Classificação de Vinhos por Análise Multivariada das Concentrações dos Elementos Químicos Obtidas por ICP-MS

Classificação de Vinhos por Análise Multivariada das Concentrações dos Elementos Químicos Obtidas por ICP-MS

Cidália Silva Universidade de Aveiro

Trabalho de fim de Curso orientado por: Armando Duarte, Departamento de Química António Batel Anjo, Departamento de Matemática Universidade de Aveiro

Universidade de Aveiro, 20 Julho de 2007

Índice RESUMO

4

INTRODUÇÃO

5

O VINHO E A VITIVINICULTURA

5

MÉTODOS ANALÍTICOS USADOS NA ANÁLISE ELEMENTAR DO VINHO

6

BREVE DESCRIÇÃO DO ESPECTRÓMETRO DE MASSA COM FONTE INDUTIVA DE PLASMA (ICP-MS)

8

 CONSTITUIÇÃO E FUNCIONAMENTO

8

 INTERFERÊNCIAS

10

 CALIBRAÇÃO

11

 ESTUDOS ANTERIORES DE CLASSIFICAÇÃO DE VINHOS COM BASE NO ICP-MS

12

ANÁLISE MULTIVARIADA DOS DADOS

12

 ANÁLISE DE CLUSTERS

12

 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS

13

 ANÁLISE DE CORRESPONDÊNCIAS

13

 ANÁLISE DISCRIMINANTE

13

IDENTIFICAÇÃO DO OBJECTIVO DO TRABALHO

14

MATERIAIS E MÉTODO

15

AMOSTRAS DE VINHO

15

MATERIAL E REAGENTES

15

CONDIÇÕES DE OPERAÇÃO DO ICP-MS

16

PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO DO MÉTODO

17

TRATAMENTO DOS DADOS

18

RESULTADOS E DISCUSSÃO

19

VALIDAÇÃO DO MÉTODO

19

ANÁLISE MULTIVARIADA

21

 ANÁLISE DE CLUSTERS

21

Página 2

 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS

22

 ANÁLISE DE CORRESPONDÊNCIAS

25

 ANÁLISE DISCRIMINANTE

26

CONCLUSÕES

27

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

28

REFERÊNCIAS ELECTRÓNICAS

29

FONTES DE FIGURAS E TABELAS

30

ANEXOS

I

ANEXO I - INTERFEREÊNCIAS E FORMULAS DE CORRECÇÃO MAIS COMUNS EM ICP-MS

II

ANEXO II - CONCENTRAÇÃO RIGOROSA DOS PADRÕES

IV

ANEXO III - CONCENTRAÇÃO DOS ELEMENTOS NOS VINHOS E RESPECTIVO LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO

V

ANEXO IV - PERCENTAGEM DE ERRO NAS DILUIÇÕES

VI

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Resumo A origem dos vinhos pode ser conhecida recorrendo a técnicas analíticas para a determinação da concentração de elementos químicos. Neste trabalho foram analisados 42 elementos (Li, Be, B, Mg, Al, K, Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Mo, Ru, Rh, Cd, Sn, Te, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, W, Tl, Pb, Th e U) de 18 vinhos portugueses oriundos das cincos regiões DOC com maior quota de mercado (Alentejo, Bairrada, Dão, Douro e Verde) com espectrómetro de massa com fonte indutiva de plasma (ICP-MS). O método foi validado com recurso a adição de padrão (spikes), diluições e material de referência. Pela análise multivariada dos resultados verifica-se, de um modo geral, a formação de dois grandes grupos: Alentejo, Dão e Douro vs Bairrada e Verde. O primeiro grupo está fortemente associado ao teor em K enquanto os vinhos Verdes, que são tradicionalmente ácidos, estão associados principalmente ao Pb. Por sua vez os vinhos da Bairrada aproximamse destes pela presença da casta baga, que lhes confere acidez, e pelo teor em Fe. Verifica-se que 100% dos vinhos foram classificados correctamente de acordo com a sua origem geográfica.

Página 4

Introdução O vinho e a vitivinicultura O local onde o homem bebeu o primeiro trago de vinho continua uma incerteza. As antigas civilizações elegem os deuses como os dadores do vinho, Osíris no Egipto, Dionísio na Grécia, e Baco em Roma. Outros partilham da opinião de que o vinho nasceu no Oriente (MARTINS, 2004; [1]). Relativamente a Portugal, não se sabe precisar quando é que o vinho surgiu, mas pensa-se que as primeiras vinhas tenham sido cultivadas pelos Fenícios. O nosso solo e clima, assim como as diferentes castas de cada região permitiram, desde há muito tempo, a produção de vinhos de alta qualidade e tipicidade. Por este motivo, Portugal foi um dos primeiros, se não mesmo o primeiro país do mundo a estabelecer e a regulamentar uma região demarcada, a do Douro, em 1756 (MARTINS, 2004; [1]). Em Portugal, as vinhas estendem-se por todo o território nacional incluindo os arquipélagos, ocupando cerca de 400 mil hectares, produzindo anualmente, em média, cerca de 10 milhões de hectolitros de vinho, o que nos coloca no 6º lugar mundial em área de vinha e no 7º lugar em quantidade de vinho produzido. Tendo neste momento doze principais regiões geograficamente delimitadas, designadas por regiões com Denominação de Origem Controlada (DOC): Açores, Algarve, Alentejo, Bairrada, Dão, Beira Interior, Douro, Estremadura, Madeira, Minho, Ribatejo, Trás-os-Montes (MARTINS, 2004; [1]). Para beneficiar de uma Denominação de Origem Controlada, todo o processo de produção do vinho é sujeito a um controlo rigoroso em todas as suas fases, desde a vinha até ao consumidor, havendo um conjunto de regras consignadas em legislação própria, como por exemplo as características do solo, castas recomendadas e autorizadas, práticas de vinificação, teor alcoólico, tempo de estágio, etc. As Comissões Vitivinícolas Regionais procedem a esse controlo de forma a garantir a genuinidade e qualidade dentro das suas regiões demarcadas [2]. Com base num estudo solicitado pela Associação Nacional das Denominações de Origem Vitivinícolas (ANDOVI), pode-se concluir que o vinho Verde e o vinho do Alentejo foram os mais comercializados dentro do universo dos vinhos DOC, seguidos por Douro, Dão e Bairrada no período entre 2002 e 2004. Resultados mais detalhados deste estudo podem ser consultados na tabela 1 [3].

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Tabela 1- Evolução da comercialização de vinhos por região vitivinícola D.O.C

Ano 2002

Ano 2003

Ano 2004

Média (3 anos)

DOC Verde

32.3

33.6

35.7

33.9

DOC Douro

12.8

13.3

14.3

13.5

DOC Bairrada

4.0

2.9

2.6

3.2

DOC Dão

11.4

10.7

10.4

10.8

DOC Estremadura

-

0.8

0.9

0.9

DOC Ribatejo

-

1.1

1.1

1.1

DOC Palmela

-

1.9

1.6

1.8

DOC Alentejo

33.8

34.5

32.0

33.4

Outros

5.7

1.4

1.4

2.8

O vinho é uma das bebidas mais consumidas no mundo apresentando uma elevada importância social e comercial e a sua qualidade está intimamente relacionada com a sua origem. Assim torna-se importante, quer para o produtor quer para o consumidor, a determinação da sua origem geográfica e variedade das castas, para assegurar a qualidade e evitar fraudes (PYRZYNSKA, 2004). Historicamente a qualidade ou origem geográfica do vinho era determinada através da prova por especialistas. Actualmente, tem-se desenvolvido novas técnicas instrumentais para este objectivo. Esta análise é usualmente realizada com base na determinação dos metais no vinho, uma vez que estes estão directamente relacionados com as propriedades do solo. Para isso admite-se que o conteúdo metálico não é significativamente influenciado pelo método de produção, transporte e armazenamento (PYRZYNSKA, 2004). Por outro lado, a análise dos elementos do vinho é importante devido às suas propriedades fisiológicas e potencialmente tóxicas. A Organização Internacional da Vinha e Vinho estabeleceu, inclusivamente, limites máximos para Cu, Zn, As, Cd e Pb de 1, 5, 0.2, 0.01 e 0.20 mg.L-1, respectivamente (CATARINO et al, 2006).

Métodos analíticos usados na análise elementar do vinho Vários artigos referem um conjunto de métodos utilizados para a determinação de metais no vinho, entre eles, os métodos electroquímicos, métodos cromatográficos e electroforéticos e métodos baseados em espectroscopia de absorção atómica. No entanto a American Society of Enologists e o Office International de la Vigne et du Vin indicam como

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técnicas oficiais os métodos baseados em espectroscopia de absorção atómica, devido à sua selectividade, alta sensibilidade e capacidade de medição directa da amostra, exigindo uma preparação mínima da amostra (PYRZYNSKA, 2004; PÉREZ-JORDAN et al, 1998). Um destes métodos é a espectroscopia de absorção atómica de chama (FAAS), que permite a atomização eficiente de metais alcalinos, alcalino terrosos e alguns metais de transição como o Mn, Cu, Fe e Zn com a chama utilizada usualmente (ar/acetileno). A espectroscopia de absorção atómica electrotermal (ETAAS) é principalmente utilizada para a análise de metais em concentrações vestígiais, contudo apresenta problemas com matrizes complexas devido a interferências (PYRZYNSKA, 2004; PÉREZ-JORDAN et al, 1998). Outro método que pode ser aplicado para análise de alguns elementos, como por exemplo, As, Sb, Se, Pb, Sn e Bi é a espectrometria de absorção atómica de geração de hidretos. Esta técnica permite a separação dos analitos dos componentes não-voláteis da matriz, reduzindo as interferências (PYRZYNSKA, 2004). A análise multielementar possibilita a medição simultânea de vários elementos da amostra, reduzindo o tempo de análise, tornando-se por isso extremamente vantajosa para os laboratórios (PYRZYNSKA, 2004). Duas técnicas que se incluem neste grupo são o espectrómetro de emissão óptica com fonte indutiva de plasma (ICP-OES) e o espectrómetro de massa com fonte indutiva de plasma (ICP-MS). O ICP-OES é adequado para amostras altamente concentradas ou com concentrações variadas de analito. No entanto o seu limite de detecção para a maioria dos metais situa-se entre 1 e 10 µg.L-1, apresentando-se como uma desvantagem relativamente ao ICP-MS (PYRZYNSKA, 2004). O ICP-MS será apresentado em maior pormenor mais adiante. A análise de activação de neutrão (NAA) é uma técnica de análise multielementar que devido à sua alta sensibilidade, exactidão e fiabilidade é regularmente utilizada como método de referência quando novos métodos estão a ser desenvolvidos ou quando outros métodos fornecem resultados não concordantes. No entanto sofre de interferências severas causadas por produtos de maior activação (PÉREZ-JORDAN et al, 1998; [4]).

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Breve descrição do espectrómetro de massa com fonte indutiva de plasma (ICP-MS) 

Constituição e funcionamento

O ICP-MS consiste na conjugação do equipamento de ICP com um espectrómetro de massa e foi desenvolvido no final da década de 80, com o objectivo de conciliar a facilidade de

Esquema 1- Constituição do ICP-MS

introdução da amostra e a rapidez da análise fornecida pelo ICP com os baixos limites de detecção do espectrómetro de massa. O resultado é uma técnica, actualmente bastante utilizada em química analítica, de análise multi-elementar e extremamente sensível, sendo a sensibilidade para cada elemento uma função da sua primeira energia de ionização (BEAUCHEMIN, 2006; ISO 17294, 2004). A amostra é aspirada através da bomba peristáltica até ao nebulizador, onde é convertida num aerossol devido ao fluxo de gás. As gotas maiores do aerossol são drenadas para o esgoto na forma

líquida

novamente

através

da

bomba

peristáltica. O que resta do aerossol é transferido para o plasma através do tubo injector da torcha com o auxílio do gás do nebulizador (BEAUCHEMIN, 2006; ISO 17294, 2004).

No plasma (nuvem de gás árgon entre 6000K e 10000K), o solvente da amostra é evaporado e os compostos são decompostos em átomos (dissociação,

Figura 1 - Bomba peristáltica com três tubos, amostra, padrão interno e esgoto

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atomização e ionização). O gás utilizado é o árgon devido ao seu baixo custo e fácil manutenção e deve ter uma pureza superior a 99.995% (BEAUCHEMIN, 2006; ISO 17294, 2004).

Figura 2 - Plasma de árgon

Os iões são transferidos do plasma para o espectrómetro através da interface onde os iões entram num sistema de vácuo. A interface consiste em dois cones arrefecidos designados por sample cone e skimmer cone (BEAUCHEMIN, 2006; ISO 17294, 2004).

Figura 3 - Sample cone e Skimmer cone

No espectrómetro de massa, os iões são separados através de um analisador (quadrupolo), de acordo com a sua razão massa e carga (m/z).

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A concentração do analito é proporcional ao número de iões que chega ao detector. O factor de proporcionalidade é determinado pela análise de soluções de concentração conhecida (calibração). 

Interferências

As interferências, espectrais e não espectrais, são um problema nas medições por ICPMS. As interferências espectrais isobáricas são causadas por isótopos de outros elementos que tem a mesma razão massa/carga que o isótopo do analito (por exemplo,

58

Fe

(interferente) e 58Ni (analito)), conduzindo a uma sobreposição de massa, ocorrendo por isso a intensificação do sinal. Um caso semelhante passa-se com iões de dupla carga (por exemplo, Ba2+ interfere com o 65Cu, 66Zn, 67Zn e 68Zn). Este problema é especialmente acentuado devido à resolução unitária do quadrupolo. Assim é recomendado a determinação de diferentes isótopos para o mesmo elemento ou, caso não seja possível, aplicar uma correcção matemática (BEAUCHEMIN, 2006; ISO 17294, 2004). Nas interferências não isobáricas causadas por iões poliatómicos a sobreposição de massa resulta da presença de moléculas: 

Formadas a partir dos constituintes do gás do plasma, reagentes e matriz da amostra (por exemplo, 40Ar16O interfere com 56Fe),



Formadas na interface, especialmente nos cones,



Devido a dissociação incompleta de moléculas.

Estas interferências são especialmente preocupantes nos casos de As, Cr, Se e V. O nível de interferências causadas por iões poliatómicos são usualmente quantificadas recorrendo à razão de CeO+/Ce+ enquanto é aspirada uma solução de cério. Esta razão permite controlar a quantidade de óxidos e deve ser a mais baixa possível, preferencialmente abaixo de 0.5%. Para alguns instrumentos este valor pode situar-se entre 2 e 3% (BEAUCHEMIN, 2006; ISO 17294, 2004).

Existe um conjunto de possíveis estratégias para minimizar este tipo de interferências, como por exemplo: 

Redução da quantidade de agua no plasma, o que permite reduzir o nível de óxidos,



Diminuir, se possível, a concentração de cloretos na solução aspirada,



Adição de etanol ou álcoois similares para a redução da interferência do ArCl,

Página 10



Uso de uma célula de colisões,



Uso de ICP-MS de alta resolução (ISO 17294, 2004).

No anexo I apresenta-se as interferências isobáricas e não isobáricas mais frequentes e as fórmulas de correcção mais usuais. O outro tipo de interferências, as não espectrais, também designadas por efeitos da matriz inclui o bloqueio do nebulizador, da torcha e dos cones devido a altas concentrações de alguns elementos e solventes orgânicos. Assim deve-se evitar a análise de amostras com grande quantidade de solvente volátil, já que origina instabilidade do plasma devido à perda de energia, formação de espécies moleculares contendo carbono e depósito do carbono na torcha e nos cones (ISO 17294, 2004). O efeito da matriz pode ser atenuado preparando todas as soluções tendo a matriz da amostra como base, no entanto este procedimento pode tornar-se difícil devido à grande variedade e complexidade de algumas matrizes. Por outro lado pode-se recorrer ao uso de padrão interno, cuja função é compensar o efeito da matriz e assim corrigir as flutuações no sistema. O padrão interno deve ser cuidadosamente escolhido (ISO 17294, 2004). 

Calibração

Embora o instrumento ofereça outros modos de operação, os mais utilizados para a determinação de concentrações são os modos de calibração quantitativo e semiquantitativo. O modo quantitativo fornece resultados de alta qualidade, contudo requer a utilização de padrões de calibração externos para cada um dos elementos a determinar, tornando-se exigente a nível de tempo (cerca de 7 minutos por amostra) e de material. Por outro lado, o método semiquantitativo utiliza apenas alguns elementos distribuídos ao longo da gama de massas de interesse para efectuar a calibração. Sendo assim a calibração semiquantitativa é um método rápido (cerca de 2 minutos por amostra) para a determinação de um grande número de elementos na mesma amostra, mas fornece resultados menos precisos que o método quantitativo (ALMEIDA e tal, 2002; CATARINO et al, 2006; PÉREZ-JORDAN et al, 1998). A comparação entre estes dois métodos na análise de vinhos já foi realizada por vários autores, verificando-se que o método semiquantitativo fornece valores com erros inferiores a 20% para 81 elementos, o que o torna adequado para análises de rotina. Contudo para controlo legal a calibração quantitativa é mais adequada, porque é exigida grande exactidão. Assim, ambas as técnicas constituem alternativas valiosas, estando a sua escolha dependente do objectivo da análise (ALMEIDA e tal, 2002; CATARINO et al, 2006; PÉREZ-JORDAN et al, 1998).

Página 11



Estudos anteriores de classificação de vinhos com base no ICPMS

A bibliografia indica alguns exemplos de utilização de ICP-MS para determinação de elementos no vinho, tentando-se, em alguns casos, fazer a classificação dos vinhos de acordo com a sua origem geográfica. Thiel et al, 2004, analisou vinhos de quatro zonas da Alemanha recorrendo a diversos elementos. Através da análise estatística multivariada conseguiu classificar os vinhos de acordo com a sua origem com uma taxa de predição de 88,6%. A análise de 34 vinhos de três regiões sul-africanas foi reportada por Coetzee e Vanhaecke, 2005, recorrendo a rácios de isótopos de boro. Neste estudo concluiu-se que o rácio de isótopos 11

B/10B pode ser útil como complemento a outros métodos na autenticação do vinho. Por fim,

Sperková e Suchánek, 2005, utilizaram 27 parâmetros para diferenciar quatro regiões vinícolas da Boémia, tendo recorrido ao ICP-OES para análise dos elementos maioritários (Ca, Fe, K, Mg e Na). Após testarem diferentes conjuntos de parâmetros na análise discriminante alcançaram níveis de 97,4 e 100% de classificação correcta para vinhos brancos e tintos, respectivamente.

Análise multivariada dos dados 

Análise de clusters

A análise de grupos ou de “Clusters” consiste num processo não supervisionado que envolve a medição da distância entre objectos a serem agrupados. Assume-se que a distância entre os pontos (amostras ou variáveis) reflecte a similaridade das suas propriedades, portanto quanto mais próximos estiverem os pontos no espaço amostral, maior a sua similaridade (MARROCO, 2003). Existem várias maneiras de calcular esta distância, a mais utilizada é a distância euclidiana, pois corresponde ao sentido trivial de distância no plano. Num sistema de duas variáveis corresponde á aplicação do teorema de Pitágoras (h2=a2+b2). A distância euclidiana apresenta vários métodos hierárquicos: vizinho mais próximo, vizinho mais afastado, distância mediana, distância média, método centróide e

Figura 4 - Distância pelo Teorema de Pitágoras

método de Ward (MARROCO, 2003).

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Neste estudo utiliza-se o método de Ward porque é o usualmente utilizado por apresentar melhores resultados. 

Análise de componentes principais

A análise de componentes principais (PCA) é uma técnica de análise multivariada, exploratória e não supervisionada. O PCA permite reduzir a dimensão da matriz de dados, possibilitando resumir a informação de várias variáveis correlacionadas (e portanto de alguma forma redundantes) em uma ou mais combinações lineares independentes (componentes principais) que explicam o máximo possível de variância das variáveis originais (MARROCO, 2003; HARDLE, 2003). 

Análise de correspondências

A análise de correspondências é uma técnica de análise exploratória que se tornou popular por permitir a redução dimensional de uma matriz de dados positivos ou nulos, e obtenção de um mapa perceptivo. Para a representação gráfica pode-se considerar apenas uma dimensão ou expandir para o número máximo de dimensões (o máximo é o menor numero entre linhas e colunas menos um). Este método permite estudar associações (similaridade) entre: 

As categorias de linhas,



As categorias de colunas,



O conjunto de categorias de linhas e o conjunto de categorias de colunas.

De entre as técnicas composicionais, a análise de factores é a mais similar, mas a análise de correspondências estende-se além desta, apresentando como grande vantagem a capacidade de representar linhas e colunas num espaço conjunto (HAIR, 1998). 

Análise discriminante

A análise discriminante é uma técnica multivariada com supervisão que tem como finalidade: 

Identificar as variáveis com maior poder discriminante entre grupos diferentes e mutuamente exclusivos de indivíduos,



A utilização destas variáveis para criar uma função discriminante que represente de forma adequada as diferenças entre os grupos,



E a utilização desta função discriminante classificar a priori novos indivíduos nos grupos, fornecendo percentagens de capacidade de predição.

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A função discriminante é criada de modo a minimizar a variância intra-grupo e maximizar a variância inter-grupo, de forma a se obter melhores classificações (MARROCO, 2003).

Identificação do objectivo do trabalho O objectivo deste trabalho é classificar, de acordo com a origem geográfica, 18 amostras de vinhos provenientes das cincos regiões vinícolas portuguesas com maior quota de mercado de vinhos DOC em Portugal. Para o efeito, procedeu-se à análise de 42 elementos (Li, Be, B, Mg, Al, K, Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Mo, Ru, Rh, Cd, Sn, Te, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, W, Tl, Pb, Th e U) através de ICP-MS.

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Materiais e Método Amostras de vinho Foram analisados 18 vinhos portugueses brancos e tintos oriundos das cinco regiões com maior quota de mercado de vinhos DOC disponíveis no mercado: 

Alentejo,



Bairrada,



Dão,



Douro e



Vinho Verde

As amostras foram diluídas 10 vezes conforme recomenda a bibliografia. Nestas condições minimiza-se a ocorrência de interferências não espectrais causadas pela matriz orgânica do vinho, especialmente pelo etanol (CATARINO et al, 2006; COETZEE et al, 2005; PÉREZJORDAN et al, 1998; PYRZYNSKA, 2004; THIEL et al, 2004). A partir deste momento entende-se como

amostra o vinho diluído dez vezes.

Material e reagentes A partir de um padrão multielementar Merck contendo Li, B, Be, Mg, Al, K, Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Mo, Cd, Te, Ba, Tl, Pb e U com concentrações variadas. A esta solução foi adicionado W a partir do padrão monoelementar de forma a se obter uma concentração final de 1 mg.L-1. Os elementos K e Mg foram concentrados utilizando padrões monoelementares de 10 g.L-1. A partir desta solução foi preparada uma solução diluída 10 vezes em água ultra-pura acidificada a 2% HNO3 (padrão M1). Utilizou-se esta solução para se preparar soluções padrão com factores de diluição de 10, 100 e 1000 vezes, obtendo-se respectivamente os padrões M2, M3, M4. Por fim, tendo este último como base, foi preparado outro padrão dez vezes mais diluído (padrão M5). Em todas as soluções foi utilizada agua ultra-pura acidificada a 2% HNO3 de forma a prevenir o processo de fermentação, adsorção e absorção dos metais pelas paredes dos frascos. Nestas condições os iões metálicos são libertados dos ligandos presentes no vinho permitindo a atomização dos analitos a partir de iões livres (PYRZYNSKA, 2004). Uma solução padrão multielementar com concentração de 1000 µg.L-1 (padrão TR1) foi preparada com base em soluções padrão monoelementares de Ru, Rh, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu,

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Gd, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu e Th, em água ultra-pura acidificada a 2% HNO3. A partir desta foram realizadas diluições sucessivas com um factor de 10 vezes de forma a se obter soluções com concentrações de 100 µg.L-1 (padrão TR2), 10 µg.L-1 (padrão TR3), 1 µg.L-1 (padrão TR4) e 0.1 µg.L-1 (padrão TR5). O mesmo procedimento foi aplicado a uma solução monoelementar de Sn obtendo-se padrões com concentração de 1000 µg.L-1 (padrão R1) 100 µg.L-1 (padrão R2), 10 µg.L-1 (padrão R3), 1 µg.L-1 (padrão R4) e 0.1 µg.L-1 (padrão R5). Etanol 96 % (v/v) foi adicionado a todas as soluções padrão e brancos (agua ultra-pura acidificada a 2% de HNO3) de forma a obter-se uma concentração final de 1% (v/v) de etanol, semelhante à matriz da amostra. As concentrações rigorosas dos padrões com etanol encontram-se no anexo II.

Condições de operação do ICP-MS As análises das amostras de vinho foram efectuadas no Laboratório Central de Análises da Universidade de Aveiro. O equipamento utilizado foi o X-Series ICP-MS da Thermo Electron Corporation com um quadrupolo, nebulizador Burgener Mira Mist e um detector multiplicador de electrões ETP. As amostras, padrões e brancos foram aspiradas pelo ICP-MS através de uma bomba peristáltica segundo as condições descritas na tabela 2, seguindo o modo de operação quantitativo. Tabela 2 - Condições de operação do ICP-MS

Parâmetros RF power

1400 w

Plasma gas flow

14-15 L.min-1

Nebulizer gas flow

0.85-0.95 L.min-1

Auxiliary gas flow

0.75-0.85 L.min-1

Sample flow rate

1 mL.min-1

Vacuum pressure

5.5 × 10-7 mBar

Dwell time

10 ms

Sweeps/reading

100

Number of replicates

3

Channels

1

Total time

83 s

Padrão interno

In

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As condições de operação foram optimizadas através da realização de uma calibração de massa com um padrão de 10 µg.L-1 para os seguintes elementos Li, Be, Na, Mg, Al, K, Ca, Sc, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, As, Se, Mo, Ag, Cd, In, Ba, Tl, Pb e U. Efectuou-se ainda um teste de performance em que a razão de CeO+/Ce+ tem de, pelo motivo referido anteriormente, ser inferior a 2%, o padrão interno tem de apresentar cerca de 300000 contagens e largura do pico de 0,65 a 0,85 a 5% da altura do pico, que caracteriza a resolução do quadrupolo. As curvas de calibração foram obtidas por regressão linear pelo método dos mínimos desvios quadrados com base no máximo de pontos correspondentes aos padrões utilizados, desde que o erro entre cada medição e a curva obtida fosse inferior a 10%. Outra possibilidade seria a obtenção das curvas de calibração por regressão linear pesada, que consiste na atribuição de factores de peso a cada ponto inversamente proporcionais à sua variância. Este método permite por isso melhores resultados que o anterior, no entanto exige informação adicional sobre erros ocorridos para os diferentes níveis de concentrações, tornando-a numa técnica difícil de se levar a cabo (ISO 17294, 2004; MILLER et al, 2003).

Nos casos em que a regressão linear convencional não resultou recorreu-se à ISO 17294, 2004, que menciona a obtenção de bons resultados com uma calibração com apenas dois pontos. Um de uma solução com concentração inferior e outro de uma com concentração superior à gama de trabalho do elemento. Considerando-se a recta adequada se os pontos intermédios apresentarem um erro inferior a 10%. Contudo este método exige uma preparação cuidada das soluções envolvidas.

Parâmetros de validação do método A análise de material de referência certificado é a melhor forma de assegurar a qualidade dos resultados analíticos. Contudo, tal como referenciado em outros artigos (CATARINO et al, 2006; JAKUBOWSKI et al, 1999; PÉREZ-JORDAN et al, 1998; PYRZYNSKA, 2004) não existe material de referência para análise dos elementos nos vinhos. Sendo assim, recorreu-se ao material de referência da RELACRE, organismo que fornece aos laboratórios soluções aquosas com concentrações rigorosas dos elementos a analisar pelo ICP-MS, realizando-se ensaios interlaboratoriais. A este material, que é habitualmente utilizado no Laboratório Central de Analises, foi adicionado etanol 96% (v/v) de forma a obter uma concentração final de 1% de etanol, semelhante à matriz da amostra.

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Para cada elemento foi realizado um spike utilizando uma amostra de vinho de cada região. Com as mesmas amostras efectuou-se diluições com diferentes factores (2, 5, 10, 20, 50, 100). Os valores de concentração dos elementos determinados nas amostras foram corrigidos tendo em conta os valores dos brancos sujeitos às mesmas condições de operação das amostras.

Tratamento dos dados Foi construída uma matriz em que as linhas representam as amostras de vinho e as colunas correspondem aos elementos Li, B, Mg, Al, K, Ca, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ba e Pb. Esta matriz foi normalizada para que todos os valores tenham a mesma ordem de grandeza, obtendo-se variáveis com média zero e desvio padrão unitário. Este procedimento permite atribuir a mesma importância a todas as variáveis. Os procedimentos estatísticos mencionados anteriormente foram realizados através do software SPSS versão 15 para Microsoft Windows, excepto a análise de correspondências que foi elaborada com o software STATISTICA versão 7 para Microsoft Windows.

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Resultados e Discussão Dos 42 elementos analisados por ICP-MS apenas 17 foram quantificados nas 18 amostras de vinho. Os restantes encontravam-se abaixo do limite de quantificação em pelo menos uma amostra de vinho. Os resultados analíticos para estes 17 elementos encontram-se resumidos na tabela 3, onde se apresenta valores medianos, mínimos e máximos das 18 amostras. O anexo III exibe os resultados detalhados do conteúdo destes 17 elementos nos 18 vinhos. Tabela 3 - Resultados analíticos (µg.L-1) para os 18 vinhos

Elemento

Mediana

Mínimo

Máximo

Li

15.397

2.949

28.739

3

3

B

4.67×10

1.71×10

7.92×103

Mg

1.02×105

5.75×104

1.36×105

Al

7.50×102

2.70×102

1.79×103

K

1.11×106

3.94×105

1.46×106

4

4

Ca

8.50×10

5.62×10

1.53×105

V

15.468

0.972

48.312

Cr

184.964

121.703

301.328

3

2

Mn

1.98×10

8.67×10

5.00×103

Fe

3.83×103

9.73×102

6.51×103

Co

3.951

1.219

13.688

Ni

23.936

12.846

95.987

Cu

49.357

22.840

542.173

Zn

468.049

340.774

806.523

Sn

2.995

0.467

16.781

Ba

254.787

61.824

370.176

Pb

15.119

6.988

43.064

Validação do método Em relação aos spikes realizados verifica-se que a percentagem média de recuperação para os elementos quantificados foi de 107 ± 22. Para este cálculo não foram considerados os spikes do B, devido à precipitação das amostras, e do Sn, porque ao se realizar os spikes a concentração excedeu o limite máximo de detecção. O As apesar de ter sido quantificado não foi considerado devido às graves interferências poliatómicas com ArCl. Consequentemente era esperada uma percentagem de recuperação muito elevada, à semelhança do que aconteceu no estudo elaborado por Almeida

Página 19

et al, 2002, que obtiveram uma percentagem de recuperação média de 267. No entanto, obteve-se uma percentagem de recuperação de 103. Esta diferença de comportamento devese, provavelmente, ao pré-tratamento aplicado às amostras. Neste estudo, a amostra ainda continha etanol (que, como já foi referido, minimiza as interferências do ArCl), enquanto no outro estudo o etanol foi completamente eliminado por radiação UV. Tabela 4 - Percentagem de recuperação média para os elementos acima do limite de quantificação

Elemento

Percentagem de Recuperação Média

Elemento

Percentagem de Recuperação Média

Li

97

Fe

107

B

141

Co

93

Mg

114

Ni

85

Al

126

Cu

116

K

117

Zn

117

Ca

101

Sn

53

V

90

Ba

128

Cr

88

Pb

104

Mn

125

As percentagens de recuperação dos elementos que apenas puderam ser quantificados nos spikes encontram-se na tabela 5, com uma percentagem de recuperação média de 102 ± 26. Tabela 5 - Percentagem de recuperação média para os elementos acima do limite de quantificação apenas nos spikes

Elemento

Percentagem de Recuperação Média

Elemento

Percentagem de Recuperação Média

Be

93

Eu

103

Ga

86

Gd

101

Mo

91

Dy

103

Ru

95

Ho

104

Rh

94

Er

103

Cd

95

Tm

103

Te

98

Yb

102

La

103

Lu

103

Ce

103

W

112

Pr

104

Tl

104

Nd

105

Th

128

Sm

104

U

118

Página 20

Os resultados das diluições podem ser consultados no anexo IV. Conclui-se que a realização de diluições poderá não ser um método adequado para validação dos resultados, porque a maioria dos elementos possuem baixas concentrações nas amostras (vinho diluído 10 vezes). De uma forma geral pode-se considerar diluições até 5 vezes, a partir deste ponto os resultados deixam de ser fiáveis. Como alternativa poder-se-ia recorrer à validação através da comparação de resultados obtidos com outra técnica, por exemplo a NAA, já mencionada como método de referência nestes casos. A análise do material de referência da RELACRE apresentou um erro médio de 5% considerando os elementos quantificados, excepto o Sn, para o qual não havia material de referência.

Análise multivariada 

Análise de clusters

O dendrograma obtido (Figura 5) evidência a formação de dois grandes grupos. O primeiro formado pelos vinhos do Alentejo, Douro e Dão e o segundo pelos vinhos Verde e da Bairrada. Dentro do primeiro grande grupo verifica-se uma formação clara de três grupos distintos, cada um referente a uma região (Dão, Alentejo e Douro). No outro grande grupo constata-se a formação de dois grupos distintos (Bairrada e Verde) com a excepção do vinho 6 (vinho da Bairrada) que aparece isolado.

Região

Vinhos

Alentejo

1-4

Bairrada

5-8

Dão

9 - 14

Douro

15, 16

Verde

17, 18

Figura 5 - Dendrograma construído com a distância Euclidiana e método Ward

Página 21



Análise de componentes principais

Um dos passos importantes da análise de componentes principais é a escolha do número de componentes a reter. Esta escolha deve ser baseada em duas regras: 

A de Kaiser, que indica que se deve reter os componentes principais com um valor próprio superior a 1, assim cada componente principal seleccionada explica pelo menos tanta variância como cada uma das variáveis originais,



O Scree Plot, que consiste na representação gráfica dos valores próprios em função de cada uma das componentes respectivas. A partir da análise visual do Scree Plot deve-se seleccionar as componentes com números de ordem superiores àquele que inicia a estabilização dos valores próprios.

Neste caso, com base na regra de Kaiser verifica-se que se deve considerar as cinco primeiras componentes, que explicam 82,6% da variância total. Pela análise do Scree Plot (Figura 6) poder-se-ia considerar seis componentes, no entanto a adição da sexta componente não se traduz num ganho substancial na explicação da variância.

6

5

Eigenvalue

4

3

2

1

0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Component Number

Figura 6 - Scree Plot, representação gráfica dos valores próprios em função de cada uma das componentes respectivas

Página 22

Tabela 6 - Valores próprios e variância explicada

Componente principal

Valores próprios

% Variância individual

% Variância acumulada

1

5,086

29,920

29,920

2

3,983

23,428

53,348

3

2,288

13,459

66,808

4

1,515

8,912

75,720

5

1,170

6,881

82,601

6

0,909

5,346

87,947

7

0,511

3,004

90,950

8

0,486

2,860

93,810

9

0,373

2,194

96,005

10

0,317

1,865

97,869

11

0,147

0,865

98,734

12

0,095

0,557

99,292

13

0,058

0,343

99,634

14

0,037

0,215

99,849

15

0,022

0,132

99,981

16

0,003

0,019 -5

17

100,000 -5

1,39×10

8,20×10

100,000

Com base na representação gráfica dos dois primeiros componentes (Figura 7), que explicam 53,3% da variância total, verifica-se a formação de cinco grupos, correspondentes às diferentes regiões, como se pode visualizar no gráfico.

3

15 16

Dimension 2

2

1

Região

Vinhos

Alentejo

1-4

Bairrada

5-8

Dão

9 - 14

Douro

15, 16

Verde

17, 18

1 2

4 3

13 9

0

10 14

11 12

6 8

7 -1

5 17

Figura 7 - Representação gráficas das duas primeiras componentes

18

-2 -2

-1

0

1

2

3

Dimension 1

Página 23

Constata-se que o vinho 2 aparece isolado, possivelmente por ser o único vinho branco “maduro”. Os vinhos verdes são tradicionalmente ácidos. Os vinhos da Bairrada feitos a partir da casta Baga apresentam um grau de acidez mais elevado [5]. Uma vez que o vinho 7 é feito exclusivamente a partir da casta Baga, pode residir aqui a explicação para este vinho se afastar dos restantes vinhos da Bairrada e se aproximar dos vinhos Verdes. O primeiro componente é fortemente influenciado pelo conteúdo em Li, Mg, Mn, Al e Ca, tal como pode ser visualizado na figura 8, e permite a diferenciação dos vinhos do Douro e da Bairrada dos restantes, à excepção do vinho 7 pelos motivos já explicados. As variáveis mais importantes para o segundo componente são Pb, Zn, V e Ba (Figura 8), verificando-se que este componente permite isolar os vinhos do Douro, constatando-se ainda uma tendência para os vinhos Verdes e da Bairrada se localizarem em valores mais negativos.

1,0 Mg

Ni

Li

Co

Mn Cr

0,5

Dimension 2

Ba

Zn

Cu Sn

V B

Pb

0,0 K

Fe

Ca -0,5 Al

-1,0 -1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

Dimension 1 Figura 8 - Influência das variáveis nas componentes

Página 24



Análise de correspondências

A utilização da análise das correspondências entre os vinhos (Figura 9) revela a formação de 3 grandes grupos, distinguindo-se os vinhos verdes (17 e 18). De entre os restantes consegue-se ainda uma distinção entre o único vinho branco (2) e os tintos. Este plano explica cerca de 93,3%. 0,20 4

0,15

0,10

15 3

1

14 16 9 13 12 11

0,05 2 0,00

58

10

7 -0,05

Dimension 2 (28,20%)

6 -0,10 17

-0,15

-0,20 -0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

Região

Vinhos

Alentejo (tinto)

1, 3, 4

Alentejo (branco)

2

Bairrada

5-8

Dão

9 - 14

Douro

15, 16

Verde

17, 18

18

0,0

0,1

0,2

Dimension 1 (65,14%)

Figura 9 - Representação gráfica das associações entre os vinhos

Quando se realiza a representação conjunta dos vinhos e dos elementos (Figura 10), constata-se que os vinhos tintos do Alentejo, Dão e Douro estão fortemente relacionados com o teor em K, à excepção dos vinhos 1 e 4 que são principalmente influenciados pelo Zn e Cr, respectivamente. Verifica-se que o vinho 2 (único vinho branco destas regiões) se encontra numa localização oposta ao K, sendo por isso o seu baixo teor neste elemento (facto confirmado pela tabela de resultados), provavelmente, a principal causa para o isolamento deste vinho. Por sua vez os vinhos Verdes estão largamente associados ao teor em Pb e, em parte, ao teor em Fe. Relativamente aos vinhos 6 e 7 (Bairrada) são atraídos para perto dos vinhos Verdes pelo seu teor em Fe.

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0,5 Li

Região

Vinhos

Alentejo (tinto)

1, 3, 4

Alentejo (branco)

2

Bairrada

5-8

0,4 V

0,3

Mn

CoNi

0,2

MgBa

B 4 Cr

0,1

15 3

1 Zn

2 0,0

Dimension 2 (28,20%)

-0,1

17Pb 18

Sn Ca

-0,2

14 16 9 13 12 K11 10 8 75 6 Fe

Dão

9 - 14

Douro

15, 16

Verde

17, 18

Cu

Al

-0,3 -0,4 -0,7

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

Vinhos Elementos

Dimension 1 (65,14%)

Figura 10 - Representação gráfica das associações entre os vinhos e elementos



Análise discriminante

A tentativa de incluir toda a informação para a formulação da função discriminante conduz em muitas situações não a um melhor modelo, mas sim à introdução de problemas de classificação. No caso particular desta análise discriminante o SPSS considerou pertinente excluir os dados dos elementos Ni, Sn, Ba e Pb. Com base nos resultados de classificação, apresentados na tabela 7, verifica-se que 100% dos vinhos foram classificados correctamente de acordo com a sua região de origem. Tabela 7 - Percentagem de classificação correcta dos vinhos

Região original

Região predita Alentejo

Bairrada

Dão

Douro

Verde

Total

Alentejo

100

0

0

0

0

100

Bairrada

0

100

0

0

0

100

Dão

0

0

100

0

0

100

Douro

0

0

0

100

0

100

Verde

0

0

0

0

100

100

Página 26

Conclusões Dos 42 elementos analisados apenas 17 foram quantificados, devido aos limites de quantificação exigidos. Estes elementos, à excepção do B e do Sn, apresentaram uma percentagem média de recuperação de 107 ± 22 nos spikes realizados. O erro associado ao material de referência da RELACRE não ultrapassou, em média, os 5%. Concluindo-se assim que a adição de etanol ao material de referência da RELACRE constitui uma boa alternativa na falta de referência de vinho. Ainda em relação à validação do método, verifica-se que a realização de diluições poderá, neste caso, não ser um método adequado para a validação dos resultados. A comparação com resultados obtidos com a NAA poderá ser uma boa alternativa. De um modo geral a análise multivariada revela a formação de dois grandes grupos, um contendo os vinhos do Alentejo, Dão e Douro e o outro incluindo com os vinhos Verdes e da Bairrada. Os vinhos do Alentejo, Dão e Douro estão fortemente associados ao teor em K, à excepção do vinho branco que aparece claramente isolado na análise de correspondências. A presença da casta Baga confere acidez aos vinhos da Bairrada, sendo esta, provavelmente, a justificação para a sua proximidade aos vinhos Verdes, tradicionalmente ácidos. Na análise correspondências constata-se que os vinhos Verdes se associam fortemente ao Pb e, em parte, ao Fe e que os vinhos da Bairrada também são influenciados pelo Fe aproximando-se, mais uma vez, dos vinhos Verdes. Conclui-se ainda que 100% dos vinhos foram classificados correctamente de acordo com a sua origem geográfica. Embora estes resultados sejam promissores seria importante analisar um maior número de amostras para confirmação dos resultados. Para complementar esta análise seria relevante o estudo dos respectivos solos, para confirmar a influência das suas propriedades nos elementos presentes no vinho, atendendo-se a contaminações durante as fases de produção, armazenamento e transporte do vinho.

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Referências Bibliográficas ALMEIDA, C.M., VASCONCELOS, M.T.S.D., Advantages and limitations of the semi-quantitative operation mode of an inductively coupled plasma-mass spectrometer for multi-element analysis of wines, Analytical Chimica Acta, 463 (2002): 165-175 BEAUCHEMIN, D., Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, Analytical Chemistry, 78 (2006): 4111-4136 CATARINO, S., CURVELO-GARCIA, A.S., SOUSA, R.B., Measurements of contaminant elements of wines by inductively coupled plasma-mass spectrocopy: A comparison of two calibration approaches, Talanta, 70 (2006): 1073-1080 COETZEE, P.P., VANHAECKE, F., Classifying wine according to geographical origin via quadropole-based ICP-mass spectrometry measurements of boron isotope ratios, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 383 (2005) 977-984 HAIR, J., JOSEPH, F., Multivariate Data Analysis, Prendice-Hall, Inc., 1998 HARDLE, W., SIMAR, L., Applied Multivariate Statistical Analysis, Springer, 2003 ISO 17294, Water quality – Application of inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS), (2004) JAKUBOWSKI, N., BRANDT, R., STUEWER, D., ESCHNAUER, H.R., GORTGES, S., Analysis of wines by ICP-MS: Is the pattern of the rare earth elements a reliable fingerprint for the provenance, Journal of Analytical Chemistry, 364 (1999): 424-428 MARROCO, J., Análise Estatística, Lisboa: Edições Sílabo, Lda, 2003 MARTINS, J. P., Vinhos de Portugal, Lisboa: Dom Quixote, 2004 MILLER, J. C., MILLER, J.N., Statistics for Analytical Chemistry, Ellis Horwood Limited, 1993 PÉREZ-JORDAN, M.Y., SOLDEVILA, J., SALVADOR, A., PASTOR, A., GUARDIA, M., Inductively coupled plasma mass spectrometry analysis of wines, Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 13 (1998): 33-39 PYRZYNSKA, K., Analytical Methods for the Determination of Trace Metals in Wine, Analytical Chemistry, 34 (2004): 69-83

Página 28

SPERKOVÁ, J., SUCHANEK, M., Multivariate classification of wines from different Bohemian regions (Czech Republic), Food Chemistry, 93 (2005): 659-663 THIEL, G., GEISLER, G., BLECHSCHMIDT, I., DANZER, K., Determination of trace elements in wine and classification according to their provenance, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 383 (2004) 1630-1636

Referências electrónicas [1] http://www.lusawines.com Acesso em 25 de Março de 2007 [2] http://www.ivv.min-agricultura.pt Acesso em 12 de Março de 2007 [3] http://www.vinhosdoalentejo.pt Acesso em 25 de Março de 2007 [4] http://web.missouri.edu/~glascockm/naa_over.htm Acesso em 28 de Maio de 2007 [5] http://www.infovini.com Acesso em 2 de Junho de 2007

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Fontes de Figuras e Tabelas Figura 1 – Fotografia gentilmente cedida por Joana Coimbra Figura 2 – Retirada de http://www.alcontrol.co.uk Figura 3 – Retirada de http://www.esc.cam.ac.uk Figura 4 – Retirada de http://criticanarede.com/cien_estatistica.html Tabela 1 – Retirada de http://www.vinhosdoalentejo.pt

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