Investigação. 2010;10:37-43
Investigação
ISSN 2177-4080 (on-line)
http://publicacoes.unifran.br
Artigo Original
Determinação in vitro da Atividade Antibacteriana dos Extratos Brutos da Casca e Polpa Farinácea de Hymenaea courbaril L. In vitro Determination of the Antibacterial Activity of the Crude Extracts from the Exocarp and the Farinaceous Pulp of Hymenaea courbaril L. Carlos Henrique Gomes Martins1*, Fernanda Rocha Souza,1 Colete Fonseca1, Luciana Assirati Casemiro1, Niege Araçari Jacometti Cardoso Furtado2, Sérgio Ricardo Ambrosio1, Wilson Roberto Cunha1 Universidade de Franca, Franca, São Paulo, Brasil2; Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. 1
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Recebido em: 04/02/10 | Recebido revisado em: 20/04/10 | Aceito em: 08/06/10 | Disponível on-line em: 22/12/10
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resumo
Foi avaliada a atividade antibacteriana in vitro de extratos brutos etanólicos da casca e da polpa farinácea da Hymenaea courbaril L. frente a bactérias padrão e isolados clínicos Gram-positivos e Gram-negativos. Foram utilizados dois métodos a difusão em ágar e microdiluição em caldo. Pelo método de difusão em ágar, houve atividade antibacteriana da polpa farinácea nas concentrações de 300 e 500mg/mL frente a: S. aureus, E. faecalis e S. flexineri (ATCC 12022). Para o método de diluição em caldo a atividade antibacteriana do extrato etanólico da casca e da polpa farinácea foi demonstrada contra todos os microrganismos testados, em concentrações que variaram de 350µg/mL a >400µg/mL, e os melhores resultados foram da CIM de 350µg/mL tanto para o extrato da casca como para a polpa farinácea frente aos isolados clínicos de S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e E. coli, P. aeruginosa, respectivamente. Concluímos que a casca e a polpa farinácea de Hymenaea courbaril L. apresentaram pequeno espectro de ação da atividade antibacteriana frente aos microrganismos avaliados; porém, novos estudos químicos, farmacológicos e clínicos devem ser realizados a fim de identificar substâncias ativas com potencial antimicrobiano. Palavras-chave: Hymenaea courbaril L.; atividade antibacteriana; extrato etanólico bruto; plantas medicinais.
abst r ac t
The in vitro antibacterial activity of the ethanolic crude extracts from the exocarp and farinaceous pulp of Hymenaea courbaril L. against standard bacteria and Gram-positive and Gram-negative clinical isolates was evaluated. Two methods were employed for this purpose, namely agar diffusion test and broth microdilution. The agar diffusion test demonstrated the antibacterial activity of the farinaceous pulp at concentrations of 300 and 500mg/mL against S. aureus, E. faecalis, and S. flexineri (ATCC 12022). The broth microdilution technique showed the antibacterial activity of the exocarp and farinaceous pulp against all the tested microorganisms, at concentrations ranging between 350µg/mL and >400µg/mL. In this case, the best results were MIC of 350µg/mL both for the exocarp and the farinaceous pulp extract against the clinical isolates of S. aureus, E. coli, and P. aeruginosa; and E. coli and P. aeruginosa, respectively. Therefore, the exocarp and farinaceous pulp of Hymenaea courbaril L. presented narrow spectrum of antibacterial action against the evaluated microorganisms. Further chemical, pharmacological and clinical studies must be carried out in order to identify the active compounds with potential antimicrobial activity. Keywords: Hymenaea courbaril L.; antibacterial activity; ethanolic crude extracts; medicinal plants.
*Autor correspondente Telefone: Endereço: Avenida Dr. Armando Salles Oliveira, 201, 14404-600, Parque Universitário, Franca, São Paulo, Brasil. (16) 3711-8756 Fax (16) 3711 8873 | E-mail:
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Introdução O reino vegetal tem contribuído de forma bastante significativa para o fornecimento de substâncias aplicáveis no tratamento de doenças que acometem os seres humanos (Cowan, 1999; Montanari; Bolzani, 2001). A grande diversidade do número de plantas no mundo é enorme e estima-se a existência entre 215.000 a 500.000 espécies (Newman et al., 2003). Esta grande reserva natural de compostos orgânicos tem demonstrado um papel altamente importante na descoberta e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos (Cowan, 1999; Alves et al., 2000). No entanto, somente uma pequena porcentagem dos recursos vegetais têm sido fotoquímica e/ou biologicamente investigados (Yunes; Valdir Filho, 2001). Hymenaea é um gênero pertencente à família Fabaceae e à subfamília Caesalpiniaceae, sendo um representante importante da flora brasileira, onde é representada por aproximadamente 30 espécies (Rizzini, 1971), que são encontradas em altitudes de até 900m acima do nível do mar, em solos arenosos e argilosos bem drenados de terra firme e várzeas altas, mas raramente em campos abertos (Ferreira; Sampaio, 2000). H. courbaril também conhecida popularmente como jatobá, jitaí, aboti-timbaí, fava-doce, jatobá-da-caatinga, farinheira, entre outros, apresenta-se como árvores de tamanhos que variam entre 15 a 20m de altura. Segundo Lorenzi e Matos (2002) essa espécie vegetal é utilizada popularmente como carminativa, sedativa e adstringente, o chá da casca é recomendado para diarréia, disenteria e cólicas intestinais. Uma revisão dos metabólitos secundários identificados nessa espécie demonstrou que diterpenos, xiloglucanas, galactomananas, oligossacarídeos e alguns tipos de ácidos graxos são os principais metabólitos presentes nesses vegetais (Tiné et al., 2000; Marsaioli et al., 1975; Lima et al., 2003). Nos últimos anos, a resistência microbiana às múltiplas drogas, bem como o aparecimento de novos tipos de infecções, vêm aumentando rapidamente e se tornando um problema mundial de saúde pública (Gaspar-Marques et al., 2006; Spellberg et al., 2004), por serem as doenças infecciosas uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos países em desenvolvimento (Ahmad; Beg, 2001). Esses fatos provocaram uma ampliação pela busca de alternativas para o tratamento de novas infecções (Gaspar-Marques et al., 2006). No presente estudo foram utilizados bactérias padrão e isolados clínicos causadores de infecções humanas. Sobre as bactérias selecionadas para este trabalho, algumas considerações devem ser feitas; a maioria delas é comumente associada a doenças intestinais. S. aureus é o agente mais comum de infecções piogênicas, podendo ser localizada na pele ou regiões mais profundas, também é responsável por vários tipos de intoxicações, incluindo as intoxicações alimentares. E. faecalis está presente na microbiota normal do homem e animais, particularmente no trato gastrintestinal e está associado a infecções diversas como bacteremia, infecção do trato urinário e intra-abdominais. As bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae (E. coli, S. flexeneri e S. Choleraesuis) aqui estudadas, causam infecções intestinais e extra-intestinais, podendo em alguns casos atravessar a mucosa intestinal determi-
nando bacteremia e infecções em diversos órgãos. P. aeruginosa é capaz de causar infecções localizadas em processos cirúrgicos, infecções hospitalares como bacteremia e ceratite (Murray et al., 2007). Desse modo, o objetivo do presente trabalho foi determinar a atividade antibacteriana in vitro por dois métodos, dos extratos brutos etanólicos obtidos da casca (exocarpo) e da polpa farinácea (endocarpo) da espécie Hymenaea courbaril L. frente a bactérias padrão e isolados clínicos Gram-positivos e Gram-negativos, causadoras de infecções humanas. Material e Métodos Coleta e identificação do vegetal A espécie vegetal foi coletada no mês de fevereiro do ano de 2006 em seu ambiente natural na Fazenda São Joaquim, no município de Batayporã, localizada a leste do Estado do Mato Grosso do Sul (Brasil), a 302 km da capital Campo Grande com coordenadas aproximadas de 22°26’S e 53°02’W G e altitude de 232 m. A identificação botânica foi realizada pelo Prof. Dr. Milton Groppo Júnior do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, sendo a exsicata depositada no herbário desta faculdade sob o código SPFR 10019. Preparação e obtenção dos extratos Foram utilizados os frutos do vegetal, que separados totalizaram 2.000 gramas de casca e 1.700 gramas de polpa farinácea de Hymenaea courbaril L. A seguir foram secas em estufa de ar circulante à temperatura de 40 °C. Em seguida, as partes do vegetal foram pulverizadas e extraídas por maceração utilizando-se uma mistura de EtOH/H2O (96:4 v/v) a 25ºC durante sete dias. Os extratos obtidos foram filtrados e concentrados em rotaevaporador sob pressão reduzida, obtendo-se, após a secagem, 97,8g de extrato das cascas e 87,3g de extrato da polpa. Bactérias avaliadas Os ensaios foram realizados utilizando-se os microrganismos provenientes da “American Type Culture Collection” (ATCC) e de isolados clínicos pertencentes à coleção do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia Aplicada - LaPeMA/Unifran (Tabela 1). Atividade antibacteriana pelo método da difusão A determinação da atividade antibacteriana pelo método de difusão em ágar foi realizada pela técnica do poço segundo Grove e Randall (1955), utilizando-se um inóculo de 108 UFC/mL. Foram utilizadas placas de Petri com ágar Mueller-Hinton (Difco), poços de 4,0 mm de diâmetro foram confeccionados, sendo esses completamente preenchidos com 40 µL dos extratos de casca e polpa farinácea solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) nas concentrações de 300 mg/mL e 500mg/mL. Como controle positivo utilizou-se Penicilina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) e Gentamicina (Sigma) na concentração de 0,05mg/ mL e como controle negativo 40 µL de DMSO. As placas foram pré-incubadas por um período de 3 horas à
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temperatura ambiente, permitindo a difusão dos extratos, como preconizado por Möller, (1966). Em seguida, as placas foram incubadas em aerobiose a 37º C por 24 horas e a atividade anti-
bacteriana avaliada pela mensuração do halo de inibição ao redor dos poços. O ensaio foi realizado em triplicata.
Tabela 1. Origem das cepas e isolados clínicos utilizados nos experimentos da atividade antibacteriana
Bactérias
Origem ATCC
Origem Isolado Clínico (*)
Staphylococcus aureus
9144
Hemocultura
Enterococcus faecalis
19433
Urina
Escherichia coli
14948
Urina
Shigella flexineri
12022
Fezes
Pseudomonas aeruginosa
27853
Secreção de ouvido
Salmonella choleraesuis
14028
Fezes
(*)As bactérias isoladas de amostras clínicas já se encontravam estocadas na bacterioteca do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia Aplicada da Universidade de Franca.
Atividade antibacteriana pelo método da diluição A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos brutos foi realizada segundo metodologia da diluição em caldo proposta pelo “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI) formerly “National Committe for Clinical Laboratory Standard” - NCCLS (NCCLS, 2003), avaliando-se os extratos na faixa de concentração entre 50 e 400µg/mL solubilizados na maior concentração em 5% de DMSO. Foram utilizadas microplacas esterilizadas com 96 orifícios. Cada orifício recebeu o inóculo, o meio de cultura líquido caldo Muller-Hinton (Difco) e as soluções dos extratos brutos diluídos, de tal maneira que o volume final em cada orifício foi de 100µL. Como controles positivos foram utilizados a penicilina e gentamicina, onde as concentrações avaliadas variaram de 0,0115µg/ mL a 5,9µg/mL. O DMSO nas concentrações de 1 a 5% foi utilizado como controle negativo. As microplacas foram então incubadas a 37ºC por 24 horas. Após esse período foram adicionados em cada orifício 30µL de solução de resazurina a 0,02% em solução aquosa para análise dos resultados (Palomino et al. 2002; Sarker et al. 2007; Ambrosio et al. 2008; Porto et al. 2009a,b). O ensaio foi realizado em triplicata. Análise estatística (Triola, 1999) Os resultados da atividade antibacteriana pelo método do poço foram expressos como média ± desvio padrão. Análises estatísticas de variância seguindo o modelo ONE-WAY ANOVA e teste de Tukey também foram utilizados para avaliar a proporcionalidade entre a concentração dos extratos e diâmetro dos halos de inibição. Resultados e Discussão Os resultados obtidos com os extratos de H. courbaril L. utili-
zando-se o método de difusão em ágar podem ser observados na Tabela 2. Analisando os resultados nas duas concentrações avaliadas, pode-se verificar que o extrato da polpa farinácea demonstrou atividade antibacteriana principalmente para as bactérias Grampositivas S. aureus - ATCC (10,00±0,00 e 14,66±2,30), S. aureus – isolado clínico (11,33±0,57 e 12,00±0,00), E. faecalis - ATCC (8,66±1,15 e 11,33±0,57) e E. faecalis – isolado clínico (11,00±0,00 e 12,00±0,00). Destaca-se que a única bactéria Gram-negativa que demonstrou sensibilidade à ação desse extrato foi a cepa S. flexineri - ATCC (10,33±0,57 e 14,33±0,57) nas duas concentrações testadas. No entanto, observa-se também que o extrato da casca não foi capaz de inibir o crescimento de nenhum dos patógenos avaliados (Tabela 2). Na Tabela 3 observa-se os resultados das concentrações inibitórias mínimas dos extratos brutos etanólicos da casca e da polpa farinácea de H. courbaril L., após realização da técnica de microdiluição em caldo. Os resultados da técnica de microdiluição em caldo demonstraram que houve atividade antibacteriana com CIM na concentração de 350µg/mL para o extrato bruto da casca de H. courbaril, frente aos isolados clínicos S. aureus, E. coli e P. aeruginosa e também nesta concentração para o extrato bruto da polpa farinácea frente a E. coli e P. aeruginosa. Para as demais bactérias a CIM foi superior a 400µg/mL. Por esta técnica os melhores resultados da CIM foram obtidas para os isolados clínicos, sugerindo serem mais sensíveis que as cepas padrão. Para os extratos que apresentaram atividade antibacteriana quando utilizada a técnica da microdiluição em caldo, verificouse que não apresentaram atividade quando realizado o método de difusão. Esses resultados talvez possam ser explicados pela dificuldade de difusão do extrato no meio de cultura. Bandeira et al. (1998) observaram que a dificuldade de difusão de produtos naturais pode estar relacionada à sua hidrossolubi-
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Tabela 2. Atividade antimicrobiana dos extratos brutos etanólicos da casca e da polpa farinácea de H. courbaril pelo método da difusão em ágar (técnica do poço). Média e desvio padrão dos diâmetros dos halos de inibição (em mm)
Bactérias Isolados clínicos a ATCC
Casca
Polpa farinácea Controle Positivo
300 mg/mL Média ± D.P
500mg/mL Média ± D.P
300 mg/mL Média ± D.P
500 mg/mL Média ± D.P
S. aureus (ATCC 9144)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
*10,00 ± 0,00
*14,66 ± 2,30
18,33 ± 2,301
S. aureus (isolado clínico)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
11,33 ± 0,57
12,00 ± 0,00
16,66 ± 1,151
E. faecalis (ATCC 19433)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
8,66 ± 1,15
11,33 ± 0,57
17,00± 0,001
E. faecalis (isolado clínico)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
11,00 ± 0,00
12,00 ± 0,00
16,00 ± 0,001
E. coli (ATCC 14948)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
15,33 ± 0,572
E. coli (isolado clínico)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
14,66 ± 1,152
S. flexineri (ATCC 12022)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
*10,33 ± 0,57
*14,33 ± 0,57
16,33 ± 0,572
S. flexineri (isolado clínico)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
14,33 ± 2,302
P. aeruginosa (ATCC 27853)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
12,66 ± 1,152
P. aeruginosa (isolado clínico)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
14,33 ± 2,302
S. choleraesuis (ATCC 14028)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
11,00 ± 0,002
S.choleraesuis (isolado clínico)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
17,00 ± 0,002
(*) – Diferença estatisticamente significante entre os halos de inibição nas concentrações de 300 mg/mL e 500 mg/mL, de acordo com o teste de Tukey (a>0,05). Controles positivos: (1) – Penicilina 0,05 mg/mL; (2) – Gentamicina 0,05 mg/mL.
lidade e ao seu peso molecular. Essas afirmações estão de acordo com Rios et al. (1988) que argumentaram que as pesquisas com atividade antimicrobiana de plantas encontram problemas devido à propriedade lipofílica de algumas amostras. Neste estudo os autores avaliaram que a insolubilidade de óleos essenciais e extratos não polares de plantas tornam difícil o uso de um meio aquoso no estudo da atividade antimicrobiana. Gundiza (1986) analisou extratos de polaridades crescentes de Helinus interigolius utilizando um método de difusão em ágar e diluição. Pela técnica de diluição em caldo, todas as frações exibiram atividade contra Candida albicans, com o método de difusão em ágar nenhuma das frações exibiu atividade contra essa levedura. Segundo o autor isso é devido ao fato de que extratos de plantas frequentemente têm baixas propriedades de difusão, enquanto no método de diluição em caldo as amostras estão em contato direto com o microrganismo teste. Se o extrato tiver baixa solubilidade em água, pelo menos as partículas em suspensão ainda estarão em contato com o organismo teste. Esses resultados são concordantes com o nosso trabalho, que apresentou poucos resultados pelo método de difusão em ágar. Por vezes, deparamo-nos com trabalhos com uma mesma planta e observamos resultados distintos em relação à atividade antimicrobiana, às vezes até mesmo discrepantes, em que foram
utilizadas as mesmas condições de experimento (ex: solvente utilizado para extração, temperatura, tempo de incubação e microrganismos) embora as técnicas ou modificações empregadas nos métodos de “screening” para avaliar a atividade antimicrobiana por diferentes autores não tenham sido as mesmas (Rios et al. 1988; Alves et al. 2008). Segundo Auricchio e Bacchi (2003), quando se comparam estudos de plantas medicinais, é notória a dificuldade de avaliação entre os resultados, pois as variáveis vão desde os aspectos climáticos que exercem influência na composição química, como o estágio de desenvolvimento do vegetal quando da sua coleta, parte da planta estudada, forma de preparar o material estudado, até os protocolos seguidos nos experimentos. Para tentar solucionar a falta de uniformidade nos critérios selecionados a fim de estudar a atividade antimicrobiana de plantas medicinais, Rios et al. (1988) publicaram uma revisão dos métodos experimentais usados para o estudo de extratos de plantas e de óleos essenciais bem como seus compostos isolados. Esses autores propuseram o uso de métodos de difusão para estudar compostos polares de pequeno ou médio peso molecular e determinação do espectro antimicrobiano, já que este método permite o teste de diferentes compostos contra um microrga-
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Tabela 3: Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos extratos brutos etanólicos da casca e da polpa farinácea de Hymenaea courbaril frente a bactérias padrão e isolados clínicos
Bactérias Isolados clínicos a ATCC
CIM (µg/mL) Casca
Polpa farinácea
Controles positivos
> 400
> 400
5,90
PEN
S. aureus (isolado clínico)
350
> 400
5,90
PEN
E. faecalis (ATCC 19433)
> 400
> 400
0,37
PEN
E. faecalis (isolado clínico)
> 400
> 400
0,74
PEN
E. coli (ATCC 14948)
> 400
> 400
1,48
GEN
350
350
0,74
GEN
S. flexineri (ATCC 12022)
> 400
> 400
0,37
GEN
S. flexineri (isolado clínico)
> 400
> 400
0,18
GEN
P. aeruginosa (ATCC 27853)
> 400
> 400
2,95
GEN
P. aeruginosa (isolado clínico)
350
350
5,90
GEN
S. choleraesuis (ATCC 14028)
> 400
> 400
1,47
GEN
S. choleraesuis (isolado clínico)
> 400
> 400
0,74
GEN
S. aureus (ATCC 9144)
E. coli (isolado clínico)
CP: controles positivos utilizados. PEN: penicilina. GEN: gentamicina.
nismo. Finalmente, a técnica de diluição em caldo é a melhor maneira de estabelecer a real potência de um composto puro, na qual a solubilidade é um requisito que otimiza os resultados (Alves et al. 2008). Em uma revisão da literatura de artigos publicados sobre atividade antimicrobiana de plantas medicinais, Rios e Recio (2005) revelaram que o maior problema com as pesquisas ainda continua sendo a falta de uniformidade nos critérios selecionados para estudar a atividade. Isso frequentemente leva a relevantes contradições entre os resultados obtidos por diferentes grupos e mesmo para os mesmos autores estudando a mesma amostra com diferentes métodos (Gonçalves et al. 2005; Alves et al. 2008). As técnicas de difusão do extrato em um meio de cultura visam determinar a sensibilidade da bactéria isolada ao antimicrobiano e o tamanho da zona de inibição é o reflexo da sensibilidade microbiana, da solubilidade e da quantidade de agente liberado nas primeiras horas após sua utilização. Somente o tamanho do halo de inibição não determinada se o extrato em questão é mais ou menos ativo, já que diversos fatores podem influenciar na difusão do mesmo, portanto, é uma técnica qualitativa. Já as técnicas que determinam a concentração inibitória mínima são quantitativas, pois possibilitam demonstrar qual a mínima concentração do extrato é necessária para inibir o crescimento bacteriano. Embora essas técnicas sejam mais sensíveis, são mais trabalhosas quando realizadas manualmente, o que impede a realização de um espectro maior de testes de “screening” em
um curto espaço de tempo. Apesar disso, nos estudos com atividade antimicrobiana de plantas este método também oferece a vantagem de se utilizar pequenas quantidades do extrato vegetal. Considerando os resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que a avaliação da atividade antibacteriana utilizando o método de difusão em ágar para os extratos brutos etanólicos da polpa farinácea de H. courbaril apresentaram pequeno espectro de atividade. Os extratos brutos etanólico da casca de H. courbaril não revelaram ação antibacteriana por esta técnica. Na determinação da concentração inibitória mínima, os extratos brutos etanólicos da casca e da polpa farinácea de H. courbaril mostraram-se eficazes contra os microrganismos avaliados. Quando comparados os resultados da atividade antibacteriana dos extratos brutos pelos métodos de difusão e diluição, foram observadas diferenças significativas, podendo considerar que a técnica de diluição em caldo foi a melhor opção para se determinar a atividade antimicrobiana neste estudo. Não foi possível comparar os resultados obtidos pela técnica de microdiluição em caldo para determinação da concentração inibitória mínima, já que após levantamento bibliográfico não encontramos relatos na literatura científica demonstrando as CIM de H. courbaril, frente a esses microrganismos, indicando que este possa ser o primeiro trabalho demonstrando a atividade antibacteriana de H. courbaril por esta metodologia. Novos estudos com abordagens químicas, farmacológicas e clínicas devem ser realizados com Hymenaea courbaril L., pois os
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extratos dessa planta demonstraram possuir algum potencial antimicrobiano. Agradecimentos Os autores agradecem o suporte financeiro obtido junto à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Processo 2006/01346-4). Os autores também agradecem ao Prof. Dr. Milton Groppo Júnior pela identificação do material vegetal. Referências Ahmad I, Beg AZ. Antimicrobial and phytochemical studies on 45 indian medicinal plants against multi-drug resistant human pathogens. Ethnopharmacol. 2001;74;113-123. Alves EG, Vinholis AHC, Casemiro LA, Furtado NAJC, Silva MLA, Cunha WR, et al. Estudo comparativo de técnicas de screening para avaliação da atividade antibacteriana de extratos brutos de espécies vegetais e de substâncias puras. Quim Nova. 2008;31:1224-9. Alves TMA, Silva AF, Brandão M, Grandi TSM, Smania EFA, Smania Junior A, et al. Biological screening of brazilian medical plants. Mem Inst Osvaldo Cruz. 2000;95:367-73. Ambrosio SR, Furtado NA, De Oliveira DC, Da Costa FB, Martins CHG, De Carvalho TC, et al. Antimicrobial activity of kaurane diterpenes against oral pathogens. Z Naturforsch C. 2008;63:326-30. Auriccho MT, Bacchi EM. Folhas de Eugenia uniflora (pitanga): propriedades farmacobotânicas, químicas e farmacológicas. Rev Inst Adolfo Lutz. 2003;62:55-61. Bandeira MFCL, Oliveira MRB, Pizzollito AC, Benatti Neto C. Estudo preliminar da atividade antibacteriana do óleo essencial e da resina da Copaifera multijuga (óleo de copaíba) associados ao óxido zinco e ao hidróxido de cálcio. J Bras Clin Est Odontol. 1998;3:46-52.
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