactéria, and antimicrobial resistance. Jornal of Dairy Science, Volume: 87, n: 8, 2433-2441, 2004. BUENO, Válter Ferreira F. Mastite bovina clínica e subclínica, na região de Pirassununga, SP: Frequências e redução na produção. 2002; volume: 3, 47-52 p. MOTA, Rinaldo Aparecido. Utilização indiscriminada de antimicrobianos e sua contribuição a multirresistência bacteriana. 2005; volume: 42, 465-470 p. ANDRADE, Maria Auxiliadora. Prevalência e etiologia de mastite bovina subclínica em propriedade do estado de Goiás que utilizam ordenha na obtenção de leite. 1998; Volume 28, 29-42 p.

11

Relatório Final – PIBIC 13/14

ANDRADE, U. V. C.; HARTMANN, W.; MASSON, M. L. Isolamento microbiológico, contagem de células somáticas e contagem bacteriana total em amostras de leite. Ars Veterinária, Volume: 25, n: 3, 129-135 p., 2009. FREITAS, M. F.; L., PINHEIRO JUNIOR, J. W.; STAMFORD, T. L. M.; RABELO, S. S. A.; SILVA, D. R.; SILVEIRA FILHO, V. M.; SANTOS, F. G. B.; MOTA, R. A. Perfil de sensibilidade antimicrobiana in vitro de Staphylococcus coagulase positivos de leite de vacas com mastite no agreste Do Estado de Pernambuco. Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, Volume: 72, n: 2, 171-177 p., 2005. OLIVEIRA, A. A.; MELO, C. B.; AZEVEDO, H. C. Diagnóstico e determinação microbiológica da mastite em rebanhos bovinos leiteiros no Tabuleiros Costeiros de Sergipe. Ciência Animal Brasileiro, Volume: 10, n: 1, 226-230 p., 2009 MENDONÇA, Elaine C. L. Caracterização fenogenotípica da resistência antimicrobiana em Staphylococcus spp. Isolados de mastite bovina. 2012; Volume 32, 859-864 p. BARBALHO, T. C. F. Isolamento de agentes bacterianos envolvidos em mastite subclínica bovina no Estado de Pernambuco. 2001; Volume: 2, 31-36 p. TEUBER, Michael. Veterinary use and antibiotic resistance. 2001; Volume: 4, 493-499 p. TENHAGEN, B. A.; KOSTER, G.; WALLMANN, J.; HEUWIESER, W. Prevalence of mastites pathogens andtheis resistance against antimicrobial agentes in dairy cows in Bradenburg, Germany. Journal of Dairy Science, Volume: 89, n: 7, 2542-2551 p., 2006. LANGONI, H.; PINTO, M. P.; DOMINGUES, P. F.; LISTONI, F. J. P. Etiologia e susceptibilidades da mastite bovina subclínica. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. Volume: 43, 507-515 p., 1991.

12