Efeito do uso da cepa starter de Penicillium nalgiovense na qualidade de salames

Efeito do uso da cepa starter de Penicillium nalgiovense na qualidade de salames1 Luís César CASTRO2, Rosa Helena LUCHESE2,*, José Francisco P. MARTINS2

RESUMO O desenvolvimento de fungos filamentosos na superfície dos salames durante a maturação é considerado um fator de qualidade que deve complementar mudanças bioquímicas envolvidas na maturação do produto. Muitos destes fungos podem, no entanto, ocasionar alterações de cor e sabor e o ataque ao envoltório, como também representar um problema de saúde pública pelas toxinas que podem produzir. Este trabalho objetivou avaliar a eficiência da cultura starter Penicillium nalgiovense (PN-2) no controle de contaminantes naturais em câmaras de maturação de salame, a operacionalização deste

controle, e o efeito geral sobre parâmetros organolépticos. Foram avaliados salames produzidos em escala industrial, os quais foram maturados por 30 dias à temperatura de 18°C e Umidade Relativa de Equilíbrio ente 80 e 60%. Os parâmetros de maturação analisados foram ácidos graxos livres (AGL), umidade, nitrogênio não protéico (NNP), aparência, sabor e aroma. As amostras inoculadas com a cultura selecionada (3 x 107esporos mL-1) mostraram, ao término do período de maturação, um aumento médio de 2,93% em AGL em relação aquelas não inoculadas. Esta diferença revelou-se significativa ao nível de 5%. A perda de umidade transcorreu de forma lenta e progressiva, não se observando diferença significativa entre as amostras inoculadas e aquelas não inoculadas (P>0,05) ao final do período de maturação. Também não foi observada diferença significativa nos níveis de pH, NNP, atributos sensoriais e de aceitabilidade. Nas análises microbiológicas não foi detectada a presença de fungos de contaminação natural nas amostras inoculadas com a cultura starter PN-2, evidenciando-se a completa predominância deste fungo. Palavras-chave: Penicillium nalgiovense; salame; maturação; starter fúngico. SUMMARY Effect of Penicillium nalgiovense starter

culture on salami quality. The growth of filamentous fungi on the surface of salami during ripening is an important factor for the quality of the product quality because it helps the biochemical changes involved in the process. Nevertheless, some of these fungi can cause problems related to discolouration and off-flavour, as well as damage on the casings. In addition, some fungi are associated to health hazards due to toxin production. This work aimed to study the ability of the starter culture Penicillium nalgiovense (PN-2)R to control natural contaminants during ripening under factory conditions, the operation of the process and the general effect on organoleptical parameters as compared to the product obtained by the traditional process. The salami were produced in industrial scale, ripened for 30 days at 18°C and 80-60% ERH. Moisture, pH, free fatty acids (FFA), non-protein nitrogen (NPN), taste, texture and aroma were the ripening parameters studied. It was observed that at the end of ripening, samples from inoculated batches had an increase of 2,93% in FFA mean value as compared to the uninoculated control. This difference was significant at 5% level. The moisture loss occurred slowly and progressively, and no significant differences were observed among inoculated and non-inoculated batches at the end of the ripening period. Statistical difference was not observed among the batches related to

pH, NPN and on the organoleptical attributes and acceptability. Microbiological analysis did not detect the presence of filamentous fungi other than the starter, and an almost complete cover by PN-2 culture was observed on the surface of the salami. Keywords: Penicillium nalgiovense; salami; ripening.

1 – INTRODUÇÃO No Brasil, a introdução de embutidos crus fermentados, como salame, tem sua origem na colonização de imigrantes alemães e italianos, principalmente na região sul do país, onde a industrialização desses produtos constitui um importante segmento da indústria de derivados cárneos. O desenvolvimento de fungos filamentosos na superfície de salames é considerado fator de qualidade. Para tanto, seu desenvolvimento, dificilmente evitável, pode ser explorado como aspecto de qualidade que venha complementar as mudanças bioquímicas envolvidas na maturação do produto. Entretanto, a inexistência de complexos climatizados em muitas empresas processadoras de salames e o controle não totalmente efetivo das condições ambientais nas câmaras climatizadas existentes favorecem o desenvolvimento de uma microbiota fúngica indesejável. A constituição dessa microbiota pode apresentar fungos toxigênicos e/ou constituir um problema comercial por descaracterização dos produtos, através de alterações de cor e sabor, ou ataque ao envoltório do embutido [1, 14]. Embora a definição das vias bioquímicas envolvidas no

processo de qualificação não esteja completamente elucidada, considera-se que ocorra um enriquecimento qualitativo e quantitativo dos salames em elementos aromáticos e de sabor, em conseqüência do metabolismo lipídico e protéico da microbiota fúngica, na superfície dos salames em processos de maturação [4]. Ademais, o crescimento de fungos desejáveis previne os efeitos adversos do oxigênio (rancificação e descoloração) e permite uma secagem mais uniforme [5, 24]. Adicionalmente, implica na degradação de ácido láctico, importante fator do "flavour" desse tipo de produto [20]. De acordo com ANDERSEN [1], culturas fúngicas "starter" devem prevenir a presença de fungos filamentosos indesejáveis, que possam produzir micotoxinas ou antibióticos, e permitir a obtenção de um produto mais uniforme com relação ao sabor, aroma e cor. Para tanto, a cultura deve ser bem adaptada ao meio cárneo e ser um bom competidor, já que um grande número de diferentes mofos tem sido capazes de colonizar a superfície dos embutidos. Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da utilização de uma cultura "starter" de fungo filamentoso em salames defumados, investigando seus incrementos qualitativos nos aspectos organolépticos característicos e sua contribuição ao controle de fungos indesejáveis.

2 – MATERIAL E MÉTODOS 2.1 – Microrganismo Utilizou-se cultura comercial liofilizada de fungo filamentoso para produtos cárneos Penicillium nalgiovense (FloraCarn PN2) fornecido da empresa Christian Hansen. 2.2 – Manufatura dos Salames e Delineamento Experimental Os salames foram manufaturados de acordo com práticas

usuais correntes na Cooperativa Central Oeste Catarinense Ltda de Chapecó, no Estado de Santa Catarina. A massa da formulação foi embutida em tripa artificial constituída de fibra de colágeno. As peças de salame embutidas apresentaram dimensões de aproximadamente 9cm de diâmetro e 50cm de comprimento. Após terem sido embutidas, as peças de salame foram levadas à sala de defumação, onde permaneceram por um período de 4 dias. Durante esse período, as peças foram submetidas a duas sessões de defumação, ambas com 2h de duração, no 2º e 4º dia e, após 30 dias de maturação. Transcorrido o período de permanência na sala de defumação, 9 embutidos, de 3 diferentes lotes, foram amostrados para análises físico-químicas. Trinta (30) embutidos defumados, dos mesmos 3 diferentes lotes, foram submetidos a inoculação superficial, por nebulização, com suspensão de esporos liofilizados de P. nalgiovense (107 propágulos mL-1) e levados à câmara teste. Outras 30 peças, sem inoculação, foram dispostas na câmara controle, observando-se a mesma disposição. A seguir, os salames foram maturados por 30 (trinta) dias. A umidade relativa de equilíbrio (URE) nas câmaras foi de 80% no início, e 60%, ao final da maturação. A temperatura de maturação foi de 18°C. Em intervalos de 10 dias os salames foram amostrados para análises físicoquímicas. Após 30 dias, os salames também foram submetidos a análise organoléptica. 2.3 – Isolamento e identificação de fungos filamentosos Realizou-se o isolamento de fungos filamentosos suspeitos encontrados em salames defeituosos oriundos de diferentes empresas produtoras de salames da região sul do Brasil, pertencentes à diferentes lotes e tempos de maturação. Amostras de crescimento fúngico suspeito foram retiradas

com auxílio de alça de níquel-cromo e inoculadas em placas contendo agar dicloran-glicerol 18 (DG-18) (Oxoid/Unipath Ltda, England) com incubação a 28°C por 3-7 dias. Amostras de ar circulante foram coletadas por exposição de placas de Petri em diferentes pontos das câmaras de maturação. A identificação dos isolados foi realizada pelo Centro de Micologia e Micotoxicologia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. A identificação baseou-se na taxonomia clássica, através do estudo morfológico (macroscópico e microscópico). Para a descrição morfológica do gênero Aspergillus e seus teleomorfos, empregou-se os critérios adotados por RAPER & FENNEL [19] e KLICH & PITT [11]. Os fungos do gênero Penicillium foram identificados de acordo com PITT [18], FRISVALD & FILTENBORG [8] e SAMSON & PITT [22]. 2.4 – Quantificação do crescimento fúngico A superfície de salames inoculados e não inoculados com o fungo starter foram amostradas pela técnica de swab. O procedimento consistiu na passagem do swab umedecido em solução diluente numa área delimitada de 1cm2 do embutido. Foram feitas três amostragens de 1cm2 em cada peça de salame. Os swabs foram transferidos para tubos contendo 10mL do diluente e, a partir deste tubo, foram preparadas diluições decimais sucessivas. Alíquotas de 1mL destas diluições foram semeadas pelo método em profundidade em agar batata dextrose (Oxoid/Unipath Ltda, England). 2.5 – Homogeneização das amostras As amostras de salame foram fatiadas e homogeneizadas em um multiprocessador (Walita, modelo Master Plus RI 3148) com 7,5cm de raio, até a obtenção de consistência pastosa. Devido ao aumento da consistência dos salames, verificada com o transcorrer do processo de maturação, o tempo de

processamento foi de 2, 4, 7 e 7 minutos, respectivamente para o inicio (0 dia), após 10, 20 e 30 dias de maturação. 2.6 – Determinação do nitrogênio não protéico (NNP) Pesou-se exatamente 10g do homogeneizado de cada amostra, obtido como acima descrito, e adicionou-se 35mL de água destilada. Esta suspensão foi então homogeneizada em um triturador-misturador tipo "ultra-turrax" (Ika-Labortechnik) por 2 min. e adicionada de 7mL de solução aquosa de ácido tricloroacético 10% (Merck S.A. Industrias Químicas) e mantida a 4°C por 2 horas. Seguiu-se centrifugação por 20 min. a 1000rpm e filtragem do sobrenadante em filtro de papel qualitativo. O filtrado obtido foi evaporado e o produto da evaporação transferido para balão de Kjeldahl de 500mL com auxílio de 350mL de água destilada, sendo o conteúdo de nitrogênio determinado pelo método de Kjeldahl [3]. 2.7 – Determinação de ácidos graxos livres (AGL) Procedeu-se a extração da fração lipídica pelo método de BLIGH & DYER [2]. Quantidades de 2,5g da amostra homogeneizada foram extraídas com uma mistura composta de 10mL de clorofórmio (Merck S.A. Indústrias Químicas), 20mL de metanol (Reagen, Quimibrás Indústrias Químicas S.A.) e 8mL de água destilada, de modo a formar um sistema monofásico miscível com o conteúdo aquoso da amostra (clorofórmio, metanol e água 1:2:0,8). Após a agitação em uma agitador rotativo de tubos (Homogeneizador de sangue modelo AP2, Phoenix Equipamentos Científicos) por 30 min., adicionou-se mais 10mL de clorofórmio e 10mL de solução aquosa de sulfato de sódio a 1,5% (Merck S.A. Indústrias Químicas) (clorofórmio, metanol e água 2:2:1,8). Os tubos foram agitados vigorosamente por 2 min. e, a seguir deixados em repouso. Com isto, o sistema monofásico separou-se em duas camadas, formando um sistema bifásico: a camada

clorofórmica, mais densa, contendo lipídeos, e a camada metanólica contendo água e os compostos não lipídicos. Descartou-se a camada metanólica e filtrou-se a camada inferior em 1g de sulfato de sódio anidro. Foram medidos exatamente 5mL do filtrado em recipiente previamente tarado. Após a secagem em estufa a 100°C, fez-se nova pesagem, obtendo-se o percentual de gordura na amostra. Para determinação de ácidos graxos livres adicionou-se ao filtrado 25mL de álcool etílico (Merck S.A. Indústrias Químicas) e titulou-se com solução aquosa de hidróxido de sódio a 0,1N (Reagen, Quimibrás Indústrias Químicas S.A.) usando-se fenolftaleína como indicador. A acidez foi calculada e expressa em massa de ácido oléico por 100g de gordura [17]. 2.8 – Análise sensorial Empregou-se o teste duo-trio [9] com um painel composto de 12 integrantes, todos treinados e conhecedores dos atributos sensoriais desejados no produto. A amostra processada pelo método tradicional (padrão) foi inicialmente oferecida aos painelistas, seguida de duas outras amostras codificadas, sendo uma igual e uma diferente do padrão. 2.9 – Análise estatística Os dados experimentais foram obtidos de análises em triplicata de 3 diferentes lotes. O método estatístico consistiu na análise de variância para o modelo inteiramente casualizado, de experimento em esquemas fatoriais. Aplicouse o teste de Tukey para comparação das médias e localização das diferenças ao nível de significância de 5%.

3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 – Efeito sobre a secagem e desenvolvimento do pH Uma perfeita cobertura de fungos sobre a superfície de

salames auxilia numa perda de umidade mais homogênea, de forma lenta e progressiva, atuando na diminuição da formação de crosta na superfície dos embutidos. Os resultados obtidos, com e sem a inoculação da cultura "starter", mostraram uma redução final no teor de umidade de 42%, referente a uma perda de peso em torno de 25% (Figura 1; Tabela 1). Esta redução de umidade foi gradual e os resultados expressaram perdas de 14% em média a cada intervalo de 10 dias, igualmente nos salames com e sem inoculação de "starter" fúngico. Estes dados confirmam os resultados obtidos por RONCALES et al. [21], sem adição de "starter".

A Figura 2 mostra os valores de pH obtidos no decorrer do período de maturação, os quais refletem a influência da microbiota fúngica filamentosa sobre o comportamento do pH, similares aos encontrados por RONCALES et al. [21]. Os dados revelam uma diminuição mais acentuada no pH dos salames não inoculados com o fungo "starter" até o 10º dia de maturação. A intensidade desse efeito se mantém durante os primeiros dias de maturação, particularmente devido ao microclima eletivo para a microbiota bacteriana acidificante. Até o 10º dia de maturação, os valores de pH dos embutidos inoculados foram significativamente superiores (P0,05). Estes dados se justificam com o crescimento da microbiota fúngica de contaminação natural nos salames não inoculado. Tal microbiota apresenta condições de adaptação já estabelecidas e também exerce atividade degradativa sobre o ácido láctico e na liberação de amônia. Resultados diferentes foram obtidos por RÖDEL et al. [20] que observaram metabolismo fúngico demasiadamente acentuado, resultando em pH final muito elevado. Estes autores empregaram dois métodos de processamen-to. No primeiro usaram temperaturas de 24°C-18°C por 7 dias, e no

segundo 25°C-19°C durante 36 horas seguido de redução a 8°C-10°C até o final do período de maturação. Com o primeiro método, os salames apresentaram um leve, mas completo, recobrimento com mofos a partir do terceiro dia, apresentando-se totalmente recobertos no oitavo dia. Utilizando-se o segundo método, observaram a cobertura total dos salames com mofos somente após três semanas. Entretanto, este retardo no desenvolvimento dos mofos influenciou favoravelmente a evolução do pH do produto. No primeiro método houve um abaixamento inicial do pH do embutido, como resultado da fermentação, seguido de um rápido aumento devido à degradação do ácido láctico e liberação de amoníaco, atingindo pH 6.6 em 15 dias, resultante do crescimento do mofo. 3.2 – Formação de compostos de Nitrogênio Não Protéico (NNP) Os níveis de NNP nos salames, sem e com inóculo, aumentaram em 7,4% e 14,8%, respectivamente, após 10 dias de maturação (Figura 3). Os resultados revelaram que os valores obtidos com as amostras inoculadas foram significativamente superiores àquelas não inoculadas até o 20º dia de incubação (P