Determinação de Zinco em Soro Sanguíneo pelo Método de FAAS e sua Correlação com o Estado de Estresse Determination of Zinc in Blood Serum by FAAS and Its Correlation with the Stress Condition

ROSILENE LINHARES DUTRA, ET AL.

Determinação de Zinco em Soro Sanguíneo pelo Método de FAAS e sua Correlação com o Estado de Estresse Determination of Zinc in Blood Serum by FAAS and Its Correlation with the Stress Condition

ROSILENE LINHARES DUTRA Centro de Ciências da Sáude – Departamento de Química (UFSC/SC)

GENY APARECIDA CANTOS* Centro de Ciências da Sáude – Departamento de Análises Clínicas (UFSC/SC)

ALDIR R. PEROZIN Hospital Universitário (UFSC/SC)

CLÁUDIA S. M. SILVA Hospital Universitário (UFSC/SC)

CARMEN D. A. WALTRICK Hospital Universitário (UFSC/SC)

MARIA DA GRAÇA BALEM Hospital Universitário (UFSC/SC)

ELISABETH M. HERMES Hospital Universitário (UFSC/SC)

ELISABETE S. MELO Hospital Universitário (UFSC/SC) *Correspondências: Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Campus Trindade, 88040900, Florianópolis/SC. [email protected]

RESUMO Foi feita a determinação de zinco em 20 amostras de soro sanguíneo de pacientes atendidos no laboratório do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), utilizando um espectrômetro de absorção atômica Varian Spectra AA 50, equipado com atomizador em chama e lâmpada de cátodo oco para zinco. O zinco foi determinado no soro em triplicata, utilizando-se uma técnica de calibração com adição do analito para eliminar possíveis interferências de matriz. Os valores encontrados para as amostras teste de zinco ficaram entre 0,8 a 1,3 mgL-1, com valores de referências entre 1,0 a 1,4 mgL-1. Os resultados dos pacientes avaliados mostraram que somente dois indivíduos acusaram sofrimento desencadeado pelo estresse, apresentando valor de zinco abaixo de 1,0 mgL-1. Esses resultados demonstram que o zinco pode ser determinado por espectrometria de absorção atômica em chama (FAAS), por meio da técnica de calibração com adição do analito livre de interferências e com boa sensibilidade. Sua determinação é de extrema importância, uma vez que a deficiência de zinco está relacionada com muitas patologias, entre elas o estresse. Palavras-chave ZINCO – SORO – ESTRESSE. ABSTRACT Zinc determination was performed in 20 blood serum samples of patients at The Hospital Universitario in Universidade Federal de Santa Catarina, Brazil. In all determinations, a Varian Spectra AA 50 atomic absorption spectrometer with flame atomizer and zinc hollow cathode lamp was used. A standard addition calibration was used to perform all the determinations, in order to avoid matrix interferences. The results found in test samples containing zinc were within the 0.8 mgL-1 to 1.3 mgL-1 range (n = 3); reference values were found within the 1.0 – 1.4 mgL-1 range. The results obtained with the evaluated patients showed that only two of them suffered of stress, resulting in a zinc concentration below 1.0 mgL-1. These results show that zinc can be determined by FAAS, through an interferencefree standard addition calibration technique with a good sensitivity. Zinc determination is of great importance, since the deficiency of this element is related to many pathologies, such as stress. Keywords ZINC – BLOOD SERUM – STRESS.

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INTRODUÇÃO zinco é um elemento traço essencial para humanos, animais, plantas e microorganismos, e seu conteúdo em humanos gira em torno de 2 g a 4 g. Concentrações elevadas de sal de zinco podem, contudo, causar queimaduras cáusticas externas e inflamações internas dos órgãos digestivos. Portanto, o seu limite de toxicidade é mais alto do que os outros elementos essenciais, por exemplo, o cobre.22 O zinco está presente, sobretudo, no músculo (60%) e nos ossos (30%), constituindo relevante elemento no corpo. É componente catalítico de mais do que 200 enzimas e constituinte estrutural de muitas proteínas. Sua função, provavelmente, está associada à prevenção da formação de radicais livres.13 Muitos trabalhos têm indicado que vários elementos traços, como o zinco, possuem papel importante em um número de processos biológicos pela inibição ou ativação de reações enzimáticas e pela competição com outros elementos, afetando a permeabilidade de células ou outros mecanismos. Dessa forma, pode-se assumir que elementos traços como o zinco exercem ação direta ou indireta no processo carcinogênico. Huang et al. constataram que pacientes com câncer de mama apresentam sérios distúrbios nos níveis de elementos traços, especialmente aqueles envolvidos no sistema antioxidante, como zinco, cobre e selênio.8 A atividade antioxidante do zinco tem sido também relatada por estudiosos.21 Esses pesquisadores observaram maiores concentrações de zinco sérico em atletas anaeróbicos (judô e esgrima) do que em atletas aeróbicos (ciclistas), por conta da baixa metabolização desse elemento, resultado da diminuição do metabolismo energético e da função antioxidante. Similarmente, estudos preliminares consideraram que, em atleta, o zinco apresenta-se diminuído nos eritrócitos e nos ossos, em razão da sua redistribuição para reparar os danos teciduais.14 Recentes pesquisas têm se concentrado no papel crucial do zinco sobre a imunidade e os efeitos de sua deficiência na resposta imune.18 Esse metal apresenta impacto sobre os mediadores da imunidade, como enzimas, pepitídeos tímicos e citocinas, explicando a grande importância do seu estado nutricional na regulação da atividade, proliferação e apoptose das células linfóides.4

O

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Além disso, como um cofator, esse elemento traço influencia a secreção de timulina e, portanto, regula a função imune mediada pelas células tipo linfócito “T”.3 O zinco revela-se também um elemento pivô em todo crescimento rápido de tecido, porque é um componente de DNA e RNA polimerase e tem ação modulatória e protetora no crescimento de ambas as células, normais e cancerígenas.6 A deficiência de zinco em humanos é comum, sendo mais prevalente em áreas onde a população vive de proteína cereal, pois esse elemento está disponível particularmente na carne vermelha e nos frutos do mar. O alto consumo de alimentos ricos em inibidores da absorção de zinco, como fitatos, certas dietas de fibras e cálcio, causam deficiência desse elemento traço.5 A deficiência de zinco também pode ocorrer em muitos processos patológicos ou mesmo em desordens de origem genética, os quais podem levar à diminuição da absorção, da utilização e da perda desse elemento. Sua deficiência inclui retardo no crescimento, hipogonadismo em homens, disfunção imunológica mediada por célula e mudança de pele.5 O enfraquecimento neurofisiológico apresenta-se como um dos severos resultados potenciais de tal deficiência, pois esse elemento é um metal de transição, essencial para a atividade e o controle neuronal de doenças neuronais, tendo sido relatado em várias doenças humanas neurodegenerativas.7 O estresse excessivo pode levar a deficiências de minerais essenciais, como magnésio, cálcio, zinco e ferro.6 Adicionalmente, quando estamos estressados, tendemos a negligenciar nossa dieta e, então, piorar essa condição patológica pela ingestão inadequada de minerais. As deficiências minerais estão ligadas a uma grande variedade de disfunções, que vão desde infertilidade e redução do crescimento a úlcera, hipertensão arterial e doença isquêmica do coração.5, 8 O estresse pode ser definido como um estado de tensão no corpo e na mente, resultado de eventos ameaçadores ou ambíguos do mundo interior, ou assim interpretados, que provoca alterações no modo de funcionamento do nosso organismo.1 Estes, quando excessivos, podem desencadear reações fisiológicas, alterações bioquímicas, situações patológicas, destacando-se as cardíacas, que comprovadamente têm o estresse como um dos fatores de risco.15 Entre outras SAÚDE REV., Piracicaba, 6(14): 31-37, 2004

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doenças decorrentes do estresse, têm-se: resistência imunológica, hipertensão arterial, alergias, dores de cabeça e depressão.16 A saúde humana depende de um delicado balanço entre reações no organismo, em que nervos, músculos, sangue, ossos, sistema endócrino e tecido visceral são continuamente renovados. Mudanças vitais ocorrem seguidamente, envolvendo muitas atividades de sistemas enzimáticos por minerais ou elementos traços como o zinco.18 A concentração total de zinco no plasma seminal humano é extremamente alta, aproximadamente 2 mM, sendo bem estabelecido que a próstata secreta altos níveis desse elemento. Existem evidências de que o zinco em plasma seminal influencia o consumo de oxigênio do espermatozóide na condensação da cromatina nuclear e na atividade da acrosina. A deficiência de zinco causa hipogonadismo, sendo esse elemento importante na estabilização da cromatina espermática e, portanto, a sua concentração no plasma seminal é fundamental para a espermatogênese.23 O zinco é um dos elementos mais freqüentemente determinados por espectrometria de absorção atômica em chama (FAAS). Sua concentração característica de 0,01 mg/L pode ser alcançada na chama ar/acetileno, com a linha de ressonância de 213,9 nm. Dessa forma, o zinco é um dos elementos com maior sensibilidade em FAAS.22 A espectrometria de absorção atômica constitui um método analítico para a determinação de elementos em pequenas quantidades. Baseiase na absorção de energia de radiação por átomos livres. Na técnica de absorção em chama, a amostra é pulverizada no interior da chama, na forma de aerossol gerado por meio de nebulizador. A chama mais largamente usada é a chama ar/acetileno. Para uma faixa de 30 elementos, oferece um ambiente adequado e uma temperatura suficiente em que se faz a sua determinação quantitativa.11 A técnica de adição do analito consiste em obter um número de alíquotas em replicatas de amostra, adicionar nelas gradativamente quantidades conhecidas do analito (soluções de calibração) e diluir para o mesmo volume. Uma das alíquotas é diluída somente com o solvente – essa contém zero de analito adicionado. Uma série de soluções assim obtidas serve como um

conjunto de soluções de calibração. Quando os valores de absorbância de cada solução são plotados versus a concentração do analito adicionado, obtém-se uma curva de calibração que intercepta o eixo da absorbância em valores maiores do que zero. Realiza-se a subtração da concentração do analito extrapolando a curva de calibração para interceptar o eixo da concentração negativa.21 A determinação de zinco na chama ar/acetileno pode ser feita sem a interferência de materiais biológicos, como urina e eritrócitos,19, 24 e em soro pela espectrometria de absorção atômica também livre de interferência.20, 22 No presente estudo, realizou-se a quantificação de zinco em amostras de soro sanguíneo de pacientes atendidos no Hospital Universitário, da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), pela técnica de espectrometria de absorção atômica em chama, correlacionando-se essas análises com o estado de estresse de tais indivíduos.

MATERIAIS E MÉTODOS Metodologia Selecionaram-se, para este estudo, 20 pacientes (servidores, professores e alunos) da UFSC, com idade entre 25 e 30 anos, que fazem parte do Núcleo Interdisciplinar de Pesquisa, Extensão e Atendimento a Dislipidemia (NIPEAD), Portaria n.º 010/DG-HU/2002. Cada indivíduo respondeu a um questionário, que serviu de instrumento de avaliação quanto ao estado de estresse dos pacientes em questão. Compôs-se a escala de sete itens, gerados com base na percepção do sujeito solicitado a se posicionar quanto aos diferentes questionamentos.12 O sangue dos pacientes, que permaneceram 12 horas em jejum, foi coletado pela manhã, por punção venosa em tubo sem anticoagulante, tomadas as devidas precauções assépticas, e, em seguida, centrifugado por 10 minutos a 3.000 x g e separado do soro. Congelaram-se as amostras em tubos desmineralizados a -20ºC, até o momento da análise.

Preparo da Amostra O soro foi diluído 1:5 com água deionizada no momento das análises, sendo que a diluição diminui prováveis interferências de matriz,22

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usando-se 1,0 mL de soro para determinação de zinco. Realizou-se um tratamento com Triton X-114 (Sigma Chemical, Alemanha) para eliminar a absorção molecular, ou seja, a presença de macromoléculas que alteram o sinal analítico.

Preparo da Curva de Calibração No preparo das soluções, empregou-se água deionizada proveniente de um sistema de purificação de água Milli-Q® da Millipore® (Bedford, MA, USA). Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. Selecionou-se o método de adição do analito para este estudo em razão da interferência de matriz observada. Pelo uso da técnica de calibração padrão, o sinal analítico da solução amostra estava resultando em um valor muito acima do especificado pela literatura.22 Para a construção da curva de calibração com adição do analito, retiraram-se quatro alíquotas da solução amostra teste, sendo que em uma delas o analito não foi adicionado, ao passo que foi adicionado aos demais volumes crescentes, utilizando-se uma solução de óxido de zinco a 0,1 mgL-1 para um volume final de 5 mL, conforme ilustrado na tabela 1. A concentração de zinco no soro foi determinada em triplicata por espectrometria de absorção atômica em chama. Realizou-se a análise de zinco em um espectrômetro de absorção atômica Varian Spectra AA 50, equipado com atomizador em chama e lâmpada de cátodo oco para zinco. Adotaram-se os seguintes parâmetros operacionais: comprimento de onda de 213,9 nm, corrente máxima da lâmpada 5 mA, chama ar/acetileno e fenda espectral 1 nm. Tabela 1. Curva de calibração para a determinação de zinco no soro, obtida pela técnica de adição do analito.22 AMOSTRA (mL) 1

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ÓXIDO DE ZINCO 10 PPM CONCENTRAÇÃO (mgL-1)

VOLUME µL) (µ

0

0

1

1,5

45

1

2,0

60

1

25

75

1

3,0

90

Procedimento Analítico • O soro foi diluído 1:5 com água ultra-pura, utilizando-se 1 mL de soro para 4 mL de água; • distribuiu-se em cinco alíquotas de 1 mL; • foram adicionados 50 µL surfactante Triton X 114 e agitados para formação das micelas; • adicionaram-se alíquotas crescentes de solução padrão de zinco – zero de adição no tubo um, e 45, 60, 75 e 90 µl nos tubos dois, três, quatro e cinco, respectivamente; • fez-se uma curva de adição para cada amostra, em virtude da presença de interferentes; • as leituras feitas em triplicatas (absorbância) foram plotadas versus concentração do padrão adicionado, obtendo-se um gráfico e, através da reta, a concentração em µg/mL das amostras isoladamente.

RESULTADOS E DISCUSSÃO Construíram-se as curvas de calibração com o emprego de cinco soluções de calibração para curva-padrão e quatro amostras de calibração para a técnica com adição do analito, com leituras em triplicata, plotando-se o sinal analítico obtido versus concentração e massa. Após vários testes preliminares, observou-se a necessidade de eliminar a absorção molecular causada pelas proteínas presentes na amostra. Para tanto, utilizou-se uma curva de calibração padrão, com faixa apropriada de trabalho de 0,0409 a 0,2432 mgL-1. Contudo, o sinal analítico obtido nas nossas amostras revelou-se aproximadamente 10 vezes acima do valor mais alto da curva de calibração. Para eliminar o problema, foi necessário tratar a amostra com um desproteinizante que, segundo a literatura, poderia ser ácido tricloroacético a 10%, ácido nítrico ou surfactante Triton X 114. Obteve-se um sinal analítico de 0,7876 na amostra tratada com ácido nítrico,7 de 0,7530 com ácido tricloroacético 10%, e de 0,3272 com surfactante Triton X 114.2, 15, 17 Nesta pesquisa, optou-se pelo uso do surfactante Triton X 114, por ter apresentado o sinal analítico mais coerente. Estudos efeitos com surfactantes na determinação de nove elementos, incluindo zinco, em FAAS, determinaram que a presença de interferência diminuiu na presença do surfactante, quando comparado à amostra diluída com água.17 SAÚDE REV., Piracicaba, 6(14): 31-37, 2004

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Figuras 1 e 2. Curvas de calibração para determinação de zinco em soro: (1) curva de calibração padrão e (2) curva de calibração com adição do analito.

Ao analisar o mecanismo do surfactante em

FAAS, Armstrong2 verificou um aumento na sensi-

bilidade (a inclinação da curva trabalhada) da determinação em torno de 44%. Outros pesquisadores, na análise do efeito do surfactante na distribuição do tamanho da gota, no transporte, na eficiência e na sensibilidade em FAAS no nebulizador pneumático, observaram que o surfactante realmente modifica a característica do aerosol primário, influenciando, dessa forma, o transporte do aerosol e o sinal analítico.15 Mesmo após a eliminação das proteínas, o sinal analítico, nesta pesquisa, continuava ainda acima da faixa apropriada de trabalho da curva de calibração padrão. Constatou-se, então, a presença de interferência de matriz e, segundo a literatura, a curva de calibração padrão só deve ser empregada em amostra livre de interferência.22 Para resolver essa questão, adotou-se a técnica de adição do analito, conforme descrito na metodologia.22 Somente assim, os sinais analíticos das amostras ficaram dentro da faixa de trabalho e também próximos aos valores relatados na literatura. Provavelmente, as interferências de matriz foram eliminadas pelo uso dessa técnica (figs. 1 e 2). A figura 1 mostra uma resposta linear na calibração do equipamento, em função da concentração. Porém, quando se tentou quantificar

a concentração de zinco nas amostras de soro, observou-se que o sinal analítico das amostras testes ficou acima da linearidade dessa curva, indicando que tal método não poderia ser empregado para a determinação direta de zinco em soro sanguíneo. Esses resultados revelaram-se diferentes das determinações realizadas em estudos anteriores.20 Estes pesquisadores determinaram o zinco em soro sanguíneo, requerendo somente uma diluição da amostra 1:1, livre de interferência, e utilizaram uma curva de calibração padrão e otimização da curva com o método de recuperação. Outros trabalhos têm determinado zinco em uma larga extensão de matrizes complexas sem a presença de interferências, com o uso de uma chama ar/acetileno.9 A curva de calibração, com adição do analito, apresentou resposta linear para todas as determinações. A figura 2 indica como se obtiveram as determinações de zinco das amostras: adotou-se a equação da reta de uma amostra teste, em que y (absorbância integrada) é igual a 0,21775 + 0,08656 x (onde x representa a massa da amostra em mg), e r é o coeficiente de linearidade, igual a 0,99267. Após eliminar a interferência de matriz, foram feitas as determinações de zinco em triplicata nas amostras de soro, como ilustra a tabela 2.

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Tabela 2. Determinação de zinco em amostras de soro sanguíneo pela técnica de calibração com adição do analito. AMOSTRAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 X±S

VALORES OBTIDOS (mgL-1) 1,0 ± 0,07 1,2 ± 0,06 1,3 ± 0,06 0,8 ± 0,05 1,3 ± 0,07 1,2 ± 0,05 1,3 ± 0,08 1,3 ± 0,07 0,9 ± 0,06 1,3 ± 0,07 1,3 ± 0,05 1,3 ± 0,08 1,2 ± 0,07 1,1 ± 0,07 1,0 ± 0,05 1,1 ± 0,06 1,2 ± 0,07 1,2 ± 0,06 1,3 ± 0,07 1,3 ± 0,08 1,18 ± 0,15

EQUAÇÃO DE REGRESSÃO LINEAR

R

ESTADO DE

Ya = 0,22326 = 0,12894 xb Y = 0,22858 + 0,09323 x Y = 0,09661 + 0,16796 x Y = 0,22151 + 0,12374 x Y = 0,10617 + 0,15069 x Y = 0,0923 + 0,200610 x Y = 0,07575 + 0,16789 x Y = 0,10841 + 0,30113 x Y = 0,02764 + 0,16784 x Y = 0,04757 + 0,17990 x Y = 0,0529 + 0,22209 x Y = 0,11474 + 0,18969 x Y = 0,37226 + 0,16466 x Y = 0,0792 + 0,21863 x Y = 0,18645 + 0,16757 x Y = 0,05248 + 0,1914 x Y = 0,06427 + 0,19215 x Y = 0,28491 + 0,10616 x Y = 0,13122 + 0,1794 x Y = 0,12803 = 0,18306 x

0,99828 0,99922 0,99972 0,99611 0,98499 0,99688 0,99772 0,98945 0,99109 0,99936 0,99008 0,99740 0,97854 0,99651 0,99960 0,99997 0,99986 0,97468 0,99848 0,99966

2 2 3 6 3 2 2 2 5 3 3 2 2 1 0 0 1 1 2 2

ESTRESSEC

a absorbância em integração; b concentração de zinco em ppm; R = coeficiente de linearidade; x = média; s = desvio-padrão. c Estados de estresse:

0 indica positivo bem-estar; 1 baixa positividade; 2 marginal; 3 indica problema de estresse; 4 indica sofrimento sério; 5 indica sofrimento severo.

Analisando os valores obtidos nos questionários aplicados aos pacientes, constatamos que nossos resultados estão concordantes com a literatura, pois os dois pacientes (4 e 9) que apresentaram valores abaixo de 1 mgL-1 foram os que apresentaram sofrimento sério e severo, como pode ser observado na tabela 2. Além disso, quatro pacientes tiveram início de sofrimento, porém, os valores de zinco mostraram-se normais, o que provavelmente pode se explicar pela atividade física por eles exercida, conforme relatos de Mocchegiani et al.14 Portanto, de fato, o zinco é requerido para o desenvolvimento e crescimento de toda espécie animal, incluindo humanos, e a sua deficiência resulta numa taxa reduzida de crescimento, fator determinante de estresse e outras patologias. Na tabela 2, podemos observar que a técnica de FAAS foi sensível e a maioria dos valores de zinco em amostras sanguíneas analisadas ficou dentro do limite esperado: 1 e 1,4 mgL-1. A média total dos valores determinados foi 1,18 ± 0,15 mgL-1, dentro dos limites especificados pela literatura. 36

Sprague e Slawin18 mostram que os valores de zinco em um pool de plasma de quatro adultos saudáveis foram 1,07 ± 0,027 mgL-1 e, em soro humano, 1,04 ± 0,15 mgL-1. Kocaturk et al.10 obtiveram uma média dos valores do sangue de 0,8946 ± 0,13 mgL-1, determinando a concentração de zinco em 30 pacientes com doença de Parkinson. Ao analisar a deficiência dietética de zinco em amostra de sangue de ratos, pesquisadores5 constataram que a concentração de zinco no soro mostrou-se significativamente menor nos ratos alimentados com dieta deficiente de zinco – entre 17% e 78% –, quando comparada com o grupocontrole. Concluíram, então, que tal deficiência retardou o crescimento dos ratos, causando também redução nos parâmetros hematológicos, proteína no soro, glicose e HDL (lipoproteína de baixa densidade), e aumentando os valores de lipídios e LDL (lipoproteínas de alta densidade).5 A análise feita com associação entre estresse e elemento traço sugeriu que o aumento do estresse em pacientes com câncer de mama pode resultar de mudanças nos níveis de certos elementos traço, SAÚDE REV., Piracicaba, 6(14): 31-37, 2004

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como o zinco.8 Em estudo sobre o efeito relativo da desnutrição protéica, do alcoolismo e do conteúdo de zinco em diferentes órgãos, pesquisadores7 observaram que a desnutrição protéica leva a uma depleção de zinco no fígado, bem como o alcoolismo e a desnutrição protéica causam depleção do zinco no músculo e aumento da excreção urinária de zinco.7

CONCLUSÃO O zinco é um metal traço que pode ser determinado por FAAS, pela técnica de calibração, com adição do analito livre de interferências, apresentando boa sensibilidade, podendo ser um marcador importante para determinar o estado de estresse.

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