RADOVI BIOARHEOLOŠKE SEKCIJE SRPSKOG ARHEOLOŠKOG DRUŠTVA
BIOARHEOLOGIJA NA BALKANU. METODOLOŠKE, KOMPARATIVNE I REKONSTRUKTIVNE STUDIJE ŽIVOTA U PROŠLOSTI.
PAPERS OF THE BIOARCHAEOLOGICAL SECTION OF THE SERBIAN ARCHAEOLOGICAL SOCIETY
BIOARCHAEOLOGY IN THE BALKANS
METHODOLOGICAL, COMPARATIVE AND RECONSTRUCTIVE STUDIES OF LIVES IN THE PAST.
Editors: Nataša Miladinović-Radmilović Selena Vitezović
Belgrade • Sremska Mitrovica 2016
RADOVI BIOARHEOLOŠKE SEKCIJE SRPSKOG ARHEOLOŠKOG DRUŠTVA
BIOARHEOLOGIJA NA BALKANU
METODOLOŠKE, KOMPARATIVNE I REKONSTRUKTIVNE STUDIJE ŽIVOTA U PROŠLOSTI.
Urednici: Nataša Miladinović-Radmilović Selena Vitezović
Beograd • Sremska Mitrovica 2016
Izdavač / Published by SRPSKO ARHEOLOŠKO DRUŠTVO, Beograd, Čika Ljubina 18-20 BLAGO SIRMIJUMA, Sremska Mitrovica, Ilariona Ruvarca bb Za izdavača / For the publisher Adam Crnobrnja Vladimir Malbašić Urednici / Editors Nataša Miladinović-Radmilović Selena Vitezović Uređivački odbor / Editorial board Dragana Filipović, Dragana Antonović, Marija Đurić, David Orton (Velika Britanija), Gordana Jeremić, Siniša Radović (Hrvatska), Aleksa Janović, Željka Bedić (Hrvatska) Sekretar redakcije / Secretary of editorial board Dragana Vulović Recenzenti / Reviewed by Zoran Rakočević, Marko Popović, Dragana Antonović, Dragana Filipović, Ivan Bugarski, Ivana Ožanić Roguljić (Hrvatska), Mario Novak (Hrvatska), Petar Milenković, Siniša Radović (Hrvatska), Sofija Petković Lektura i prevod na engleski / Proof-reading and translation into English Jelena Vitezović Tehnički urednik / Technical editor Miro Radmilović Grafička oprema / Graphic layout Nebojša Ćosić Štampa / Printed by DC Grafički centar, Savski nasip 7, Novi Beograd Tiraž / Printed in 200 ISBN 978-86-84457-17-4 Ova je knjiga štampana sredstvima Ministarstva za prosvetu, nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije. This book is published with the financial support of the Ministry of Education, Science and Technological Development of the Republic of Serbia.
SADRŽAJ/TABLE OF CONTENTS
Nataša Miladinović-Radmilović, Selena Vitezović Bioarheologija na Balkanu. Metodološke, komparativne i rekonstruktivne studije života u prošlosti. ..................................................................................................................................1 Metodologija proučavanja osteološkog materijala Dragica Bizjak, Dragana Vulović DNK analize humanog osteološkog materijala sa arheoloških lokaliteta............................................5 Dragana Vulović, Dragica Bizjak Primena analiza hemijskih elemenata i stabilnih izotopa u bioarheologiji.......................................17 Nataša Miladinović-Radmilović Standardizacija antropoloških zapisnika – incineracija.....................................................................33 Rekonstrukcija ishrane u prošlosti Elena Stojanova Kanzurova, Zoran Rujak Food preparation, storage and consumption in the Neolithic in the Republic of Macedonia.............................................................................................................69 Cvetana Popova Prehistoric bulgur from the neolithic settlement of Yabalkovo, Bulgaria.........................................81 Dragana Filipović, Aleksandar Bulatović, Dragan Milanović Archaeobotanical analysis of two Iron Age sites in south-eastern Serbia.........................................87 Nemanja Marković, Teodora Radišić, Vesna Bikić Uloga živine u srednjovekovnoj ekonomiji manastira Studenica.......................................................99 Metodološke, komparativne i rekonstruktivne studije života u prošlosti: studije slučaja Ksenija Đukić, Marija Đurić The use of Willems’ radiological method for dental age assessment among the Ajmana population......................................................................................................................119 Gordana Jeremić, Toni Čerškov Requescit in pace – neka zapažanja o poremećajima „večnog počinka” na primeru jugoistočnog dela nekropole u Jagodin mali (Naissus).....................................................................127
SADRŽAJ
Ksenija Đukić, Tamara Pavlović Pitanje upotrebe koštanog praha u medicinske svrhe kod Avara: primer groba br. 77 sa nekropole Čik................................................................................................147 Vesna Bikić, Nataša Miladinović-Radmilović Vojnik ili sveštenik: slučaj groba sa Beogradske tvrđave..................................................................159 Sofija Petković, Selena Vitezović, Željka Temerinski Roman bone plating from Davidovac (Southern Serbia): preliminary interpretation and reconstruction................................................................................185 Varia Nataša Miladinović-Radmilović, Ksenija Đukić Марија Ђурић-Срејић, Увод у физичку антропологију древних популација – Dvadeset godina kasnije.................................................................................................................203
Bioarheologija na Balkanu: Metodološke, komparativne i rekonstruktivne studije života u prošlosti.
1
BIOARHEOLOGIJA NA BALKANU. Metodološke, komparativne i rekonstruktivne studije života u prošlosti. Nataša Miladinović-Radmilović, Arheološki institut, Beograd Selena Vitezović, Arheološki institut, Beograd
Rekonstrukcija života u prošlosti osnovni je cilj arheologije kao nauke. Metodološki i teorijski okviri proučavanja menjaju se i unapređuju neprekidno od samog nastanka arheologije kao naučne discpline, preispituju se stare metode, nove stvaraju, preuzimaju i prilagođavaju iz drugih discplina, i tako dalje. Bioarheološki ostaci, koji su istovremeno i biološki i kulturni, odnosno, istovremeno pripadaju sferama prirodnog i kulturnog, imaju poseban značaj za proučavanje različitih aspekata života u prošlosti, posebno onih koji se odnose na kvalitet života, način ishrane, biljni i životinjski svet sa kojim su prošle zajednice bile u interakciji, ali i na mnoge druge aspekte. Ovaj zbornik nastavlja se na prehodni, Bioarheologija na Balkanu: Bilans i perspektive, i sada donosi radove koji su metodološke prirode i studije slučaja sa teritorije Balkana o rekonstrukciji života u prošlosti, od praistorije do srednjeg veka. Radovi delom proističu iz skupova održanih u okviru Sekcije za bioarheologiju Srpskog arheološkog društva, posebno tematskih sesija Rekonstrukcija izvora hrane i načina prehrane u praistoriji: nabavka, priprema i prezentovanje hrane u neolitu Balkana i Metodološke, komparativne i rekonstruktivne studije života u prošlosti. Sekcija je nastala iz potrebe da se rezultati rada bioarheoloških istraživanja predstave široj arheološkoj javnosti, kao i da se pokrene diskusija o metodološkim i drugim problemima sa kojima se ra-
zličiti stručnjaci susreću u radu. Pored toga, cilj je bio ne samo da se predstave interdisciplinarni radovi, već da se zaista pokrenu multidisciplinarna istraživanja. U ovom zborniku, prvi su radovi metodološke prirode – N. Miladinović-Radmilović nastavlja sa predlaganjem standardizovane metodologije obrade humanog osteološkog materijala, dok D. Vulović i D. Bizjak ukratko predstavljaju metode i njihovu primenu analize DNK humanog osteološkog materijala i analize hemijskih elemenata i stabilnih izotopa. Odeljak o rekonstrukciji ishrane u prošlosti donosi različite studije sa široke balkanske teritorije, i to od neolita do srednjeg veka. Prvi je rad makedonskih arheologa E. Kanzurove i Z. Rujaka, koji su dali pregled svih do sada raspoloživih podataka o ishrani u neolitu na tlu Makedonije. C. Popova predstavlja jedinstveni nalaz bulgura sa ranoneolitskog lokaliteta Jablkovo u Bugarskoj, koji ukazuje na načine pripreme i čuvanja hrane među ranim zemljoradničkim zajednicama. D. Filipović i koautori daju rezultate arheobotaničkih analiza sa dva gvozdenodopska lokaliteta, Crnoklište-Gornjo Polje i Staničenje-Mađilka u jugoistočnoj Srbiji. Mada uzorak nije veliki, značajan je, jer su arheobotanički uzorci iz ove oblasti srazmerno malobrojni. Rad N. Markovića i koautora bavi se ulogom živine u srednjovekovnoj ekonomiji manastira Studenice.
2
NATAŠA MILADINOVIĆ-RADMILOVIĆ i SELENA VITEZOVIĆ
Studije slučaja opet pokazuju raznovrsnost tema koje uključuju i bioarheološke podatke i na koje se sve načine različiti pristupi mogu koristiti u tumačenju prošlosti. Rad K. Đukić i M. Đurić prikazuje određivanje starosti pomoću Vilemsove metode na primeru populacija sa Ajmane. G. Jeremić i T. Čerškov bave se problemom desakralizacije grobnog prostora u kasnoj antici i uzrocima oštećenja grobova. K. Đukić i T. Pavlović razmatraju pitanje upotrebe koštanog praha u medicinske svrhe u okvirima avarske kulture, a na primeru groba sa lokaliteta Čik. Rad V. Bikić i N. Miladinović-Radmilović donosi interesantnu kombinovanu analizu arheoloških i antropoloških podataka na primeru groba vojnog sveštenika iz pred-modernog doba sa Beogradske tvrđave. Zbornik zatvara rad S. Petković i koautora, koji predstavlja rimsku koštanu oplatu sa pred-
stavom Arijadne, verovatno sa drvene kutije ili sanduka, iz Davidovca, i koji pokazuje kako kombinovana analiza same predstave, tehnike izrade, kao i konzervatorska rekonstrukcija, pružaju podatke o stanovnicima rimskog Davidovca i njihovom imovnom i socijalnom statusu, trgovini koja se odvijala i mogućim zanatskim radionicima u široj okolini. U budućnosti će, nadamo se, interesantne studije i značajni metodološki radovi opet naći svoje mesto u okviru radova Bioarheološke sekcije. I, na kraju, ali ne najmanje važno, htele bismo da se zahvalimo svim kolegama koji su podržali naš rad, kako kolegama iz Arheološkog instituta, tako i članovima Srpskog arheološkog društva koji su nas podržali i koji su pratili naša izlaganja na skupovima.
Bioarheologija na Balkanu: Metodološke, komparativne i rekonstruktivne studije života u prošlosti.
5
DNK ANALIZE HUMANOG OSTEOLOŠKOG MATERIJALA SA ARHEOLOŠKIH LOKALITETA DRAGICA BIZJAK1 i DRAGANA VULOVIĆ2 1 Knjaževac e-mail:
[email protected] 2 Beograd e-mail:
[email protected]
Apstrakt: Dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) jeste molekul u vidu spiralno uvijenog lanca, koji ulazi u sastav svih ćelija jednog organizma. Ovaj molekul u sebi sadrži nasleđene genetske informacije koje utiču na strukturu, razvoj i metabolizam ljudskog tela. Prve analize drevne DNK, odnosno delova molekula DNK ekstrahovanih iz humanih tkiva otkrivenih tokom arheoloških iskopavanja, sprovedene su tokom osamdesetih godina prošloga veka. Ove analize su zbog metodoloških ograničenja uglavnom za cilj imale samo uspešnu ekstrakciju DNK molekula i dokazivanje njene autentičnosti. Razvoj metodologije molekularne biologije danas omogućava široku primenu DNK analize u fizičkoj antropologiji, arheologiji, evolucionoj biologiji, forenzici i paleopatologiji. U ovom radu biće predstavljena struktura DNK molekula i uslovi pod kojima oni ostaju očuvani u humanom osteološkom materijalu. Zatim ćemo opisati celokupan tok analize, od prikupljanja uzoraka do krajnjih rezultata. Posebna pažnja biće usmerena na interpretaciju rezultata dobijenih DNK analizom. U ovom delu rada pokazaćemo kako se dobijeni rezultati mogu iskoristiti za rekonstrukciju evolutivnih procesa, odnosa različitih populacija u prošlosti i odnosa određenih grupa i pojedinaca u okviru jedne populacije, za određivanje pola individua i za utvrđivanje prisustva patoloških promena, genetski uslovljenih ili infektivnih, koje se ne mogu utvrditi makroskopskim metodama. Ključne reči: dDNK, uzorkovanje, kontaminacija, metodi ekstrakcije, amplifikacija, primena Abstract: Deoxyribonucleic acid (DNA) is the molecule in the form of helically twisted chain which exists in the structure of all cells of an organism. This molecule contains the inherited genetic information which affects the structure, development and metabolism of human body. First analyses of ancient DNA molecules or parts of DNA extracted from human tissues discovered during archaeological excavations were carried out in the eighties of the last century. These analyses were, due to methodological limitations, mainly aimed towards a successful extraction of DNA molecules and proving its’ authenticity. Development of methodology of molecular biology today allows for a wide use of DNA analysis in physical anthropology, archeology, evolutionary biology, forensics and palaeopathology. The structure of DNA molecules and conditions under which they remain preserved in human osteological material will be presented in this paper. Then we will describe the analysis, from sampling to final results. Special attention will be paid to the interpretation of the results obtained by DNA analysis. In this part of the paper, we will show how those results can be utilized for the reconstruction of the evolutionary process, the relationship between different populations in the past and relations between groups and individuals within a population, to determine the sex of individuals and to determine the presence of pathological changes caused by genetics or infections, which cannot be determined by macroscopic methods. Key words: aDNA, sampling, contamination, extraction methods, amplification, application
6
DRAGICA BIZJAK i DRAGANA VULOVIĆ
UVOD Molekularna arheologija, proučavanje DNK iz arheoloških ostataka, relativno je nova oblast istraživanja koja se koristi metodologijom molekularne biologije u cilju rešavanja antropoloških problema. Proučavanje dDNK, DNK izdvojene iz drevnih kostiju i tkiva, omogućio je razvoj molekularne genetike (Stone 2008: 461). Istorijat istraživanja u ovoj oblasti započinje sredinom osamdesetih godina prošloga veka, kada su Higuči i saradnici izvršili prvu uspešnu ekstrakciju dDNK iz očuvanih ostataka jedinke kuage, izumrle vrste južnoafričke zebre (Higuchi et al. 1984). Prvi eksperimenti sprovođeni su da bi se utvrdilo samo prisustvo DNK u drevnim humanim ostacima, kao što su sasušena meka tkiva i kosti (Pääbo 1985; Hagelberg et al. 1989). Cilj ovih ranih istraživanja bilo je uspešno ekstrahovanje, utvrđivanje stanja očuvanosti i prikazivanje autentičnosti dDNK, kao i proučavanje procesa degradacije DNK molekula nakon smrti individue (Kaestle and Horsburgh 2002: 93–94; Stone 2008: 461). Najveći problem tokom ovih istraživanja predstavljala je loša očuvanost genetskog materijala u drevnim ostacima. Zahvaljujući razvoju tehnologije i metodologije molekularne genetike, na prvom mestu usavršavanjem metoda ekstrakcije i amplifikacije fragmentovanih molekula dDNK, i upotreba NGS platformi tokom poslednje decenije, stvorene su mogućnosti za široku primenu ovih analiza u fizičkoj antropologiji, arheologiji, evolucionoj biologiji, forenzici i paleopatologiji. Podaci koji se dobijaju ovom analizom mogu da olakšaju polnu determinaciju, da omoguće identifikaciju individue, da otkriju veze među pojedincima sahranjenim na nekoj nekropoli, da ukažu na poreklo migratornih populacija ili tok domestifikacije biljnih i životinjskih vrsta, da potvrde prisustvo bolesti koje ne ostavljaju vidljiv trag na kostima i da rasvetle filogenetske veze između modernih i izumrlih vrsta, npr. veze neandertalaca i modernih ljudi. Analiza dDNK podrazumeva ispitivanje dva osnovna tipa DNK: mitohondrijalnog i jedarnog.
Veliku većinu genomske DNK sadrži jedro (nukleus) ćelije u kome se nalaze samo dve kopije jedarne DNK (jedna nasleđena od oca, a druga od majke). Sa druge strane, ćelijske organele mitohondrije sadrže manje genomskog DNK materijala (mtDNK), ali u većem broju kopija tako da se u svakoj ćeliji nalazi po nekoliko hiljada molekula mtDNK. Veća količina dDNK u organelama uvećava mogućnost ekstrakcije neoštećenih segmenata DNK u odnosu na jedreni genetski materijal. Upravo zbog ove činjenice, većina ranijih istraživanja je bila zasnovana na ispitivanje mtDNK. Međutim, sa unapređivanjem metoda ekstrakcije i amplifikacije segmenata DNK molekula stvorena je mogućnost za ispitivanje jedrenih lokusa, što je u velikoj meri proširilo spektar hipoteza koje mogu biti testirane preko dDNK (Kaestle and Horsburgh 2002: 94). Odabir lokusa, odnosno delova DNK molekula, kao i tip DNK koji će se analizirati zavisi od konkretnih pitanja koja interesuju istraživače. Proučavanje markera X i Y hromozoma se vrši da bi se utvrdio pol individua, da bi se odredile nasledne karakteristike sa očeve ili majčine strane i da se otkriju genetske bolesti.1 Autosomalni nuklearni markeri (nalaze se na nepolnim hromozomima) koriste se za utvrđivanje očinstva i materinstva, prisustva genetski uslovljenih oboljenja ili varijacija karakterističnih za određena područja (geografski uslovljene varijacije). Ispitivanje mtDNK omogućava praćenje nasleđivanja majčinskom linijom zbog činjenice da se mtDNK prenosi sa majke na dete. Zbog velike stope mutacije, mitohondrijalni markeri su obično i geografski uslovljeni i u nekim slučajevima im je distribucija ograničena na jedno pleme. Kada analiziramo više uzoraka po populaciji, metodi populacione genetike mogu da se upotrebe za konstrukciju filogenetskih stabala ili mreža, procene genetskog diverziteta, genetske udaljenosti među populacijama i procene razme-
1 Pol se ovom metodom određuje u onim slučajevima kada je skelet jako loše oštećen ili kod dečjih individua, kod kojih je teško pouzdano utvrditi pol na osnovu morfoloških karakteristika.
DNK ANALIZE HUMANOG OSTEOLOŠKOG MATERIJALA SA ARHEOLOŠKIH LOKALITETA
7
ne gena među populacijama (Kaestle and Horsburgh 2002: 95). GRAĐA DNK MOLEKULA I USLOVI NJIHOVE PREZERVACIJE U DREVNOM MATERIJALU Molekuli dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) predstavljaju nosioce genetičkih informacija koje određuju sve aspekte koje ljudsko biće čine funkcionalnim organizmom. Osnovna jedinica građe molekula DNK je nukleotid, koji se sastoji od pentoznog šećera dezoksiriboze, azotne baze i fosfatne grupe. U izgradnji DNK molekula učestvuju dva tipa azotnih baza: dve purinske, adenin i guanin, i dve pirimidinske, timin i citozin. Svaki DNK molekul grade dva suprotno uvijena, odnosno antiparalelna polinukleotidna lanca spojena u vidu dvostrukog heliksa. Na spoljašnjoj površini molekula nalaze se jedinice dezoksiriboze, međusobno vezane fosfatnim grupama, dok se u njegovoj unutrašnjosti nalaze azotne baze, povezane u komplementarne bazne parove vodoničnim vezama. Bazni par uvek sačinjava jedna purinska sa jednom pirimidinskom bazom, i to adenin sa timinom i guanin sa citozinom (Slika 1). Veličina molekula DNK se kreće od 50 do 250 miliona baznih parova. Molekul mitohondrijalne DNK ima kružnu formu, a sastoji se od približno 16.500 baznih parova (Slika 2) (Mays 2002: 197–199). Odmah nakon smrti individue dolazi do razgradnje DNK molekula putem enzimskog ili neenzimskog hidrolitičkog kidanja dugih polinukleotidnih lanaca na fragmente koji sadrže od 100 do 500 nukleotida (Стојковић и др. 2007: 63–69). Očuvanost fragmenata DNK molekula u drevnom humanom osteološkom materijalu zavisi od većeg broja faktora. Među važnijim treba pomenuti starost samog uzorka. Ispitivanja su pokazala da se dovoljna količina dDNK za analizu, uz idealne uslove sredine, može očuvati u uzorcima starim do 130 hiljada godina (Loreille et al. 2001). Jedan od najbitnijih faktora za prezervaciju DNK u drevnom materijalu jeste uticaj sredine u kojoj se uzorak nalazio od trenutka smrti individue. Brzina degradacije DNK molekula u inhumiranom materijalu zavisi od tem-
Slika 1. Struktura DNK lanca Figure. 1. DNA chain structure
Slika 2. Mitohondrjalna DNK Figure. 2. Mitochondrial DNA
perature zemljišta, vlažnosti i kiselosti tla. Veću mogućnost za očuvanje dDNK u osteološkom materijalu pružaju suve sredine sa nižim temperaturama i neutralnom ili alkalnom pH vredno-
8
DRAGICA BIZJAK i DRAGANA VULOVIĆ
šću, mada molekuli DNK opstaju i u materijalu deponovanom u ledu ili izuzetno vlažnim uslovima, odnosno potopljenom u vodi (Hagelberg and Clegg 1991; Lawlor et al. 1991). Uzorke u tlu takođe mogu da kontaminiraju i inhibitori lančane reakcije polimeraze, koji onemogućavaju amplifikaciju dDNK molekula. Problemi inhibicije mogu da se reše modifikacijom metoda ekstrakcije. Prevelika doza inhibitora u uzorku može da u potpunosti onemogući amplifikaciju, a samim tim i analizu (Kaestle and Horsburgh 2002: 110). Drugi bitan faktor u očuvanju DNK je racemizacija aminokiselina, do koje spontano dolazi nakon smrti organizma. Na brzinu racemizacije deluju isti faktori sredine koji utiču na degradaciju DNK. Merenjem racemizirane količine aminokiselina moze se odrediti količina očuvane DNK u uzorku. Ukoliko se u uzorku nalazi velika količina racemiziranih aminokiselina, to je manja šansa da je prisutna očuvana DNK. Sa druge strane, manji stepen racemizacije ne mora nužno da znači da je dDNK u uzorku očuvana, jer na njenu degradaciju mogu da utiču i neki faktori koji se ne odnose na racemizaciju (Poinar et al. 1996). Kako je analiza racemizacije destruktivna, ne treba je koristiti u slučajevima gde je moguće uzeti samo malu količinu uzorka, jer nije pouzdana. Drugi metod za proveru očuvanosti dDNK je određivanje prisutne količine kolagena u kostima. Treći podrazumeva analizu životinjskih kostiju. Ukoliko se pokaže da su uslovi na lokalitetu takvi da se u njima očuvao dDNK, onda će se verovatno naći i u ljudskim kostima (Kaestle and Horsburgh 2002: 110). Kvalitet i kvantitet ekstrahovane dDNK takođe zavisi od dela skeleta sa koga potiče uzorak. Tako, na primer, bolje rezultate daju analize korenova zuba u odnosu na analize uzoraka kostiju, koje su, opet, uspešnije od onih vršenim na ostacima mekih tkiva (O’Rourke et al. 1996). Prema istraživanjima sprovedenim u prethodnih nekoliko godina, najveću količinu dobro očuvane endogene DNK sadrži petrozni deo temporalne kosti. Gamba i saradnici su, tokom ispitivanja genoma praistorijskih populacija na tlu Mađar-
ske, izvršili analizu uzoraka uzetih iz petroznih delova temporalnih kostiju, zuba i ostalih delova skeleta. Rezultati su pokazali da najveću koncentraciju dDNK sadrže upravo uzorci iz petroznih delova temporalnih kostiju, kao i da se dužine dDNK molekula značajno razlikuju u odnosu na one ekstrahovane iz zuba ili drugih delova skeleta (Gamba et al. 2014).2 Najveća koncentracija endogene DNK u pars petrosa se, prema istraživanjima, nalazi u kompaktnom koštanom tkivu koje izgrađuje unutrašnje uho (Pinhasi et al. 2015). Na očuvanje dDNK u kostima veoma utiču i način čuvanja i konzervacije materijala nakon iskopavanja. Potpuno uništenje, smanjenje količine prisutne dDNK ili kontaminaciju uzorka mogu da izazovu postupci kao što su: čuvanje u formaldehidu, gama zračenje, lepljenje ili lakiranje materijala (Thuesen and Engberg 1990; Cooper 1993; Kaestle and Horsburgh 2002). Osim pomenutih, kao bitan faktor treba pomenuti i sam način sahranjivanja, jer neke pogrebne prakse podrazumevaju izvođenje rituala koji mogu da promene hemijsku strukturu humanog osteološkog materijala. Najdrastičniji primer je incineracija. Visoke temperature gorenja lomače, tokom spaljivanja tela pokojnika, uništavaju organske materije koje izgrađuju kosti, a samim tim i dDNK. Istraživanja su pokazala da molekuli DNK opstaju u kostima koje su gorele na temperaturama ne višim od 600oC (Walker et al. 2008: 133–135). U zavisnosti od stepena očuvanosti materijala i genetskog lokusa koji se ispituje, uz napredak molekularne tehnologije, uspeh ekstrakcije DNK iz drevnih uzoraka se kreće od 0 do 90% (Stone 2008: 465).
2 Ovo istraživanje je pokazalo da se u petroznom delu temporalne kosti očuva 37,4–85,4% endogene DNK, dok se količina iste u zubima i drugim kostima kreće od 0,3% do 20,7%. Neoštećeni delovi molekula dDNK iz pars petrosa su za 4 do 16 navoja duži u odnosu na one iz zuba, dok su od onih iz ostalih kostiju duži i za 183 navoja (Gamba et al. 2014).
DNK ANALIZE HUMANOG OSTEOLOŠKOG MATERIJALA SA ARHEOLOŠKIH LOKALITETA
9
Slika 3. Uzimanje uzorka za DNK analizu (iz Стојковић и др. 2007: 65, Sl. 1.) Figure. 3. Taking samples for a DNA analysis (from Стојковић и др. 2007: 65, Sl. 1.)
METODOLOGIJA ISPITIVANJA DDNK Analiza dDNK započinje procesom ekstrakcije molekula iz ostataka kao što su zubni korenovi, kosti, meka tkiva (osušena, zamrznuta ili očuvana u vodi) i koproliti (Slika 3). Preporučuje se da se za ovu vrstu analiza uzorci vade iz kompaktnih delova kostiju ili dentina, jer se u njima po pravilu očuva veća količina dDNK u odnosu na spongiozno tkivo i zubnu gleđ (Rohland and Hofreiter 2007). Prvi korak u procesu ekstrakcije je priprema uzorka, koja obuhvata uklanjanje površinske kontaminacije egzogenom DNK, do koje može doći, na prvom mestu, u tlu u kome je individua sahranjena i koje sadrži bakterijsku DNK, a zatim i svaki put kada kosti dođu u kontakt sa oso-
bama koje ih iskopavaju, čiste i obrađuju. Izvori egzogene DNK mogu biti različiti, a ona moze da kontaminira uzorak dok njime rukuju arheolozi, muzejsko osoblje, antropolozi i zaposleni u laboratorijama u kojima se vrši analiza uzoraka. Na kontaminaciju mogu da utiču lepljenje uzoraka, pranje materijala (tom prilikom egzogena DNK može da prodre dublje u koštani matriks i tako oteža dekontaminaciju), i rendgensko snimanje kostiju. Do kontaminacije uzorka modernom DNK može doći i u laboratorijama, zato se analize dDNK ne vrše u modernim, već u posebnim laboratorijama specijalizovanim za ovakve vrste ispitivanja, kako bi se izbegla kontaminacija. Ove laboratorije bi trebalo da budu prostorno odvojene od drugih i, u idealnim uslovima, da se sastoje
10
DRAGICA BIZJAK i DRAGANA VULOVIĆ
iz najmanje tri prostorije. U prvoj bi se, u tom slučaju, čuvao potrošni materijal i nepripremljeni uzorci, i u njoj bi se osoblje presvlačilo u adekvatna radna odela i stavljalo dodatnu zaštitnu opremu, koja obuhvata mreže za kosu, maske za lice, laboratorijsku obuću i zaštitne rukavice. Druga prostorija bi trebalo da sadrži laboratorijske kapele, u kojima se vrši priprema uzoraka. U trećoj prostoriji, sa uobičajenom opremom za molekularno-biološke laboratorije, zatim bi se
na se može efikasno ukloniti kontaminirani sloj, ali se tom prilikom stvara koštana prašina koja može sadržati egzogenu DNK i tako ponovo kontaminirati uzorak. Brisanjem varikinom ne može uvek u potpunosti da se očisti kontaminacija, naročito ako je zašla dublje u matriks. Potapanjem u varikinu, sa druge strane, može da se uništi i endogena DNK, naročito ako je uzorak porozan. UV zraci uklanjaju samo površinsku kontaminaciju, i to ako je površina uzorka ravna, te nisu
Slika 4. Dekontaminacija uzorka (iz Стојковић и др. 2007: 65, Sl. 1.) Figure. 4. Decontamination of the sample (from Стојковић и др. 2007: 65, Sl. 1.)
vršila analiza. Ova prostorija bi trebalo da ima odvojene kapele za svaku fazu analize. Takođe, laboranti koji rade sa modernim materijalom ne bi trebalo da borave u laboratorijama gde se analizira dDNK, jer mogu preko odeće, obuće i kose da kontaminiraju uzorke. Radne površine u laboratoriji moraju redovno da se čiste varikinom i UV zracima, da se na njima ne bi nakupljala DNK. Iz istog razloga, treba temeljno čistiti laboratorijsko posuđe (Kaestle and Horsburgh 2002: 112; Knapp et al. 2012). Uz sve mere opreza neminovno dolazi do kontaminacije uzorka. Da bi se kontaminacija otkrila na vreme, tokom ekstrakcije i amplifikacije se vrše negativne kontrole, odnosno paralelno testiranje praznih epruveta i onih sa uzorkom. Ukoliko se u oba nađe DNK, to je pokazatelj da je uzorak kontaminiran. Drugi metod za verifikovanje autentičnosti DNK sekvenci je određivanje početne količine molekula u ekstraktu. Poslednja provera se odnosi na replikaciju. Moraju se analizirati nekoliko amplifikovanih uzoraka iz minimum dve ekstrakcije. Eksterna replikacija podrazumeva da se deo uzorka šalje u drugu laboratoriju, koja će da izvrši kontrolnu analizu (Kaestle and Horsburgh 2002: 111–112). Uklanjanje kontaminiranih slojeva kostiju može da se izvrši na više načina, i to su: odsecanje ili struganje površinskih slojeva kostiju, izlaganje kontaminiranih površina UV zracima i potapanje materijala u hlorovodoničnu kiselinu ili rastvor varikine (Slika 4). Svaki od ovih metoda ima svoje prednosti i mane. Struganjem površi-
pogodni za uzorke gde je egzogena DNK kontaminirala unutrašnjost uzorka. Većina stručnjaka predlaže kombinaciju ovih metoda (Kaestle and Horsburgh 2002: 112; Stone 2008: 464). Nakon dekontaminacije vrši se proces ekstrakcije, koji započinje drobljenjem ili mlevenjem uzorka. U uzorcima se zatim vrši razbijanje proteina različitim reagensima, a delovi molekula DNK se zatim ekstrahuju na jedan od dva ustaljena načina. Prvi obuhvata izlaganje uzorka hemikalijama (fenol/hloroform) koje privlače sve komponente ćelija koje nisu DNK, a drugi podrazumeva tretiranje uzorka silicijum-dioksidom, koji vezuje samo molekule DNK, nakon čega se ostatak ispira (Hagelberg and Clegg 1991; Höss and Pääbo 1993; Kaestle and Horsburgh 2002: 95). Ekstrakcija uz pomoć silicijum-dioksida predstavlja jednu od najprimenjenijih metoda za pribavljanje dDNK iz uzoraka jer je, na prvom mestu, brza i lako izvodljiva (ekstrakti se dobijaju već nakon dva dana). Metoda je lako prilagodljiva uzorcima različitog kvaliteta i kvantiteta, i za njeno sprovodjene je potrebna samo standardna laboratorijska oprema i mala količina hemikalija koja se koristi za ekstrakciju. Još jedna od prednosti ove metode jeste ta da se njom uspešno iz uzorka odstranjuju inhibitori PCR-a. Prvi korak u ekstrakciji odnosi se na mlevenje uzorka u fini prah, kome se dodaje rastvor za ekstrakciju. Ova smeša se zatim ostavlja da inkubira 16 do 24 sata uz lagano mešanje (blaga rotacija) u mračnim uslovima. Da bi se ekstrahovala veća količina dDNK, period inkubacije se produžava za je-
DNK ANALIZE HUMANOG OSTEOLOŠKOG MATERIJALA SA ARHEOLOŠKIH LOKALITETA
11
Tabela 1. Primena dDNK u antropološkim istraživanjima Table 1. Application of aDNA in anthropological researches PRIMENA dDNK U ANTROPOLOGIJI MARKERI
MOGUĆNOSTI PRIMENE
markeri X i Y hromozoma
polna determinacija → rekonstrukcija obrazaca sklapanja brakova i sahranjivanja, određivanje odnosa stopa mortaliteta muškaraca i žena, određivanje razlika u učestalosti bolesti, načinu ishrane i društvenom statusu
mtDNK, X i Y hromozomi, autozomalni mikrosateliti
majčinsko/očinsko srodstvo → rekonstrukcija strukture društva, socijalnog statusa, obrazaca sklapanja brakova, običaja sahranjivanja i migracija
mtDNK, X i Y hromozomi, autozomalna DNK
kontinuitet i smena populacija → rekonstrukcija migratornih talasa, određivanje predačkopotomačkih veza među zajednicama i određivanje veza među zajednicama sa sličnim ili različitim morfološkim karakteristikama/materijalnom kulturom
mtDNK, X i Y hromozomi, autozomalna DNK
filogenetska rekonstrukcija → rekonstrukcija evolutivnih tokova vrste i poreklo modernih ljudi
dan do tri sata uz jače mešanje na temperaturi od 56ºC. Uzorci se zatim centrifugiraju i izdvojeni talog se tretira vezujućim baferima i dodaje im se suspenzija silicijum-dioksida. Kiselost smeše se, uz dodavanje hlorovodonične kiseline, svodi na pH vrednost 4, a zatim se uzorci ostavljaju da inkubiraju tri sata u mraku. Nakon ovoga se u više koraka vrši odvajanje neotrebnih sastojaka smeše da bi se dobio čist ekstrakt dDNK (Rohland and Hofreiter 2007; Dabney et al. 2013). Količina ekstrahovane dDNK iz uzorka obično je jako mala i iznosi manje od 1% od originalne količine. Da bi se obezbedila dovoljna količina materijala za analizu, metodom lančane reakcije polimeraze (PCR) više miliona puta se kopiraju fragmenti DNK lanca koji su u fokusu istraživanja. Umnoženi molekuli DNK mogu da biti analizirani tako što se sekvence lanca sa specifičnim položajem izdvajaju dejstvom restriktivnih enzima. Kod dDNK sekvence se najčešće odvajaju metodom kloniranja, jer se tokom lančane reakcije polimeraze, pored autentične DNK, umnožavaju i oštećeni delovi autentične DNK kao i kontaminaciona DNK. Zbog toga se iz produkta PCR-a izdvaja jedan autentični molekul i ubacuje u bakteriju, čijim se razmnožavanjem klonira DNK. Čim broj bakterija dostigne odgovarajuću vrednost, DNK se izoluje i određuju se sekvence (Kaestle and Horsburgh 2002: 96; Stone 2008: 465–466).
PRIMENA DNK ANALIZA U ARHEOLOŠKIM I ANTROPOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA Rezultati dobijeni tokom ispitivanja dDNK se dalje analiziraju putem standardnih populacionih genetičkih analiza. Ovi podaci se koriste za rešavanje mnogih arheoloških ili antropoloških problema, koji mogu biti fokusirani na pojedinca, jednu zajednicu ili populaciju nekog užeg ili šireg regiona. Način analize i broj uzoraka diktira konkretni problem koji se istražuje (Tabela 1). Za istraživanja na populacionom nivou, koja proučavaju odnose između dve zajednice iz istog ili različitog perioda, na primer, potrebno je uzeti uzorke od najmanje 25 osoba po zajednici i posmatrati nekoliko lokusa istovremeno. Ovako opsežne analize se preporučuju i kada se ispituju odnosi između pojedinaca u okviru jedne zajednice (Stone 2008). Istraživanja na individualnom nivou podrazumevaju ispitivanje manje količine dDNK. Ovakve analize mogu da omoguće polnu determinaciju individue, u slučajevima kada je skelet oštećen u toj meri da određivanje pola ne može da se vrši na osnovu morfoloških karakteristika ili metričkih parametara. Takođe, analizom DNK može da se ustanovi prisustvo patologije koja ne ostavlja vidljiv trag na kostima, da se na molekularnom nivou izvrši identifikacija oboljenja kao što su tuberkuloza, lepra, bruceloza, kuga i druge, da se rekonstruiše način ishrane
12
DRAGICA BIZJAK i DRAGANA VULOVIĆ
individue ili da se u forenzičkim istraživanjima izvrši identifikacija žrtve zločina (Stone 2008; Watson and Lockwood 2009; Mutolo et al. 2012). Individualni uzorci mogu da pruže i doprinos ispitivanju toka evolucije naše vrste. Sledeće studije slučaja će pokazati na koji način analize dDNK mogu da doprinesu arheološkim i antropološkim istraživanjima. Posebno interesovanje bude molekularno-arheološka istraživanja osteološkog materijala istorijskih ličnosti. U ovakvim istraživanjima se najpre identitet ličnosti utvrđuje upoređivanjem rezultata antropološke analize sa podacima prikupljenim iz istorijskih izvora i tokom arheoloških iskopavanja. Analize dDNK se u ovakvim slučajevima koriste samo kao provera, upoređivanjem sa uzorcima prikupljenim od živih potomaka istorijskih ličnosti. Jedno od ovakvih istraživanja sprovedeno je 2006. godine, kada su u manastiru Manasija pronađeni ostaci muškarca starog oko 50 godina, za koje se pretpostavljalo da pripadaju despotu Stefanu Lazareviću. Kako skeletni ostaci kneginje Milice nisu bili dostupni za analizu, isključena je mogućnost identifikacije na osnovu analize mtDNK koja se nasleđuje preko majke. Zato je za identifikaciju izabrana metoda reverzne analize paterniteta, kojom se ispituju lokusi jedrene DNK. Analizom gena iz uzoraka prikupljenih od muškarca sahranjenog u Manasiji i kneza Lazara došlo se do zaključka da su ove dve osobe u prvom stepenu srodstva sa verovatnoćom od 99,93%. Ovim je definitvno utvrđeno da je skelet otkriven duž južnog zida zapadnog traveja crkve manastira Manasija pripadao sinu kneza Lazara, odnosno, despotu Stefanu Lazareviću (Стојковић и др. 2007: 63–69). Na najjednostavnijem nivou DNK analiza nam omogućava polnu determminaciju na osnovu X i Y hromozoma. Genetsko određivanje pola naročito je korisno u slučajevima kada se ispituju skeleti dečjih individua, kod kojih se pol teško može odrediti morfološkim metodama. Jedno od interesantnijih istraživanja na ovu temu sprovedeno je na skeletnim ostacima novorođenčadi otkrivenim u kanalizaciji rimskih termi u Aškelonu. Pretpostavlja se da se na ovom mestu, u periodu
od IV do VI veka, nalazio bordel. Na lokalitetu je otkriveno oko 100 skeleta novorođenih dečjih individua, za koje se smatra da predstavljaju žrtve čedomorstva. Genetsko određivanje pola izvršeno je na uzorcima uzetim sa levih femura 43 individue. Pol je bilo moguće utvrditi na ostacima 19 individua, od kojih je 14 bilo muškog, a svega 5 ženskog pola. S obzirom na to da je u ovom društvu više cenjeno muško potomstvo, visoka stopa čedomorstva muške dece protumačena je kao posledica zadržavanja ženske dece, koja bi kasnije radila u bordelu (Smith and Kahila 1992; Faerman et al. 1998). Neki autori dovode u pitanje rezultate ovih istraživanja, na prvom mestu jer je reč o malom broju uzoraka koji statistički pokazuju vrednost blisku prirodnom odnosu mortaliteta ženske i muške novorođenčadi. Sa druge strane, fragmenti lanaca prikupljene nuklearne dDNK u ovom slučaju su veoma dobro očuvani, što može da ukaže na moguću kontaminaciju uzoraka (Kaestle and Horsburgh 2002). Na populacionom nivou istraživanja, podaci dobijeni analizom dDNK mogu da doprinesu rekonstrukciji migracionih talasa populacija ili da pokažu kontinuitet jedne zajednice na nekom određenom prostoru. Jedno od ovakvih istraživanja je sprovedeno u Kini 2000. godine, na materijalu prikupljenom sa lokaliteta Linzi. Tim stručnjaka je ispitivao sekvence mtDNK iz kostiju individua sahranjenih oko 2500 i 2000 godina pre nove ere. Dobijene rezultate su zatim upoređivali sa rezultatima istraživanja sprovedenim na savremenoj populaciji u Linziju i stanovništvu centralne i istočne Azije. Tokom istraživanja je formirano šest velikih mitohondrijalnih haplogrupa. Učestalost haplogrupa drastično se promenila u periodu od 2500 do 2000 godina pre nove ere, što je ukazalo na postojanje velikih migratornih talasa u ovom periodu, tokom kojih je stanovništvo više nalik na moderne Evropljane smenjeno populacijom koja više podseća na današnje stanovnike Azije (Wang et al. 2000; Kaestle and Horsburgh 2002). Tokom poslednjih godina sprovedeno je nekoliko obimnih istraživanja koja su imala cilj da prikažu na koji način se menjala genomska sli-
DNK ANALIZE HUMANOG OSTEOLOŠKOG MATERIJALA SA ARHEOLOŠKIH LOKALITETA
ka populacija Evrope i Azije tokom praistorije, kako su se ljudi prirodnom selekcijom adaptirali na nove uslove života koje je najpre donela neolitizacija, a zatim i sociokulturni faktori koji su nastali početkom bronzanog doba. Prema ovim istraživanjima, kod većine modernog stanovništva Evrope je prisutna mešavina gena zapadnoevropskih lovaca-sakupljača, evropskih ranoneolitskih populacija i stepskih nomada. Ova ispitivanja su potvrdila hipotezu o migracionom talasu koji se početkom neolita širio ka Centralnoj i Južnoj Evropi. Njima je utvrđeno na koji način su novi uslovi života i način ishrane uticali na promene u metabolizmu, imunom sistemu i na fizički izgled ljudi. Takođe su registrovane i smene populacija na početku bronzanog doba (Allentoft et al. 2015; Matheison et al. 2015). Analize dDNK omogućile su da se donekle rasvetle odnosi H. sapiens sapiens-a sa drugim hominidima. Sekvenciranje kompletnog neandertalskog genoma i njegovo upoređivanje sa genomima pet savremenih individua iz različitih delova sveta omogućilo je identifikaciju genomskih regiona koji su verovatno pogođeni pozitivnom selekcijom kod nekadašnjih ljudi, uključujući gene koji utiču na metabolizam i kognitivni i skeletni razvoj. Tokom ovih istraživanja je ustanovljeno da neandertalci dele više genetskih varijacija sa današnjim stanovništvom Evrope i Azije nego sa stanovništvom subsaharske Afrike. Ovaj podatak pokazuje da je do upliva neandertalskih gena kod modernih ljudi došlo u periodu pre razdvajanja i udaljavanja evroazijskih populacionih grupa (Green et al. 2010). ZAKLJUČNA RAZMATRANJA Iako je metodologija molekularnih istraživanja napredovala i omogućila rešavanje velikog broja otvorenih pitanja u arheološkim istraživanjima, određeni problemi još uvek mogu da ograniče rezultate istraživanja. Na prvom mestu treba pomenuti kontaminaciju materijala, koja može da utiče na autentičnost rezultata. Zbog toga je vrlo važno pravilno rukovati uzorcima i proveravati dobijene rezultate. Zatim, treba pažljivo
13
planirati istraživanja, odnosno uskladiti mogućnosti ekstrakcije odgovarajućih lokusa dDNK sa ciljevima istraživanja. Podatke dobijene molekularnom analizom uvek treba kombinovati sa saznanjima dobijenim ispitivanjem drugih arheoloških ostataka, da bi se dobila što kompletnija slika o problemu koji nas interesuje. BIBLIOGRAFIJA Allentoft, M. E., et al. 2015. Population genomics of Bronze Age Eurasia. Nature 522: 167–172. Cooper, A. 1993. DNA from museum speciments. In: Herrmann, B. and Hummel, S. (eds) Ancient DNA. New York, Springer-Verlag: 149–165. Dabney, J., et al. 2013. Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA fragments. Proceedings of the National Academy of Science 110 (39): 15758–15763. Faerman, M., Bar-Gal, G. K., Filon, D., Greenblatt, C. L., Stager, L., Oppenheim, A. and Smith, P. 1998. Determining the sex of infanticide victims from the Late Roman era through ancient DNA analysis. Journal of Arhaeological Science 25: 861–865. Gamba, C., et al. 2014. Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory. Nature Communications 5 (5257). Green, R. E., et al. 2010. A draft sequence of the Neandertal genome. Science 328 (5979): 710–722. Hagelberg, E., Sykes, B. and Hedges, R. 1989. Ancient bone DNA amplified. Nature 342: 485. Hagelberg, E. and Clegg, J. B. 1991. Isolation and characterization of DNA from archaeological bone. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B—Biological Sciences 244: 45–50. Higuchi, R., Bowman, B., Freiberger M., Ryder O. R. and Wilson, A. C. 1984. DNA sequences from the quagga, and extinct member of the horse family. Nature 312: 282–284. Höss, M. and Pääbo, S. 1993. DNA extraction from Pleistocene bones by a silica-based purification method. Nucleic Acids Research 21: 3913–3914. Kaestle, F. A. and Horsburgh, K. A. 2002. Ancient DNA in Anthropology: Methods, Applications, and Ethics. Yearbook of Physical Anthropology 45: 92–130. Knapp, M., Clarke, A. C., Horsburgh, K. A. and MatissoSmith, E. A. 2012. Setting the stage – Building and
14
DRAGICA BIZJAK i DRAGANA VULOVIĆ
working in an ancient DNA laboratory. Annals of Anatomy 194: 3–6. Krings, M., Stone, A., Smitz, R. W., Krainitzki, H., Stoneking, M. and Pääbo, S. 1997. Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell 90: 19–30. Lawlor, D. A., Dickel, C. D., Hauswirth, W. W. and Parham, P. 1991. Ancient HLA genes from 7,500-year-old archaeological remains. Nature 349: 785–788. Loreille, O., Orlando, L., Patou-Mathis, M., Philippe, M., Taberlet, P. and Hänni, C. 2001. Ancient DNA analysis reveals divergence of the cave bear, Ursus spelaeus, and brown bear, Ursus arctos, lineages. Current Biology 11: 200–203. Mathieson I., et al. 2015. Genome-wide patterns of selection in 230 ancient Eurasians. Nature 528: 499–503. Mays, S. 2002. The archaeology of Human Bones. New York: Routledge. Mutolo, M. J., et al. 2011. Osteological and Molecular Identification of Brucellosis in Ancient Butrint, Albania. American journal of physical anthropology 147(2): 254–263. O’Rourke, D. H., Carlyle, S. W. and Parr, R. L. 1996.Ancient DNA: methods, progress and perspectives. American Journal of Human Biology 8: 557–571. Pääbo, S. 1985. Preservation of DNA in ancient Egyptian mummies. Journal of Archaeological Science 12: 411– 417. Pinhasi, R., et al. 2015. Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone. PLoS ONE 10 (6): e0129102. Poinar, H. N., Hoss, M., Bada, J. L. and Pääbo, S. 1996. Amino acid racemization and the preservation of ancient DNA. Science 272: 864–866.
Rohland, N. and Hofreiter, M. 2007. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nature protocols 2 (7): 1756-1762. Стојковић, О., Варљен, Т. и Микић, Ж. 2007. Молекуларногенетичка анализа скелетних остатака историјских личности из манастира Ресаве и Раванице. Саопштења XXXIX: 63–69. Smith, P. and Kahila, G. 1992. Identification of infanticide in archaeological sites: a case study from the Late Roman–Early Byzantine period periods at Ashkelon, Israel. Archaeological Science 19: 667–675. Stone, A. C. 2008. DNA analysis of archaeological remains. In: Katzenberg M. A. and Saunders S. R. (eds) Biological Anthropology of the Human Skeleton, Second Edition. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey: 461–483. Thuesen, I. and Engberg, J. 1990. Recovery and analysis of human genetic material from mummified tissue and bone. Journal of Archaeological Science 17: 679–689. Walker, P. L., Miller, K. W. P. and Richman, R. 2008. Time, Temperature, and Oxygen Availability: An Experimental Study of the Effects of Environmental Conditions on the Color and Organic Content of Cremated Bone. In: Schmidt, C. W. and Symes, S. A. (eds) The Analysis of Burned Human Remains. Academic Press: 129–137. Wang, L., Oota, H., Saitou, N., Jin, F., Matsushida, T. and Ueda, S. 2000. Genetic structure of a 2,500-year-old human population in China and its spaciotemporal changes. Molecular Biology and Evolution 17: 1396– 1400. Watson, C. L. and Lockwood, D. N. 2009. Single Nucleotide Polymorphism Analysis of European Archaeological M. leprae DNA. PLoS ONE 4 (10): e7547.
DNK ANALIZE HUMANOG OSTEOLOŠKOG MATERIJALA SA ARHEOLOŠKIH LOKALITETA
15
Summary
DNA ANALYSIS OF THE HUMAN OSTEOLOGICAL MATERIAL FROM ARCHAEOLOGICAL SITES DRAGICA BIZJAK and DRAGANA VULOVIĆ
Molecular archaeology is a new field of research that uses methods from molecular biology to resolve anthropological problems. Advances in molecular genetics made the analysis of ancient DNA possible. The first researches in this field were aimed towards a successful extraction and authentication of human DNA from ancient bones and preserved tissues. Due to poor preservation of DNA molecules, early studies mainly focused on the conditions of DNA preservation in ancient remains. Thanks to the development of technologies and methodologies of molecular genetics, and the development of extraction methods and amplification of fragmented molecules of aDNA, opportunities for wider application of these analyzes in physical anthropology, archeology, evolutionary biology, forensics and paleopathology were created. Data obtained through this analysis can facilitate gender determination, enable the identification of individuals, uncover connections between individuals buried in a necropolis, indicate the origin of migratory populations or the course of the domestication of plants and animals, confirm the presence of diseases that leave no visible traces on bones and reveal phylogenetic connections between modern and extinct species, such as, for example, links between Neanderthals and modern humans. Analysis of aDNA involves testing two basic types of DNA: mitochondrial and nuclear. The vast majority of genomic DNA contains nucleus of cells in which there are only two copies of nuclear DNA (one inherited from the father and one from the mother). On the other hand, cellular organelle mitochondria contain less genomic DNA material (mtDNA), but in a larger number of copies so that each cell has several thousand
mtDNA molecules. A larger quantity of aDNA in organelles may increase the extraction of intact DNA segments. Due to this fact, most previous researches were based on mtDNA testing. However, the search for improved methods of extraction and amplification of DNA molecules segments created the opportunity for testing nuclear loci, which greatly expanded the range of hypotheses that can be tested through aDNA (Kaestle and Horsburgh 2002: 94). Choosing a locus, or parts of a DNA molecule, and the type of DNA to be analyzed, depends on the specific issues of interest to researchers. The molecules of deoxyribonucleic acid (DNA) are carriers of genetic information that determines all aspects of a human being as a functional organism. The basic unit of the molecule is a DNA nucleotide that is comprised of a pentose sugar deoxyribose, nitrogen bases and phosphate groups. The structure of a DNA molecule involves two types of nitrogen bases: two purine, adenine and guanine, and two pyrimidine, thymine and cytosine. Each DNA molecule is made up of two opposite twisted or antiparallel polynucleotide chains, attached in the form of a double helix. On the outer surface of the molecule are deoxyribose units, each associated with phosphate groups, while nitrogen bases are located in its’ interior, linked in complementary pairs by hydrogen bonds of the base. The base pair is always composed of one purine with a pyrimidine base, adenine with thymine and guanine with cytosine. The size of DNA molecules ranges from about 50 to 250 million base pairs. Mitochondrial DNA molecule has a circular form, and consists of approximately 16500 base pairs (Mays 2002: 197–199).
16
DRAGICA BIZJAK i DRAGANA VULOVIĆ
Immediately after the death of an individual the degradation of the DNA molecules begins by means of enzymatic or hydrolytic non-enzymatic breaks of elongated strands of polynucleotide fragments comprising from 100 to 500 nucleotides (Стојковић и др. 2007: 63–69). The amount of preserved fragments of DNA in ancient human osteological material depends on a number of factors. Depending on the degree of conservation of the material, genetic loci are examined, and with the advances in molecular technology, the success of DNA extraction from ancient samples ranges from 0–90% (Stone 2008: 465). An analysis of aDNA begins with the process of extracting molecules from residues such as dental roots, bones, soft tissue (dried, frozen or preserved in water) and coprolites. The first step in the extraction process is sample preparation, which involves the removal of surface contamination of exogenous DNA that occurs each time bones come into contact with people who excavate, clean and process bones. Contaminated layers of bones can be removed in several ways, and these are: cutting or scraping the surface layers of bones, irradiating the contaminated surfaces with UV light and soaking the material in hydrochloric acid or a bleach solution. After the decontamination is carried out, extraction process starts with crushing or grinding the sample. Parts of DNA molecules are then extracted with one of the two established ways. The first involves exposing a sample to chemicals (phenol/chloroform) that attract all components of cells that are not DNA, and the other involves treating the sample with silica that binds DNA molecules (Hagelberg and Clegg 1991; Höss and Pääbo 1993; Kaestle and Horsburgh 2002: 95). Quantity of aDNA extracted from a sample is generally very small and less than 1% of the original volume. To ensure a sufficient quantity of material for analysis, polymerase chain reaction (PCR) is used to copy fragments of DNA chains which are in the focus of research several million times. The results obtained during aDNA tests can be further analyzed by standard
population genetic analysis. These data are used to solve many archaeological or anthropological problems, which can focus on an individual, a community or a population of a narrower or wider region. The analysis method and the number of samples are dictated by the specific problem that is being investigated. For research on a population level, which investigates the relations between two communities from the same or from different periods, for example, it is necessary to take samples from at least 25 people of each community and watch several loci simultaneously. Such extensive analyses are recommended when examining relationships between individuals within a single community (Stone 2008). Research at the individual level include testing smaller quantities of aDNA. Such analyses may enable the determination of the sex of an individual, in cases where the bone is damaged to such extent that sex determination cannot be made on the basis of morphological characteristics or metric parameters. Also, DNA analysis can establish the presence of pathology that leaves no visible traces on bones, to reconstruct the diet of an individual or to carry out research in forensic identification of victims of crime. Individual samples can provide a contribution to the examination and course of evolution of our species. Although the methodology of molecular research progressed and enabled the resolution of a large number of outstanding issues in archaeological research, problems can still limit research results. In the first place, we should mention the contamination of material that may affect the authenticity of results. It is, therefore, very important to handle the samples properly and double-check the results. Furthermore, research should be carefully planned, leveraging the extraction of relevant loci of aDNA with the objectives of the research. The data obtained by molecular analysis should always be combined with the knowledge gained by examining other archaeological remains, in order to obtain a more complete picture of the problem at hand.
CIP - Каталогизација у публикацији Библиотека Матице српске, Нови Сад 572:902(497)(082) BIOARHEOLOGIJA na Balkanu : metodološke, komparativne i rekonstruktivne studije života u prošlosti / urednici Nataša Miladinović-Radmilović, Selena Vitezović. - Beograd : Srpsko arheološko društvo ; Sremska Mitrovica : Blago Sirmijuma, 2016 (Novi Beograd : DC Grafički centar). - 204 str. : ilustr. ; 29 cm. - (Radovi Bioarheološke sekcije Srpskog arheološkog društva = Papers of the Bioarchaeological Section of the Serbian Archaelogical Society) Na spor. nasl. str.: Bioarchaeology in the Balkans. - Radovi na srp. i engl. jeziku. - Tiraž 200. - Str. 1-2: Bioarheologija na Balkanu / Nataša Miladinović-Radmilović, Selena Vitezović. - Napomene i bibliografske reference uz tekst. - Rezimei na engl. jeziku uz svaki rad. - Bibliografija uz svaki rad. ISBN 978-86-84457-17-4 1. Миладиновић-Радмиловић, Наташа, 1973a) Биоархеологија - Балкан - Зборници COBISS.SR-ID 304124935
