Compartimentação de Vias Metabólicas

ARTIGO DE REVISÃO

A compartimentação de vias metabólicas: uma ferramenta da natureza e do Homem. André da Silva, Bruno Gonçalves, Martim Caldeira, Miguel Rosas, Rafael Peixinho. Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa Submetido a 25 de abril de 2016. ÍNDICE 0.

ABSTRACT ................................................................................................................... 2

1.

INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 2 1.1.

CONCEITOS GERAIS ......................................................................................... 2

1.2.

COMPARTIMENTAÇÃO .................................................................................... 7

1.2.1.

Vias metabólicas ................................................................................................ 7

1.2.2.

Problemas reais .................................................................................................. 7

1.2.3.

Soluções na compartimentação ......................................................................... 9

2.

CASOS-ESTUDO ...................................................................................................... 14

2.1.

Compartimentação espacial .................................................................................... 14

2.1.1.

Procariotas ....................................................................................................... 14

2.1.2.

Peroxissomas ................................................................................................... 15

2.1.3.

Vacúolos .......................................................................................................... 16

2.1.4.

GAPDH “multifacetado” ................................................................................. 17

2.2.

Compartimentação temporal .................................................................................. 18

2.3.

Considerações ......................................................................................................... 19

3.

MODELAÇÃO ........................................................................................................... 20

4.

APLICAÇÕES ............................................................................................................ 26

5.

CONCLUSÃO ............................................................................................................ 29

6.

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 30 Página | 1

0. ABSTRACT A fronteira é um fator fundamental para a vida. É o escudo da ordem contra o caos, da entropia negativa contra a entropia positiva. A capacidade de diferença em relação ao exterior é o que possibilita que um ser vivo esteja, efetivamente, vivo. E isso consegue-se através da compartimentação. Esta estratégia triunfante estendeu-se a todo o tipo de funções. Aqui foca-se o papel da compartimentação na regulação de vias metabólicas: as razões evolutivas, os exemplos que têm sido descritos, consequências na modelação computacional, aplicações biotecnológicas e o futuro que se prevê pelo presente, tanto na investigação básica como nas translações deste conhecimento. Avanços significativos têm-se verificado nos últimos anos. Todavia, muito do potencial das ideias da compartimentação permanece sem usufruto.

1. INTRODUÇÃO

“Ao longo do tempo, os conceitos tiveram de evoluir para outros níveis.” – Prof. António Ferreira.

1.1.

CONCEITOS GERAIS

O compartimento é um elemento tão ubíquo e tão basilar que é visto como pano de fundo. Mas é precisamente por isso que devemos refletir sobre o que ele significa. Dum ponto de vista matemático, um compartimento é definido como um espaço físico confinado por uma fronteira, que contem uma “quantidade duma substância que tem uma cinética de transporte uniforme e distinguível” (1), sendo que a substância pode existir em diversas formas interconvertíveis (2), mas, normalmente, pode considerar-se homogéneo (3). Dum ponto de vista biológico, é definido como uma “região subcelular com reações bioquímicas cineticamente separadas ou isoladas de outras reações celulares” (4). Dum ponto de vista prático, intuitivo e conceptual, é uma “caixa”. Página | 2

Um compartimento traz uma fronteira e uma fronteira traz a divisão do espaço em interior e exterior. O que originalmente era um espaço comum, com as mesmas propriedades, passa a ter duas partes com relativa independência. O compartimento, com este potencial para a diferença, possibilita a criação da chamada entropia-negativa (5), ou sintropia, (ordem física, défice de entropia, previsibilidade informativa) contra a entropia positiva (desordem física sob a tendência ao caos, imprevisibilidade informativa), inevitável, como ditado pela segunda lei da termodinâmica. No fundo, a nível fundamental, molecular, o compartimento é um “condicionador do acaso”. Trata-se duma simples mas grandiosa estratégia sem estratega. Em termos abstratos, este recurso traz duas grandes vantagens: controlo do interior e resistência ao exterior - isto sem deixar de se ter as vantagens da comunicação entre os dois lados. No contexto celular, a ausência de trocas entre o interior e o exterior resultaria na morte da célula, já que a entidade viva tem obrigatoriamente de ser um sistema aberto - se o sistema vivo fosse isolado, estaria condenado "à degradação da ordem que o caracteriza" (6). Para isso, a natureza recorre a membranas de permeabilidade seletiva e variável - como as vamos entendendo desde o modelo do mosaico fluido (7). Por um lado, sendo uma barreira física, a membrana oferece resistência a variações no interior, como na temperatura, no pH e na força iónica (8), criando um microambiente (9). Por outro lado, nas membranas dos organismos de hoje, também se encontram proteínas complexas, que permitem que moléculas entrem e saiam, consoante a gestão necessária do organismo. Para lá das que possibilitam a passagem de certas moléculas passivamente, existem outras que bombeiam ativamente moléculas contra gradientes. Juntamente com a manutenção dos compartimentos, a resistência ao aumento de entropia, etc., isto contribui para o constante preço dum elevado consumo energético. Note-se, contudo, que em termos termodinâmicos, a constituição per si dos compartimentos não acarreta grandes custos, já que a agregação dos lípidos polares, como os fosfolípidos ou os ácidos gordos, em bicamadas e em vesículas (Figura 1) liberta moléculas de água por diminuição da superfície de solvatação dos lípidos, compensando o aumento da organização espacial do compartimento. Portanto, é um Página | 3

recurso com uma base “barata” para a célula - o que pode ter facilitado a sua adoção num ambiente de “caldo primordial” no início da vida.

Figura 1 - Representação esquemática de dois tipos de estruturas, bicamada e vesícula, formadas por lípidos polares, como ácidos gordos de cadeia longa. Cada molécula possui uma parte hidrófoba e outra hidrófila. Adaptado de 18.

A característica fundadora duma célula é a sua distinção do meio (10), a capacidade para ter certas propriedades. Todas as reações e atividades bioquímicas celulares ocorrem dentro dum compartimento – no mínimo, dentro da própria célula. Todas as células são compartimentos delimitados por membranas (11). Foi Haldane o primeiro a propor que as membranas tiveram um papel fundamental na origem da vida: “A célula consiste em numerosas moléculas suspensas em água e encapsuladas numa película lipídica. Quando todo o mar era um vasto laboratório químico, as condições para a formação de tal película deveriam ser relativamente favoráveis.” (12). Estas “películas” seriam estáveis, osmoticamente ativas e capazes de manter a concentração seletiva de gradientes iónicos e outros (13). O facto de ser uma membrana lipídica a delimitar todas as células vivas contemporâneas sugere que os compartimentos protocelulares teriam provavelmente o mesmo tipo de material (9). Os lípidos polares são uma boa opção porque, para lá das razões termodinâmicas, já depois de ter sido razoavelmente concluído, também experimentalmente, em 1994 por Pier Luigi Luisi e colegas (14), foi mostrado em 2010 que resolvem o problema do início da replicação dos compartimentos: “um fornecimento de ácidos gordos no folheto externo duma vesícula pré-biótica pode resultar na sua replicação sem fuga do conteúdo”, formando-se a partir da estrutura Página | 4

esférica uma “delgada e alongada, extremamente frágil, que se divide espontaneamente em múltiplas vesículas-filha”, em que “o conteúdo parental, com RNA, foi distribuído aleatoriamente pelas novas vesículas” (15) (Figura 2).

Figura 2 - Processo observado da replicação de micelas lipídicas. Adaptado de 15.

O fenómeno observado compreende-se facilmente pela geometria esférica das vesículas: com o crescimento da vesícula pela adição de mais material, o volume aumenta mais rapidamente do que a sua superfície (𝑉 =

4 3

𝜋𝑟 3 ; 𝐴 = 4𝜋𝑟 2 ), até que,

depois duma mudança de forma transitória para suavização do problema, se divide em vesículas mais pequenas. É, sem dúvida, um passo significativo na compreensão de como um compartimento deste género teria possibilitado, como se viu, duma forma “barata” e fácil, a capacidade de autorreplicação do chamado “chemoton”, definido em 1971 por Tibor Gánti como a unidade básica dum sistema químico minimalista, evidenciando todas as características de vida, contido num “saco” para que “os componentes do sistema não se percam em solução” (16). A emergência de sistemas vivos deve ser vista como a emergência de “sistemas químicos dinâmicos compartimentados” (17), como bem se verifica hoje que este princípio é fundamental a todas as formas de vida. Depois, ao circunscrever grupos de espécies químicas dentro de células, introduzse um novo nível de seleção: para além da que existe entre espécies dentro de cada célula, passa a existir uma seleção entre células (18) – uma multiplicação dos acontecimentos probabilísticos e das capacidades da seleção natural. Este recurso da “caixa” pode promover tanto uma tendência de competição como uma de cooperação. Em qualquer dos casos, o que certamente possibilita é o aumento Página | 5

da complexidade biológica, como, aliás, se comprova pelo crescimento genericamente proporcional de ambas as partes (vesículas de fagocitose, invólucro nuclear e sistemas membranares, mitocôndrio e plasmídeos, vacúolo, etc.). A evolução tende no sentido da complexidade sempre que a complexidade beneficia o organismo - aumenta ou melhora as suas capacidades e consequentes sobrevivência e reprodução. Aqui a compartimentação assume-se como um bom alicerce. Adicionalmente, existe também um outro fator que importa considerar: para lá da termodinâmica, o compartimento também é uma barreira cinética. Poder-se-ia constatar que com esta estratégia pode haver perda de velocidade e limitação da dinâmica do sistema, já que consiste em dividir espaços, o que multiplica passos. Embora, como se viu, todas as outras vantagens possam facilmente superar esta potencial desvantagem, esta mesma última pode também constituir uma vantagem. Todo o empreendimento da vida é no sentido de manter o sistema interno de cada entidade que a representa longe do estado equilíbrio com o exterior, como escreveu Erwin Schrödinger em 1944: “a matéria viva evita o decaimento para o equilíbrio” (5) - caso contrário, tem-se a morte ou nem sequer se passa da não-vida. Assim, para lá do controlo ativo que uma fronteira possa ter, até a mera função de barreira física pode dificultar e atrasar quaisquer forças que para aí tendam, dando efetivamente tempo à célula para executar a boa gestão que lhe é vital - para conseguir ser “impermeável à morte”, expressão de Lewis Thomas (19) -, ainda mais relevante com o aumento da complexidade em que está envolvida. Portanto, é perfeitamente plausível que o compartimento, unidade da separação, para lá se ser fundamental hoje, tivesse sido fundamental também no início da própria vida. A evolução natural biológica, passada e presente, é o argumento-mor da importância da compartimentação, o recurso a organizar sistemas em “caixas”. Em suma, tem-se este recurso como possibilitador da ordem e da complexidade, pelo que, em última análise, parece justo e rigoroso afirmar que a compartimentação permite o “sonho da vida”. Sem compartimentação a vida não é possível. Foi esta subestimada mas poderosa ideia que motivou a escrita desta revisão.

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1.2.

COMPARTIMENTAÇÃO

1.2.1. Vias metabólicas

Uma via metabólica é um sistema dinâmico de reações químicas, parte dum metabolismo geral, com diversos elementos interconectados: enzimas, metabolitos, cofatores, efetores, etc. Tudo isto é traduzido numa constante cinética de fluxos característicos que pode variar ao longo do tempo. A regulação deste sistema pode advir de mudanças em qualquer parâmetro que influencie a quantidade ou a “qualidade” dos vários elementos: desde as concentrações de cada elemento ao tipo de meio reacional, viscosidade, pH, força iónica, temperatura, alterações químicas dos elementos ou efeito channeling. Objetivamente, o controlo da atividade de cada via metabólica encontra-se normalmente complexamente distribuído pelos seus elementos, pelo que alterações num local podem ter influência noutro distante ou até no funcionamento global da via.

1.2.2. Problemas reais

Normalmente, não se atenta a esse facto, mas as células são extraordinariamente densas. Atendendo à complexidade de processos que desempenha, à velocidade a que os desempenha e à eficiência com que os desempenha, é curioso constatar que só em macromoléculas tem-se 20 a 30% do volume interior total de uma célula ocupado (20) e que se encontram em movimento constante e divergente, sendo que existe inevitavelmente uma grande porção de encontros indesejados e condicionadores. Nenhum componente está presente em concentrações de tal ordem, o efeito deve-se é ao somatório das presenças de todas as unidades dos vários componentes. A sobrelotação geral é visualmente evidente em qualquer representação realista do interior celular (Figura 3).

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Figura 3 - Simulação baseada em dados reais do ambiente interior da célula. Fotograma copiado de 21.

Por outro lado, ao contrário do que se assume, por exemplo, em modelações através de equações diferenciais ordinárias (ODEs), para simplificação, o interior celular não é uma solução homogénea (concentrações seriam iguais em todos os pontos espaciais) nem idealmente diluída (cada soluto não interagiria com nenhum dos outros): “as células não são simples sacos de enzimas e metabolitos com uma organização espacial e temporal aleatória” (22). É então de rigor considerar que nem os metabolitos e enzimas estão homogeneamente distribuídos pelo espaço celular nem o percurso entre eles é desimpedido, tem de haver uma difusão e uma submissão ao acaso. No contexto duma célula com dimensões relativamente enormes, o encontro “eficaz” entre os elementos certos é na verdade dificultado numa magnitude que pode não ser inicialmente intuitiva. A lei de Fick afirma o seguinte: 𝐽 = −𝐷 proporcional ao gradiente de concentração (

𝜕Φ 𝜕𝑥

𝜕Φ 𝜕𝑥

. Ou seja, a magnitude do fluxo (𝐽) é

), sendo a constante de proporcionalidade

um coeficiente de difusão (𝐷) que representa a facilidade com que o soluto se move no meio. Aqui se junta o facto do meio celular ser extremamente “populado”, pelo que D é reduzido. Mais, sabendo que as interações entre metabolitos e enzimas são Página | 8

normalmente mediadas através de forças fracas, as forças atrativas atuam a distâncias muito curtas, pelo que a barreira da difusão terá mesmo de ser ultrapassada primeiro. Ainda mais, as interações fracas que efetivamente podem ter aqui efeito são entre proteínas, não sendo só as próprias a dificultar a circulação como as “redes” que assim podem formar. Este efeito de resistência ao deslocamento acentua-se quanto maior é a dimensão do corpo em trânsito. A natureza tem claramente necessidade de resolver esta realidade dos sistemas biológicos. 1.2.3. Soluções na compartimentação

A solução é já adágio da natureza: organização. Dentro duma célula viva, o metabolismo geral depende da organização estrutural das suas várias vias. Isto concretiza-se no recurso à compartimentação espacial dos elementos das vias metabólicas, sendo que esta compartimentação pode ser tanto por delimitação através de membranas ou mesmo apenas por agregação de vários elementos por interações físicas em “microcorpos” (23). A introdução do compartimento tanto faz ultrapassar barreiras difusivas como reúne num espaço menor elementos de interesse enquanto exclui outros sem interesse. Na representação da Figura 5, constata-se a enorme densidade e heterogeneidade celular, mas já organizada, da parte identificada na Figura 4.

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Figura 4 - Simulação dum corte transversal duma célula eucariótica, mostrando a localização da parte relevada na Figura 5. (24)

Figura 5 - Simulação dum corte transversal dum mitocôndrio com uma magnificação de 1 000 000x. Todas as macromoléculas e membranas estão visíveis, mas as pequenas moléculas, iões e água foram omissas para clareza. O citoplasma está no topo e o mitocôndrio no resto da imagem. As proteínas solúveis estão a azul, as membranas e as proteínas associadas a membranas estão a verde, o RNA está a rosa, os ribossomas a magenta, o DNA e as proteínas associadas ao DNA estão a amarelo e a laranja. (24)

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Assim, a compartimentação providencia um mecanismo para organizar o metabolismo e regular as vias metabólicas. Por um lado, trata-se efetivamente dum fundamental instrumento de gestão, por outro, trata-se dum “condicionador do acaso”, como se escreveu antes, quer seja a condicionar o “acaso positivo”, porque a probabilidade dum metabolito encontrar um enzima num espaço menor é superior à deste o encontrar num espaço maior, ou o “acaso negativo”, porque se limita a probabilidade de metabolitos se difundirem contra elementos indesejados (nos termos anteriores, encontros não “eficazes”). Note-se que a compartimentação proporciona a divisão de tarefas e a especialização, que também contribuem para um maior rendimento metabólico, uma vez que cada compartimento pode apresentar condições específicas e apropriadas à sua função, surgindo a noção de “compartimentação funcional”. Note-se ainda que com a compartimentação seletiva, o efeito da sobrelotação até já pode constituir uma vantagem, porque é um potencial promotor das atividades termodinâmicas. Portanto, a compartimentação pode trazer as seguintes principais vantagens: 

Limitação da difusão.



Possibilitação da especialização (um local dedicado a certas funções).



Possibilitação duma “diferenciação identificada”, em que se criam locais diferentes mas existindo uma gestão “inteligente” em que a célula “sabe” o que cada compartimento é (por exemplo: um fator de transcrição x é direcionado para o núcleo e não para um lisossoma, como no conhecido caso do NF-kB), através de “tags”, etc. Pode utilizar (e utiliza) esta última funcionalidade para sequenciar e conferir direcionalidade a vias metabólicas.



Controlo do que passa e de quanto passa por unidade de tempo (permeabilidade seletiva e variável – diferencial). O que tem interesse fica ou entra e o que não tem interesse sai ou não entra. Esta seletividade pode variar ao longo do tempo.

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

Mobilidade de vias metabólicas. Estando confinadas a um compartimento, podem ser mobilizadas para locais específicos (utiliza-se em fenómenos de crescimento diferencial, motilidade, etc.)



Manutenção de diferenças de potencial elétrico, de pH, etc.



Otimização de condições (desde concentrações de metabolitos e de enzimas a concentrações hidrogeniónicas e salinas), criando microambientes mais favoráveis. Aumenta a rentabilidade (11).



Função de barreira física. Funciona tanto como proteção do exterior como do interior (por exemplo: de ROS, metais pesados, etc.). Impede a fuga de elementos das vias metabólicas. Abrandamento de processos de transporte, o que pode trazer uma vantagem temporal.



Limitação de interferências indesejadas e promoção de interações desejadas.



Impedimento de ciclos fúteis. A separação e/ou direcionalidade conferida pela compartimentação pode impedir que certos metabolitos sejam continuamente interconvertidos em reações a operar em direções contrárias.



Modificação do tipo de atividade de enzimas. Alguns enzimas apresentam diferentes tipos de atividade consoante as condições do meio envolvente.



Promoção da atividade termodinâmica e consequente reatividade.



Função de reserva (por exemplo: células do tecido adiposo em animais e vacúolos em plantas).



Criação duma “plataforma” que é a fronteira em si. Repara-se facilmente que se cria um interior e um exterior, mas também a própria estrutura física que separa os dois espaços está presente e traz um imenso potencial (basta atentar-se à “maravilha da engenharia” que são as redes membranares da respiração mitocondrial ou à fotossíntese nos tilacoides). As membranas biológicas não são meros separadores, são separadores funcionais.



Possibilitação do aumento da concentração enzimática a ponto de se promover uma agregação ordenada (semelhante a um efeito de channeling “induzido”) (25).



Amplificação de sinais. A mera transição de uma dada quantidade de elementos duma via metabólica para um compartimento de menor volume aumenta as

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atividades enzimáticas (numa cinética Michaeliana, por exemplo, aumentando a concentração de substrato e/ou até do próprio enzima, i. e., Vlim). Este recurso à ideia da “caixa” tem sido ubiquamente adotado na natureza e com um claro sucesso. Cerca de metade do volume interior duma célula eucariótica está envolto em membranas e nas plantas o vacúolo pode ocupar até cerca de 95% do volume celular (26). Considerando o exemplo do compartimento nuclear, o mais óbvio, já foram formuladas hipóteses de que o encerramento do genoma foi um subproduto da compartimentação de vias metabólicas e de que este possibilitou um aumento da complexidade dos seres vivos por a transcrição passar a ocorrer num local distinto do da tradução (27). A compartimentação é um princípio fundamental da vida. As células contemporâneas mais evoluídas são sistemas compartimentados, dinâmicos e altamente sofisticados, em que existe um volume interno separado do volume externo por uma fronteira, que controla de várias formas complexas as trocas de matéria e energia entre o interior celular e o ambiente exterior (17). Todavia, apesar desta óbvia necessidade da compartimentação, o seu papel e as suas implicações permanecem subapreciados (28). Como defende John Ellis, “esta negligência pelos bioquímicos deve ser remediada”, é necessário “mudar a atitude de que isto pode ser seguramente ignorado e que pergunta por que razão elegantes experiências in vitro devem ser complicadas” (20). Sucede que a consideração desta realidade biológica, para lá de na vertente teórica, também na vertente experimental pode trazer benefícios e não implica grandes complicações. Por exemplo, a mera adição de altas concentrações de macromoléculas naturais e/ou sintéticas ao tampão usado permite a mimetização in vitro da sobrelotação molecular que existe em compartimentos celulares in vivo – uma aproximação ao real tão simples que se poderia tornar rotineira. Em conclusão, existe sem dúvida um grande potencial na compartimentação como recurso para a regulação de vias metabólicas. Serão em seguida abordados alguns casosestudo já descritos mas antes dispersos pelas suas várias especialidades, tendo, contudo, o objeto deste artigo em comum. Foram selecionados de acordo com a solidez do seu Página | 13

conhecimento e de modo a constituírem uma amostra algo representativa da amplitude dos casos já conhecidos – pelo menos os já conhecidos.

2. CASOS-ESTUDO 2.1.

Compartimentação espacial

Encontram-se muitos exemplos de compartimentação a nível fisiológico nos humanos, desde o líquido cefalorraquidiano e o líquido amniótico ao estômago e aos nódulos linfáticos. A nível bioquímico, os exemplos conhecidos e descritos também não faltam, nem em quantidade nem em qualidade. 2.1.1. Procariotas Apesar da ideia comum que se possa ter, a utilização da compartimentação no interior da célula não se restringe aos mais complexos eucariotas. Mesmo os procariotas, que, como indica o nome, nem sequer um núcleo verdadeiramente delimitado possuem, têm sido objeto de descobertas que revelam um interior altamente estruturado, com coleções de corpos celulares, proteicos ou mesmo membranares, funcionais, seja em bactérias ou em arqueas. Temos como um exemplo bastante estudado o caso dos carboxissomas, envolvidos na fixação de carbono, que encapsulam enzimas RuBisCO e anidrases carbónicos (Figura 6) (29). Esta é uma estratégia em que se concentra CO2 num local individual, se evita a sua saída do mesmo após sair do anidrase carbónico, se reúne dois elementos duma via metabólica criando um efeito de channeling “induzido” e se compensa a baixa eficiência do RuBisCO, melhorando significativamente o ciclo de Calvin–Benson–Bassham para eficiências comparáveis a plantas C4 (25).

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Figura 6 - Exemplo de microcompartimentos em procariotas: carboxissomas. (a) Imagem de transmissão eletrónica de Halothiobacillus neapolitanus com setas indicando carboxissomas, corpos densos em proteínas. Adaptado de 30. (b) A cápsula hexagonal proteica. O interior está cheio de RuBisCO e anidrase carbónico para maximizar a retenção de CO2. Adaptado de 29. (c) Microscopia de fluorescência de carboxissomas, a verde, mostrando que a sua localização in vivo em cianobactérias é regulada de forma a estarem bem espaçados uns dos outros e alinhados ao centro. Adaptado de 31.

2.1.2. Peroxissomas Um dos benefícios que a compartimentação subcelular pode trazer é a criação de microambientes que otimizem a atividade de enzimas específicos (32). O catalase e o oxidase peroxissomais apresentam maior atividade a pH alcalino (33). Estando confinados num espaço celular particular, esse requisito pode ser cumprido sem problemas para o resto da célula. Uma vertente da utilização deste compartimento que é transversal é a proteção do resto da célula de potenciais efeitos danosos dos radicais que se formam no interior do peroxissoma. Por outro lado, alguns organismos utilizam esta compartimentação no peroxissoma mas para aumentar significativamente a concentração de enzimas e substratos, de modo a aumentar as taxas catalíticas. Noutros casos ainda, a aglomeração proteica chega a ter uma densidade de tal ordem que se formam inclusões amorfas cristalinas (Figura 7) (34). Inicialmente, este fenómeno não parecia fazer sentido, do ponto de vista da célula, uma vez que, em estudos bioquímicos em que se comparou catalase cristalino com catalase difundido no meio, se verificou que o cristalino apresentava mais de dez vezes menor atividade específica do que o outro. Contudo, depois verificou-se que, de facto, a estratégia aqui era outra: estas formações diminuíam Página | 15

a atividade enzimática mas aumentavam imenso a estabilidade estrutural dos enzimas num ambiente que era altamente oxidativo e apresentavam uma grande resistência a radiação UV, a variações de pH e ao stresse térmico (35). Aqui a estratégia da compartimentação não tem como objetivo principal o aumento da atividade enzimática nem a proteção do citosol exterior, mas sim aumentar a estabilidade estrutural num ambiente altamente austero. Isto deveria ter conferido um enorme potencial evolutivo a este tipo de organismos.

Figura 7 - Exemplos de microcorpos visualizados por microscopia de transmissão eletrónica. (a) Peroxissoma indicado com uma seta, dentro duma célula de mesênquima de girassol. O corpo de inclusão cristalino é formado por catalase. Adaptado de 36 e de 37. (b) Corpo de Woronin (derivado de peroxissoma) com um cristal hexagonal proteico no interior, de Aspergillus nidulans. Adaptado de 38.

2.1.3. Vacúolos Um outro caso de compartimentação que, embora de forma mais adjacente, também condiciona o funcionamento de vias metabólicas envolve a ideia de retirar elementos indesejados num determinado espaço confinando-os noutro. Aqui o exemplo óbvio é o vacúolo. Já é bem conhecido que este organelo pode tanto armazenar em grande quantidade compostos de reserva ou que tragam vantagens evolutivas para o organismo em geral, como as antocianinas (39), como isolar compostos tóxicos para as células, como metais pesados (40).

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2.1.4. GAPDH “multifacetado” O enzima 3-fosfato-gliceraldeído desidrogenase (GAPDH, EC 1.2.1.12), há muito considerado como um mero enzima glicolítico, tem sido associado a diferentes processos dependendo da sua localização celular (41), sendo que alguns dos processos nem estão sequer relacionados com vias de produção de energia (42, 43, 44, 45). Também tem sido identificado o seu envolvimento íntimo na etiologia de várias patologias humanas, como doenças neurodegenerativas (46, 47), diabetes (48), cancro (49), entre outras (50). Trata-se dum enzima multidimensional (Figura 8), que pode assumir várias atividades consoante o local onde se encontra: para lá do citosol, já foi identificado no plasma sanguíneo, no invólucro nuclear, no interior do núcleo, no retículo endoplasmático e no aparelho de Golgi (41).

Figura 8 - Os vários tipos de atividade apresentados pelo enzima GAPDH consoante a sua localização celular que já foram identificados. Adaptado de 45.

Aqui importa referir também o caso doutro enzima glicolítico: o piruvato cinase, na sua isoforma M2 (EC 2.7.1.40). Foi descrita uma função não-metabólica deste

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enzima quando passa do citoplasma para o núcleo, passando a atuar como um coativador transcricional (52, 53, 54). Em conclusão, os exemplos são variados, muitos mais não foram aqui mencionados e muitos mais estão certamente por descobrir. Ainda assim, existem outras vertentes de compartimentação. Com o avançar dos casos que se vão conhecendo, vai tornando-se sólida a imagem de que são poucos os enzimas que existem verdadeiramente livres na célula, mas sim em “hiperestruturas” com outros enzimas, constituintes estruturais da célula e elementos regulatórios, uns em maior outros em menor grau, uns de forma transiente outros de forma permanente, mas criando redes otimizadas para uma mais eficiente dinâmica de metabolitos dum centro ativo enzimático para outro (55, 56, 57, 23). Assim, constata-se que não existem só fronteiras físicas externas, como também “forças internas”, interações intermoleculares que criam também compartimentações e que culminam no efeito de channeling “induzido”. Temos já exemplos claros disso: desde vias metabólicas associadas ao citoesqueleto aos inflamassomas que reúnem caspases, passando pelo recrutamento de enzimas glicolíticos em projeções celulares ricas em actina (invadopodia) de células cancerígenas invasivas (58, 59). Ainda uma outra vertente de compartimentação é, para lá da espacial, a temporal.

2.2.

Compartimentação temporal

Qual a razão pela qual uma célula pode executar, por exemplo, vias metabólicas que parecem incompatíveis ou mesmo contraditórias e fúteis? A resposta passa pela capacidade de as compartimentar não só no espaço mas também no tempo. Nesta vertente é aproveitada a ideia de fluxo informativo, em que a própria variação da informação ao longo do tempo pode conter informação. Como casos ilustrativos, considere-se a glicólise e a gluconeogénese, as proteases digestivas, a membrana nuclear como regulador do fluxo de informação em ambos os sentidos, a expressão génica diferencial, as oscilações temporais de concentrações de cálcio ou mesmo das diferenças de potencial nos neurónios.

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Deste recurso emergem efeitos como, a partir dos mesmos componentes, diferentes respostas dependendo do timing objetivo e relativo de vários elementos de vias metabólicas ou das próprias vias metabólicas em geral, numa segregação temporal rigorosamente regulada – algo que se verifica mais em vias de sinalização, onde a rapidez e a assertividade da resposta têm uma importância mais central. É uma estratégia utilizada em respostas transitórias, por exemplo. Os compartimentos mais óbvios são os visíveis e delimitados por membranas, mas existe também um grande potencial em compartimentações temporais (60, 61). Mas nesta vertente menos óbvia, ainda mais acentuadamente do que na anterior, muitos mecanismos permanecem por ser elucidados. 2.3.

Considerações

Viu-se alguns exemplos concretos de várias formas de compartimentação. Adicionalmente, podem existir várias formas a funcionar integradas em simultâneo, em diferentes níveis de compartimentação. Depois da realidade evidenciada nas secções anteriores, está agora ainda mais esclarecida a importância biológica da compartimentação, para lá dos fundamentos teóricos, nos argumentos factuais e práticos. Deste modo, está igualmente esclarecido o que se afirmou logo no início deste artigo sobre o compartimento, enquanto unidade de separação, ter sido fundamental tanto na origem da vida como na sua evolução e no seu presente. A natureza recorreu, continua a recorrer e a recorrer cada vez mais, a esta solução, para, por entre outros fins, regular vias metabólicas. Assim sendo, algumas considerações podem ser feitas. Por exemplo, a maioria dos metabolitos não estará presente a concentrações uniformes em todos os compartimentos (62). Portanto, a determinação experimental de concentrações em extratos celulares ou mesmo tecidos, com restos de meio extracelular, não dá mais que valores médios aproximados, que não conseguem refletir com exatidão as concentrações a que um dado enzima está exposto dentro do compartimento em que se encontra in vivo. Até meados dos anos 70, o citoplasma de células intactas era visto como equivalente ao citosol obtido in vitro (63). Desde então, tem evoluído o cuidado

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que se tem com este tipo de imprecisões que não são fiéis à realidade da célula (28). O citoplasma celular deve ser visto não como homogéneo mas como um complexo conjunto de subcompartimentos, individualizados em maior ou em menor grau, no citosol. Têm sido melhorados procedimentos para ter isto em conta – alguns procedimentos até com origens antigas, como as técnicas de fracionação rápida para medir níveis de metabolitos mitocondriais desenvolvidas por Zuurendonk e Tager (64). Depois, tem-se a própria observação da distribuição celular dos metabolitos. Já se dispõe de muitas metodologias e em alguns casos já pode ser feita uma observação direta, como por NMR, em que se consegue simultaneamente localizar e dosear metabolitos como o ATP ou como o NADH, em que é possível fazê-lo até em células vivas - atente-se também no exemplo do NADPH deuterado, em que dois estudos determinaram a direção de vias metabólicas de serina e glicina no mitocôndrio vs. no citosol, seguindo o fluxo deste analito e doseando as suas quantidades relativas (65, 66).

3. MODELAÇÃO

"Os modelos são representações simplificadas (mas não simplistas!), da realidade. São ferramentas para revelar mecanismos que não podem ser diretamente observados, tal como a ressonância magnética.” (67) "Muito do criticismo ao desenvolvimento de modelos em Biologia advém da falta de apreciação da variedade de papéis que podem ser executados através da modelação matemática.” (68)

Os modelos são abstrações da realidade. No contexto aqui abordado, surgem como uma ferramenta muito poderosa. A modelação funciona aqui como uma técnica avançada para o estudo da regulação, que pode envolver a consideração quantitativa duma multitude de dados e interações característicos de sistemas biológicos (69). Já se viu que é vantajoso considerar a compartimentação e a modelação computacional surge como uma excelente ferramenta para esse objetivo. Página | 20

A utilização desta ferramenta não tem de significar grandes complicações, pelo contrário, até pode, por exemplo, agilizar ensaios experimentais com previsões, etc. Uma das abordagens bastante elegantes é a utilização de equações diferenciais ordinárias (ODEs, mencionadas anteriormente) para modelar matematicamente fluxos metabólicos. Como exemplo deste método, atente-se ao seguinte caso ilustrativo que se desenvolveu no âmbito da realização deste artigo. Considere-se uma pequena e simples via metabólica com três metabolitos (A, B e C) em que o último tem uma retroação negativa (Quadro 1). A colocação do enzima que transforma B em C num compartimento com 10x menos volume que o global leva a que a concentração do metabolito C chegue a uma concentração no interior do compartimento de cerca de 100x em relação à situação sem compartimentação, mas demora mais tempo a atingir o estado estacionário, comprovando-se o que se tinha comentado teoricamente no início. Ou seja, a divisão dum espaço anteriormente comum em dois traz um novo nível de regulação da via.

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Quadro 1 - Simulação do efeito da compartimentação duma via metabólica-modelo simples, com retroação negativa. Utilizou-se o módulo Stimator e executou-se em linguagem Python. Assumiu-se que os transportes através da membrana teriam uma constante de velocidade 10x inferior às reações. Utilizou-se um quociente de volumes (Kuv = Vcompart. inicial/Vcompart. final) para simular a modificação de volumes. Via não compartimentada

vin: -> A, kin v1: A -> B, k1 * A * (1 / (1 + C)) v3: B -> C, k3 * B vout: C ->, kout * C kin = 1 k1 = 1 k3 = 1 kout = 1

Via compartimentada

vin: -> A, kin v1: A -> Bout, k1 * A * (1 / (1 + Cout)) v2: Bout -> Bint, k2 * Bout * kuv v3: Bint -> Cint, k3 * Bint * kuv v4: Cint -> Cout, k4 * Cint * 1/kuv vout: Cout ->, kout * Cout kin = 1 k1 = 1 k2 = 0.1 k3 = 1 k4 = 0.1 kout = 1 kuv = 10

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Em relação a aumento de atividade de vias metabólicas por compartimentação, note-se o seguinte: considerando o modelo mais simples do que contribui para a velocidade dum passo numa via metabólica, 𝑣 = 𝑘 ∗ [𝐴], a compartimentação tanto pode aumentar [𝐴] como a concentração do próprio enzima, aumentando 𝑘 - sendo que com a cinética de Michaelis-Menten o aumento é ainda mais significativo por a atividade enzimática ter mais influência do que a concentração de substrato. Veja-se também um outro exemplo do formato desta abordagem num modelo duma via dividida entre o citosol e o núcleo, realizado por Ganesan e Zhang (Figura 9).

Figura 9 - Representação esquemática dum modelo com dois compartimentos e uma dinâmica espacial e temporal, com respetivas equações diferenciais (ODEs), que resumem as reações e as taxas de difusão. Ambos os compartimentos se consideram homogéneos. Adaptado de 70.

Numa vertente mais aplicada à investigação, Klitgord e Segrè também compararam a compartimentação com a não-compartimentação do metabolismo de leveduras e concluíram que a separação espacial era um fator crucial para a fidelidade dos resultados obtidos com os modelos (71). Numa reconstituição virtual do metabolismo humano, Natalie Duarte e colegas também chegaram a uma conclusão semelhante, em que se confirmou “duma forma matematicamente rigorosa” que a Página | 23

compartimentação é fundamental para a coordenação de todo o metabolismo celular (72). Por exemplo, na investigação de vias de respostas ao stress agudo envolvidas em patologias cardíacas defende-se a utilidade de modelos computacionais deste tipo (73). Na investigação de complexas redes metabólicas em plantas, que podem ter interesse biotecnológico, também a disponibilidade futura de modelos que incluam a compartimentação metabólica se consideram bastante relevantes para melhorar a capacidade de engenharia de vias (74). Para a modelação de vias metabólicas compartimentadas, devem ser usados dados relativos às condições dos vários elementos quando estão efetivamente compartimentados, bem como dados relativos aos transportadores na interface dos compartimentos. Não discernir informação relativa a cada compartimento, tal como existe in vivo, origina modelações “grosseiras”. Por isso, é necessário que existam bases de dados com essas competências. Por entre as várias que existem, a KEGG não tem qualquer informação relativa a compartimentos, a HumanCyc começa a ter (75), a EHMN, a Recon 1 e a Reactome já disponibilizam informações de redes metabólicas compartimentadas, sendo o último serviço o que apresenta um conhecimento mais desenvolvido. Até informações mais específicas como os múltiplos estados de protenação que os metabolitos podem apresentar consoante o compartimento em que se encontram já foram propostos como possível adição a bases de dados (76). Verificamse já animadores esforços neste sentido, como o exemplo da base de dados com o nome elucidativo “Compartments” (disponível em http://compartments.jensenlab.org/), desenvolvida por Janos Binder e colegas, do laboratório de Lars Juhl Jensen, onde se integram dados, frequentemente atualizados, relativos à localização subcelular de proteínas, ilustrando até os resultados em figuras de células esquemáticas (Figura 10).

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Figura 10 - Exemplo do resultado da pesquisa do enzima cardiolipina sintase, em http://compartments.jensenlab.org/Search. Acedido a 12 de maio de 2016.

Concluindo, a modelação permite desde visualizar a simulação da evolução de variáveis dum modo que é praticamente impossível experimentalmente (várias variáveis simultaneamente, algumas não são acessíveis ao estudo experimental, estudo direto, etc.) a testar hipóteses e prever resultados sem ter de se gastar tudo o que envolve um ensaio laboratorial (materiais, tempo, esforço, etc.). Portanto, embora sempre de carácter hipotético, virtual e dependente de confirmação experimental, este tipo de modelações são, sem dúvida, uma mais-valia na investigação científica, bem, como noutras áreas. A utilidade de modelos computacionais é indiscutível e existem cada vez mais recursos disponíveis. No futuro, espera-se desde novos desenvolvimentos de bases de dados à construção de melhores modelos, com ainda melhores capacidades de simulação e previsão in silico.

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4. APLICAÇÕES Para além da ideia de compartimentação e da investigação fundamental inerente, a poderosa estratégia natural de compartimentação de vias metabólicas tem potencial para aplicações, nomeadamente na Biotecnologia. E algumas não são previsíveis nem futuras mas sim já concretizadas e com sucesso (77, 78). Exemplo disso são os esforços verificados em aplicações em engenharia metabólica para elevar o rendimento de um produto desejado. Aválos e seus colegas provaram a fiabilidade deste conceito ao sobre-expressar os enzimas duma via que produz isobutanol no citosol, só que desta feita no mitocôndrio (79). Comparando as duas abordagens, no mitocôndrio obteve-se 260% do que se obtinha no citosol. Outro exemplo de aplicações que vale a pena ser referido é o de Blumhoff e seus colegas (80). Montaram efetivamente a via do ácido itacónico no mitocôndrio, ao invés de no citosol, e duplicaram o rendimento deste produto. Existem várias ferramentas, algumas delas já bem estabelecidas, que podem ser aproveitadas para aplicações de ideias aqui discutidas. Uma técnica já antiga que vai ganhando cada vez mais destaque em várias áreas da Biotecnologia (por exemplo, foi no início deste ano comunicada a construção de microcápsulas de células-β (Figura 11) que superaram o último desafio da resistência imunitária e curaram murganhos com Diabetes (81, 82)) é a oclusão em microcápsulas. Uma possibilidade de aplicação desta técnica a vias metabólicas poderia provavelmente ser a compartimentação artificial.

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Figura 11 - Representação esquemática do funcionamento das microcápsulas de células-β. Adaptado de CellProtect ®.

Um dos problemas da utilização de extratos enzimáticos “livres de células”, que permitem otimizar catálises enzimáticas e mesmo construir vias metabólicas, é a perda do controlo e da robustez da compartimentação nativa, para lá de outros problemas mais técnicos, como a necessidade de imobilização dos enzimas, inibições por produto, etc. Uma possível solução poderá residir na aplicação de compartimentos artificiais a vias metabólicas. Na prática o procedimento-base é bastante simples: uma solução com o enzima em elevada concentração e um tipo de ião divalente como o Ca2+ é introduzida sob microgotículas numa solução de alginato, um exemplo de polímero que forma ligações cruzadas através de iões divalentes. Com isto, forma-se um compartimento em volta do espaço do enzima adicionado, cuja fronteira é uma superfície porosa que permite a passagem de certos elementos mas não de outros. Imagine-se agora as vantagens a priori da utilização destes “sacos de enzimas” num meio com o substrato: os enzimas não se dispersam pelo meio, ficando numa concentração elevada dentro das microcápsulas e sendo facilmente recolhidos por filtração (introduz-se o meio com substrato, retira-se depois o produto por filtração e o Página | 27

ciclo pode continuar), pode juntar-se vários enzimas duma via neste pequeno espaço, criando o efeito de channeling “induzido” (e aqui artificial), não se tem o problema da sobrelotação celular porque se escolhe o que lá se introduz, pode ter-se vários compartimentos diferentes, com uma especialização e/ou uma sequencialidade, da mesma forma que a célula aproveita este recurso. Esta abordagem que aqui se propõe, ou outras do tipo (11), poderá ter aplicações da Biotecnologia de dimensão industrial e até, quiçá, contribuir para avanços nos estudos da origem da vida (83, 84). Outra técnica merecedora de referência é a utilização de discos lipídicos, em que se induz a expressão proteica associada a membranas (85). Esta técnica promove a organização dos enzimas numa geometria específica que favorece o sistema geral, providenciando um maior rendimento. Também se utilizam em tecnologias de Biologia sintética hidrogéis de DNA designados por p-gells para ativação da síntese de compostos de interesse através da transcrição (86). Existem ainda vários desafios a estas estratégias: identificação de cofatores e efetores alostéreos, avanços em técnicas de metabolic profiling, identificação de transportadores envolvidos, já que a nossa informação ainda é limitada em relação às centenas de proteínas que transportam uma miríade de metabolitos pelas fronteiras de compartimentos (74), e desenvolvimento de melhores modelos computacionais que possibilitarão uma maior capacidade de simulação e de previsão. Existe também a oportunidade para, no futuro, se utilizarem abordagens de engenharia de vias metabólicas, semelhantes às dos sucessos enunciados em cima, mas noutras vias de metabolismo primário, porque, para lá de se poder produzir elevados rendimentos de compostos com valor económico, também se pode utilizar este conhecimento na investigação básica de redes biológicas nativas. Em suma, tendo por base a poderosa ideia da “caixa” e uma estratégia de racionalizar, organizar e otimizar, tem-se vindo a assistir a um aumento de aplicações com uma grande utilidade, mesmo perante grandes limitações.

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5. CONCLUSÃO A compartimentação assume-se como um recurso, uma solução eficaz e, literal e exatamente, desde sempre adotada pelos seres vivos como vantagem evolutiva. Viu-se aqui um conjunto de razões pelas quais é um elemento fundamental na regulação de vias metabólicas. Viu-se também que vários esforços têm existido no sentido de explorar este elemento: tanto a “montante” como a “jusante”. Por um lado, tem-se documentado, por exemplo, os papéis atípicos que enzimas metabólicos podem ter de acordo com a sua localização espacial e os percursos que componentes como o cofator NADPH descrevem entre vias metabólicas compartimentadas. Por outro lado, têm sido dadas provas de sucesso de abordagens que utilizam as ideias aqui tratadas, resultando em, por exemplo, melhores eficiências catalíticas, com valor de nível industrial. Todavia, para lá do potencial ainda por descobrir, muito do já descoberto está ainda por ser aproveitado. Há aplicações previsíveis até a nível terapêutico, como com o conhecimento de que enzimas glicolíticos se compartimentam em projeções de actina envolvidas na migração de células endoteliais (86, 87, 88), oferecendo novas oportunidades, apelativas, de alvos antiangiogénicos, ou com o conhecimento de que compartimentos celulares diferentes têm ambientes diferentes (pH, potencial químico, potencial elétrico, etc.), possibilitando uma entrega dirigida e uma ativação específica de fármacos (90, 91, 32). Mesmo a nível fundamental muito está por fazer: por mero exemplo, a elucidação das proteínas envolvidas em processos de transporte que constituem a interface do compartimento relativamente à via metabólica em causa e o seu papel. Evidencia-se assim necessário que se passe a considerar mais o fator compartimentação no desenvolvimento ou melhoramento de métodos experimentais, computacionais e teóricos, deixando as simplificações excessivas quando não trazem, de facto, vantagens e tirando partido dos avanços técnicos e tecnológicos - existem já muitas ferramentas e ideias para ajudar tal consideração e espera-se que continuem a ser desenvolvidas e aumentadas. Há lugar para isso tanto a “montante”, procurando mais exemplos na investigação Bioquímica e compreender processos fundamentais do metabolismo celular (recomendações já antigas como, em 1999, Brady, Pessin e Saltiel Página | 29

ao indicarem que, para se perceber completamente os mecanismos moleculares relacionados com a ação da insulina, se teria de elucidar a regulação da compartimentação subcelular de diferentes pools de enzimas (92)), como a “jusante”, translacionando o conhecimento adquirido para a Biotecnologia (recurso à biomimetização em elementos artificiais ou à engenharia em elementos naturais), a Medicina, entre outras áreas. Já vários passos foram dados nestas direções, pelo que existe otimismo em relação ao progresso. Isto, atentando sempre tanto às valências como às limitações de cada abordagem – ambas em grande parte ainda desconhecidas. Ao longo desta revisão tentou organizar-se e avaliar-se, concretizando em síntese, a ampla literatura disponível mas dispersa em relação ao padrão que aqui se pretendia identificar, fundamentar e desenvolver. Também era objetivo dos autores expor hiatos ainda por investigar e soluções ainda por explorar. Espera-se que tenha ficado tão avivada a ideia da compartimentação, patente desde o início da vida até aos seus expoentes mais complexos, do mais conhecido ao mais desconhecido, que fique agora mais difícil ignorá-la. Incentiva-se aqui a procura de respostas às perguntas levantadas e a procura de perguntas ainda nem sequer formuladas.

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