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Efeitos alelopáticos de Lafoensia glyptocarpa Koehne sobre Sesamum indicum L. e sobre o crescimento de coleóptilos de Triticum aestivum L. Luiza Paiva Silva de Moraes, Sonia Cristina Juliano Gualtieri, Maria Inês Salgueiro Lima, Ana Beatriz Gatti, Viviane de Cassia Pereira & Maria Augusta Ferraz Machado Miranda Laboratório de Ecofisiologia de Sementes- Universidade Federal de São Carlos Washington Luiz, km 235 CEP 13565-905, São Carlos, SP, Brasil.
[email protected] Recebido em 03.IX.2013. Aceito em 26.V.2014
RESUMO - Este trabalho avaliou o potencial alelopático de extratos foliares e radiculares de Lafoensia glyptocarpa Koehne sobre a germinação de sementes e o crescimento de plântulas e de células do metaxilema de gergelim (Sesamum indicum L.). A partir dos resultados, verificou-se que os extratos de folhas e raízes de L. glyptocarpa causaram alterações na germinação das sementes e no crescimento das plântulas de gergelim, além de alterações na raiz primária e diminuição no tamanho e número de células do metaxilema. Foram também obtidos extratos foliares com hexano, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol, e testados sobre o desenvolvimento de coleóptilos de trigo, sendo que os quatro últimos apresentaram atividade. Com o sub-fracionamento do extrato de acetato de etila, que se apresentou como o mais promissor, cessou a atividade inibitória para as sub-frações, sendo posteriormente verificada a presença de sinergismo entre elas. Palavras-chave: alelopatia; Lafoensia glyptocarpa; Sesamum indicum, sinergismo ABSTRACT - Allelopathic effects of Lafoensia glyptocarpa Koehne on Sesamum indicum L. and on the growth of Triticum aestivum L. coleoptiles. This study evaluated the allelopathic potential of leaf and root extracts of Lafoensia glyptocarpa Koehne on seed germination and the growth of seedlings and sesame (Sesamum indicum L.) metaxylem cells. We found that the leaf and root extracts of L. glyptocarpa changed in sesame seed germination and seedling growth, as well as changes in the primary root and decreased size and number of metaxylem cells. Leaf extracts were also obtained with hexane, dichloromethane, ethyl acetate, acetone, and methanol, and tested when developing wheat coleoptiles, and the last four showed activity. By subfractioning the ethyl acetate extract, which was the most promising, inhibitory activity ceased for subfractions, and the presence of synergism was subsequently found between them. Key words: allelopathy; Lafoensia glyptocarpa; Sesamum indicum, synergism
INTRODUÇÃO As plantas sintetizam uma diversidade de substâncias químicas em resposta a diferentes fatores ambientais. Os compostos secundários produzidos pelas plantas foram possivelmente originados devido ao estresse causado às mesmas, como a ação de microrganismos, herbívoros ou patógenos (Oliveiros-Bastidas 2008). Algumas substâncias provenientes do metabolismo secundário das plantas são conhecidas como aleloquímicos (Silva et al. 2011).
A alelopatia envolve a adição de substâncias no ambiente, que influenciam o desenvolvimento de um novo indivíduo prejudicando-o ou favorecendo-o (IAS 2012). Um determinado tipo de influência química pode ser denominada de inter-específica quando uma espécie vegetal exerce efeito alelopático sobre outras espécies ou intra-específica se o efeito for sobre ela mesma (Macías et al. 2007). O estímulo ou a inibição no desenvolvimento de outras plantas por aleloquímicos sinalizam de forma secundária mudanças ocorridas em nível molecular e celular. IHERINGIA, Sér. Bot., Porto Alegre, v. 69, n. 1, p. 37-48, julho 2014
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Alterações nas estruturas citológicas e ultraestruturas, na permeabilidade da membrana, nos processos metabólicos e no material genético podem induzir alterações no DNA e RNA, de forma direta ou indireta (Ferreira & Áquila 2000). O desenvolvimento de moléculas bioativas com essas propriedades tem sido amplamente utilizado como estratégia nos últimos anos, sendo aplicados na agricultura como alternativa ao uso de herbicidas e pesticidas (Waller 1999, Macías et al. 2008). Lafoensia glyptocarpa Koehne é uma espécie popularmente conhecida como mirindiba-rosa e pertence à família Lythraceae. Apresenta crescimento rápido e por isto é recomendada para plantios mistos destinados à recomposição de áreas degradadas de preservação permanente. É uma espécie semidecídua, heliófita, característica da floresta pluvial atlântica. Ocorre no interior da floresta primária densa e em formações secundárias, apresenta dispersão restrita e irregular (Lorenzi 2002). O estudo fitoquímico desta espécie, realizado a partir do caule e da casca dos frutos, conduziu ao isolamento e identificação de ésteres derivados do ácido cinâmico, cumarato de alquila, ferulato de alquila e cinamato de sitosterila, além de saponinas e triglicerídeos (Carvalho 2006). Sabe-se que os aleloquímicos podem estar presentes em todos os órgãos das plantas incluindo folhas, flores, frutos, raízes, rizomas, caules e sementes (Borella & Pastorini 2009). Nesse sentido, espera-se que os extratos aquosos de folhas e raízes de Lafoensia glyptocarpa possuam substâncias alelopáticas que favoreçam seu estabelecimento no cerrado. Baseado nestas informações, este trabalho teve como objetivo identificar os possíveis efeitos alelopáticos causados por extratos aquosos de folhas e raízes de Lafoensia glyptocarpa, na germinação, crescimento de plântulas e morfologia das células radiculares de Sesamum indicum L. (gergelim) e sobre o crescimento de coleóptilos de Triticum aestivum (trigo) a fim de fracionar estes extratos e verificar a atividade de cada uma das frações. Esse método foi proposto pela primeira vez por Hancock et al (1964) e é considerado como bioensaio padrão para avaliação da bioatividade geral de um extrato. O uso de sementes de espécies nativas do cerrado em bioensaios de alelopatia não é aconselhável, pois estas espécies normalmente apresentam dormência e variabilidade genética, resultando em uma maior plasticidade dos dados (Pina 2008). Sendo assim, é recomendável o uso de sementes de espécies cultivadas de boa qualidade e de germinação rápida e uniforme (Ferreira & Aquila 2000).
MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal e Preparação do extrato aquoso Folhas maduras e raízes de Lafoensia glyptocarpa foram coletadas no campus da Escola Superior de Agronomia Luiz de Queiroz- USP em Piracicaba - SP. Após a coleta o material vegetal foi triado manualmente, seco em estufa com circulação de ar a 40 ºC durante 72 h, e moído em moinho industrial. Ao material vegetal seco e triturado foi adicionada água destilada para obtenção das soluções nas concentrações de 5 e 10% de peso/ volume (g/mL). Em seguida os extratos de folhas e raízes foram deixados em repouso durante três horas a 4ºC. Posteriormente foram filtrados com auxilio de bomba a vácuo acoplada a um funil de Buchner e recobertos com papel de filtro qualitativo. Bioensaio de Germinação A espécie alvo utilizada para este bioensaio foi o gergelim (Sesamum indicum L., Pediliaceae). Foram utilizadas placas de Petri de 9 cm de diâmetro, forradas com duas folhas de papel de filtro umedecidas com 5 mL dos extratos de folha ou raiz 5 e 10%, o controle foi feito com água destilada. As placas foram seladas com papel filme, a fim de manter a umidade no interior da placa (MaraschinSilva & Áquila 2006) e mantidas em câmeras B.O.D. climatizadas a 28ºC (± 2ºC) com 12h de fotoperíodo. Para este bioensaio foram realizadas quatro repetições com 30 sementes cada. As leituras foram realizadas em intervalos de 12 horas durante sete dias, foi considerada germinada a semente que apresentava 2 mm de protrusão da radícula e curvatura geotrópica positiva (Borghetti & Ferreira 2004). Os parâmetros analisados foram porcentagem e velocidade de germinação, calculados de acordo com fórmulas propostas por Labouriau & Valadares (1976). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. Bioensaio de Crescimento Para a avaliação dos efeitos dos extratos sobre o crescimento das plântulas de gergelim, foram utilizadas as mesmas concentrações de extrato de folhas ou raízes (5 e 10%). As sementes previamente germinadas em água, apresentando emissão de raiz primária de cerca de 2 mm de comprimento foram transferidas para caixas plásticas transparentes (11 x 29 x 9,5 cm) forradas com duas folhas de papel de filtro e umedecidas com 20 mL de extrato ou água (controle). Também foi realizado um bioensaio de
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recuperação, que consistia em plântulas previamente germinadas em água, transferidas para caixas plásticas transparentes na presença dos extratos, utilizando o procedimento acima e decorridos dois dias as plântulas foram transferidas para caixas contendo água destilada (assim como o controle que estava em água destilada).O experimento foi conduzido em câmaras tipo B.O.D. a 28°C e fotoperíodo de 12 h. Após 7 dias foram feitas medidas da parte aérea e da parte radicular das plântulas com paquímetro digital. Avaliação dos Efeitos Alelopáticos em Elementos do Xilema Para esta avaliação, as plântulas cresceram nas mesmas condições de luz e temperatura citadas no bioensaio de crescimento. Decorridos quatro dias as plântulas de gergelim foram retiradas das caixas e com o auxilio de um estilete foi separado um segmento da raiz primária e colocado em álcool 70%. A coloração do material vegetal foi feita a partir do método Fuchs modificado (Kraus & Arduin 1997). As raízes foram imersas em álcool (70%) durante sete dias e depois colocadas em soda cáustica (NaOH a 25%) por 24 h. Decorrido este período o material vegetal foi colocado em uma solução de safranina (C20H19N4C1) e soda cáustica (NaOH a 50%) e colocado em estufa a 60ºC durante 24 h. Após a coloração o material vegetal foi colocado em lâminas de vidro com xarope de Apathy para observação em microscópio óptico (Olympus-BX41) acoplado com câmara fotográfica (Sony CCD-IRIS). Foram utilizadas quatro raízes primárias provenientes de plântulas de gergelim crescidas em água destilada ou nos extratos de raiz ou folha de L. glyptocarpa. De cada raiz foi fotografado 50% de seu comprimento total, da região central em direção ao colo, o aumento utilizado foi de 20 vezes (Gatti 2008). A partir das fotos foram medidas as células centrais do metaxilema. Fracionamento do Extrato Bruto - Extração Líquido-Líquido Para extração líquido-líquido foi preparado o extrato aquoso com 50 g de pó de folhas de L. glyptocarpa em 500 mL de água destilada. Este extrato foi mantido em geladeira no escuro durante 24 horas. Para esta extração foram utilizados 500 mL do extrato aquoso concentrado de folhas. O extrato foi fracionado com os solventes orgânicos em ordem crescente de polaridade: hexano, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol utilizando um funil de separação. Foram feitas duas extrações consecutivas, cada uma com 500 mL de cada
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solvente. Em seguida, as frações foram deixadas em repouso até a separação de duas fases: a do solvente adicionado e a do extrato aquoso. As fases obtidas para cada um dos solventes foram reunidas e secas em rotavapor. Com as frações obtidas da extração foi feita a avaliação do potencial alelopático. Bioensaio com coleóptilos de trigo Para este bioensaio foram utilizadas plântulas de trigo (Triticum aestivum var. Pizon) germinadas em placas de Petri de 15 cm de diâmetro, forradas com papel de filtro umedecido com água destilada. As placas foram mantidas em estufa a 24º C na ausência de luz, durante três dias (Gatti 2008). Após esse período as plântulas foram selecionadas e cortadas em uma guilhotina de Van der Weij, onde foram descartados os 2 mm apicais da parte aérea. Do restante, foram cortados segmentos de coleóptilos de 4 mm de comprimento, os quais foram mantidos em meio nutritivo durante uma hora antes de serem utilizados para o bioensaio. Todo este procedimento foi realizado sobre luz verde de segurança (Macías et al. 2010). O crescimento dos coleóptilos foi feito em tubos de ensaio contendo solução tampão de fosfato de potássio (pH 5,6) composto de 10g de sacarose, 0,525 g de ácido cítrico e 15 g de fosfato dibásico dissolvidos em meio litro de água destilada. A este tampão foram adicionadas as frações provenientes da extração líquido-líquido dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO). De cada uma das frações obtidas com a extração líquido-líquido foi utilizado 10 mg. As concentrações utilizadas para os bioensaios foram 600, 300 e 150 ppm. Dois mL de cada solução e suas respectivas concentrações foram colocados nos tubos de ensaio onde posteriormente foram adicionados os coleóptilos de trigo. Estes tubos foram colocados em uma centrífuga com rotação de 6 rpm durante 24 horas a 25°C no escuro. Além dos tubos contendo as frações e suas concentrações foram feitos dois controles, um com água e DMSO e outro somente com a solução tampão. Foram feitas seis repetições contendo cinco coleóptilos cada. Após 24 horas os coleóptilos foram retirados dos tubos de ensaio, fotografados com câmera digital e medidos com auxílio do programa Image Pro-Plus. Fracionamento Com base nos resultados obtidos no bioensaio de crescimento dos coleóptilos de trigo, foi realizado um outro fracionamento utilizando-se a fração que apresentou maior potencial de inibição de crescimento. Assim, a fração acetato de etila, obtida IHERINGIA, Sér. Bot., Porto Alegre, v. 69, n. 1, p. 37-48, julho 2014
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a partir da extração líquido-líquido, foi submetida ao fracionamento cromatográfico utilizando sílica gel 60 (fase normal) (70 -230 mesh ASTM) como fase estacionária. Como fase móvel foi utilizada uma série de eluentes em ordem crescente de polaridade: hexano 100%, hexano + acetato de etila 75, 50, 25 %, acetato de etila 100%, acetato de etila + acetona 75, 50, 25 % , acetona 100 %, acetona + metanol 75, 50, 25 % e metanol 100%. Com este procedimento foram obtidas 82 sub-frações, que foram novamente reunidas de acordo com a similaridade química visualizada em cromatografia de camada delgada (CCD), resultando em 7 sub-frações. Cada cromatoplaca foi observada sob luz ultravioleta (UV) nos comprimentos de onda de 254 e 365 nm e revelada com Oleum (solução de 10 mL de ácido sulfúrico e 200 mL de ácido acético dissolvidos em 40 mL de água). Foi realizado um novo bioensaio de crescimento de coleóptilos de trigo para determinar o potencial alelopático das sete sub-frações obtidas. Análise Estatística O delineamento experimental dos bioensaios foi inteiramente casualizado, com quatro repetições para cada tratamento. Os valores de porcentagem foram transformados em arco seno (Labouriau 1983). Os dados foram submetidos à análise de variância e, dependendo da distribuição, foi utilizado teste não paramétrico (Kruskal-Wallis) ou paramétrico (Tukey) a 5% de probabilidade (Santana & Ranal 2004). As análises estatísticas foram realizadas no Programa Estat 5.0.
o crescimento das plântulas, porém uma redução significativa tanto na porcentagem da germinação quanto na velocidade da germinação de sementes indicam que os aleloquímicos presentes no extrato vegetal estão atuando negativamente sobre a espécie alvo (Borghetti & Ferreira 2004). Atrasos na germinação de sementes de qualquer espécie podem ter implicações biológicas importantes, pois refletirão no estabelecimento da planta em condições naturais e na relação com espécies vizinhas (Escudero et al. 2000; Chaves et al. 2001). Dentre as possíveis alterações no padrão de germinação, são observados efeitos sobre a permeabilidade de membranas, transcrição e tradução de RNA, integridade dos mensageiros secundários, da respiração, conformação de enzimas e de receptores, ou uma ação conjunta destas alterações (Ferreira & Áquila 2000, Maraschin -Silva & Áquila 2006). A avaliação do pH e do potencial osmótico dos extratos vegetais é fundamental, pois valores extremos tanto de pH quanto de potencial osmótico dos extratos podem atuar sobre as sementes e/ou plântulas e mascarar o efeito alelopático (Carmo et al. 2007). Neste trabalho, tanto o pH quanto o potencial osmótico dos extratos foram encontrados dentro de uma faixa de valores aceitáveis como não interferentes sobre a germinabilidade das sementes. Os extratos aquosos L. glyptocarpa alteraram o processo germinativo das sementes de gergelim. A inibição da germinação foi mais efetiva quando foram utilizados os extratos de folhas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO Bioensaio de germinação Os extratos de folhas de L. glyptocarpa causaram alterações tanto na porcentagem quanto na velocidade de germinação das sementes de gergelim nas duas concentrações testadas. O extrato da raiz a 5% aumentou a velocidade de germinação, sendo que sua média foi superior a do tratamento controle, o extrato da raiz a 10% diminuiu a velocidade de germinação quando comparado com o tratamento controle (Fig.1). Os extratos de folha nas duas concentrações (5% e 10%) também diminuíram significativamente a velocidade de germinação das sementes quando comparados com o tratamento controle. A porcentagem de germinação foi menor na presença dos extratos de folha em ambas as concentrações (Fig. 2). Sabe-se que a germinação de sementes é muito menos sensível à ação dos aleloquímicos do que
Bioensaio de Crescimento O crescimento de plântulas de gergelim na presença de extratos aquosos de raiz e folhas de L. glyptocarpa (5 e 10%) apresentou redução significativa, diferindo estatisticamente do controle. Todas as plântulas apresentaram-se deterioradas quando foram expostas a estes tratamentos. As menores médias de crescimento da parte aérea e da raiz das plântulas de gergelim foram obtidas nos tratamentos extrato de folhas a 5 e 10% (Fig. 3). Conforme observado na figura 3, o crescimento das raízes sofreu redução significativa no comprimento quando comparadas com o grupo controle. As raízes primárias tornaram-se escurecidas e necrosadas quando mantidas em meio contendo os referidos extratos (raiz 5% e 10% e folhas 5% e 10%). Assim, verifica-se que em relação ao crescimento inicial, as plântulas de gergelim apresentaram anormalidade no desenvolvimento das raízes.
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Fig. 1. Velocidade de germinação de sementes de gergelim submetidas à ação de extratos aquosos de folhas (5 e 10 %) e raízes (5 e 10%) de Lafoensia glyptocarpa. Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo Teste de Tukey a 0.05% de probabilidade.
Fig. 2. Porcentagem de germinação de sementes de gergelim submetidas à ação de extratos aquosos de folhas (5 e 10 %) e raízes (5 e 10%) de Lafoensia glyptocarpa. Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo Teste de Tukey a 0.05% de probabilidade.
Esse mesmo efeito foi observado por Gatti et al. (2004). A presença de anormalidade em raízes parece ser um bom parâmetro para a detecção de efeitos alelopáticos, pois este órgão é mais sensível à ação alelopática que a parte aérea (Pires & Oliveira 2001). A avaliação da anormalidade das plântulas é instrumento valioso nos experimentos de alelopatia e a necrose da radícula é o sintoma mais comum da anormalidade (Ferreira & Áquila 2000). A parte aérea das plântulas de gergelim submetidas aos extratos de L. glyptocarpa
também sofreu alterações significativas no seu desenvolvimento. Além do comprimento da parte aérea ter sido significativamente menor que no grupo controle, ocorreram alterações morfológicas não observadas no controle, como o desenvolvimento de folhas primárias, quando submetidas a extratos de folhas (5 e 10 %). A figura 4 apresenta o comprimento médio da raiz e parte aérea das plântulas de gergelim submetidas aos extratos de folha ou raiz (5 e 10%), e aos mesmos extratos sendo posteriormente transferidas para água IHERINGIA, Sér. Bot., Porto Alegre, v. 69, n. 1, p. 37-48, julho 2014
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destilada, para avaliar a possibilidade de recuperação das plântulas após a permanência nos extratos. De modo geral, as plântulas submetidas aos extratos foliares, nas duas condições propostas acima, a 5 e 10%, apresentaram menores médias de crescimento de parte aérea e raiz quando comparadas ao controle e aos extratos de raiz. Porém, as raízes foram mais afetadas pelos extratos foliares, nas duas concentrações, em relação a parte aérea. Estes resul-
tados corroboram com a constatação de que os aleloquímicos geralmente têm efeitos mais pronunciados na radícula (Inoue et al. 2010, Grisi et al. 2012, Grisi et al. 2013). Compostos alelopáticos podem estar associados a alterações nos processos celulares das espécies alvo. Na célula alguns aleloquímicos atuam aumentando a permeabilidade da membrana, induzindo a peroxidação lipídica, e causando a ruptura celular (Santos et al. 2008, Weir et al. 2004).
Fig. 3. Comprimento (mm) da parte aérea e raiz primária de gergelim crescidos sob influência de extrato aquoso de folha de Lafoensia glyptocarpa (5% e 10%), raiz (5% e 10%) e controle (crescimento em água destilada). Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas (parte aérea) e minúsculas (parte subterrânea) não diferem entre si pelo teste de Tukey a 0.05% de probabilidade.
Não houve diferença significativa no crescimento das plântulas que ficaram dois dias nos extratos de folha ou raiz (5% e 10%) e depois foram transferidas para substrato umedecido com água em relação àquelas que permaneceram durante sete dias sob influência dos extratos, ou seja, não houve resposta de recuperação no crescimento das plântulas. Para alguns autores, o conceito de reversão baseia-se em amenizar parcial ou totalmente os efeitos fitotóxicos, fornecendo um substrato que elimine a deficiência fisiológica ocasionada pelo aleloquímico ou ainda que reaja diretamente com ele, impedindo sua ação (Gatti 2008). Os extratos de raiz e folhas de L. glyptocarpa interferiram no tamanho médio das células xilemáticas de gergelim (Fig. 5), inibiram o crescimento de suas raízes e esta inibição ocorreu pela diminuição do alongamento das células radiculares do metaxilema
das raízes, porém o extrato de raiz a 5% não apresentou diferença estatística em relação ao controle (Fig. 6). Isto indica a provável interferência dos aleloquímicos presentes nos extratos de L. glyptocarpa. O crescimento das células meristemáticas pode ser interrompido sob condições de estresse. Um dos prováveis agentes que atuam na divisão celular das células radiculares é a auxina. A diminuição na concentração de auxina pode levar a um aumento ou diminuição do tamanho das células. As auxinas desempenham um papel central na regulação do crescimento de raízes modulando diversos processos, como as respostas trópicas a luz e gravidade, arquitetura geral de raízes e caules, desenvolvimento vascular, alongamento celular, entre outros (Tamimoto 2005). Sabe-se ainda que vários herbicidas contendo grupos fenólicos são análogos às auxinas, além do fato de que substâncias como o ácido benzóico são freqüen-
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Fig. 4. Comprimento (cm) da parte aérea e raiz primária de plântulas de gergelim crescidas em duas condições. Extrato: 7 dias nos extratos de folha ou raiz a 5 e 10% (F 5%, F 10%, R 5% e R10%, respectivamente) de Lafoensia glyptocarpa; e Extrato + Água: 2 dias nos extratos (nas mesmas concentrações citadas acima) + 5 dias em água destilada. Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas (parte aérea) e minúsculas (parte radicular) não diferem entre si pelo teste Tukey a 0.05% de probabilidade.
Fig. 5. Tamanho médio das células do metaxilema de raízes de gergelim crescidas em água e em presença dos extratos folha 5%, folha 10% raiz 5% raiz 10% de Lafoensia glyptocarpa. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem entre si pelo teste Tukey.
temente descritas com atividade alelopática, sendo a utilização de seus derivados como herbicida (TBA, TIBA, Dicamba) bem conhecida (Souza-Filho 2006). Verificou-se que os extratos aquosos de folhas de L. glyptocarpa não apenas alterou o tamanho das células metaxilemáticas do gergelim, como também o
número de células, quando comparadas com o grupo controle, sendo que as plântulas crescidas em contato com extrato de folha (5 e 10%) apresentaram menos células (Fig. 7). Este fato pode estar associado à diminuição no índice mitótico causado pela toxicidade do extrato. Aliotta et al. (2004) demonstraram IHERINGIA, Sér. Bot., Porto Alegre, v. 69, n. 1, p. 37-48, julho 2014
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Fig. 6. Fotomicrografia de células do xilema de raiz de gergelim crescidas em água (A), em presença dos extratos de folha 5% (B), folha 10% (C), raiz 5% (D), raiz 10% (E) de Lafoensia glyptocarpa. As elipses destacam os comprimentos das células em cada tratamento.
que a expansão de células radiculares foi reduzida em presença de diferentes concentrações de resíduos de Olea europea e esta redução resultou no espessamento da ponta da raiz em comparação ao controle. Segundo Al-Wakeel et al. (2007) a inibição do alongamento celular pode estar relacionada com a ação direta dos aleloquímicos por interferirem também no processo de divisão celular alterando o equilíbrio entre os diferentes hormônios. Bioensaio com coleóptilos de trigo As frações diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol causaram inibição significativa no crescimento dos coleóptilos em relação ao controle (Fig. 8). A fração hexano estimulou significativamente o crescimento dos coleóptilos. A fração que promoveu maior inibição no comprimento dos coleóptilos foi a fração obtida com acetato de etila, alcançando mais de 65% de inibição na concentração 300 ppm. Esta inibição pode ser melhor observada quando comparada com o crescimento dos coleóptilos crescidos em solução tampão (controle com DMSO). Dados similares foram encontrados por Macías et al. (2004) onde frações e substâncias isoladas de Helianthus annuus também provocaram inibição no comprimento de coleóptilos de trigo. Gatti (2008) verificou que as frações hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, de Aristolochia esperanzae causaram dimi-
nuição no comprimento dos coleóptilos quando comparados com o grupo controle. Os resultados dos ensaios com coleóptilos de trigo levaram a um segundo fracionamento da fração acetato de etila em cromatografia de coluna utilizando sílica de fase normal. As sub-frações obtidas foram agrupadas de acordo com a similaridade encontrada na cromatografia de camada delgada (CCD). Ocorreu um aumento significativo no tamanho dos coleóptilos nas sub-frações D, E e F em relação ao controle nas diferentes concentrações (600 ppm, 300 ppm, e 150 ppm), e aumento de tamanho em quase todas as subfrações estudadas (Fig. 9). Diante deste fato, as frações de acetato de etila foram novamente agrupadas (Fig. 10), e observou-se novamente inibição do crescimento dos coleóptilos em relação ao controle. O herbicida nicosulfuron e a fração reagrupada de acetato de etila causaram uma inibição significativa no comprimento dos coleóptilos, nas três concentrações estudadas, quando comparadas com o grupo controle. Este fato levou a crer na possibilidade de sinergismo entre os metabólitos encontrados nas frações de acetato de etila de L. glyptocarpa. Segundo Odum (2007) sinergismo é um fenômeno químico no qual o efeito obtido pela ação combinada de duas substâncias químicas diferentes é maior do que a soma dos efeitos individuais dessas mesmas
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Fig. 7. Número de células medidas no metaxilema de raízes de gergelim crescidas em água e em presença dos extratos folha 5%, folha 10% raiz 5% raiz 10% de Lafoensia glyptocarpa K. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem entre si pelo teste Tukey.
Fig. 8. Inibição / Estímulo de crescimento dos coleóptilos crescidos durante 24 horas a 25°C no escuro. Fração Hexânica, Diclorometano, Acetato de etila, Acetona e Metanol da extração líquido-líquido. * indica diferenças significativas em relação ao controle (teste de Tukey 5% de probabilidade).
substâncias. Existem, na literatura, algumas informações sugerindo a existência de sinergismos como resultado da ação combinatória de diferentes aleloquímicos (Kubo et al. 1992, Weidenhamer 1994, Einhellig 1995). Nos poucos trabalhos em que essa hipótese é testada, a combinação entre dois ou mais agentes alelopáticos envolve concentrações fixas e as inferências são baseadas no aumento das inibições (em que se conclui pela existência de sinergismo) ou na ausência de aumento (em que se conclui pela inexistência de sinergismo) (Souza-Filho 2006).
CONCLUSÕES A presença de sinergismo em relação às subfrações de acetato de etila de L. glyptocarpa elucida o aumento significativo do crescimento dos coleóptilos de trigo e posterior diminuição do crescimento dos coleóptilos quando as sub-frações foram reagrupadas. Os extratos de L. glyptocarpa alteraram a germinação, o crescimento de plântulas e o padrão de crescimento das células metaxilemáticas da raiz gergelim. IHERINGIA, Sér. Bot., Porto Alegre, v. 69, n. 1, p. 37-48, julho 2014
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Fig. 9. Inibição / Estímulo de crescimento dos coleóptilos crescidos durante 24 horas a 25°C no escuro. Sub-frações da fração Acetato de etila. (A a G) da extração líquido-líquido. * Indica diferenças significativas em relação ao controle (teste de Tukey 5% de probabilidade)
Fig. 10. Inibição / Estímulo do crescimento dos coleóptilos crescidos durante 24 horas a 25°C no escuro. Reunião das sub-frações da fração Acetato de etila. (A a G) da extração líquidolíquido e a inibição causada pelo herbicida nicosulfuron. * indica diferenças significativas em relação ao controle (teste de Tukey 5% de probabilidade).
AGRADECIMENTOS
REFERÊNCIAS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro. Ao Prof. Dr. Marcos Arduin pelo auxílio no estudo da anatomia da raiz.
Al-Wakeel, S.A.M., Gabr, M.A., Hamid, A.A. & AbuEl-Soud, W.M. 2007. Allelopathic effects of Acacia nilotica leaf residue on Pisum sativum L. Allelopathy Journal 19(2):411-422. Aliotta, G., Ligrone, R., Ciniglia, C., Pollio, A., Stanzione,
IHERINGIA, Sér. Bot., Porto Alegre, v. 69, n. 1, p. 37-48, julho 2014
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Efeitos alelopáticos de Lagoensia glyptocarpa Koehne sobre Sesamum indicum L., ...
M. & Pinto, G. 2004. Application of microscopic techniques to the study of seeds and microalgae under olive oil wastewater stress. In: Allelopathy – Chemistry and mode of action of allelochemicals (F.A. Macías; J.C.G. Galindo; J.M.G. Molinillo & H.G. Cutler, eds). Editora CRC Press, Washington, p. 289-314. Borella, J. & Pastorini, L.H. 2009. Influência alelopática de Phytolacca dioica L. na germinação e crescimento inicial de tomate e picão-preto. Biotemas 22(3):67-75. Borghetti, F. & Ferreira, A.G. 2004. Interpretação de resultados de germinação. In Germinação do básico ao aplicado (A.G. Ferreira & F. Borghetti, eds.). Ed. Artmed, Porto Alegre, p. 209-222. Carmo, F.M.S.; Borges, E.E.L. & Takaki, M. 2007. Alelopatia de extratos aquosos de canela-sassafrás (Ocotea odorifera (Vell.) Rohwer). Acta Botanica Brasílica 21(3)697-705. Carvalho, P.E.R. 2006. Espécies arbóreas brasileiras. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Informação Tecnológica, Brasília. v.2. 627p. Chaves, N., Sosa, T., Escudero, J.C. 2001. Plant growth inhibiting flavonoids in exudate of Cistus ladanifer and in associated soils. Journal of Chemical Ecology 27:623-631. Einhellig, F.A. 1995. Mechanism of action of allelochemicals in allelopathy. In Allelopathy: Organisms, processes, and applications (Inderjit, K.M.M. Dakshini & F.A. Einhellig, eds.). American Chemical Society, Washington DC, p. 96-116. Escudero, A., Albert, M.J., Pita, J.M. & Pérez-Garcia, F. 2000. Inhibitory effects of Artemisia herba-alba on the germination of the gypsophyta Helianthemum squamatum. Plant Ecology 148:71-80. Ferreira, A.G. & Áquila, M.E.A. 2000. Alelopatia: uma área emergente da ecofisiologia. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal 12:175-204. Gatti, A.B., Perez, S.C.J.G.A. & Lima, M.I.S. 2004. Atividade Alelopática de extratos aquosos de Aristolochia esperanzae O. Ktze na germinação e crescimento de Lactuca sativa L. e Raphanus sativus L. Acta Botânica Brasílica 18 (3): 459-472. Gatti, A.B. Atividade alelopática de espécies do cerrado. 2008, 138 f. Tese de Doutorado, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, São Paulo. Grisi, P.U.; Ranal, M.A.; Gualtieri, S.C.J. & Santana, D.G. 2012. Allelopathic potential of Sapindus saponaria L. leaves in the control of weeds. Acta Scientiarum. Agrononomy 34(1):1-9. Grisi, P.U.; Gualtieri, S.C.J.; Anese, S.; Pereira, V.C. & Forim, M.R. 2013. Effect of Serjania lethalis ethanolic extract on weed control. Planta Daninha 31(2):239-248. Hancock, C.R.; Barlow, H.W. & Lacey, H.J. 1964. The East Malling Coleoptile Straight Growth Test Method. Experimental Botany 15(1):166- 176. Inoue M.H.; Santana D.C.; Souza-Filho A.P.S.; Possamai A.C.S.; Silva L.E.; Pereira M.J.B. & Pereira K.M. 2010. Potencial alelopático de Annona crassiflora: Efeitos sobre plantas daninhas. Planta Daninha 28 (3):489-498
47
IAS. International Allelopathy Society. 2012. Disponível em: http://www.international-allelopathy-society.org. Acesso em: 12.11.2012. Kraus, J.E. & Arduin, M. 1997. Manual básico de métodos em morfologia vegetal. Rio de Janeiro, Seropédica. Editora Universitária Rural, Rio de Janeiro, p. 198. Kubo, I.; Muroi, H. & Himejina, M. 1992. Antimicrobial activity of green tea flavor components and their combination effects. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 40:245-248. Labouriau, L.G. & Valadares, M.B. 1976. On the germination of seeds of Calotropis procera. Anais da Academia Brasileira de Ciências 48:174-186. Labouriau, L.G. 1983. A germinação das sementes. Washington: Departamento de Assuntos Científicos e Tecnológicos da Secretaria Geral da Organização dos Estados Americanos, 174 p. Lorenzi, H. 2002. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas do Brasil. Instituto Plantarum, Nova Odessa, São paulo. 368 p. Macías, F.A.; Galindo, J.C.G.; Molinillo, J.M.G. & Cutler H.G. 2004. Allelopathy: Chemistry and mode of action of allelochemicals .CRC Press, Washington, 372 p. Macías, F.A.; Galindo, J.L.G. & Galindo J.C.G. 2007. Evolution and current status of ecological phytochemistry. Phytochemistry 68:2917–293. Macías F.A.; Oliveiros-Bastidas A.; Marín D.; Carrera C.; Chinchilla N. & Molinillo J.M.G. 2008. Plant biocommunicators: their phytotoxicity, degradation studies and potencial use as herbicides models. Phytochemistry Reviews 7:179-194. Macías, F.A.; Lacret, R.; Varela, R.M.; Nogueiras, C. & Molinillo, J.M.G. 2010. Isolation and Phytotoxicity of Terpenes from Tectona grandis. Journal of Chemical Ecology 36:396-404. Maraschin-Silva, F. & Áquila, M.E.A. 2006. Potencial alelopático de espécies nativas na germinação e crescimento inicial de Lactuca sativa L. (Asteraceae). Acta Botânica Brasílica 20(1): 61-69. Odum, E. Fundamentos de Ecologia. 2007. Thomson, São Paulo. 612 p. Oliveiros-Bastidas A.J. 2008. El fenómeno alelopático. El concepto, las estrategias de estudio y su aplicación en la búsqueda de herbicidas naturales. Química Viva 7(1):1-34. Pina, G.O. 2008. Efeito alelopático do extrato aquoso foliar de Eugenia dysenterica DC. (Myrtaceae – cagaita) na germinação, crescimento e morfo-anatomia de Sesamum indicum L. (Pedaliaceae – gergelim) e Raphanus sativus L. (Brassicaceae – rabanete) 106 f. Tese de Doutorado, Universidade de Brasília, Brasília. Pires, N.M. & Oliveira, V.R. 2001. Alelopatia. In: Plantas daninhas e seu manejo (Oliveira Jr, R.S. & Constantin, J.,Coord.).. Agropecuária, Guaíba. p. 145-185. Santana, D.G. & Ranal, M.A. 2004. Análise da germinação: um enfoque estatístico. Editora Universidade de Brasília, Brasília. 247p. Santos, W.D.; Ferrarese, M.L.L.; Nakamura, C.V.; Mourão, K.S.M.. C.; Mangolin, A. & Ferrarese-Filho, IHERINGIA, Sér. Bot., Porto Alegre, v. 69, n. 1, p. 37-48, julho 2014
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MORAES, L.P.S. DE; GUALTIERI, S.C.J.; LIMA, M.I.S.; GATTI, A.B; PEREIRA, V. C. DE & MIRANDA, M.A.F.M.
O. 2008. Soybean (Glycine max) root lignification induced by ferulic acid. The possible mode of action. Journal of Chemical. Ecology 34(9):1230-1241. Silva, J.; Fortes, A.M.T.; Gomes, F.M.; Pinto, T.T.; Bonamigo, T. & Boiago, N.P. 2011. Alelopatia de Camelina sativa Boiss. (Brassicaceae) sobre a germinação e desenvolvimento inicial de Bidens pilosa (L.) e Glycine max (L.) Merr. Biotemas 24(4):17-24. Souza-Filho, A.P.S. 2006. Proposta metodológica para análise da ocorrência de sinergismo e efeitos potencializadores entre aleloquímicos. Planta daninha, Viçosa 24(3):607-610. Tamimoto, E. 2005. Regulation of root growth by plant
hormones: Roles for auxin and gibberellin. Critical Reviews in Plant Sciences 24:249–265. Waller, G.R. 1999. Introduction. In Recent Advances in Allelopathy (Macías F.A.; Galindo J.C.G.; Molinillo J.M.G. & Cutler H.G., eds.). Universidad de Cádiz, Cádiz. p. 63-70. Weidenhamer, J.D. 1994. Allelopathic potential of menthofuran monoterpenes from Calamuntha ashei. Journal of Chemical Ecology 20:3345-3359. Weir T.; Park S-W. & Vivianco, J.M. 2004. Biochemical and physiological mechanisms mediated by allelochemicals. Current Opinion in Plant Biology 7:472-479.
IHERINGIA, Sér. Bot., Porto Alegre, v. 69, n. 1, p. 37-48, julho 2014
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