Cinética de la bacteria corynebacterium glutamico para producir lisina

Universidad De Guadalajara Centro Universitario De Ciencias Exactas e Ingenierías Licenciatura en Ingeniería en Alimentos y Biotecnología

Comparación de la cinética de producción de lisina en Corynebacterium glutamicum utilizando un riboswitch

José Gabriel Cárdenas Dávalos

(209678735)

Asesor: Escobar Hernández Daniel

Módulo M3: Cinética Química Y Química Coloidal Ciclo 2016-A

Tabla de contenido 1

Introducción ....................................................................................................... 3

2

Desarrollo .......................................................................................................... 3 2.1

¿Qué es la lisina? ....................................................................................... 3

2.2

Alimentos funcionales. ................................................................................ 4

2.2.1

¿Por qué consumir alimentos funcionales? .......................................... 5

2.3.

¿Maneras de producir lisina? ..................................................................... 6

2.4

Microorganismos auxótrofos. ...................................................................... 6

2.5

Corynebacterium glutamicum. .................................................................... 7

2.5.1

Medio y condiciones de crecimiento de C. glutamicum. ....................... 8

2.5.2.

Ruta biosintética de lisina en Corynebacterium glutamicum ............... 9

2.6.

Técnicas empleadas para mejorar la sobreproducción de lisina en C.

glutamicum. ....................................................................................................... 11 2.6.1

Riboswitches. ..................................................................................... 11

2.6.2 Comparación de la producción de lisina en de C. glutamicum utilizando el riboswitch de Bang Zhou y An-Ping Zeng .................................................. 13 2.6.3 Formulas cinéticas para el crecimiento de Corynebacterium glutamicum. ....................................................................................................................... 14 3

Conclusiones ................................................................................................... 14

4

Bibliografía ...................................................................................................... 15

1

INTRODUCCIÓN

Para el correcto funcionamiento del cuerpo humano es necesario ingerir una cantidad relativamente elevada de aminoácidos, por lo general los consumimos en concentraciones adecuadas pero en otras ocasiones no y en ese momento tenemos un problema. Además muchos aminoácidos cumplen funciones “extra” en el organismo, un claro ejemplo de estas funciones especiales es el aumento en la cantidad de anticuerpos que se encuentran presenten en el organismos, esta función es realizada por el aminoácido lisina. En la industria ganadera se utiliza la lisina para aumentar la calidad de los piensos animales, por tal motivo la lisina es el segundo aminoácido mayormente producido a nivel mundial. Ya que la demanda de lisina es alta es necesario buscar nuevas maneras de producirla o de aumentar la producción con los métodos actuales. En este trabajo se muestra el uso de un riboswitch el cual permite aumentar la concentración de lisina obtenida en la fermentación realizada por Corynebacterium glutamicum. Incluido en este trabajo se presentan dos fórmulas cinéticas, las cuales se emplearon para poder medir el crecimiento bacteriano y el consumo de glucosa en el transcurso de la fermentación. 2 2.1

DESARROLLO ¿Qué es la lisina?

La lisina es un aminoácido esencial que tiene un papel importante en la síntesis de proteínas y que además cuenta con la propiedad de estimular la producción de anticuerpos tanto en animales como en seres humanos. (Gil Hernández 2010). Es el principal aditivo en piensos animales ya que no se encuentra en las cantidades adecuadas en los granos de cereal. Al año se producen alrededor de treinta mil toneladas de este aminoácido únicamente en Japón.

En el organismo humano, la lisina es utilizada como precursor en la síntesis de otras moléculas, como es el caso de L-cartinina, la cual es fundamental en la oxidación de ácidos grasos y por lo tanto en el metabolismo energético (Gil Hernández 2010). Debido a las funciones benéficas de la lisina dentro del cuerpo humano, es tentador aumentar la ingesta diaria de esta en la población. Esto se puede lograr adicionando la molécula de lisina a un alimento, a este tipo de alimentos se les conoce como “alimentos funcionales”. 2.2

Alimentos funcionales.

En el sentido más básico, todos los alimentos son funcionales, ya que todos generan alguna función en el cuerpo, ya sea que proporcionen energía, nutrientes, micronutrientes, agua o fibra. Sin embargo, se denominan “alimentos funcionales” a todos aquellos que tienen características que los hacen especialmente potentes en la promoción del mantenimiento de una vida saludable. Dichos alimentos se caracterizan por la adición o mejora de un ingrediente biológicamente activo para promover la salud y a menudo, parecen oscilar entre la comida y la medicina (Spackman, 2014). El origen del término alimento funcional se remonta a Japón, a mediados de la década de los 80’s como parte de un proyecto de investigación patrocinado por el estado que pretendía analizar, caracterizar y mejorar las propiedades nutritivas de los alimentos, de aquí surge este concepto que hace referencia a todos aquellos alimentos que tienen como objetivo hacer frente a algunos problemas de salud (Spackman, 2014). Desde ese entonces, los alimentos funcionales han venido ganando terreno debido a que además de su contenido nutritivo básico aportan beneficios a otras funciones fisiológicas (de Alba Monroy, et al., 2014), con lo cual el consumidor se ve bastante beneficiado. La tabla 1 muestra los ingredientes que tradicionalmente son adicionados a los alimentos funcionales y cuál es la labor que desarrollan en el organismo humano.

Tabla 1. Ingredientes adicionados a los alimentos funcionales y su labor en el organismo. Ingrediente

Labor en el organismo

Vitaminas y minerales

Asegurar una dieta adecuada.

Nutrientes

específicos

o Mejorar

la

salud

ósea,

prevenir

antioxidantes

enfermedades en recién nacidos.

Ácidos omega-3

Protección contra varias enfermedades

Remplazo de azúcares

Bajo aporte calórico.

Remplazo de grasas

Bajo aporte calórico y lipídico.

Esteroles vegetales

Inhibición de la absorción y del colesterol y reducción de este en sangre.

Fito-estrógenos

Imitación de hormonas femeninas.

Probióticos

Mejoramiento del equilibrio microbiano del organismo

Prebióticos

Estimulación del crecimiento de bacterias saludables en el organismo.

2.2.1

¿Por qué consumir alimentos funcionales?

Existen varias razones por las que las personas comienzan a consumir alimentos funcionales o complementos nutricionales, entre las más importantes se encuentran: (1)

para compensar dietas inadecuadas o potencialmente

inadecuadas, (2) para compensar incrementos conocidos en la necesidad de un nutriente o aprovechamiento inadecuado del mismo, (3) para tratar o prevenir enfermedades no relacionadas con carencias y (4) para mejorar el rendimiento deportivo (Webb, 2007). Un alimento funcional adicionado con lisina se podría consumir por dos razones, la primera de ellas es para mejorar el estado de salud, ya sea de manera rápida y observable o como una prevención a largo plazo. La segunda razón se debe a que todos los aminoácidos tienen la propiedad de mejorar la asimilación de otros

nutrientes. Con esto se consigue un alimento funcional con mucho campo de acción y dirigido a un gran número de personas. 2.3.

¿Maneras de producir lisina?

La lisina puede ser producida de dos maneras: químicamente y por medio de una fermentación, siendo esta última la manera más eficiente de producirla. La producción anual de lisina es de aproximadamente 70,000 toneladas, de las cuales el 80% es por medio de una fermentación. La lisina forma parte de la familia de los aminoácidos sintetizados a partir del aspartato e industrialmente se utilizan microorganismos como: Corynebacterium spp. o Brevibacterium spp. Para lograr producir este aminoácido con un buen rendimiento se deben de utilizan cepas auxótrofas. 2.4

Microorganismos auxótrofos.

Los microrganismos auxótrofos son aquellos que, a causa de una mutación, carecen de alguna enzima en una ruta biosintética, por lo que son incapaces de sintetizar uno o varios metabolitos requeridos para su crecimiento. Debido a esto, dichos metabolitos deben de ser agregados al medio para su crecimiento (Madigan, Martinko y Parker, 2010). Un auxótrofo que requiere treonina y metionina para su crecimiento fue seleccionado para producir lisina ya que carece de la enzima homoserina deshidrogenasa en el punto de ramificación aspartato semialdehido (Ilustración 2) (Mosier y Ladisch 2009). Gracias a la carencia de homoserina deshidrogenasa los intermedios metabólicos se desvían completamente hacia la vía de la lisina, lo que genera una sobreproducción de esta.

Ilustración 1. Ruta biosintética de lisina en Corynebacterium glutamicum carente de la enzima Homoserina deshidrogenasa (Nathan S. Mosier, M. R. L., 2009)

2.5

Corynebacterium glutamicum.

Corynebacterium glutamicum es una bacteria Gram positiva que puede ser aislada del suelo y pertenece a los actinomicetos, una subdivisión de las bacterias Gram positivas. En la ilustración 3 se puede apreciar a este microorganismo.

Ilustración 2. Micrografía electrónica de Corynebacterium glutamicum mostrando la típica forma en V de dos células, que se origina como consecuencia de la división celular (Ratledge, 2006).

Esta bacteria fue identificada por los Doctores S. Udaka y S. Kinoshita en Kyowa Hakko Kogyo, en 1957. Ellos buscaban microorganismos capaces de excretar aminoácidos y descubrieron que su aislado número 534, en un medio con sales minerales era capaz de excretar L-glutamato, un aminoácido estrechamente relacionado con la L-lisina (Ratledge, 2006). También se percataron que tenían que agregar metionina al medio para lograr producir una cantidad considerable de aminoácidos, lo cual, les hizo sospechar que se trataba de una cepa auxótrofa, un poco más adelante confirmaron esta suposición. 2.5.1 2.5.1.1.

Medio y condiciones de crecimiento de C. glutamicum. Sustratos requeridos

Para el crecimiento de C. glutamicum se requiere de una buena fuente de carbono, usualmente se emplean melazas negras e hidrolizados de haría de soja, se han patentado cepas que acumulan L-lisina a partir de n-parafinas, ácidos alifáticos y alcoholes. La fermentación es aeróbica por lo que se debe de realizar en tanques agitados aireados. Se utiliza amonio para mantener un pH cercano a la neutralidad, y la temperatura se controla a los 28°C. se utiliza un inóculo bastante pequeño. El proceso en lotes (mejor conocido como batch) ha tenido mucho más éxito que el proceso continuo.

La fermentación dura aproximadamente 60 horas y produce de 40-45 gramos de lisina por cada litro de solución. 2.5.2.

Ruta biosintética de lisina en Corynebacterium glutamicum

La L-lisina es sintetizada a través de una larga vía biosintética, por lo que la primer enzima es fuertemente controlada (aspartatoquinasa). Esta enzima se inactiva por retro-inhibición cuando en el medio hay una gran cantidad de L-lisina y L-treonina. Corynebacterium glutámico tiene una peculiaridad en comparación con otros microorganismos, esta bacteria solamente contiene una única forma de aspatoquinasa a diferencia de otros microorganismos como E.coli o Salmoenlla typhimurium que contienen tres formas de aspartoquinasa, cada una de ellas inhibida por un producto final diferente. Otra característica notable de Corynebacterium glutámico es que posee una vía biosintética dividida para la síntesis de lisina. A nivel de la piperidina-2,6dicarboxilato el flujo se bifurca a través de la variante de la succinilasa para la síntesis de D,L-diaminopimelato o por la variante de la deshidrogenasa (Ilustración 4) (Ratledge y Kristiansen, 2006).

Ilustración 3. Ruta biosintética de lisina en C. glutamicum (E. M. T. El-Mansi, C. F. A. B., & Arnold L. Demain, A. R. A., 2012)

El uso de una u otra vía depende de la cantidad de amonio que hay en el medio, a concentraciones bajas de amonio la enzima deshidrogenasa no puede contribuir a la formación de lisina, debido a que tiene una débil afinidad con el amonio, en cambio la baja concentración de amonio favorece el flujo a través de la variante de la succinilasa. Al inicio de la fermentación tres cuartas partes de lisina se producen a través de la variante de la deshidrogenasa, en cambio al final de la fermentación la lisina es sintetizada exclusivamente por la vía de la succinilasa como se puede apreciar en la ilustración 5.

Ilustración 4. Grafica que muestra el uso de las diferentes variantes de la ruta biosintética de lisina en C. glutamicum. Al inicio de la fermentación de L-lisina prevalece el uso de la variante de la deshidrogenasa, mientras que al final se utiliza exclusivamente la variante de la succinilasa. La escala va de 0 a 100%. (Ratled y Kristiansen, 2006).

La excreción de lisina en C. glutamicum es por medio de un transporte activo lo cual propicia una elevada concentración en el medio externo. El catión lisina es excretada gracias al gradiente de potencial en la membrana. El sistema depende únicamente de la fuerza de atracción y no del ATP. 2.6.

Técnicas empleadas para mejorar la sobreproducción de lisina en C.

glutamicum. 2.6.1

Riboswitches.

Recientemente se han identificado nuevos mecanismos regulatorios de la expresión genética en los que algunos mRNAs interactúan de manera altamente específica y con gran afinidad con moléculas como tRNAs y metabolitos como aminoácidos, nucleobases y vitaminas. La unión de las moléculas efectoras provoca un cambio estructural del mRNA que afecta la expresión de los genes en él incluídos, lo cual puede observarse a diferentes niveles, como son la transcripción, el inicio de la traducción o el procesamiento de los mRNAs. A estos elementos regulatorios se les ha denominado riboswitches (Miranda Rios, Smith A., Grundy, Soberon, Henkin Y Ontiveros-Palacios,

Actualmente Li-Bang Zhou y An-Ping Zeng del instituo de ingeniería en bioprocesos y biosistemas de la Universidad Tecnológica de Hamburgo, Alemania están trabajando en el desarrollo de un riboswitch que permite controlar la síntesis de metabolitos competitivos de lisina pero que a la vez son esenciales para el crecimiento de la célula, como lo explican en su artículo denominado “Exploring Lysine Riboswitch for Metabolic Flux Control and Improvement of L‑ Lysine Synthesis in Corynebacterium glutamicum”. Se trata de un mecanismo que se activa con la concentración de treonina y metionina en el medio interno de la célula. A bajas concentraciones de estos metabolitos se desactiva permitiendo así que la célula pueda sintetizarlos y con ellos mejorar su crecimiento. Cuando la concentración de treonina y metionina aumenta lo suficiente el riboswitch se activa desviando todo el flujo de la ruta hacia la biosíntesis de lisina permitiendo una sobreproducción de lisina en óptimas condiciones, la ilustración 5 presenta un esquema simple de este proceso. Gracias a la implementación de este riboswitch es posible un crecimiento celular óptimo y al mismo tiempo sobre producir lisina evitando la retro-inhibición. Actualmente esta técnica aún se encuentra en fase de desarrollo pero los avances y los resultados obtenidos son muy favorables.

Ilustración 5. Esquema básico del funcionamiento del Riboswitch empleado por LiBang Zhou y An-Ping Zeng

2.6.2

Comparación de la producción de lisina en de C. glutamicum utilizando el

riboswitch de Bang Zhou y An-Ping Zeng Se realizaron 2 modificaciones a una cepa de C. glutamicum, a una de ellas se le agregó un riboswitch de lisina proveniente de E. Coli, a esta cepa se le denominó por el código LPECRS y a la segunda cepa se le adicionó un riboswitch de Bacillus subtilis a la cual se le denominó LPBSRS, se utilizó una cepa sin modificaciones para poder comparar el beneficio que otorga el uso de los distintos riboswitches. En la ilustración 6 se pueden observar 3 graficas, en la superior se grafica el crecimiento bacteriano contra el tiempo, en la de en medio se grafica el consumo de glucosa contra el tiempo y en la inferior se grafica la concentración de lisina obtenida contra el tiempo.

Ilustración 6. Comparación de 3 cepas de C. glutamicum.

Se aprecia un aumento de 2 gramos por litro en la cepa modificada con el riboswitch proveniente de E. Coli en comparación a la cepa sin riboswitch y un aumento de 1 gramo por litro en comparación con la cepa modificada con el riboswitch proveniente de Bacillus subtilis.

En la tabla 2 se aprecian los valores específicos de estas tres cepas Tabla 2. Producción de lisina en las tres distintas cepas.

En la fermentación realizada por la cepa LPECRS se aprecia una reducción en la concentración final de biomasa pero un aumento considerable en el rendimiento de lisina por lo tanto el riboswitch proveniente de E. Coli tiene mejores resultados. 2.6.3

Formulas cinéticas para el crecimiento de Corynebacterium glutamicum.

En base a los valores obtenidos se pudo identificar las siguientes fórmulas para la cepa sin modificaciones Crecimiento celular:

𝑑𝑋 𝑑𝑡

= 𝜇. 𝑋

Donde X es la concentración de biomasa y 𝜇 es el tiempo de generación celular. En este caso el tiempo de generación para la cepa sin modificaciones es de 𝜇 = 0,394ℎ−1 . 𝑑𝑆

Consumo de glucosa: − 𝑑𝑡 = 𝑄𝑠 3

CONCLUSIONES

En base a los datos obtenidos de la concentración obtenida de lisina es posible determinar que el riboswitch proveniente de E. Coli es el que mejores resultados arroja, por tal motivo la producción a nivel industrial de lisina en C. glutamicum puede ser incrementada empleando este riboswitch.

4

BIBLIOGRAFÍA

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ACS

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