Dissertação de Mestrado: AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA EM BIOPSIAS RENAIS PARA ESTUDO COMPARATIVO COM AS FORMAS AL E NÃO AL NA AMILOIDOSE: CONTRIBUIÇÃO PARA DIAGNÓSTICO E CLASSIFICAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

ELISSA OLIVEIRA DA FONSECA

AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA EM BIOPSIAS RENAIS PARA ESTUDO COMPARATIVO COM AS FORMAS AL E NÃO AL NA AMILOIDOSE: CONTRIBUIÇÃO PARA DIAGNÓSTICO E CLASSIFICAÇÃO

Niterói 2014

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ELISSA OLIVEIRA DA FONSECA

AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA EM BIOPSIAS RENAIS PARA ESTUDO COMPARATIVO COM AS FORMAS AL E NÃO AL NA AMILOIDOSE: CONTRIBUIÇÃO PARA DIAGNÓSTICO E CLASSIFICAÇÃO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Humana.

Orientadora: Maria Lucia Ribeiro Caldas Coorientador: Porphirio José Soares Filho

Niterói 2014

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Fonseca, Elissa Oliveira AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA EM BIOPSIAS RENAIS PARA ESTUDO COMPARATIVO COM AS FORMAS AL E NÃO AL NA AMILOIDOSE: CONTRIBUIÇÃO PARA DIAGNÓSTICO E CLASSIFICAÇÃO. Niterói, UFF, Faculdade de Medicina, 2014 55f. Maria Lucia Ribeiro Caldas e Porphirio José Soares Filho Dissertação de Mestrado – Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia, 2014. 1. Amiloide. 2. Amiloidose renal. 3. Vermelho Congo. I. Caldas, Maria Lucia Ribeiro. II. Universidade Federal Fluminense. Pós-Graduação em Patologia. III. Padronização de laudos histopatológicos e contribuição de marcadores específicos para diagnóstico da amiloidose renal.

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ELISSA OLIVEIRA DA FONSECA

AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA EM BIOPSIAS RENAIS PARA ESTUDO COMPARATIVO COM AS FORMAS AL E NÃO AL NA AMILOIDOSE: CONTRIBUIÇÃO PARA DIAGNÓSTICO E CLASSIFICAÇÃO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de concentração: Patologia Humana.

Aprovado em 26 de outubro de 2014.

BANCA EXAMINADORA Prof Carlos Alberto Basílio (Avaliador prévio) Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro Prof Jorge Almeida Universidade Federal Fluminense Prof Albanita Viana Universidade Federal do Rio de Janeiro Prof Arley Junior Universidade Federal Fluminense

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Aos meus pais, com amor e eterna gratidão. Nem as palavras mais cuidadosas seriam capazes de expressar.

6

Gostaria de agradecer à minha orientadora Maria Lucia Ribeiro Caldas e ao meu co-orientador Porphirio José Soares Filho, pelo apoio integral e entendimento do verdadeiro sentido de se trabalhar em equipe. Sou também muito grata ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da UFF por todo o suporte, ao atencioso Prof. Licínio Esmeraldo da Silva, aos professores patologistas, aos funcionários do HUAP e aos amigos de todas as horas. Agradeço especialmente ao querido professor Dr Kalil Madi por todo apoio na patologia e na vida.

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RESUMO INTRODUÇÃO: A amiloidose faz parte de um grupo de distúrbios em que a deposição de diferentes proteínas com dobradura anormal apresenta histologicamente as mesmas propriedades tintoriais microscópicas e físicas à luz polarizada, com semelhante aspecto fibrilar ultraestrutural. Os rins são um dos órgãos mais afetados, sendo a amiloidose um dos principais diagnósticos diferenciais na investigação da proteinúria nefrótica, podendo ocorrer progressão para insuficiência renal crônica. As alterações histopatológicas em biopsias renais de pacientes com amiloidose sistêmica resultam da deposição de proteínas amiloides em vasos, glomérulos e compartimento tubulointersticial. A padronização da interpretação da biopsia na amiloidose renal é essencial para o correto diagnóstico do tipo de disfunção amiloide, e para facilitar a interpretação dos dados por diferentes nefropatologistas. OBJETIVOS: O presente estudo tem como principal objetivo avaliar e utilizar a classificação de Sen e Sarsik, através de técnica histomorfométrica, nos compartimentos glomerular, tubulointersticial e vascular. MATERIAL E MÉTODOS: De 2000 a 2011, a partir de 1609 biopsias percutâneas em rins nativos, foram diagnosticados 42 casos como amiloidose renal. Deste, 37 possuíam informações clínicas e laboratoriais uniformes para estudo inicial. Dezessete casos foram submetidos a estudo histomorfométrico. Os valores obtidos por morfometria foram enquadrados na classificação adotada e comparados com dados clínico-laboratoriais. RESULTADOS: Dos 37 casos analisados, 21 eram do tipo não AL e 16 AL, com distribuição variável ao longo dos anos e casos AL sendo diagnosticados de forma crescente a partir de 2006. A idade variou entre 32 e 80 anos, com média de 57 anos (não AL média de 60,33 e AL média de 50,24). A sétima década de vida concentrou o maior número de casos. Pacientes do sexo masculino e feminino mostraram tendências semelhantes. Hipertensão arterial foi observada em 37,8% dos casos. A proteinúria média foi de 5839 mg/dia, e a maior parte dos pacientes apresentou-se na faixa nefrótica. Hematúria esteve presente em 75% dos casos. Nos 17 casos submetidos a morfometria, houve predomínio de depósitos glomerulares, e estes se classificaram nas formas mais intensas (classes IV e VI). Os compartimentos tubulointersticial e vascular mostraram menor extensão de depósitos. Não foram observados padrões morfológicos glomerulares distintos. O presente estudo não mostrou diferença estatística entre as classes atribuídas aos três compartimentos renais e os dados epidemiológicos, clínicos e laboratoriais. CONCLUSÃO: Identificou-se a necessidade da aplicação de parâmetros mais uniformes de avaliação histomorfométrica na avaliação da distribuição dos depósitos amiloides renais. Localização e extensão dos depósitos amiloides nos compartimentos renais não mostraram associação eststística com o tipo de amiloidose AL ou não AL, hipertensão arterial, creatinina sérica proteinúria, hematúria ou ainda dados epidemiológicos.

PALAVRAS-CHAVE Amiloide, amiloidose renal, vermelho Congo

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ABSTRACT BACKGROUND: Amyloidosis is part of a group of disorders in which the deposition of misfolding proteins shares histologically the same microscopic appearance and physical properties at polarized light, and displays similar fibrillar ultrastructure. The kidneys are one of the most affected organs, and amyloidosis is one of the main differential diagnoses in the investigation of nephrotic proteinuria, which may progress to chronic renal failure. Histopathological changes in kidney biopsies of systemic amyloidosis results from glomerular , vascular and tubulointerstitial amyloid deposits. The standardization of interpretation of renal biopsy in amyloidosis is essential for the correct diagnosis of the type of amyloid dysfunction, and ease of data interpretation by different nephropathologists. OBJECTIVES: This study aims to evaluate and use the classification of Sen and Sarsik through histomorphometric technique in glomerular, tubulointerstitial and vascular compartments. MATERIAL AND METHODS: From 2000 to 2011, 42 cases were diagnosed as renal amyloidosis from 1609 percutaneous biopsies in native kidneys. Thirty seven had uniform clinical and laboratory information for initial study. Seventeen patients underwent histomorphometric study. The values obtained by morphometry were applied in the classification adopted and compared with clinical and laboratory data. RESULTS: Of the 37 analyzed cases, 21 were type non AL and 16 AL, with variable distribution over the years and AL cases being diagnosed increasingly from 2006. The age ranged between 32 and 80 years, with an average of 57 years (mean 60.33 non AL and 50.24 AL). The seventh decade of life had the largest number of cases. Males and females showed similar trends. Hypertension was observed in 37.8% of cases. The average proteinuria was 5839 mg / day, and most patients presented nephrotic range proteinuria. Hematuria was present in 75% of cases. In the 17 cases submitted to morphometry glomerular deposits were predominant, and these were classified in the most intense forms (classes IV and VI). The tubulointerstitial and vascular compartments showed less extensive deposits. No distinct glomerular morphological patterns were observed. The present study showed no statistical difference between the grades assigned to the three kidney compartments and epidemiological, clinical and laboratory data. CONCLUSION: We identified the need for more uniform application of histomorphometric parameters in assessing the distribution of renal amyloid deposits. Location and extent of amyloid deposits in the kidney compartments showed no eststístical association with the type amyloidosist, high blood pressure, serum creatinine, proteinuria, hematuria or epidemiological data.

KEYWORDS Amyloid, renal amyloidosis, Congo red

9

SUMÁRIO 1

INTRODUÇÃO

15

2

REVISÃO DA LITERATURA

18

2.1

ASPECTOS HISTÓRICOS

18

2.2

AMILOIDOSE AA

22

2.3

AMILOIDOSE AL

23

2.4

AMILOIDOSE HEREDITÁRIA

25

2.5

O COMPONENTE AMILOIDE P

26

2.6

AMILOIDOSE RENAL

27

2.6.1

Classificação de Sen e Sarsik

28

2.6.2

Imuno-histoquímica e imunofluorescência

31

3

OBJETIVOS

34

3.1

GERAL

34

3.2

ESPECÍFICOS

34

4

MATERIAL E MÉTODOS

35

4.1

MATERIAL

35

4.1.1

Critérios de inclusão

35

4.1.2

Critérios de exclusão

36

4.1.3

Microscopia óptica

36

4.1.4

Imuno-histoquímica por imunofluorescência

37

4.1.5

Informações epidemiológicas, clínica e laboratoriais

37

4.2

MÉTODOS

37

4.2.1

Microscopia óptica

37

4.2.1.1

Histomorfometria

38

4.2.1.2

Compartimento glomerular

38

4.2.1.3

Compartimento vascular

43

4.2.1.4

Compartimento tubulointersticial

46

4.2.1.5

Classificação de Sen Sarsik

50

4.2.2

Análise dos resultados

50

5

RESULTADOS

52

6

DISCUSSÃO

59

10

7

CONCLUSÃO

68

8

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

69

ANEXOS

55

11

LISTA DE TABELAS Tabela 1

Classificação histopatológica da amiloidose renal baseada no envolvimento glomerular

30

Tabela 2

Classificação histopatológica dos depósitos amiloides vasculares

31

Tabela 3

Classificação histopatológica dos depósitos amiloides intersticiais

31

Tabela 4

Análise do compartimento glomerular à coloração HE em caso exemplo

39

Tabela 5

Análise do compartimento vascular à coloração HE em caso exemplo

45

Tabela 6

Análise do compartimento tubulointersticial à coloração pelo HE em caso exemplo

50

Tabela 7

Características epidemiológicas dos casos não AL e AL

53

Tabela 8

Características clínicas e laboratoriais dos casos não AL e AL

56

Tabela 9

Distribuição amiloide nos compartimentos glomerular, vascular e tubulointersticial

57

Tabela 10

Trabalhos publicados com abordagem da distribuição amiloide em biopsias renais

63

12

LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1

Distribuição de casos de amiloidose renal AL e não AL por ano de 2000 a 2011

53

Gráfico 2

Frequência de amiloidose AL e não AL de acordo com idade e sexo

54

Gráfico 3

Distribuição das classes de depósitos amiloides nas faixas etárias

57

13

LISTA DE FIGURAS Figura 1

Calibragem da imagem no AxioVision

40

Figura 2

Aspecto histopatológico da análise glomerular à HE

41

Figura 3

Aspecto histopatológico da análise glomerular ao VC

41

Figura 4

Aspecto histopatológico da análise glomerular à HE em doença avançada

42

Figura 5

Aspecto histopatológico da análise glomerular ao VC em doença avançada

43

Figura 6

Aspecto histopatológico da análise vascular à HE

45

Figura 7

Aspecto histopatológico da análise vascular ao VC

45

Figura 8

Aspecto histopatológico da análise tubulointersticial

47

Figura 9

Aspecto histopatológico da exclusão glomerular e vascular no compartimento tubulointersticial

48

14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AA

amiloidose secundária (proteína A)

AL

amiloidose primária (cadeia leve)

C3

componente C3 do sistema complemento

C1q

componente C1q do sistema complemento

C4

componente C4 do sistema complemento

DNA

ácido desoxirribonucleico

FAN

fator antinuclear

FITC

isotiocianato de fluoresceína

GEFS

glomeruloesclerose focal e segmentar

HAS

hipertensão arterial sistêmica

HBsAg

antígeno de superfície do vírus da hepatite B

HCV

vírus da hepatite C

HE

hematoxilina e eosina

HIV

vírus da imunodeficiência humana

IF

imunofluorescência

IgA

imunoglobulina A

IgG

imunoglobulina G

IgM

imunoglobulina M

IHQ

imuno-histoquímica

IP

imunoperoxidase

IRA

insuficiência renal aguda

IRC

insuficiência renal crônica

MET

microscopia eletrônica de transmissão

PAS

ácido periódico de Schiff

PASM

prata metenamina

PBS

tampão fosfato-salino ou phosphate buffered saline

TM

tricômico de Masson

VC

vermelho Congo

15

1 INTRODUÇÃO

A amiloidose faz parte do grupo de distúrbios com deposição extracelular de diferentes

proteínas

autólogas

com

dobradura

anormal

que

apresenta

histologicamente as mesmas propriedades tintoriais microscópicas e físicas à luz polarizada, com semelhante aspecto fibrilar.1,2,3 Os órgãos acometidos pela deposição de tais proteínas apresentam comprometimento da função fisiológica, resultante de alterações teciduais arquiteturais e provável toxicidade celular.4 Embora não existam descrições de dados epidemiológicos uniformes na literatura mundial, é sabido que o aparecimento da amiloidose está relacionado com o avançar da idade. No momento do diagnóstico, mais de um quarto dos pacientes já apresentam síndrome nefrótica.5 Estudo recente confere à amiloidose o segundo lugar nas causas de glomerulopatias secundárias, ficando atrás apenas da nefrite lúpica.6 Outro estudo demonstra que a amiloidose renal é o principal diagnóstico histológico em pacientes idosos acima de 85 anos.7 No Brasil, análise recente de 9617 biopsias renais classifica a amiloidose como a segunda principal causa de lesões glomerulares associadas a doenças metabólicas (31,3%) e um dos diagnósticos

mais

frequentes

nos

idosos

(nefropatia

membranosa

13,1%,

glomeruloesclerose focal e segmentar (GESF) 12,1%, amiloidose 9,8%, nefropatia diabética 7,5% e nefroangioesclerose benigna e maligna 6,1%).8 Existem diversos tipos de amiloidose, destacando-se entre eles as formas secundária (AA) e primária (AL). Na amiloidose sistêmica associada a processos

16

inflamatórios crônicos ou do tipo AA, as fibrilas amiloides são depositadas em múltiplos órgãos e tecidos e são derivadas de precursores plasmáticos gerados a partir de quebra da proteína A amiloide, um reagente inflamatório de fase aguda produzido pelo fígado.8-15 Amiloidose de cadeia leve (AL) pode ocorrer isoladamente ou associada a várias doenças linfoproliferativas de células B, englobando o mieloma múltiplo, linfomas e macroglobulinemia, e frequentemente mostra envolvimento renal, sendo evidenciada imunorreatividade tecidual de amiloide para cadeia leve κ ou λ. 16-18 Em virtude do comprometimento renal em ambas as formas AA e AL, com semelhanças na apresentação clínica, o diagnóstico diferencial é aspecto importante para tratamento e avaliação prognóstica do paciente. Os rins são um dos órgãos mais afetados, sendo a amiloidose um dos principais diagnósticos diferenciais na investigação da proteinúria nefrótica.17,19 Tal diagnóstico geralmente é feito em estágio avançado da doença, desfavorecendo resposta terapêutica adequada e podendo ocorrer progressão para insuficiência renal crônica. As alterações histopatológicas em biopsias renais de pacientes com amiloidose

resultam

de

depósitos

amiloides

vasculares,

glomerulares

e

tubulointersticiais.20 A técnica mais usada para identificação amiloide é a imunohistoquímica (IHQ) por imunoperoxidase (IP) e por imunofluorescência (IF), com utilização de anticorpos dirigidos especificamente para proteínas amiloidogênicas. A técnica de coloração pelo vermelho Congo (VC) continua sendo padrão ouro diagnóstico e quando associado aos resultados de IHQ a sensibilidade diagnóstica é maior.21 A padronização da interpretação da biopsia na amiloidose renal é essencial para o correto diagnóstico do tipo de disfunção amiloide, e facilidade na interpretação dos dados por diferentes nefropatologistas. Apesar

do

recente

estabelecimento

da

padronização

de

critérios

histopatológicos na avaliação das lesões morfológicas na amiloidose renal por meio da classificação proposta por Sen e Sarsik em 2010,22 ainda não há uso amplo desta categorização microscópica do amiloide entre os vários patologistas envolvidos no diagnóstico da doença. Outros estudos contribuíram para a avaliação de diferentes formas de envolvimento renal por depósitos amiloides em biopsias renais, 20,23,24 mas sem detalhamento da técnica de morfometria aplicada, assim como o trabalho de Sen e Sarsik.

17

Tal classificação demonstra necessidade de uniformidade não apenas de dados epidemiológicos relacionados a amiloidose renal, mas também nos laudos histopatológicos de biopsias renais com suspeita diagnóstica de amiloidose. Segundo, Sen e Sarsik, os glomérulos seguem uma escala quantitativa percentual de deposição amiloide, que vai de 0 a VI, onde 0 significa a ausência de depósitos glomerulares e VI indica amiloidose avançada, ocupando quase todo o tufo capilar glomerular. Além disso, padrões morfológicos similares à classificação usada na nefrite lúpica25 são atribuídos a cada classe glomerular. A classificação de 2010 também avalia, em menor detalhamento, os compartimentos tubulointersticial e vascular, categorizando a deposição amiloide como ausente, mínima, focal, moderada e severa. Contudo, nos estudos que avaliam diferentes níveis de envolvimento renal por depósitos amiloides detectados morfologicamente nas biopsias renais, observou-se que não há dados sobre a técnica de morfometria aplicada.19,20,22,26 A distinção dos diferentes tipos bioquímicos das fibrilas amiloidóticas é fundamental em relação a indicação da patogênese da doença e às estratégias terapêuticas a serem adotadas.27 Não há diferenciação histomorfológica que possa fazer esta distinção, embora algumas associações como predomínio de depósitos vasculares e intersticiais na doença hereditária22 e depósitos glomerulares e vasculares na AA25 tenham sido reladas na literatura e da mesma forma, não há distinção ultraestrutural das fibrilas na análise à microscopia eletrônica de transmissão (MET). Com base na literatura consultada e nas limitações diagnósticas, elaboramos a hipótese de que a conclusão histopatológica de amiloidose feita em biópsias renais é mais precisa através da caracterização da distribuição quantitativa e qualitativa do depósito amiloide.

18

2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 ASPECTOS HISTÓRICOS O primeiro relato de amiloidose aconteceu em meados do século XVII, sendo descrito em 1639 por Nicolaus Fontanus, no livro Responsionun et curationun medicinaliun liber unus, no qual foi descrita uma necropsia de um jovem, que apresentava ascite, febre e epistaxe.26 O fígado macroscopicamente exibia formações irregulares e grandes abscessos, o baço estava aumentado de volume, repleto de massas brancacentas, o que segundo Kyle e Bayard (1975), podia representar o aspecto macroscópico do chamado “baço em sagu” da amiloidose. 27 Posteriormente, em 1842, Rokitansky descreveria a amiloidose sistêmica ao observar pacientes com síndromes consumptivas exibindo fígado com “aspecto de toucinho” e tumores no baço.28 Por volta de 1657, Tomas Bartholin, estudando o sistema linfático no homem, descreveu em caso de necropsia de mulher, no livro Historiarum Anatomicarum Raridrarum Centuria, salientando que o baço aberto apresentava constituição firme e que aos cortes emitia um som similar ao de cortar madeira esponjosa. 29 Os casos de necropsias descritos por Fontanus e Bartholin estavam incluídos nos relatos de Theophil Bonet em 1679, publicado em seu livro Sepulcrum Sive Anatomia Practica.30 Posteriormente Portal em 1813 descreve alguns casos de amiloidose tendo como base a distribuição anatômica em vários órgãos, estudos estes que foram posteriormente ampliados por Lobstein em 1829. 31,32 A reação modificada do

19

iodo-ácido sulfúrico foi usada inicialmente por Gmelin em 1829 e aplicada por Schleiden em 1838 em plantas, visando localizar o amido, criando assim o termo “amiloide”, para descrever o componente de amido normal dos vegetais. 33,34 Portanto o termo amiloide foi escolhido pela semelhança tintorial ao amido. 35,36 A mesma reação do iodo-ácido sulfúrico para identificar a substância amiloide nos animais foi introduzida por Virchow em 1854, que passou a utilizar o termo “alteração amiloide” devido a similaridade de reação com a celulose, concluindo que a sua constituição era de uma substância “cellulose like”.37 Com base em suas observações, Virchow acreditou que o amiloide era um depósito de uma substância de natureza celulósica com localização tecidual, sugeriu que a amiloidose sistêmica era causada pela deposição de material proveniente do leito vascular e a medida que se isolasse tal substância, seria possível definir a sua natureza.

Com

conhecimento metodológico e médico de sua época, Rudolf Virchow usou iodo, que era empregado para demonstrar celulose ou amido, para corar corpos amiláceos que

apresentavam

alterações

macroscópicas

anômalas.

Estes

infiltrados

apresentavam coloração azul-violeta, passando a ser designados amiloides.36 O termo amiloide foi escolhido pela semelhança tintorial ao amido, fazendo referência aos achados de 1838 do botânico alemão Mathias Schleiden, quando de sua descrição do componente amiláceo normal das plantas.35,36 Friedreich e Kekulé em 1859 demonstraram a presença de proteína amiloide e ausência de carboidrato em “massa de amiloide”, orientando o estudo do amiloide primeiro como proteína individual e depois como componente de classes de proteínas. Após decorridos setenta anos da designação da terminologia para esta doença, anatomopatologistas investigaram e descreveram a distribuição dos depósitos amiloides, enquanto patologistas experimentais procuraram estabelecer a patogênese e a natureza química destas proteínas modificadas.38 As descrições à microscopia ótica identificavam esta proteína como depósito róseo (hialino) nas estruturas comprometidas, quando da aplicação e exame microscópico de cortes corados pela hematoxilina e eosina. Um grande avanço na compreensão da estrutura bioquímica do amiloide se iniciou com a coloração da proteína com cristal violeta e o metil violeta. Esta última reação, descrita inicialmente em 1875,39 foi denominada metacromasia, e representa coloração diferente da cor original do corante causada pela particular e específica concentração de suas

20

moléculas, em determinados tipos de substratos da reação. A coloração vermelho Congo foi introduzida por Bennhold em 1922, como coloração de escolha para identificação do depósito amiloide nos tecidos. Quando examinada a microscopia de luz não é específica para a proteína, já que pode corar também tecido elástico e faixas densas de colágeno.40 Em 1927, Divry e Florkin coraram os agregados amiloides com vermelho Congo e observaram que sob luz polarizada, estes apresentavam birrefringência verde característica. Até os dias atuais este método de coloração é considerado padrão-ouro para diagnóstico histológico da amiloidose. No entanto, isoladamente o vermelho Congo não permite distinguir os diferentes tipos de proteínas que podem fazer parte da doença amiloidose.38 Em 1959, estudos ultramicroscópicos realizados por Cohen e Calkins, invalidaram o conceito primitivo sobre o caráter homogêneo do amiloide, demonstrando que as proteínas amiloides são fibrosas e constituídas por fibrilas rígidas, não ramificadas.39 Pras et al., em 1968, permitiram a purificação destas fibrilas através do método de dessecação.40 Análises bioquímicas tem permitido a diferenciação de mais de 15 proteínas amiloides e a identificação de precursores fibrilares que, na maioria, são derivados das proteínas circulantes do plasma. Nos últimos anos, a imuno-histoquímica (IHQ) tem sido incorporada aos diagnósticos histopatológicos como método complementar através da utilização de reagentes altamente específicos, mesmo em material de rotina. Da mesma forma, o uso da recuperação antigênica e de novas técnicas com polímeros vem aumentando a imunorreatividade do substrato e a precisão diagnóstica. Embora a IHQ possa ser influenciada por vários fatores que vem desde a fase pré-analítica (fixação e processamento do tecido), passando pela fase analítica (escolha de anti-corpos primários e sistema de visualização) e ainda a fase pós-analítica (interpretação dos resultados) é, através da integração dos achados morfológicos com os resultados IHQ, que se pode formular a conclusão diagnóstica com maior precisão. 41 Microdissecção a laser e espectrometria de massa são novas técnicas usadas para o diagnóstico e caracterização de doenças renais com depósitos organizados, tais como a amiloidose, principalmente formas incomuns e familiares. Consistem de dissecação dos glomérulos, digestão tríptica de material dissecado, análise e geração de um perfil de proteínas utilizando algoritmos.42

21

O estudo imuno-histoquímico deve constituir um procedimento preciso, sendo dependente de cuidados em sua preparação, acondicionamento de amostras e reagentes adequados, até o desenvolvimento técnico e sua correta interpretação. Em muitos casos é necessário utilizar a técnica de IHQ para detecção molecular na identificação do tipo de substância amiloide, fornecendo dados mais precisos para definir melhor o tratamento do paciente. A IHQ permite identificação precisa de alguns tipos de substância amiloide, condição que possibilita o diagnóstico mais apropriado e correto, proporcionando melhor avaliação da sua distribuição bem como identificação dos principais tipos de amiloide renal e terapias antifibrilares adequadas.20,21 A interpretação dos resultados deve ser feita inicialmente no contexto da positividade do vermelho Congo e o material deve ser sempre correlacionado com a IHQ, permitindo melhor definição do tipo de amiloide apresentado em cada caso.43,44 Segundo Linke, todo tipo de amiloidose requer avaliação de sua composição química mais apurada porque a patogenicidade de cada tipo é diversa e dependendo do tipo de amiloide vai requerer terapias diferentes. 45 Nos casos em que há dificuldade na identificação do amiloide, o emprego da IHQ serve também como método de rastreamento para detecção de possíveis depósitos amiloides e mesmo quando em pequenas quantidades, a imunorreação pode favorecer a identificação precoce e o tratamento na fase inicial da doença. 21,46 De acordo com Schonland, a IHQ é importante ferramenta para o diagnóstico da amiloidose, permitindo sua classificação em 94% dos casos estudados, com elevada precisão na sua determinação.47 Na investigação da amiloidose como doença sistêmica, caracterizar a positividade das fibrilas pelo vermelho Congo quando da observação à luz polarizada, é somente o passo inicial da investigação do processo. A identificação da fibrila proteica específica depositada é o fator diagnóstico mais importante para orientação terapêutica do paciente. A determinação da extensão do depósito e estruturas envolvidas nos diferentes órgãos colabora na identificação do prognóstico a curto e longo prazo. Na medicina moderna não se justifica mais o diagnóstico de amiloidose sem esforços para estabelecer do ponto de vista bioquímico, com auxílio de diferentes técnicas e aplicação de marcadores específicos, que tipo de amiloidose o paciente e seu médico assistente estão enfrentando.

22

2.2 AMILOIDOSE AA Na amiloidose sistêmica associada a processos inflamatórios crônicos ou do tipo AA, as fibrilas amiloides são depositadas em múltiplos órgãos e tecidos 9-11 e sabidamente são derivadas de precursores plasmáticos gerados a partir de quebra da proteína A amiloide, um reagente inflamatório de fase aguda produzido pelo fígado.12-15 Em sua patogênese, a amiloidose secundária (AA) tem como precursor amiloidogênico o fragmento N-terminal da proteína amiloide sérica A (SAA), uma apolipoproteína que é sintetizada pelos hepatócitos sob regulação de citocinas próinflamatórias. O comportamento da SAA durante um processo inflamatório é comparável ao da proteína C reativa, proteína que é frequentemente avaliada na prática clínica. A concentração mediana de SAA no plasma de indivíduos saudáveis é 3 mg/L, porém pode aumentar para mais de 2000 mg/L durante uma resposta de fase aguda. Um excesso de produção sustentado é um pré-requisito para o desenvolvimento de amiloidose AA, embora por razões ainda não totalmente esclarecidas, esta apenas ocorra numa pequena proporção dos doentes com doenças inflamatórias crônicas. Sellar e colaboradores, em 1994, usaram uma combinação de técnicas de mapeamento para demonstrar que a superfamília do gene SAA compreende conjunto de genes localizados no cromossoma 11p15. Em 1995 foi identificada uma variante alélica do gene SAA1 que foi descrita como um fator de risco para o desenvolvimento de amiloidose AA. 48-50 Contudo, recente estudo experimental em ratos, demonstrou que a deposição de amiloide AA pode ocorrer independentemente da inflamação e que o tempo que precede a deposição amiloide é determinado pela concentração de SAA na circulação. 50 Dentre as várias formas de apresentação, os rins são os órgãos mais afetados,19 sendo a amiloidose um dos principais diagnósticos diferenciais na investigação

da

proteinúria

nefrótica,51

podendo

ocorrer

progressão

para

insuficiência renal crônica em decorrência do acúmulo progressivo de fibrilas amiloides,52 levando a destruição glomerular com consequente comprometimento do restante da arquitetura renal. Além da substituição de sua estrutura pelo amiloide,

23

sugere-se que tais proteínas possuam efeitos tóxicos que contribuem diretamente para a lesão renal.53 Na Europa, a amiloidose AA corresponde a 45% dos casos de amiloidose sistêmica. Este tipo pode ser causado por doença hereditária (Febre Mediterrânea Familiar) ou adquiridas, incluindo doenças inflamatórias crônicas como artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal, febre do mediterrâneo, ou outras síndromes febris, bronquiectasias, tuberculose e osteomielite crônica. Febre Mediterrânea Familiar e tuberculose foram referidas como causas mais frequentes. 54 No rim há deposição progressiva de amiloide, resultando em proteinúria e perda progressiva da função renal. O envolvimento renal é uma das principais causas de morbidade e mortalidade. A doença de base normalmente é de longa data, e inflamação ativa normalmente está presente quando a amiloidose se torna evidente. Os glomérulos são quase sempre envolvidos, depósitos intersticiais são incomuns, mas podem ser encontrados na medular renal. Em alguns casos associados a artrite reumatoide o envolvimento predominantemente vascular pode ser encontrado. Algumas das doenças predisponentes, tais como artrite reumatoide e tuberculose, muito prevalentes na população adulta, a demonstração imuno-histoquímica da proteína AA em tecido com depósito amiloide ou uma avaliação cuidadosa para outros tipos de amiloidose deve ser realizada.22

2.3 AMILOIDOSE AL

Amiloidose de cadeia leve (AL), mais prevalente nos Estados Unidos e Ocidente,16

pode

linfoproliferativas

ocorrer de

isoladamente

células

B,

ou

englobando

associada mieloma

a

várias

múltiplo,

macroglobulinemia, frequentemente com envolvimento renal,

17

doenças

linfomas

e

podendo ser

evidenciada imunorreatividade tecidual de amiloide para cadeia leve κ ou λ, já que na sua formação, ocorre deposição de proteína derivada de fragmentos de cadeia leve de imunoglobulinas.18 Glenner e colaboradores em 1971 após análise sequencial da cadeia de aminoácidos, relataram que a amiloidose primária, agora conhecida como amiloidose AL, porém inicialmente descrita como amiloide B pelos

24

laboratórios Benditt, é resultado da deposição de fragmentos de cadeias leves de imunoglobulina.55 Um sistema in vitro desenvolvido para o estudo da amiloidose renal tem fornecido informações que demonstram como células mesangiais interagem com cadeias leves monotípicas e produzem amiloide. As cadeias leves amiloidogênicas interagem com receptor, ainda não totalmente compreendido, na superfície das células mesangiais. Quando estas células são incubadas com amiloide produtor de cadeias leves glomerulopáticas, ocorre transformação no fenótipo da linhagem de células macrofágicas. Além disto, a internalização de cadeias leves através de mecanismo mediado pela clatrina e processado nos lisossomas, parece fazer parte de importante papel no processo da formação do amiloide. Tal modelo in vitro tem revelado etapas cruciais no processo amiloidogênico que pode ser amenizado por meio de terapêutica específica. Os achados descritos são particularmente verdadeiros para a forma primária da amiloidose (AL). Tanto modelos experimentais in vitro assim como modelos experimentais in vivo que possam duplicar a forma humana de amiloidose AL fornecerão melhor conhecimento da etiologia, e por último, melhor abordagem da prevenção e tratamento eficazes que poderão retardar a evolução da doença. 56 Este tipo de amiloidose foi considerado como discrasia plasmática, pois mostra similaridade com a patogênese da doença de cadeia leve, com a diferença de que nesta última não há formação de fibrilas. Demonstração de uma imunoglobulina monoclonal no sangue, na urina, ou em células plasmocíticas da medula óssea também é útil para o diagnóstico. Biópsia de medula óssea é importante para determinar a carga de células plasmáticas e também avaliar a clonalidade. Devido à frequência de gamopatias monoclonais clinicamente insignificantes em pacientes idosos, a presença de uma gamopatia monoclonal nesses casos não deve levar à conclusão de que a amiloidose é AL, a menos que haja evidência de imuno-histoquímica de cadeias leves nos depósitos amiloides ou se houve uma avaliação minuciosa para outros tipos de amiloidose. 22 Em virtude do comprometimento renal em ambas as formas AA e AL, e por vezes com semelhanças na apresentação clínica, o diagnóstico diferencial destas duas apresentações é aspecto importante para o tratamento e avaliação prognóstica do paciente.57

25

2.4 AMILOIDOSE HEREDITÁRIA

Outra forma de amiloidose, a amiloidose hereditária ou familiar, é causada pela deposição de proteínas geneticamente modificadas e está associada com mutações nos genes de transtiretina (ATTR), apolipoproteína AI (ApoAI), apolipoproteína AII (ApoAII), lisozima (ALys) e fibrinogênio A (AFib). A prevalência de amiloidose renal hereditária é desconhecida. Lachmann et al sugeriram que 10% dos casos diagnosticados como amiloidose AL são na verdade amiloidose hereditária.57 Até o momento da identificação de proteínas amiloides fibrilares e seus precursores, a amiloidose familiar era classificada pelo seu fenótipo clínico e patológico.22 A amiloidose familiar polineuropática tipo I (também conhecida como doença dos pezinhos) foi descrita inicialmente por Mário Corino de Andrade em 1939, em Póvoa de Varzim, Portugal.58 Costa e autores em 1978 e Skinner e Cohen em 1981 relataram que a pré-albumina, conhecida atualmente como transtiretina, é a fibrila proteica associada com a polineuropatia amiloidótica familiar tipo I. 59,60 Sua ocorrência se restringe a determinadas áreas geográficas, estando associada à substituição da metionina pela valina da transtiretina. 56,57 Este tipo de amiloidose de evolução lenta, afeta principalmente nervos periféricos, contudo, em algumas mutações genéticas da ATTR, a nefropatia pode estar presente, levando a insuficiência renal.61,62,14 Várias formas familiares são neuropáticas ou cardiopáticas, mas praticamente todas podem afetar os rins, com presença de depósitos. A frequência de tal diagnóstico é crescente, no entanto ainda permanece subdiagnosticada.63 Foi descrito que o envolvimento glomerular isolado, sem amiloide no compartimento tubulointersticial ou vascular, é característico de AFib, com evolução rápida para insuficiência renal.64 Em pacientes com complicações renais, gastrointestinais, e hemorrágicas, ALys deve ser considerada. Na ApoAI, os depósitos são tipicamente

26

extraglomerulares, em localização medular renal, com disfunção renal, sem proteinúria marcada.22 Recentemente, foi descoberta outra proteína amiloide que compremete o rim – fator quimiotático leucocitário 2 (leukocytic chemotactic factor 2 LECT2) após a análise química de fibrilas isoladas a partir de carcinoma de células claras ressecado de uma mulher de 61 anos com história prévia de síndrome nefrótica por amiloidose renal.62 Em série de dez casos, os indivíduos afetados são adultos com disfunção renal, quantidades variáveis de proteinúria e depósitos amiloides intersticiais e mesangiais com forte congofilia. Em nenhum caso houve uma história familiar sugestiva de amiloidose, contudo, 7 dos 10 pacientes eram mexicanos, sugerindo influência de fatores hereditários e/ou ambientais na patogênese dessa nova entidade.65

2.5 O COMPONENTE AMILOIDE P

Além dos componentes fibrilares do amiloide, todos depósitos amiloide contem elementos não-fibrilares glicoproteicos (responsáveis pela positividade PAS do amiloide), incluindo glicosaminoglicanos, apolipoproteína E (Apo E) e o componente P amiloide. O componente amiloide P (também conhecido como amiloide P no soro ou SAP) é uma glicoproteína da circulação normal, que é resistente à digestão por protease, e tem uma elevada afinidade para o componente fibrilar de amiloide.66,67 Pertence à superfamília das pentraxinas, bem como a proteína C-reativa, sendo proteínas de fase aguda da resposta inflamatória, produzidas pelo fígado, sob indução de citocinas (IL-6 principalmente) e desempenhando importante papel na resistência inata a microrganismos e na remoção de debris celulares patogênicos (incluindo componentes da matriz extracelular).68 Tal componente foi primeiramente descrito por Bladen, que se referiu ao mesmo como uma estrutura pentagonal, constituída por formações globulares, cujo diâmetro varia de 80 Å a 100 Å e, que recebeu o nome de “Componente Plasmático do Amiloide” ou componente “AP” (Amyloid “P” component).69 Embora o componente

27

amiloide P esteja presente em todos os tipos de amiloide, e tenha sido descrita suas distintas propriedades antigênicas,70é importante saber que também está presente no tecido elástico normal e membranas basais.71 Portanto, uma imunopositividade para o componente “P” do amiloide não significa necessariamente que está sendo visto o amiloide "real". É necessário primeiro estabelecer a presença de amiloide pela coloração vermelho Congo positiva, antes de prosseguir para marcadores imunohistoquímicos. De qualquer forma, o componente P amiloide está presente em todos os tipos de amiloide, e sempre deve ser positivo, podendo ajudar a destacar a extensão dos depósitos.66

2.6 AMILOIDOSE RENAL

As alterações histopatológicas em biopsias renais de pacientes com amiloidose sistêmica resultam de depósitos amiloides vasculares, glomerulares e tubulointersticiais, além de lesões secundárias de outra causa, como as relacionadas à idade. As características histopatológicas da amiloidose renal foram mais esclarecidas através dos anos, em virtude do número crescente de lesões identificadas e diagnosticadas.20 Embora não existam descrições de dados epidemiológicos uniformes na literatura mundial, é sabido que o aparecimento da amiloidose está relacionado com o avançar da idade. No momento do diagnóstico, mais de um quarto dos pacientes já apresentam síndrome nefrótica.5 Um estudo recente confere à amiloidose o segundo lugar nas causas de glomerulopatias secundárias, ficando atrás apenas da nefrite lúpica.6 Outro estudo demonstra que a amiloidose renal é o principal diagnóstico histológico em pacientes idosos acima de 85 anos. 7 No Brasil, um estudo recente com 9617 biopsias renais, agrupa a amiloidose dentre os principais diagnósticos de doenças glomerulares em adultos, junto com glomerulopatia membranosa, glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF), nefropatia diabética e nefroangioesclerose.8 Tem sido um desafio cada vez maior aplicar novos achados da patogênese à interpretação das biopsias renais na amiloidose e correlacionar os achados

28

patológicos a sintomas, escolha de tratamento e prognóstico. Ainda não foram demonstradas associações claras entre a extensão do depósito amiloide identificado na biopsia renal e as várias manifestações clínicas. 72 Existe a necessidade de padronização no relato da biopsia de pacientes diagnosticados com amiloidose renal, incluindo classificação bioquímica, padrão histomorfológico, quantificação de depósito renal e associação com outras lesões. A padronização da interpretação da biopsia na amiloidose renal é essencial para o correto diagnóstico do tipo de disfunção amiloide, e facilidade na interpretação dos dados por diferentes nefropatologistas. Isto certamente facilitaria o estabelecimento de condutas terapêuticas adequadas e específicas, para cada caso diagnosticado. O manejo de depósitos localizados é principalmente conservador, enquanto que amiloidoses sistêmicas envolvem abordagens radicais variando entre quimioterapia agressiva e transplante hepático; dessa forma, novas terapias farmacológicas tendo como alvo a fibrilogênese estão sendo estudadas.2 O desafio atual é detectar o amilóide precocemente e estabelecer correta classificação. O tratamento precoce está associado com melhores resultados e maior sobrevida, podendo não somente interromper o processo amiloidogênico, mas também reverter depósitos já estabelecidos.4,53 O

não

tratamento

da

amiloidose

tem

maior

morbidade,

progride

invariavelmente para insuficiência renal, e pode ser fatal com associação do comprometimento cardíaco ou outros desfechos específicos, como fratura patológica por depósitos amiloides, descrita por Chan e colaboradores (2011).73 Pelo fato de já ter sido demonstrado que os depósitos podem regredir, a progressão da amiloidose pode ser diminuída ou interrompida por tratamento da doença de base ou por terapias específicas.74

2.6.1 CLASSIFICAÇÃO DE SEN E SARSIK Algumas classificações histopatológicas de outros processos, como a classificação de Banff75 para diagnóstico da patologia do enxerto renal, ou a classificação das nefrites lúpicas, pela International Society of Nephrology / Renal

29

Pathology Society (ISN/RPS),25 resultaram através de seu amplo uso em benefício para conduta clínica e índices prognósticos.76 Apesar

do

recente

estabelecimento

da

padronização

de

critérios

histopatológicos na avaliação das lesões morfológicas na amiloidose renal por meio da classificação proposta por Sen e Sarsik em 2010,22 ainda não há uso amplo desta categorização microscópica do amiloide entre os vários patologistas envolvidos no diagnóstico da doença. Outros estudos contribuíram para a avaliação de diferentes formas de envolvimento renal por depósitos amiloides em biopsias renais 75,77,20 mas sem detalhamento da técnica de morfometria aplicada, assim como o trabalho de Sen e Sarsik. Segundo Sen e Sarsik, a Classe I de envolvimento glomerular é definida como amiloidose renal com extensão mínima inferior a 10%. O depósito amiloide é mínimo focal e segmentar, dentro do pólo vascular ou no mesângio. Na análise pela HE, coloração de rotina, o depósito pode ter aparência quase normal, portanto técnicas histoquímicas e MET podem ser necessárias para um diagnóstico definitivo. Vermelho Congo e outras técnicas podem não identificar claramente pequenos depósitos e a avaliação ultraestrutural é a melhor maneira de obter o diagnóstico. Pode não ocorrer alteração tubulointersticial concomitante.22 Classe II de envolvimento glomerular é definida como amiloidose mesangial mínima com 10% a 25% de extensão, sem alteração tubulointersticial concomitante. O depósito amiloide é focal e segmentar dentro do pólo vascular e no mesângio. Às vezes, a diferenciação entre classe I e classe II com base em microscopia óptica de rotina pode ser difícil. Se a suspeita de amiloidose não foi feita através da coloração pelo HE, deve-se classificar como classe I.22 Classe III de envolvimento glomerular é definida como amiloidose mesangiocapilar focal com 26% a 50% de extensão (segmentar) e menos de 50% glomérulos (focal) facilmente reconhecidos na coloração de rotina (HE). Discretas alterações tubulointersticiais corticais podem estar presentes. Amiloide nos vasos e no interstício medular pode acompanhar as lesões glomerulares. 22 Classe IV de envolvimento glomerular é definida como amiloidose difusa mesangiocapilar com 51% a 75% de extensão. O acometimento glomerular pode ser global ou segmentar, à semelhança da nefrite lúpica difusa global ou segmentar. Alterações tubulointersticiais corticais crônicas devem estar presentes, incluindo os

30

depósitos intersticiais, atrofia tubular, fibrose e inflamação, e glomérulos globalmente esclerosados. Diferenciação de classe IV da classe III pode ser difícil. Se houver lesão tubulointersticial significativa e envolvimento glomerular difuso, deve-se classificar como classe IV.22 Classe V de envolvimento glomerular é definida como um padrão membranoso difuso sem deposição proeminente mesangial, muito parecido com glomerulonefrite membranosa. Foi observado que este padrão é geralmente associado com AL ou amiloidose não AA. Depósitos focais mínimos de padrão membranoso na AL (forma precoce) devem ser classificados como classe I. Esse padrão foi descrito como perimembranosa (tipo III) por Shiiki e colaboradores.24 Classe VI de envolvimento glomerular é definido como amiloidose avançada, com mais de 76% de extensão, ocupando mais de 50% do tufo glomerular, e nódulos de amiloide glomerular com ou sem esclerose global. Nesta classe há perda tubular proeminente com fibrose intersticial e inflamação.22 A classificação em cada compartimento encontra-se detalhada nas tabelas a seguir (Tabelas 1, 2 e 3). Tabela 1 – Classificação histopatológica da amiloidose renal baseada no envolvimento glomerular Classe

Definição

0

Ausência de depósitos amiloides

I

Depósito amiloide mínimo hilar

II

Depósito amiloide mínimo mesangial

III

Depósito amiloide mínimo focal mesangiocapilar

IV

Depósito amiloide difuso mesangiocapilar

V

Depósito amiloide membranoso

Fonte: SEN, S.; SARSIK, A proposed histopathologic classification, scoring, and grading VI Amiloidose renalB.avançada system for renal amyloidosis: standardization of renal amyloid biopsy report. Arch Pathol Lab Med, 134(4), 2010

31

Tabela 2 – Classificação histopatológica dos depósitos amiloides vasculares Grau

Definição

0

Ausência de depósitos vasculares

1

Depósito amiloide vascular mínimo

2

Depósito amiloide vascular focal

3

Depósito amiloide vascular moderado

4 Depósito amiloide severohistopathologic classification, scoring, and grading Fonte: SEN, S.; SARSIK, B. difuso A proposed system for renal amyloidosis: standardization of renal amyloid biopsy report. Arch Pathol Lab Med, 134(4), 2010 Tabela 3 –Classificação histopatológica dos depósitos amiloides intersticiais Grau

Definição

0

Ausência de depósitos intersticiais

1

Depósito amiloide intersticial mínimo

2

Depósito amiloide intersticial focal

3

Depósito amiloide intersticial moderado

4

Depósito amiloide intersticial severo

Fonte: SEN, S.; SARSIK, B. A proposed histopathologic classification, scoring, and grading system for renal amyloidosis: standardization of renal amyloid biopsy report. Arch Pathol Lab Med, 134(4), 2010

2.6.2 IMUNO-HISTOQUÍMICA E IMUNOFLUORESCÊNCIA A distinção dos diferentes tipos bioquímicos das fibrilas amiloidóticas é fundamental em relação à patogênese da doença e às estratégias terapêuticas a serem adotadas.78 Não há diferenciação histomorfológica que possa fazer esta distinção, embora algumas associações como o predomínio de depósitos vasculares e intersticiais na doença hereditária e glomerulares e vasculares na AA tenham sido reladas na literatura e da mesma forma, não há distinção ultraestrutural evidente à

32

microscopia eletrônica.22,24 A coloração pelo vermelho Congo tratado com permanganato de potássio também não se aplica, na medida em que casos não AA podem levar a diagnósticos falso-negativos. As técnicas mais usadas para identificação amiloide são a imunofluorescência (IF) e a imuno-histoquímica (IHQ), com

a

utilização

de

anticorpos

dirigidos

especificamente

para

proteínas

amiloidogênicas. Tais técnicas são consideradas acessíveis e de fácil aplicação laboratorial. Quanto à amiloidose AA, não há vieses significativos, o contrário acontece com a amiloidose AL, que pode ser confundida com amiloidoses hereditárias quando da negatividade com anticorpos comerciais, quando então são necessários outros estudos moleculares em laboratórios especializados. 79,46 Bely estudou a solubilidade e resistência do depósito amiloide correlacionando estas com a apresentação histopatológica observada com auxílio de histoquímica e imunohistoquímica, concluindo como pode ser útil a aplicação de tais técnicas na avaliação prognóstica do paciente com amiloidose renal.80 Para correta avaliação clínica, a utilização no diagnóstico de técnicas imunohistoquímicas é considerada padrão de referência atual na classificação bioquímica do amiloide. O método pode ser realizado com segurança, utilizando-se tecidos processados por métodos de congelação ou inclusão em parafina. No entanto, na amiloidose AL caracterizada na IHQ o desafio permanece e as dificuldades envolvem truncamento das fibrilas cadeia leve ou pesada. 81 Existem anticorpos comerciais para as regiões constantes das cadeias leves das imunoglobulinas (Ig). Nos casos AL em que as fibrilas amiloides são derivadas de cadeia leve truncada, ou seja, contendo somente regiões variáveis, não costuma haver imunorreatividade com anticorpos comerciais.4 Da mesma forma, um painel limitado de anticorpos pode excluir diagnósticos de

amiloidose

hereditária,

principalmente

marcando

cadeias

leves

de

imunoglobulina. Nestes casos, o principal diagnóstico diferencial é entre o amiloide AL e amiloidose hereditária. A imunofluorescência pode aumentar a sensibilidade em relação à reação por imunoperoxidase em cortes de parafina, principalmente em depósito pequenos, mas sua especificidade é baixa. 53 Contudo, o vermelho Congo continua sendo padrão ouro diagnóstico e quando associado aos resultados de IHQ a sensibilidade diagnóstica é maior.21 Tem sido observadas variações na polarização do Vermelho Congo, com tonalidades discrepantes do clássico descrito (verde

33

maçã), sendo acrescidas cores como amarelo, azul e vermelho. O verde puro seria condição ideal, mas é comum a coloração amarela por questões físicas de birrefringência e ainda o azul e o vermelho dependentes de posicionamento do filtro polarizador e do analisador.82-84

34

3 OBJETIVOS 3.1

GERAL Avaliar e utilizar a classificação de Sen e Sarsik, através de técnica

histomorfométrica, nos compartimentos glomerular, tubulointersticial e vascular.

3.2 ESPECÍFICOS a. Estabelecer

a

utilidade

diagnóstica

da

padronização

de

laudos

histopatológicos em amiloidose renal, através da descrição do grau de envolvimento das estruturas renais. b. Caracterizar as formas de apresentação clínica e laboratorial através da análise dos dados obtidos em protocolo clínico. c. Correlacionar os achados clínicos e laboratoriais aos tipos de amiloidose renal e a extensão dos depósitos amiloides nos compartimentos renais pelas técnicas histológicas aplicadas ao estudo (HE, IF e VC). d. Correlacionar dados epidemiológicos com a extensão dos depósitos amiloides nos compartimentos renais.

35

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1

MATERIAL Do levantamento de 1609 casos de biopsia percutânea em rim nativo, no

período de 2000 a 2011, proveniente da consultoria em nefropatologia do Laboratório Bio Neo - Rio de Janeiro (liberado para investigação com consentimento da administração do laboratório Bio Neo, conforme Anexo 1) foram selecionados quarenta e dois casos com diagnóstico histopatológico de amiloidose renal. Destes, 37 casos apresentavam informação suficiente para avaliação de dados clínicos e laboratoriais. Foram excluídos casos sem representação cortical e lâminas tecnicamente inviáveis para análise. Assim, 17 casos, contendo lâminas e/ou blocos de parafina com tecido preservado, foram submetidos a estudo histomorfométrico. O material corresponde a lâminas coradas pela hematoxilina e eosina e pelo vermelho Congo, laudos histopatológicos com as descrições das biopsias renais à microscopia óptica e de imunofluorescência. Também foram selecionados blocos de parafina para posterior aplicação de técnica de IHQ por IP.

4.1.1 Critérios de inclusão

36

Casos diagnosticados como amiloidose renal AL ou não AL, com requisições contendo informações clínico-laboratoriais e laudos histopatológicos com descrição da microscopia e IF.

4.1.2 Critérios de exclusão Foram excluídas amostras tecnicamente inadequadas, casos em que o diagnóstico tenha ocorrido na ausência de glomérulos para exame histológico, casos em que o material residual em bloco de parafina foi insuficiente para aplicação da técnica de VC e aqueles com dados insuficientes do paciente na requisição da biopsia renal.

4.1.3 Microscopia óptica As amostras para microscopia óptica foram fixadas em formalina a 10% tamponada, em tampão fosfato pH 7.0,

processadas de acordo com a rotina e

emblocados em parafina para diagnóstico em nefropatologia. Realizados cortes seriados, com 3 m de espessura, em 5 níveis, corados pela hematoxilina e eosina (HE), ácido periódico reativo de Schiff (PAS), tricrômico de Masson (TM) e prata metenamina (PASM), cujas técnicas estão detalhadas nos Anexos 2, 3, 4 e 5. Nos casos analisados, tais colorações auxiliam principalmente na distinção entre o componente proteico amiloide e outras estruturas, dentre elas o colágeno, que, ao se depositar no parênquima renal, assume aspecto parecido com o amiloide à Hematoxilina e Eosina. Cortes adicionais de 7 m de espessura foram corados pelo VC pela técnica de Highman,85 detalhada no Anexo 6, e análise feita em campo claro e sob luz polarizada. Todas as biopsias foram processadas, cortadas e posteriormente coradas por um único técnico com formação especializada para tais procedimentos.

37

4.1.4 Imuno-histoquímica por imunofluorescência As amostras para microscopia de IF foram transportadas em solução transporte de Michel,86 descrita no Anexo 7, lavadas em PBS pH 7.4, embebidas em tissue Tek® e congelado com auxílio de nitrogênio líquido, cortadas em criostato a 20ºC, em 5 µm e incubadas segundo técnica descrita no Anexo 8 para os antissoros de coelho anti-humanos policlonais, para imunoglobulinas, componentes do complemento e proteínas específicas, conjugados a isotiocianato de fluoresceína (FITC) fornecidos pela DAKO®: IgA, IgG, IgM, C3, C1q, C4, fibrinogênio, cadeia leve Kappa e cadeia leve Lambda. Tais marcadores fazem parte da rotina diagnóstica previamente aplicada a todos os casos de biopsia renal, sendo de particular interesse no presente estudo as cadeias leves Kappa e Lambda, a fim de confirmar os casos suspeitos de amiloidose AL.

4.1.5 Informações epidemiológicas, clínicas e laboratoriais Informações epidemiológicas clínicas e laboratoriais foram registradas no momento da biopsia para posterior avaliação em conjunto com os achados histopatológicos. Dentre elas podemos citar idade, sexo, raça, indicação para a realização da biópsia renal, hipertensão, edema, artrite/artralgia, neuropatias, doenças associadas, vômitos, lesões cutâneas, proteinúria de 24 horas, virologia (HbsAg, anti-HCV, HIV) e sorologia (FAN, anti-DNA, C3 e C4).

4.2

MÉTODOS

4.2.1 Microscopia óptica

38

Foi procedida revisão de todas as lâminas obtidas dos 37 casos selecionados. Destes, 17 foram submetidos a registro fotográfico para posterior estudo histomorfométrico. As características histopatológicas foram estudadas por meio de revisão interobservadores das biopsias (nefropatologista, orientador e aluna do mestrado), baseada em protocolo previamente estabelecido segundo a classificação de Sen e Sarsik, detalhada adiante. Na revisão dos casos foi levado em consideração os seguintes aspectos: adequabilidade da amostra (número total de glomérulos), afinidade tintorial dos depósitos amiloides (HE, PAS, TM, PASM) e birrefringência (quando analisados cortes corados por VC sob luz polarizada), padrão de deposição amiloide (glomerular, vascular ou tubulointersticial) e achados secundários: esclerose glomerular, arterioesclerose, hialinose arterial e arteriolar, fibrose intersticial e atrofia tubular.

4.2.1.1 Histomorfometria Os 17 casos foram fotografados em sequência com aumento de 200x para tubulointerstício e 400x para glomérulos e vasos. A análise histomorfométrica foi realizada com o programa AxioVision Rel. 4.7, que foi calibrado com escalas correspondentes ao microscópio acoplado à câmera fotográfica CCD Canon G10 com 14.7MP. Foi analisado a forma de distribuição de depósitos amiloides nos diferentes compartimentos do parênquima renal: glomerular, tubulointersticial e vascular, além da análise quantitativa destes em cada compartimento, com inserção dos valores numéricos obtidos em planilhas, como detalhado nos tópicos seguintes. Durante a avaliação da histomorfometria, os valores obtidos por mensuração a HE são comparados aos do VC.

4.2.1.2 Compartimento glomerular Para cada caso foram geradas imagens sequenciais das colorações HE e VC em 400x, analisadas individualmente, onde é observado o número de glomérulos, se estes estão representados completamente ou parcialmente (ambos os cortes

39

completo e parcial foram considerados), área glomerular total, área do tufo capilar (excluído o espaço de Bowman) e área de depósitos amiloides, quando presentes (Tabela 4).

Tabela 4 – Análise do compartimento glomerular à coloração HE em caso exemplo

Organização dos valores morfométricos em planilha do Excel

Os valores encontram-se em m², e foram obtidos com auxílio de calibragem feita a partir da máquina fotográfica acoplada ao microscópio e programação de escalas no AxioVison (Figura 1).

40

Figura 1 – Calibragem da imagem no AxioVision

AxioVisionLE Release 4.7.2 (12-2008)

Os glomérulos foram delimitados a partir da cápsula de Bowman e ao redor dos tufos capilares, contornando espaços interlobulares se forem nítidos, padronizados com linha de cor vermelha e os depósitos amiloides em preto (Figura 2). O mesmo foi feito com os glomérulos identificados à microscopia de campo claro e à luz polarizada na coloração pelo VC, que foi usada como imagem de pareamento com o campo claro (Figura 3).

41

Figura 2 – Aspecto histopatológico da análise glomerular à Hematoxilina e Eosina

Corte corado pela hematoxilina e eosina, evidenciando as áreas analisadas – depósitos amiloides (cabeças de seta), cápsula de Bowman e tufo glomerular (em vermelho).

Figura 3 – Aspecto histopatológico da análise glomerular ao Vermelho Congo

A

B

Cortes corados pelo vermelho Congo, evidenciando em (A) as áreas analisadas – depósitos amiloides (cabeças de seta), cápsula de Bowman e tufo glomerular (em vermelho) e em (B) a imagem correspondente com brilho esverdeado dos depósitos sob luz polarizada.

42

Alterações secundárias (principalmente fibrose/esclerose) foram separadas dos depósitos amiloides com uso de colorações especiais (PASM, PAS e TM), além da polarização pelo VC. Foram considerados capilares preservados aqueles com alças finas e nítidas. Em alguns glomérulos havia grande deposição amiloide, ocupando quase toda a área capilar, e formando alguns pequenos espaços brancos que não foram considerados na mensuração de área, realizada nas colorações Hematoxilina e Eosina e Vermelho Congo (Figuras 4 e 5).

Figura 4 – Aspecto histopatológico da análise glomerular à Hematoxilina e Eosina em doença avançada

Corte corado pela hematoxilina e eosina, evidenciando a área analisada – depósito amiloide ocupando todo o tufo glomerular.

43

Figura 5 – Aspecto histopatológico da análise glomerular ao Vermelho Congo em doença avançada

B

A

Cortes corados pelo vermelho Congo, evidenciando em (A) a área analisada em preto – depósito amiloide ocupando todo o tufo glomerular e em (B) a imagem correspondente com brilho esverdeado dos depósitos sob luz polarizada.

4.2.1.3 Compartimento vascular Assim como no compartimento glomerular, foram analisadas imagens sequenciais com aumento de 400x, e os dados gerados foram reunidos na planilha para cada caso (Tabela 5). Artérias e arteríolas foram analisadas (não foram considerados estruturas venosas ou capilares intertubulares), através do número de segmentos vasculares, área da parede vascular (contornada em amarelo) e área de depósito amiloide (contornado em preto), quando presente (Figuras 6 e 7).

44

Tabela 5 – Análise do compartimento vascular à coloração HE em caso exemplo

Organização dos valores morfométricos em planilha do Excel

45

Figura 6 – Aspecto histopatológico da análise vascular à Hematoxilina e Eosina

Corte corado pela hematoxilina e eosina, evidenciando a área analisada – depósito amiloide (linha preta) ocupando a parede vascular (linha amarela).

Figura 7 – Aspecto histopatológico da análise vascular ao Vermelho Congo

A

B

Cortes corados pelo vermelho Congo, evidenciando em (A) as áreas analisadas – depósito amiloide em preto ocupando a parede vascular em amarelo e em (B) a imagem correspondente sob luz polarizada mostrando brilho esverdeado.

46

As classes mínima, focal, moderada e severa de depósitos amiloides vasculares foram referidas na classificação de Sen e Sarsik, porém não quantificadas. Aqui atribuímos valores percentuais de 0 a 25% para a classe I (mínima), 26 a 50% à classe II (focal), 51 a 75% à classe III (moderada) e >75% à classe IV (severa). A área da parede vascular foi considerada como 100% e os valores dos depósitos amiloides, obtidos pela morfometria, foram enquadrados na classe de percentual correspondente.

4.2.1.4 Compartimento tubulointersticial As imagens sequenciais foram fotografadas em aumento de 200x e registradas como área total da biopsia, área tubulointersticial (excluídos vasos e glomérulos da área total) e área de deposição amiloide, a partir do somatório de todas as imagens. A área total foi contornada por linha azul e a extensão do fragmento foi indicada por linha amarela (Figura 8). A linha azul contornou a área do tecido, finalizando sempre em uma reta horizontal que se repete na foto seguinte e assim sucessivamente até completar toda a extensão da biopsia. A linha amarela parte sempre do ponto mais alto da biopsia até o meio da linha azul horizontal (quando na extremidade da biopsia) ou do meio de uma linha horizontal azul para o meio da linha horizontal azul seguinte (sequências de imagens do meio da biopsia). Vasos e glomérulos foram contornados com cores correspondentes previamente citadas (glomérulos em vermelho e vasos em amarelo) para exclusão; bem como possíveis depósitos amiloides foram contornados por linha preta (Figura 9).

47

Figura 8 – Aspecto histopatológico da análise tubulointersticial 229636.84 µm²

Corte corado pela hematoxilina e eosina, evidenciando a área analisada – área total (linha azul) e comprimento (linha amarela).

48

Figura 9 – Aspecto histopatológico da exclusão glomerular e vascular no compartimento tubulointersticial

Corte corado pela hematoxilina e eosina, evidenciando a área analisada – área total (linha azul) e áreas de exclusão glomerular (linha vermelha) e vascular (linha amarela).

49

Os dados finais tabelados geraram valores correspondentes à área total da biopsia,

área

tubulointersticial,

comprimento

da

biopsia

e

área

amiloide

tubulointersticial (Tabela 6). Assim como no compartimento vascular, as classes mínima, focal, moderada e severa de depósitos amiloides tubulointersticiais foram referidas na classificação de Sen e Sarsik, porém não quantificadas. Aqui atribuímos valores percentuais de 0 a 25% para a classe I (mínima), 26 a 50% à classe II (focal), 51 a 75% à classe III (moderada) e >75% à classe IV (severa). A área tubulointersticial foi considerada como 100% e os valores dos depósitos amiloides obtidos pela morfometria, foram enquadrados na classe de percentual correspondente. Tabela 6 – Análise do compartimento tubulointersticial à Hematoxilina e Eosina em caso exemplo

Organização dos valores morfométricos em planilha do Excel

50

4.2.1.5 Classificação de Sen e Sarsik Com base nos achados registrados nas diferentes tabelas, foi aplicada a classificação de Sen e Sarsik (vide revisão da literatura).22 Os mesmos casos foram reavaliados e classificados por estudo cego por nefropatologista e co-orientador. Após a discriminação das diferentes classes, foi observado que não houve na classificação

usada

como

referência,

detalhamento

do

comprometimento

tubulointersticial e vascular, diferentemente do que ocorre com o compartimento glomerular. A extensão da lesão nestes compartimentos é de extrema importância na progressão para cronicidade. A partir desta observação, estabelecemos na metodologia do estudo atual, critérios bem definidos para estudo dos três compartimentos renais (vide item 3.2.1.1 Histomorfometria).

4.2.2 Análise dos resultados Todos os dados numéricos provenientes do estudo histomorfométrico, bem como dados clínicos e laboratoriais previamente fornecidos, foram incluídos em planilha Excel para correlação estatística. Os dados numéricos referidos incluíram as classes de deposição amiloide em glomérulos, a partir dos percentuais calculados com a proporção da área de deposição amiloide em relação à área do tufo capilar na coloração VC em campo claro. Os dados numéricos também incluiram a classe tubulointersticial, correspondendo a área de depósito amiloide ao VC em relação à área tubulointersticial, bem como a classe vascular que relaciona a área amiloide com a área total da parede vascular. Tais classes foram relacionadas aos seguintes dados clínico-laboratoriais uniformemente presentes na requisição da biopsia: idade, sexo, tipagem amiloide (AL e não AL), creatinina sérica, hipoalbuminemia, hipertensão arterial, proteinúria, hipercolesterolemia e síndrome nefrótica. Os resultados da dosagem de creatinina foram divididos em dois grupos, um com valores menores ou iguais a 1.7 mg/dL e outro com valores maiores). Os valores referentes a proteinúria foram divididos em 3 diferentes faixas: menos que 500 mg/dia, 500 a 3500 mg/dia e mais que 3500 mg/dia). Para verificação de diferença estatística significativa entre as classes de deposição amiloide em cada compartimento e idade, foi usado o teste de Kruskal-

51

Wallis. Quando comparadas as classes com o sexo dos pacientes e com as tipagens AL e não AL, foi usado o teste de Fisher. Para analisar a associação das classes com os valores de creatinina e proteinúria, bem como com a presença de hematúria, hipertensão arterial e hipercolesterolemia, foi usado o teste de diferença de proporções. A todos os testes foi aplicado nível de significância  = 0,05. Foi também utilizado o coeficiente kappa de Cohen (), a fim de avaliar a concordância entre os achados à HE e ao VC.

52

5 RESULTADOS

De 2000 a 2011, 37 casos com diagnóstico histopatológico de amiloidose renal foram selecionados do total de 1609 biopsias renais percutâneas, correspondendo a 2,3%. Dos casos selecionados, 18 pacientes eram do sexo feminino e 19 do sexo masculino. Do total de casos, 29,7% eram do sexo feminino e foram diagnosticados como amiloidose não AL, 18,9% eram do sexo feminino com amiloidose AL, 27,1% do sexo masculino não AL e 24,3% masculino AL, como pode ser visto na Tabela 7. Tabela 7 – Características epidemiológicas dos casos não AL e AL Parâmetros

Amiloidose não AL

Amiloidose AL

Número de pacientes

21

16

Idade (anos)

57.9 ± 12.7

56.6 ± 11

11 (29.7%)

7 (18.9%)

10 (27.1%)

9 (24.3%)

Sexo Feminino Masculino

Dados obtidos a partir da revisão das requisições de biopsia renal.

O Gráfico 1 mostra a distribuição dos casos AL e não AL, ao longo dos anos estudados.

53

Gráfico 1 – Distribuição de casos de amiloidose renal AL e não AL por ano de 2000 a 2011

Número de casos diagnosticados como amiloidose renal em cada ano em relação ao número total de casos no respectivo ano.

No grupo de 37 casos com dados clínicos e laboratoriais, foi observado expressivo aumento no diagnóstico de amiloidose AL no nosso grupo de pacientes em anos mais recentes (2006 a 2011). A idade variou entre 32 e 80 anos, média de 57 anos, sendo 62,2 % dos casos com mais de 50 anos. A média de idade entre os casos não AL foi 50,24 e em casos AL foi 60,33. A frequência nos tipos de amiloidose de acordo com a distribuição etária é ilustrado no Gráfico 2, sendo identificados 2 pacientes com idade entre 30 e 39 anos, 8 entre 40 e 49 anos, 9 entre 50 e 59 anos, 12 entre 60 e 69 anos, quatro entre 70 e 79 anos, e um paciente com 80 anos. Foram diagnosticados 11 pacientes do sexo feminino com amiloidose não AL, e 10 do sexo masculino com o mesmo diagnóstico. Sete pacientes eram do sexo feminino, com diagnóstico de amiloidose AL e 9 do sexo masculino com o mesmo tipo de amiloidose. Dos 37 casos, 21 (56,8%) foram diagnosticados como amiloidose renal não AL e 16 (43,2%) como AL. No que diz respeito ao gênero, mulheres mostraram uma tendência semelhante quando comparadas com homens em nosso estudo (48,6% dos casos eram de pacientes do sexo feminino e 51,4% do sexo masculino). Em nosso estudo, observaram-se 12 mulheres e 10 homens não AL e 6 mulheres e 9 homens AL.

54

Gráfico 2 – Frequência de amiloidose AL e não AL de acordo com idade e sexo

A idade foi distribuída em faixas etárias.

Em nossos casos, doze pacientes mostraram aumento da creatinina sérica no momento da biopsia, oito destes com amiloidose AL. Hipertensão arterial sistêmica (níveis acima de acima de 140/90 mmHg) foi identificada em 14 (37,8%) dos nossos pacientes. O compartimento de maior deposição amiloide foi glomerular (97% dos casos),

frequentemente

com

depósitos

tubulointersticiais

e

vasculares

concomitantes (21% e 57%, respectivamente). Sessenta e sete por cento das biópsias mostravam áreas pontuais de fibrose intersticial e 12% apresentavam vários focos de fibrose. Quinze por cento dos casos não exibiram fibrose intersticial. Um paciente do sexo feminino, de 51 anos de idade, apresentou história familiar para doença renal (não especificada), com positividade para cadeia leve nos glomérulos à imunofluorescência, diagnosticado como AL. Testes laboratoriais mostraram proteínúria de 24 horas média de 5839mg/dia (979mg/dia a 17900mg/dia). Apenas 10,8% dos pacientes apresentaram proteinúria de entre 1g/dia e 3,5 g/dia, e 54% desenvolveram proteinúria nefrótica. Proteinúria inferior a 1g/dia esteve presente em 2,7% dos pacientes. Hipoalbuminemia foi observada em 2 (5,4%) pacientes. Hipercolesterolemia foi vista em 6 pacientes. Síndrome nefrótica foi registrada em 9 dos 37 pacientes estudados (24%) e 5 pacientes apresentaram edema sem síndrome nefrótica associada. Hematúria foi

55

detectada em 75% dos pacientes. Insuficiência renal aguda ocorreu em cerca de 10% dos pacientes e perda de função renal crônica em cerca de 5% no momento do diagnóstico. Nenhum dos 15 pacientes testados apresentou sorologia positiva para HIV ou hepatite B ou C. Os 4 rins cujas imagens radiológicas foram fornecidas mostraram tamanho e aparência normais. Não foram relatados casos com presença de proteína de Bence Jones na urina no momento da biopsia e também não foram identificados pacientes portadores de diabetes mellitus. As características demográficas, clínicas e bioquímicas dos pacientes estudados estão resumidas na Tabela 8.

Tabela 8 – Características clínicas e laboratoriais dos casos não AL e AL Características clínicas Parâmetros

Amiloidose não AL

Amiloidose AL

Edema

5 (13,5%)

2 (5.4%)

Síndrome nefrótica

4 (10.8%)

5 (13,5%)

Hipertensão arterial

8 (21.6%)

6 (16.2%)

Insuficiência cardíaca

1 (2.7%)

1 (2.7%)

IRA (insuficiência renal aguda)

2 (5.4%)

2 (5.4%)

IRC (insuficiência renal crônica)

1 (2.7%)

1 (2.7%)

Parâmetros

Amiloidose não AL

Amiloidose AL

Proteinúria de 24h

5.9 ± 4.3

5.8 ± 3.6

Hematúria

5 (13,5%)

4 (10.8%)

Anti-HCV

negativo

negativo

HBsAg

negativo

negativo

Anti-HIV

negativo

negativo

Creatinina

3.4 ± 3.4

1.9 ± 1.3

Proteína de Bence Jones

negativo

negativo

Hipoalbuminemia Hipercolesterolemia

1 (2.7%)

1 (2.7%)

3 (8.1%)

3 (8.1%)

Características laboratoriais

Dados obtidos a partir da revisão das requisições de biopsia renal.

Dentre os 17 casos submetidos a estudo histomorfométrico, observou-se distribuição mais intensa dos depósitos amiloides no compartimento glomerular (Classe IV em 29,4% dos casos e Classe VI em 23,5% dos casos). Os demais

56

compartimentos (tubulointersticial e vascular) mostraram menor quantidade de depósitos (a maior parte dos casos contida na Classe I ou mesmo sem depósitos), como pode ser visto na Tabela 9.

Tabela

9

–

Distribuição

amiloide

nos

compartimentos

glomerular,

vascular

e

tubulointersticial

Classe (ausência)

Glomérulos Nº de % casos 1 5,9

Vasos Nº de % casos 4 23,5

Tubulointerstício Nº de % casos 6 35,3

I

1

5,9

8

47,1

9

52,9

II

3

17,6

1

5,9

0

0,0

III

3

17,6

1

5,9

1

5,9

IV

5

29,4

3

17,6

1

5,9

V

-

-

-

-

-

-

VI Total

4

23,5

-

-

-

-

17

100

17

100

17

100

Número absoluto e percentual de casos em cada classe de quantificação amiloide – com base na classificação de Sen & Sarsik.

Não houve diferença estatística entre idade e classe glomerular de depósitos. Contudo, é possível observar a distribuição das classes de depósito amiloide nas faixas etárias no Gráfico 3.

57

58

Também

não

houve

diferença

estatisticamente

significativa

entre

a

localização glomerular, vascular ou tubulointersticial dos depósitos e o sexo dos pacientes diagnosticados, bem como com os tipos não AL e AL. A distribuição de amiloide nos três compartimentos foi ainda associada ao nível de creatinina sérica, à presença de hematúria, a hipertensão arterial, hipercolesterolemia e aixa de proteinúria, sem significância estatística. Os valores de proteinúria de 24 horas foram divididos em três faixas: valores inferiores a 500 mg/dia, valores entre 500 mg/dia e 3500 mg/dia e valores acima de 3500 mg/dia. Nenhum caso apresentou proteinúria de 24 horas inferior a 500mg. Foi observada concordância entre a análise da distribuição de depósitos amiloides pelo HE e pelo VC. As classes glomerulares concordantes atingiram 76,5% dos casos. As classes tubulointersticiais concordantes atingiram 88,2% dos casos. A análise da concordância referente à distribuição de depósitos amiloides nos vasos pelo HE e pelo VC, não foi possível de ser realizada em virtude da ausência de casos categorizados nas classes II e III pelo HE, criando uma situação de assimetria classificatória. No entanto, a avaliação das concordâncias decisórias pelo HE e pelo VC mostra um patamar de 70,6% dos casos com depósitos vasculares.

59

6 DISCUSSÃO

O aumento do número de casos de amiloidose renal vem sendo observado por estudos como o de Tsai e colaboradores, que referem esta tendência como consequência de mecanismos obscuros, mas provavelmente poderia ser justificada em parte devido ao envelhecimento populacional, resultando em maior quantidade de pessoas em idade de alto risco para o desenvolvimento de amiloidose. 72 O mesmo fator de risco é referido pelos autores como importante para o aumento da incidência de amiloidose AL. A maioria dos casos de amiloidose não AL ocorrem no contexto de processos inflamatórios crônicos, o que não depende da idade.72 Em nosso levantamento foi observada grande variação no número de novos casos, tanto AL quanto não AL, com maior destaque para casos AL os mais diagnosticados a partir de 2006. Essa mudança de perfil diagnóstico pode ter associação com a utilização de novas ferramentas clínico-laboratoriais que possam ter aumentado o número de casos suspeitos da forma primária de amiloidose. Von Hutten relatou que as prevalências absoluta e relativa de amiloidose renal tipos AA e AL não apresentaram tendências significativas para diminuição ou aumento durante o período de 17 anos de estudo.5 Pettersson relatou que a incidência de amiloidose AL tem se mantido estável ao longo dos anos.2 Bergesio e colaboradores e Von Hutten relataram maior número de casos de AL (63,5% e 53,7%), o que pode estar relacionado aos achados da literatura sobre maior prevalência de amiloidose AL em países desenvolvidos.16,5

60

O estudo italiano citado também mostrou que a idade média de diagnóstico foi de 63 anos (19 a 88 anos), sem diferença significativa entre homens (média 63 anos) e mulheres (média de 66 anos).16 Pacientes do sexo feminino mostraram tendência semelhante quando comparadas com os do sexo masculino em nosso estudo, o que também vem sendo demonstrado por outros estudos.16,72 No entanto, Tsai e colaboradores observaram em sua coorte que o número total de casos do sexo masculino foi superior ao do sexo feminino e a incidência de amiloidose AL mostrou estar aumentando em mulheres.72 Apesar de ser considerada causa importante de lesão glomerular associada a doenças metabólicas no adulto e um dos diagnósticos mais frequentes nos idosos,8 não foi evidenciada associação estatística entre idade e intensidade de deposição amiloide nos diferentes compartimentos no presente estudo. A questão a respeito de maior susceptibilidade feminina ao desenvolvimento de amiloidose AL nos últimos anos é incerta, sendo esta informação nova na literatura mostrando necessidade de investigação mais profunda.72 No nosso trabalho, não observamos diferença relevante entre os gêneros. A maioria dos casos era proveniente de pacientes na 7ª década de vida (12 casos), e a média de idade nos casos AL foi ligeiramente maior que nos casos não AL (60,33 contra 50,24). No estudo de Bergesio e colaboradores, dez pacientes estavam em diálise no momento do diagnóstico, cinco deles apresentavam forma AL, e cinco não AL. 16 Com a progressão do comprometimento renal, azotemia e insuficiência renal e hipertensão arterial podem se desenvolver no paciente com amiloidose renal. 2 Em nossos casos, doze pacientes mostraram aumento da creatinina sérica no momento da biopsia, oito destes com amiloidose AL. Concordamos com Tsai e colaboradores a respeito de que algum grau de comprometimento da função renal possa estar associado com altos níveis de pressão arterial,72 o que é visto em 14 (37,8%) dos nossos pacientes e foi relatado em 12,8% de 40 pacientes de um estudo recente do Cairo realizado entre 2003 a 2009.87 Hipertensão arterial é descrita como característica incomum da amiloidose, que pode se dar por comprometimento vascular por depósitos amiloides.4 No nosso estudo, não houve associação estatística significativa entre hipertensão arterial sistêmica e depósitos amiloides vasculares ou em nenhum dos outros dois compartimentos. Depósitos vasculares são relatados como associados a maiores

61

níveis séricos de creatinina, apesar de tais dados não demonstrarem significância estatística.20,24 Esta associação também não foi comprovada no presente trabalho. A diminuição

do

lúmen

vascular

pode

provocar

isquemia

glomerular

e

consequentemente alterar o clearance de creatinina. Muitos dos casos de amiloidose sistêmica são caracterizados pelo envolvimento renal, o qual pode ser refletido em altos índices de proteinúria de 24 horas, principalmente composta por albumina superior a 0,5 g. 2 De acordo com outros autores, a proteinúria média também esteve acima da faixa nefrótica, 5,8 ± 3,9 g/dia.72,5 A proteinúria foi

achado laboratorial mais frequente em relatos de

outros autores, com variações de amplo espectro, de assintomática a síndrome nefrótica grave, atingindo altas taxas de excreção urinária de 20 a 30g/dia. Quando a proteinúria excede 3 g a 5 g em 24 horas, a hipoalbuminemia é consequentemente desenvolvida,2 o que foi verificado em 2 (5,4%) dos 37 pacientes estudados. Apenas 10,8% dos nossos pacientes apresentaram proteinúria de 24 horas entre 1 g/dia e 3,5 g/dia e 54% mostraram proteinúria na faixa nefrótica. Proteinúria inferior a 1 g/dia esteve presente em 2,7% dos pacientes. Não houve associação estatística significativa entre proteinúria e depósitos glomerulares, tubulointersticiais ou vasculares no nosso trabalho. Contudo a literatura refere maior frequência deste indicador quando há distribuição amiloide mais difusa nos glomérulos, 20,24 o que nos parece coerente quando se leva em consideração o comprometimento direto da barreira de filtração glomerular. Hematúria foi detectada em 75% dos nossos casos estudados, contradizendo a literatura que relaciona este dado como achado raro na amiloidose renal. 2 Não evidenciamos associação estatística significativa desta forma de apresentação clínica com o padrão de distribuição amiloide. Verine e colaboradores afirmaram haver relação significativa entre hematúria e depósitos glomerulares (p = 0.0089). 24 De forma semelhante ao que acontece com a membrana basal glomerular afetada por

depósitos

amiloides,

gerando

proteinúria,

acreditamos

que

pelo

comprometimento da membrana filtrante possa haver perda de hemácias na urina, de forma mais intensa em pacientes com extensos depósitos glomerulares. Segundo Pettersson, cerca de 15% dos pacientes com amiloidose AL preenchem os critérios para mieloma múltiplo, e em cerca de 15% dos pacientes com amiloidose, tal neoplasia irá se desenvolver.2 Na análise de nossos protocolos

62

clínicos não foram identificadas informações sobre doenças linfoproliferativas ou resultado para pesquisa de proteínas de Bence Jones no exame da urina. Deste modo, esses dados não foram incluídos na discussão no trabalho. Apesar

do

recente

estabelecimento

da

padronização

de

critérios

histopatológicos como forma de classificação para avaliar extensão das lesões morfológicas na amiloidose renal,22 ainda não há referido na literatura uso amplo desta classificação entre os vários patologistas envolvidos no diagnóstico da doença. Tem sido observado que estudos que avaliam diferentes formas de envolvimento renal por depósitos amiloides detectados morfologicamente nas biopsias renais, não detalham a técnica de morfometria aplicada. 20,23,24,77,88,89 O estudo de Sen e Sarsik propõe um modelo de estimativa percentual que engloba os compartimentos glomerular, tubulointersticial e vascular, porém não mostra a aplicação de tal proposta dentro de um grupo de casos. Outros seis trabalhos publicados na literatura não só apresentam uma forma de quantificação, como a executam dentro de suas respectivas coortes, o que está resumido na Tabela 10. 20,23,24,78,88,89 Tabela 10 – Trabalhos publicados com abordagem da distribuição amiloide em biopsias renais Quantificação de depósitos

Autor (ano de publicação)

Número de casos

Período estudado

País

Hopfer et al. (2011)

203

48 anos

Verine et al. (2007)

174

Uda et al. (2006) Looi e Cheah (1996)

Shiiki et al. (1988)

Watanabe e Saniter (1975)

Glomérulos

Vasos

Tubulointerstício

Alemanha

Segmentar 50%*

-

-

16 anos

França

1+ 50%

leve, moderada, severa

leve, moderada, severa

38

5 anos

Japão

Tipo I ou intermediário*

Tipo II ou intermediário*

-

18

-

Malásia

>60% ou 60% ou 60% ou 60% em um dos três compartimentos, indica o padrão glomerular, vascular ou tubulointersticial *** Grau 4 é referente ao tufo glomerular completamente ocupado por depósitos (sem capilares remanescentes)

63

Em 2011, Hopfer e colaboradores20 relataram o padrão incerto de dinâmica dos depósitos amiloides em biopsias renais, dividindo o compartimento glomerular em dois grupos, o primeiro com menos que 50% do tufo capilar ocupado por depósitos e o segundo grupo com deposição amiloide em mais que 50% do tufo capilar. Tal trabalho refere ainda padrões glomerular, vascular e tubulointersticial de deposição amiloide (84,6%, 9,4% e 6% dos casos, respectivamente), mas sem detalhes quantitativos, relatando apenas predomínio de depósitos em determinado compartimento. Padrões glomerular, vascular e tubulointersticial já haviam sido utilizados por Looi e Cheah em 1996, com valores percentuais associados. A quantidade mínima de 60% de deposição amiloide glomerular definia tal padrão, da mesma forma que mais que 60% de ocupação da parede de artérias e arteríolas por depósitos definia o padrão vascular. Mais que 60% de acometimento do tubulointerstício caracterizava o padrão tubulointersticial.88 Verine e colaboradores graduaram os depósitos amiloides glomerulares em 1+, 2+ ou 3+ (50%) e referiram o comprometimento vascular e tubulointersticial como leve, moderado ou intenso, sem atribuição de estimativa percentual.24 Dois trabalhos publicados por autores do Japão fizeram também análise quantitativa dos depósitos amiloides.72,88 Um deles, publicado em 2006, reúne apenas casos com diagnóstico de amiloidose do tipo AA, mostrando presença exclusiva de amiloide nos glomérulos em 71,1% dos pacientes. 72 Essa distribuição exclusiva foi denominada como Tipo I ou padrão glomerular. Tipo II ou padrão vascular, onde os depósitos encontravam-se exclusivamente nas paredes de artérias e arteríolas, foi verificado em 28,9% dos pacientes. Havia ainda um grupo intermediário,

que

contava

com

depósitos

glomerulares

e

vasculares,

correspondendo a 52,6% do total de biopsias. Depósitos tubulointersticiais não foram mencionados. O outro estudo japonês enquadra o comprometimento glomerular por depósitos amiloides em graus 1, 2, 3 ou 4 (0,05). É possível que o número total de casos analisados tenha limitado a análise estatística, não permitindo estabelecer com exatidão diferenças estatísticas entre tipagem e distribuição da proteína amiloide. É importante lembrar que a amiloidose é doença incomum e a demonstração de perfil na distribuição dos casos pode contribuir para melhor compreensão da doença em nossa área geográfica, onde pouco conhecimento específico está descrito na literatura. Na classificação proposta por Sen e Sarsik são admitidos padrões morfológicos distintos de comprometimento glomerular por depósitos amiloides, tais aspectos não foram levados em consideração em nosso trabalho. Ao enquadrar o aspecto morfológico glomerular da amiloidose a classes semelhantes à da nefrite lúpica, os autores modificam e adaptam o que outros já haviam observado durante sua experiência.23,24 Concordamos que os glomérulos possam apresentar aspectos distintos quanto à distribuição dos depósitos amiloides, mas não parece adequado enquadrar tais distinções em classes, já que as alterações correspondem a diferentes estágios dentre de um mesmo espectro de acometimento do tufo capilar. Watanabe e Saniter (1975), uns dos primeiros a relatar variados aspectos do depósito amiloide glomerular à microscopia óptica, deixam claro que os depósitos acometem predominantemente o mesângio, com formação de nódulos ou apenas expansão do mesmo. Tais depósitos frequentemente se estendem do mesângio para a membrana glomerular e isso acarretaria maior susceptibilidade a proteinúria.23 Outros autores seguiram esta linha de observação, contudo denominando classes de acordo com a extensão dos depósitos amiloides

66

glomerulares. Verine e colaboradores são alguns destes autores e atribuem inclusive maiores índices de proteinúria à classe mesangiocapilar, que seria o tipo correspondente a estágio mais avançado da doença.24 Verificamos que a deposição amiloide glomerular ocorre a partir do mesângio, frequentemente se estendendo para a membrana basal glomerular e, nesse contexto, o glomérulo acometido pode mostrar diferentes estágios dentre de um mesmo espectro de acometimento do tufo capilar. A tentativa de enquadrar o aspecto morfológico glomerular em classes contradiz o processo etiopatogênico da amiloidose, que é distinto da nefrite lúpica. O padrão membranoso de deposição amiloide, classe V de Sen e Sarsik, foi suprimido da nossa análise por não apresentar categorização percentual e sim padrão morfológico distinto que não foi observado em nossa casuística. Contudo, estudos que registram tais padrões morfológicos de comprometimento glomerular, referem o aspecto membranoso como achado raro,24 podendo assim justificar a ausência deste no presente trabalho. Algumas classificações histopatológicas de outros processos patológicos, como a classificação de Banff 75 para diagnóstico da patologia do enxerto renal, ou a classificação das nefrites lúpicas, pela International Society of Nephrology / Renal Pathology Society (ISN/RPS),25 resultaram através de seu amplo uso em benefício para conduta clínica e índices prognósticos.34 Contudo, em nosso estudo morfométrico, os padrões morfológicos sugeridos pela classificação de Sen e Sarsik, simulando os padrões da classificação da nefrite lúpica (ISN/RPS)25, não foram observados. O lúpus eritematoso sistêmico é uma doença mediada por imunocomplexos circulantes que

quando depositados nos glomérulos

são

responsáveis por uma variedade de padrões morfológicos. Na amiloidose ocorre expansão mesangial pela formação de nódulos em consequência à deposição de proteínas

autólogas

de

estrutura

semelhante,

caracterizando

processo

etiopatogênico distinto da nefropatia por enxerto renal e nefrite lúpica.

A

classificação atualmente utilizada para nefrite lúpica reflete o entendimento da patogênese de tal doença sistêmica26 e seu comprometimento renal, que é distinto do que se observa na amiloidose renal, não sendo portanto passível de reprodução. Considerando que o VC é padrão ouro para o diagnóstico da amiloidose 21 e nem sempre o que é observado como hialino a HE pode ser reproduzido positivamente ao VC, é fundamental comparar os achados com utilização da

67

congofilia à luz polarizada. Em nosso estudo foi identificada concordância estatisticamente significativa de forte intensidade ( = 0,807; p < 0,0001), quando da comparação com avaliação do depósito intersticial pelas duas técnicas, e intensidade moderada a forte ( = 0,696; p < 0,0001) quando da avaliação do depósito glomerular. Esta variação em nosso achados deve ter ocorrido por conta de amostragem glomerular irregular. A associação com compartimento vascular não pode ser bem definida em virtude do pequeno número de casos com comprometimento dos vasos. Consideramos a classificação da amiloidose renal de Sen e Sarsik importante, porém o estabelecimento de novos parâmetros para este modelo descrito podem trazer dados importantes para indicação prognóstica e tratamento do paciente. Ao mesmo tempo a normatização da investigação histopatológica e dos laudos histopatológicos, torna mais fácil o entendimento entre especialistas da mesma área. Caracterizamos que morfometria bem detalhada é tecnica importante para atingir estas metas. Acreditamos que trabalhos com maior número de casos, com a padronização sugerida por Sen e Sarsik e aplicando a técnica morfométrica descrita por nós, possam estabelecer com mais critério o fundamento apresentado no trabalho. É também nossa impressão que em laboratórios especializados a técnica por imuno-histoquímica por peroxidase deve fazer parte da investigação de rotina em casos de suspeita clínica de amiloidose renal, caracterizando com precisão o diagnóstico dos casos de AA e AL.

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7 CONCLUSÃO

Identificamos que é possível a aplicação de parâmetros mais uniformes de avaliação na classificação de Sen e Sarsik, particularmente com auxílio da histomorfometria. Outros estudos com detalhamento metodológico podem contribuir na avaliação entre os achados histopatológicos e a apresentação clínico-laboratorial de pacientes com amiloidose renal. Localização e extensão dos depósitos amiloides nos compartimentos renais (glomérulos, vasos e interstício) não mostraram associação eststística com o tipo de amiloidose AL ou não AL, bem como com hipertensão arterial, creatinina sérica proteinúria, hematúria ou ainda dados epidemiológicos.

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ANEXO 1 AUTORIZAÇÃO DO LABORATÓRIO FONTE DO MATERIAL

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ANEXO 2 TÉCNICA DA HEMATOXILINA-EOSINA (HE)90 Material necessário para a solução de Hematoxilina de Harris (Junqueira e Junqueira,1983) Hematoxilina 2,5g Álcool 100% 25ml Alúmen de amônio ou potássio 50g Água destilada 500ml Óxido vermelho de mercúrio 1,25g Ácido acético 20ml Inicialmente, a hemotoxilina deve ser dissolvida no álcool e o alúmen na água destilada (previamente aquecida). Posteriormente, as duas soluções devem ser misturadas e aquecidas até a fervura. O óxido de mercúrio é adicionado à solução que deve ser resfriada, mergulhando-se o frasco em água fria. O ácido acético é então colocado na solução fria para finalmente ser filtrada. O prazo de envelhecimento desta solução é entre dois e três meses. A partir desta data o corante perde suas propriedades e não reage adequadamente com o tecido. Material necessário para a Eosina (Junqueira e Junqueira,1983) Eosina solúvel em água 1g Água destilada 100ml Procedimentos para a coloração Embora as etapas possam ser definidas, o tempo em cada fase depende da qualidade e da idade das soluções dos corantes. Deste modo, poderá ser observada nas etapas abaixo uma variação muito grande em relação ao tempo que pode ser ajustado durante o procedimento no laboratório. De acordo com Junqueira e Junqueira (1983), as etapas são: desparafinar e hidratar os cortes; corar em hematoxilina entre 5 e 15min; lavar em água corrente por 10min; corar em eosina entre 1 e 10min; lavar em água e desidratar em álcool 70% rapidamente; diafanizar e montar em resina. Montagem Final da Lâmina Este processo consiste em depositar uma gota de resina líquida sobre o corte que está aderido à lâmina de vidro e cobri-lo com uma lamínula. Nesta etapa deve-se evitar as bolhas de ar que se formam na resina durante a colocação da lamínula. Finalmente a lâmina é catalogada. A resina depois de seca garantirá uma lâmina permanente que poderá durar anos.

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ANEXO 3 TÉCNICA DO ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF (PAS)91 Solução corante: Reativo de Schiff Aquecer 200 ml de água destilada em um erlenmeyer de 500 ml até a ebulição. Adicionar 1 g de Fucsina Básica (MERCK, C.I.42510) cuidadosamente adicionando pouco a pouco, evitando a reação térmica, deixar abaixar a temperatura em 60 C aproximadamente e filtrar agitando sempre até que a temperatura abaixe à do ambiente. Adicione 20 ml de ácido clorídrico 1N (água destilada 92 ml; ácido clorídrico 8 ml). Adicione também 1 g de Metabissulfito de Sódio. Continuar agitando por mais 3 horas e deixar em repouso durante a noite. Adicionar 1 g de carvão ativado. Agite por 1 hora, filtre o corante e estoque em geladeira. Solução de ácido periódico 0,5% Cristais de ácido periódico Água destilada

0,5 g 100 ml

Procedimento Desparafinar e hidratar Oxidar em Ácido Periódico 0,5% por 15 minutos Lavar em água corrente por 5 minutos e enxaguar na água destilada por 3 vezes Corar em Reativo de Schiff por 30 minutos Lavar em água corrente por 5 minutos Contra corar pela Hematoxilina de Harris por 5 segundos Lavar em água corrente por 5 minutos Desidratar, diafanizar e montar em resina Resultado Glicogênio, mucina, membrana basal, fungos - vermelho Núcleos azul

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ANEXO 4 TÉCNICA DO TRICÔMICO DE MASSON92 Solução de bouin Solução saturada de Ácido Pícrico Formaldeído puro Ácido Acético Glacial

75 ml 25 ml 5 ml

Hematoxilina férrica de Weigert Solução A Hematoxilina pó Álcool 95%

1g 100 ml

Solução B Solução aquosa de Cloreto Férrico a 29% 4 ml Água destilada 95 ml Ácido Clorídrico Concentrado 1 ml Solução de trabalho: juntar na hora do uso partes iguais da solução A e B Solução de escarlate de Biebrich Solução aquosa de Escarlate de Biebrich 1% 90 ml Solução aquosa de Fucsina Ácida 1% 10 ml Ácido Acético Glacial 1 ml Solução ácida fosfotúngstica-fosfomolíbdica Ácido Fosfotúngstico 2,5 g Ácido Fosfomolíbdico 2,5 g Água destilada 100 ml Solução de azul de anilina Azul de Anilina Ácido Acético Glacial Água destilada

2,5 g 2 ml 100 ml

Solução de água-ácido Água destilada Ácido Acético Glacial

100 ml 1 ml

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Procedimento Desparafinar e hidratar Lavar em água corrente por 5 minutos Mordentar em solução de Bouin por 1 hora na estufa a 60 graus ou preferencialmente deixar por uma noite em temperatura ambiente Lavar em água corrente até desaparecer o amarelo deixado pela solução de Bouin Passe em água destilada Core pela solução de Hematoxilina Férrica de Weigert (A e B) por 10 minutos Lavar em água corrente por 10 minutos Passe em água destilada Corar pela solução de Escarlate de Biebrich por 5 minutos Passe por água destilada Diferencie pela solução de Ácido Fosfotúngstico-Fosfomolíbdico durante 10 a 15 minutos Passe por água destilada Corar pela solução de Azul de Anilina durante 5 a 10 minutos Lave em água destilada Passe pela solução de Ácido Acético Glacial 1% por 3 a 5 minutos Passe por água destilada Desidrate, diafanize e monte em resina. Resultado Núcleos - pretos Citoplasma, Queratina, Fibras intercelulares - vermelho Colágeno e Muco - azul

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ANEXO 5 TÉCNICA DA PRATA METENAMINA (PASM)93 Reagentes Solução de ácido periódico 30 ml Solução de nitrato de prata 30 ml Solução de hexametilenotetramina 30 ml Solução de tetraborato de sódio 30 ml Solução de cloreto de ouro 30 ml Solução de fixação 30 ml Método Desparafine e hidrate as secções com água destilada. Deite 10 gotas do reagente A na secção: deixe actuar durante 30 minutos. Lave em água destilada. Prepare a câmara húmida e insira a lâmina com a secção virada para cima. Deite na cápsula pequena incluída na embalagem 10 gotas do reagente B, adicione 10 gotas do reagente C e 10 gotas do reagente D, agite e ponha a solução assim obtida na secção: feche a câmara úmida e incube na estufa a 60°C. Deixe actuar durante 3040 minutos. Retire a câmara húmida da estufa, abra a tampa e verifique a tonalidade da impregnação: se o escurecimento estiver correcto, deixe arrefecer a lâmina durante 5 minutos e lave-a em água destilada; se for insuficiente, volte a incubar na estufa e verifique a cada 5 minutos. Deite 10 gotas do reagente E na secção: deixe actuar durante 1 minuto. Lave em água destilada. Deite 10 gotas do reagente F na secção: deixe actuar durante 1 minuto. Lave em água destilada Desidrate através da série ascendente dos alcoóis, xileno e bálsamo. Resultado Membranas basais, glicogénio, cápsula dos micetes e das bactérias: preto.

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ANEXO 6 VERMELHO CONGO MODIFICADO POR HIGHMAN85 Cortes preferencialmente de 8 a 10µm. Solução corante Vermelho Congo 500mg Álcool etílico absoluto 50ml Água destilada 50ml Solução diferenciadora Hidróxido de potássio 200mg Álcool etílico absoluto 80ml Água destilada 20ml Procedimento Desparafinizar os cortes e hidratar em água corrente Colocar na solução corante por 3 minutos Retirar as lâminas com os cortes e lavar o excesso em água corrente Diferenciar o tecido com a solução diferenciadora (controlar ao microscópio) Lavar em água corrente Contracorar com hematoxilina de Harris Lavar bem em água corrente até azular Desidratar, clarificar em xilol e montar em meio sintético Resultado Amiloide de cor vermelho-alaranjada Núcleos em azul Fibra elástica levemente alaranjada

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ANEXO 7 SOLUÇÃO DE TRANSPORTE DE MICHEL86 (ST) É utilizada para transportar amostras (bx renal, linfonodos e outras) para estudo por técnica de imunofuorescência. A ST não é um fixador, e não deve ser usada para outros propósitos (em particular transporte de células para citometris de fluxo). Deve ser armazenada sob refrigeração (geladeira – não no freezer) até seu uso. Amostras já colhidas e colocadas em ST devem ser mantidas a temperatura ambiente até serem enviadas para o laboratório de referência.

Soluções: 1.0 M citrato de potássio tamponado pH 7.0: Dissolver 21.0 g ácido citríco monohidratado (ou 19.2 g ádico cítrico anidro) em 30 ml of água deionizada ou destilada aquecida. Esfriar. Ajustar o pH para 7.0 com hidróxido de potássio 1M (cerca de 35 ml) Diluir para 100 ml com mais água. Solução de lavagem: 25 ml citrato de potássio tamponado 1.0M 50 ml sulfato de magnésio hephidratado 0.1 M (F.W. 246.5) 50 ml N-ethyl maleimide 0.1M (= 12.5 g em 1 L de água) (Sigma E3876.) Água para fazer 1 litro. Ajustar para pH 7.0 com hidróxio de potássio 1M Armazenar no refrigerador. Meio de transporte (ST): Dissolver 55 g of sulfato de amônio em 100 ml solução de lavagem. (Adicionar lentamente com misturador mecânico.) Ajustar o pH para cerca de 6.9 com hidróxido de potássio 1M (< 2 mL) Amostras podem ser mantidas em temperatura ambiente, lugar fresco, fora da luz direta por 5 dias. A partir deste ponto devem ser processadas imediatamente ou emblocadas em TisssueTek em nitrogênio líquido. Antes devem ser lavada em 3 trocas de solução de lavagem, de 10 min cada (pode ser substituída por 3 lavagens de 10 min cada de PBS pH 7.2.

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ANEXO 8 TÉCNICA DE IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA PARA PROCESSAMENTO DE BIOPSIAS RENAIS Princípio Cortes congelados de tecido renal podem ser incubados (corados) com antissoro conjugado a fluoresceína para detecção de imunoglobulinas e complemento. Amostra Amostras provenientes de biópsias renais (nativas, implantes ou enxertos) obtidas por punção de agulha, cirúrgicas ou laparoscopia, transportadas em solução transporte (Michel’s solution) ou em solução salina 0,9%. A salina gelada só deverá ser utilizada quando após o procedimento de biópsia a amostra será transportada em menos de 2 horas para o local de entrega, em isopor com gelo. As amostras de tecido enviadas em solução transporte, permanecem estáveis a temperaturaambiente por até 4 dias, quando então deverão ser imediatamente processadas para a técnica de imunofluorescência direta, após lavagem em PBS pH 7.4, 3 banhos de 5 min cada. Deve ser evitada a fixação prévia com acetona por questões de interferência na técnica final. Preparo das lâminas Devem ser desengorduradas em solução álcool/éter, volumes iguais, e secadas ao ar. Posteriormente serão silanizadas a 4% (filmadas) para que se obtenha melhor aderência do tecido à lâmina. Podem ser usadas lâminas comerciais filmadas. Técnica As amostras fixadas em solução transporte devem ser lavadas em solução PBS pH 7.4 - 3 banhos de 5 min cada. Cortar as amostras em 5/6 microns, em criostato a –20ºC, preparadas em bloco de Tissue-Teck (OCT), e deixar secar ao ar por 5'. Lavar em tampão PBS 7.4 - 3 banhos de 5 min cada. Secar o excesso do tampão das lâminas sem secar o corte. Incubar com os anti-soros IgG, IgM, IgA, C3, C1q, fibrinogênio, cadeias leves Kappa e Lambda na diluição estabelecida previamente (pode variar de 1/8 a 1/30) em câmara úmida por 30 min. Lavar em tampão PBS 7,4 - 3 banhos de 5 min cada. Secar o excesso da mistura sem secar o corte, e montar com lamínulas, usando meio de glicerol 9:1 PBS 7.4 ou meio próprio comercializado. - As lâminas devem ser armazenadas em caixas plásticas fechadas e seladas em freezer a -

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ANEXO 9 TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA POR IMUNOPEROXIDASE Cortes de 5 μm de espessura são obtidos e coletados em lâminas silanizadas tratadas com solução de silano a 4% (3-aminopropiltrietoxisilano, APTS, Sigma Aldrich cod.:A3648 Chemical Co, Saint Louis, USA). Desparafinização e hidratação Lâminas com cortes teciduais são aquecidas em estufa a 60ºC por 10 minutos. Em seguida, são imersas em xilol aquecido a 60ºC durante 10 minutos e em xilol a temperatura ambiente, passando por quatro (04) banhos de 5 minutos cada. Seguem-se quatro (04) lavagens de 5 minutos cada em etanol em concentrações decrescentes (dois banhos em álcool absoluto, e duas a 90%). As lâminas são então submetidas a imersão em água destilada, finalizando esta etapa. Bloqueio da peroxidase endógena Um banho de 30 minutos é realizado em peróxido de hidrogênio a 30% (diluído em água destilada). Recuperação antigênica Os cortes são expostos a calor úmido durante 45 minutos, em tampão citrato de sódio 10nH, pH 6,0, pré-aquecido a 96ºC. As amostras são resfriadas à temperatura ambiente por 30 minutos e lavadas em tampão TBS-Tween 20. Bloqueio de cargas inespecíficas tissulares Incubação do material em solução BSA e leite desnatado por 15 minutos. Aplicação do anticorpo primário Foram realizadas quatro (04) diluições em diluente DAKO®: 1:25, 1:50, 1:100 e 1:150. Aplicação do sistema de revelação / amplificação, baseado em polímero livre de biotina, Novolink (Novocastra/ Vision Biosystems, Newcastle, Inglaterra) Após incubação, os cortes foram lavados em tampão fosfato-salino (PBS) e aplicouse sistema de detecção livre de biotina, utilizou-se pós-primário por 30 minutos e polímero por outros 30 minutos. A revelação das reações foi feita com cromógeno 3,3-diaminobenzidina (DAB) na diluição de 0,06% em H2O2 à 1% em PBS pH7,4 por 5 minutos, com contracoloração por imersão em hematoxilina de Harris por 30 segundos. Finalmente as lâminas são submetidas a lavagem de um minuto em etanol a 95%, duas lavagens de 3 minutos em etanol a 100% e duas lavagens de 5 minutos em xilol. Na montagem das lâminas será usado Entellan. Anticorpo primário Anticorpo monoclonal de camundongo para componente A amiloide humano, clone mc1, DBS, código Mob 003, diluição 1:25 - 1:150.

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Controle Utilizados como controle casos de biopsia renal com diagnóstico de amiloidose tipo AA.