Acta Farmacêutica Portuguesa 2014, vol. 3, n. 2, pp. 149-166
Endocitose e tráfego intracelular de nanomateriais Endocytosis and intracellular trafficking of nanomaterials Ferreira L.A.B.1, Radaic A. 1, Pugliese G.O. 1, Valentini M.B. 1, Oliveira M.R. 1, de Jesus M.B.1 ARTIGO ORIGINAL | ORIGINAL ARTICLE
RESUMO Os avanços recentes da nanotecnologia têm aumentado a utilização de nanomateriais e nanodispositivos para diagnose, terapias e outros fins tecnológicos. O conhecimento da interação entre nanomateriais e meios biológicos permite a descoberta de aplicações mais racionais, podendo ajudar a entender e antever seus efeitos adversos e citotóxicos. A endocitose é um processo biológico dependente de energia que está envolvida na internalização de nanopartículas pelas células, e depende de eventos orquestrados que requerem o funcionamento coordenado dos lipídios e proteínas da membrana plasmática. Estudos que visam investigar em detalhes a endocitose e o tráfego intracelular de nanopartículas são indispensáveis para compreensão de mecanismos celulares ainda inexplorados e permitem projetar novas funções, que consequentemente auxiliam na escolha de aplicações biomédicas da nanotecnologia. Nesse contexto, esta revisão visa conceituar as principais vias de endocitose utilizadas no estudo da internalização de nanomateriais em células eucarióticas. Além disso, alguns destinos intracelulares de nanomateriais serão discutidos para auxiliar nos estudos do processamento celular de nanopartículas e desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas. Palavras-chave: Endocitose, nanopartícula, tráfego intracelular
ABSTRACT Recent advances in nanotechnology have increased the use of nanomaterials and nanodevices for diagnostic, therapeutic and other technological applications. The knowledge about the interaction between nanomaterials and biological media allows the development of more rational applications, as well understand and anticipate adverse and toxic effects resulting from this interaction. Endocytosis is an energy-dependent biological process responsible for internalization of nanoparticles, which depends on orchestrated events that require lipids and plasma membrane proteins functioning. Studies that aim to investigate in detail the endocytosis and intracellular trafficking of nanoparticles are essential for understanding cellular mechanisms, which in turn help to select its biomedical applications. In this context, this review aims to conceptualize the main routes of endocytosis used to study the internalization of nanomaterials in eukaryotic cells. In addition, we discuss some intracellular trafficking of nanomaterials to aid in studies of the cellular processing and development of new therapeutic tools. Keywords: endocytosis nanoparticle, intracellular trafficking
Nano-Cell Interactions Lab., Departamento de Bioquimica, Instituto de Biologia CP 6109, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, 13083-970, Campinas, SP, Brasil Autor para correspondência: para correspondência: Marcelo Bispo de Jesus Correio - e-mail:
[email protected] -http://lattes.cnpq.br/9611381402490228
1
Submetido/ Submitted: 2 outubro 2014 | Aceite/Accepted: 15 novembro 2014 © Ordem dos Farmacêuticos, SRP
ISSN: 2182-3340
Ferreira L.A.B., Radaic A. , Pugliese G.O. , Valentini M.B. , Oliveira M.R. , Jesus Correio M.B.
COMO OS NANOMATERIAIS ENTRAM NAS CÉLULAS? Estruturas em escala nanométrica, incluindo
fazer o transporte através de células endoteliais (transcitose)
11–13
. Durante a endocitose, uma
porção da membrana plasmática sofre inva-
nanopartículas, são abundantes na natureza e
ginação e forma uma vesícula lipoproteica na
estão presentes em nosso planeta há bilhões de
porção interior da célula, que é então liberada
anos
. Os exemplos mais comuns nos quais
no citoplasma. Portanto, essa vesícula é consti-
podemos encontrar estruturas em nanoescala
tuída de uma porção da membrana plasmática,
são leite, pólen, fumaça, emissões vulcânicas,
bem como constituintes do meio externo confi-
além de alguns micro-organismos, como vírus e
nados em uma vesícula intracelular (Fig. 1). A
bactérias. A vida na Terra evoluiu em presença
endocitose pode ser classificada em fagocitose
de nanoestruturas, de modo que a interação
e pinocitose. A fagocitose é desempenhada por
e internalização delas não é uma novidade.
células do sistema imunológico, principalmente
Existem até mesmo evidências de um meca-
por fagócitos profissionais, como os monócitos,
nismo de internalização rudimentar em seres
macrófagos, neutrófilos, células dendríticas
mais primitivos como bactérias . O fato da
e mastócitos
interação entre nanomateriais e células não
internalizam materiais exógenos, geralmente
ser um evento recente na natureza nos leva a
com diâmetros maiores que 750 nm, para
pensar que, durante esse tempo, as células
formar um fagossomo que será processado no
desenvolveram mecanismos para internalizar
interior da célula. Já na pinocitose a vesícula
e, muitas vezes, metabolizar nanomateriais
.
endocitada é chamada endossomo e essa via é
Um exemplo disso é a defesa desenvolvida pelas
virtualmente presente em todos os tipos celu-
células contra patógenos intracelulares, seguida
lares. A pinocitose pode ser dividida em endoci-
da co-evolução dos patógenos para desenvolver
tose mediada por clatrina, endocitose mediada
estratégias moleculares para escapar desses
por caveolina, macropinocitose ou endocitose
mecanismos
clatrina-caveolina independentes 5.
1–3
4
7,8
5,6
. Essa co-evolução dificulta o
11,14
. Nesse processo, as células
desenvolvimento sistemas eficientes de carrea-
A internalização de nanopartículas depende
mento de fármacos ou genes para liberação
de eventos orquestrados que requerem o
intracelular . Nas células eucarióticas, animais
funcionamento coordenado dos lipídios e
e vegetais, o principal mecanismo de internali-
proteínas da membrana plasmática.
9
zação, também utilizado pelos nanomateriais, é a endocitose.
Vários aspectos são importantes para determinar a internalização de um nanomaterial,
A endocitose é um processo biológico depen-
como o tipo de interação que ele estabelece com
dente de energia, vital para células eucarióticas
a membrana plasmática, sua forma e compo-
e altamente conservado entre tipos celulares
sição, além de seu tamanho e revestimento 5,14,15.
e espécies. Ela acontece com o dinâmico rear-
A via de internalização será determinada por
ranjo da membrana, dos microtúbulos, dos
uma série de fatores, incluindo as propriedades
filamentos de actina e filamentos intermediá-
físico-químicas dos nanomateriais (tamanho,
rios que são componentes do citoesqueleto da
composição química, carga, funcionalização
maioria das células eucarióticas
da superfície, reatividade superficial, adsorção
10
. Normal-
mente as células utilizam-se da endocitose para
superficial, etc.)
internalizar nutrientes, realizar transdução de
essas vias serão melhor detalhadas e relacio-
sinais, modular a composição da membrana
nadas com a endocitose de nanomateriais.
plasmática, reciclar receptores de membrana e
150
16
. Nas seções seguintes
Acta Farmacêutica Portuguesa, 2014, vol. 3, n. 2
Endocitose mediada por Clatrina
da curvatura da membrana
A endocitose mediada por clatrina (EMC)
revestida por clatrina possui aproximadamente
é um dos mecanismos de internalização em
100-200 nm de diâmetro, sendo formada a
células eucarióticas mais estudados e foi inicial-
partir da constrição da membrana invaginada
mente observado por Roth e Porter em 1964
pela GTPase dinamina, que libera a vesícula no
ao investigarem a endocitose de proteínas em
citoplasma
gema de oocisto do mosquito Aedes aegypti
polimerização de actina e miosina de classe I
. Após alguns anos, Pearse (1975) avaliou a
para gerar a invaginação da membrana, estru-
formação de vesículas em membranas sináp-
turação da vesícula revestida, recrutamento
ticas por microscopia eletrônica, observou
para o citoplasma e cisão da vesícula. Algumas
uma estrutura proteica que revestia as vesí-
proteínas adaptadoras e a proteína miosina
culas em formação, as quais eram capazes de
VI também são essenciais para o transporte
interagir com outras moléculas e serem trans-
das vesículas para endossomos precoces
17
5,24–27
22–24
. A vesícula
. Outro fator importante é a
10
.
portadas para compartimentos celulares espe-
A EMC pode influenciar no destino ou
cíficos. Portanto, Pearse propôs que se tratava
degradação lisossômica de nanomateriais. Esse
de um importante exemplo de uma classe de
fator é relevante quando se utiliza nanopartí-
proteínas, denominando-a de clatrina .
culas como carreadores de fármacos ou genes.
18
A EMC é considerada uma “rota clássica”
de
pela
de fármacos (drug delivery), a forma pela qual
essenciais
a partícula é endocitada pode fazer com que a
para sobrevivência celular. Esta via endocí-
nanopartícula seja degradada pelas enzimas
tica também desempenha papel importante
lisossomais e não chegar ao alvo destinado.
na internalização de complexos de receptores
Estabelecer estratégias para promover o escape
de membrana, transportadores de metais,
dos endossomos e evitar a degradação lisos-
moléculas de adesão e os receptores de sina-
somal é vital para o sucesso da terapia
lização, citocinas, neurotransmissores, pató-
esse motivo, essa via de internalização deve ser
genos, antígenos e lipoproteínas
. Outras
evitada quando o alvo do tratamento não são
funções da EMC incluem a regulação nega-
os lisossomos, ou quando o escape dos endos-
tiva da sinalização celular por internalização
somos não querer a acidificação do endossomo.
absorção
internalização, de
vários
responsável
No uso de nanopartículas para carreamento
nutrientes
19–22
28–30
. Por
ou degradação de receptores e manutenção da homeostase celular, por exemplo, por meio de
Endocitose mediada por Caveolina
bombas de íons de tráfico intracelular
.
A endocitose mediada por caveolina é outro
O mecanismo de formação relacionado
mecanismo que permite a internalização de
com a EMC envolve a formação de uma vesí-
nanopartículas. Caveolinas são proteínas de
cula a partir da polimerização de uma proteína
22-24 kDa incorporadas na porção citosó-
citosólica chamada clatrina-1, que também
lica da membrana plasmática e com porções
requer o auxílio proteínas adaptadoras AP180
N- e C-terminais encontradas voltadas para
e AP-2
o citoplasma
22,24
5,19,20,23
. A clatrina é uma proteína composta
31
. Logo que essas proteínas são
por estruturas denominada trisquélions, que
sintetizadas, elas são inseridas na membrana
possuem três cadeias pesadas (~190 kDa) e
do retículo endoplasmático e levadas pela via
três cadeias leves (~25 kDa). Os trisquélions
secretora do retículo, formam complexos homo
se configuram para gerar uma estrutura hexa-
e heteroligoméricos no complexo de Golgi e
gonal e pentagonal, que propicia a formação
são transportadas para a membrana plasmática
151
Ferreira L.A.B., Radaic A. , Pugliese G.O. , Valentini M.B. , Oliveira M.R. , Jesus Correio M.B.
como conjuntos de aproximadamente 100-200
plasmática liberando o endossomo no cito-
moléculas de caveolina. É importante ressaltar
plasma, são essenciais para a endocitose
que essas proteínas não estão funcionais até a
mediada por. Também têm participação na
sua chagada à membrana plasmática. Ao serem
endocitose mediada por caveolina as proteínas
depositadas na membrana plasmática, onde
de membrana associadas à vesícula (VAMP2 -
desempenham seu papel biológico relacionado
vesicle-associated membrane protein) e proteínas
não só a endocitose, mas também a sinalização
associadas ao sinaptossoma (SNAP - synapto-
celular 31,32.
some-associated protein), que mediam a fusão do
A caveolina é encontrada em invaginações da membrana plasmática em forma de balão com tamanho entre 50-100 nm denominada cavéolas
endossomo com outras vesículas intracelulares, além de outras proteínas como GTPases 39,40. Essa via aparenta ser mais lenta in vitro
. Encontram-se associadas às
quando comparada com a via de EMC. Contudo
cavéolas, microdomínios de membrana enri-
o mais importante é que em alguns casos essa
quecidas com fosfolipídios, esfingolipídios e
via pode evitar a degradação lisossomal
colesterol, conhecidos como lipid rafts
33
41,42
.
. As
Além disso, as vesículas de cavéola transportam
cavéolas são particularmente abundantes em
e se fundem aos caveossomos ou corpos multi-
células endoteliais, nas quais podem consti-
vesiculares (MVBs), que possuem um pH
tuir de 10 a 20% das proteínas da membrana
neutro 5. Por essa mesma razão, acredita-se que
plasmática. São também encontradas em adipó-
esta via é benéfica para a entrega de proteínas
citos, fibroblastos e células de músculo liso
.
e DNA 5. Entretanto, essa visão foi colocada
Por outro lado estão ausentes em neurônios e
em cheque após a descoberta de que os caveos-
leucócitos
, ausentes também em algumas
somos possuem um pH ácido, ao contrário do
linhagens de células tumorais, como a linhagem
que se acreditava e a discussão sobre a endo-
de câncer de próstata PC3
. A caracterís-
citose mediada por caveolina como uma via
tica marcante da cavéola é a presença de uma
facilitadora da entrega de ativos permanece em
proteína de membrana com estrutura grampo
aberto 43,44.
5,37
38
33,34
35,36
chamada caveolina-1 (Cav1), na qual é indis-
Há relatos na literatura de diversos nanoma-
pensável para a formação da cavéola. A Cav1
teriais internalizados pela via da caveolina. Essa
faz com que a cavéola assuma sua estrutura em
via tem atraído grande atenção na nanomedi-
forma de frasco e possa envolver moléculas que
cina por ter sido sugerida como via de escape
se ligam em sua superfície . Até 144 moléculas
à degradação lisossomal
caveolina foram apontadas na incorporação de
endocitose mediada por caveolina é a via fisio-
uma única estrutura caveolar 35. Além da Cav1,
lógica para transcitose. Dessa forma, ela pode
que está presente na maioria das células, há
ser empregada para entrega trans-vascular de
outras isoformas como caveolina-2 (Cav2), a
nanomateriais, por exemplo para a entrega de
qual auxilia e facilita a endocitose, porém não é
ativos no sistema nervoso central, onde há a
essencial para a formação da cavéola; e a caveo-
necessidade de atravessar barreira hematoence-
lina-3 (Cav3), que é expressa especificamente
fálica 32,46–48
5
5,36,45
. Além disso, a
nos músculos estriados cardíacos e esqueléticos33,35.
Macropinocitose
Proteínas como cavina, responsáveis pela
Macropinocitose pode ser definida como a
indução da curvatura da membrana, e dina-
internalização de grandes quantidades de mate-
mina, que realiza a constrição da membrana
rial extracelular, e é caracterizada pela movimen-
152
Acta Farmacêutica Portuguesa, 2014, vol. 3, n. 2
tação da membrana plasmática induzida por uma
diferenciadas, tais como os fagócitos profissio-
ativação global do citoesqueleto de actina. Essa
nais que desempenham papéis significativos
via envolve a transposição de grande quantidade
no sistema imunológico, como a endocitose de
de fluido externo através da formação de ondu-
antígenos e a liberação de corpos apoptóticos e
lações na extensão da membrana plasmática: as
células necróticas. Além disso, tem sido suge-
projeções citoplasmáticas se fundem a membrana
rida como uma via endocítica eficaz para a inter-
como ondas resultando em grandes vacúolos
nalização de drogas nas células. Curiosamente
endocíticos, heterogêneos em tamanho e morfo-
a macropinocitose também pode ser induzida
logia, chamados macropinossomos
por vírus e bactérias. Esses organismos, assim
. Os macropi-
49,50
nossomos oferecem uma rota eficaz para a endo-
como protozoários e príons
citose de macromoléculas não seletíveis e são
ativar essa via para invadir as células hospe-
fáceis de distinguir de outras vesículas formadas
deiras.
52,54,58,59
, podem
durante a pinocitose, uma vez que são estru-
Em relação à internalização de nanopartí-
turas substancialmente maiores (0.5-10 µm), não
culas, foi descrita recentemente a internalização
revestidas e que se encolhem durante a sua matu-
de quantum dots através de macropinocitose
ração intracelular 51.
Nanopartículas mesoporosas de sílica são prin-
60
.
Embora a definição de macropinocitose
cipalmente internalizadas em células Hela por
possa dar a impressão de ser um processo
EMC, entretanto a internalização via macropi-
aleatório, trata-se na verdade de um processo
nocitose mostrou uma liberação mais eficiente
celular muito complexo e bem coordenado
de agentes quimioterápicos nessas células
49
.
61
.
Sabe-se hoje que macropinocitose é um tipo de
Ademais, a macropinocitose é descrita como
endocitose regulada por actina que, ao contrário
uma das principais vias para a internalização de
dos mecanismos de endocitose acima discu-
nanopartículas maiores (> 300 nm) 62.
tidos, não é conduzida diretamente pela carga ou pelos receptores associados
15
. O processo
é geralmente iniciado por estímulos externos através da ativação transiente de receptores
Endocitose independente de Clatrina e Caveolina Atualmente as vias de endocitose mediadas
de tirosina quinases (RTKs), que por sua vez
por
ativam proteínas chave da sinalização celular,
podem ser consideradas vias clássicas, tanto
como Ras, PLC e PI3 quinase. Essas proteínas
pelo conhecimento em torno dessas vias, como
coordenam as mudanças em filamentos de
ferramentas que dispomos para estudá-las.
actina, gerando uma agitação na membrana
Entretanto, as células animais possuem outros
plasmática
e essa perturbação na membrana
mecanismos de endocitose, que atualmente
se projeta sobre os fluidos no meio extracelular.
são menos conhecidos, mas nos últimos anos
Além disso, membros da família Rho e seus
vem se mostrando biologicamente relevante
efetores também são requeridos para ativação
para o funcionamento celular
da maquinaria de polimerização de actina e
estas vias foram caracterizadas em células de
ondulação da membrana plasmática .
mamíferos, mas estudos mais recentes têm
52,53
50
clatrina,
caveolina
e
macropinocitose
63
. Inicialmente,
A macropinocitose tem um papel impor-
mostrado a existência dessas vias também em
tante para a motilidade celular e obtenção de
outros organismos modelos como Caenorhab-
nutrientes, consequentemente, é bastante estu-
ditis elegans, Drosophila melanogaster, Dictyostelium
dada no contexto da progressão e metástase de
discoideum e células vegetais 64–67 e fungos 68.
câncer
54–57
. É importante também para células
Para mamíferos, já foi demonstrado na lite-
153
Ferreira L.A.B., Radaic A. , Pugliese G.O. , Valentini M.B. , Oliveira M.R. , Jesus Correio M.B.
ratura que parte dos produtos extracelulares, cerca de 50% de toda atividade endocitária69, são
internalizados
Glebov et al. (2006)83 colocalizaram floti-
de
lina-1 em cargas endocitadas e mostraram que o
, como fluído extrace-
nocaute de flotilina-1 reduz a internalização da
lular, proteínas ligadas a Glicosilfosfatidilino-
glicoproteína CD59 na subunidade B da toxina
sitol, interleucinas, hormônios de crescimento
de cólera 83. Já Frick et al. (2007)85 demostraram,
entre outros compostos. Tais vias também
através de micrografias eletrônicas, que micro-
são utilizadas para a invasão de patógenos e
domínios ricos em flotilina-1 e flotilina-2 não
toxinas, além de possuírem grande participação
coincidem com invaginações com caveolina-1,
na transdução de sinais celulares .
fortalecendo a ideia de que são vias distintas 85.
clatrina e caveolina
independentemente
relação molecular em suas sequências 84.
11,70,71
72
As vias de endocitose independentes de
Em estudo mais recente, Sorkina et al. (2013)86
clatrina e caveolina vêm sendo constantemente
relatam que os microdomínios de flotilina
exploradas e descritas. Uma série de inibi-
podem funcionar também como moduladores
dores e ferramentas já vem sendo utilizadas
de internalização por clatrina para transpor-
para caracterizar essas vias
. Entretanto,
tador de dopamina (DAT) e propõem as floti-
as distinções entre essas vias ainda não são
linas como moduladores que podem organizar
tão evidentes
e há, ainda, dificuldade em
microdomínios, regulando a mobilidade lateral
encontrar inibidores específicos para carac-
de DAT 86. Entretanto, alguns detalhes molecu-
terizá-las
lares da via, como a dependência ou indepen-
75–78
63,79–81
5,45,73,74
. Dentre as principais formas
alternativas de endocitose podemos destacar:
dência de dinamina permanece em aberto 82.
endocitose mediada por flotilina; endocitose
Para nanomateriais, foi demonstrado que a
mediada por CDC42; endocitose mediada
internalização de compostos catiônicos (como
por Arf6 e endocitose mediada por RhoA4. A
lipídios, poliaminas e peptídeos) pode ser
seguir, cada uma dessas formas de endocitose é
mediada por de flotilina-1
brevemente descrita
plexos catiônicos
87
72
, bem como poli-
. Além desses exemplos, a
participação de flotilina-1 e -2 foi demonstrada Endocitose mediada por Flotilina
na internalização de nanopartículas de sílica em
A família das flotilinas é composta por duas
células epiteliais de pulmão e células endote-
proteínas altamente homólogas – flotilina-1 e
liais 88. Com os avanços nos métodos de estudo
flotilina-2 também denominadas, respectiva-
e a descoberta de novos inibidores para essa via,
mente, de reggie-2 e reggie-1 – que cumprem
em um futuro próximo essa via é forte candidata
várias funções como sinalização celular e inte-
para se juntar as vias clássicas de endocitose.
ração com o citoesqueleto, além da endocitose. Porém não há consenso na literatura com
Endocitose mediada por CDC42
relação aos detalhes moleculares do funcio-
A proteína controladora da divisão celular
namento dessa família de proteínas
. São
42 (Cdc42) é membro da superfamília Ras e,
proteínas associadas a membranas e também
como tal, a Cdc42 interage com diversos subs-
estão ligadas a microdomínios lipídicos, bem
tratos, mas principalmente no crescimento
como as caveolinas. Por isso, flotilinas são
celular, polimerização de actina, mudanças no
consideradas marcadores desses microdomínios
citoesqueleto, processamento de RNA e endo-
lipídicos . Além disso, possuem grande homo-
citose 89.
82
82
logia estrutural quando comparadas à caveolina-1
154
83
, apesar de não possuírem nenhuma
Dentro do seu âmbito de ação, a Cdc42 é responsável pela internalização de proteínas
Acta Farmacêutica Portuguesa, 2014, vol. 3, n. 2
ancoradas
em
Glicofosfatidilinositol
(GPI)
GEEC 90,94–96.
desagrupadas na membrana, como também
Sabharanjak et al. (2002)90 observaram
internalização de grande volume de fluido
grande especificidade nos nanodomínios lipí-
extracelular e toxinas ligadas a lipídios . Cada
dicos formados na via dependente de Cdc42.
vez mais estudos têm demonstrado que esse
Os autores verificaram que proteínas cujas
mecanismo pode constituir uma via alterna-
âncoras de GPI foram trocadas por caudas
tiva a clatrina e caveolina
transmembranares
90
11,90–92
. Nesse caso, o
ou
que
a porção C-terminal da Cdc42, ligando-se aos
excluídas da internalização 90. Porém, o maqui-
lipídios presentes na membrana celular 11, mais
nário celular associado para esta especifici-
especificamente a fosfatidilinositol 4,5-bifos-
dade, a formação do próprio CLIC, sua natu-
fato de sítios enriquecidos com esfingomie-
reza e os papéis de seus efetores principais
linas e colesterol, formando nanodomínios
ainda permanecem obscuros na literatura
.
Esses domínios nanométricos são essenciais
Lu & Low (2002)
citoplasmáticas
não
possuiam
11,92
extensões
proteínas
funcionamento da via endocítica se inicia com
97
foram
11,90
.
relatam que é possível
para a internalização, pois parecem funcionar
utilizar receptores de folato para internali-
como sinalizadoras deste mecanismo de inter-
zação de nanomateriais. Os receptores de folato
nalização , além de serem sensíveis à remoção
são proteínas ancoradas por GPI e, uma vez
de colesterol da célula .
ativados, internalizariam através da via Cdc4297.
91
90
Com a formação dos nanodomínios, há
A partir dessa ideia, Dixit et al. (2006)98 produ-
o recrutamento das proteínas de membrana
ziram nanopartículas de ouro conjugadas com
para
domí-
polietilenoglicol (PEG) modificado por ácido
nios maiores nos quais a endocitose aparenta
fólico e demonstraram internalização destas
ocorrer
nanopartículas em células de câncer mas não
regiões 11,90
específicas,
formando
. Curvaturas da membrana ou de
vesículas iniciais, são mediadas primariamente
significativa em linhagens não-cancerígenas
por carreadores independentes de clatrina
Entretanto, a relação entre os nanomateriais
(CLIC, do inglês, clathrin independent carrier) e
e essa via de internalização ainda carece de
caveolina
. Essas curvaturas e vesículas se
estudos e há poucas referências na literatura o
fundem e formam um compartimento endos-
papel e a relevância dessa via de internalização.
11,90
98
.
somal enriquecido com proteínas ancoradas por GPI (também denominado de GEEC ou GPI-
Endocitose mediada por ARF6
-Enriched Endocitic Compartiment). Neste ponto, a
O fator 6 de ribosilação em adenosina difos-
Cdc42 sinaliza para a polimerização de actina,
fato (ARF6) pertence também à superfamília
gerando a invaginação alongada característica
Ras de pequenas proteínas ligantes de GTP.
desta via endocítica .
Essa proteína interage e influencia diversos
90
Essa via aparenta ser independente de dina-
processos celulares, tais como o tráfego trans-
mina, clatrina, caveolina, RhoA e receptor de
membranas e remodelamento da actina no
interleucina-2β
citoesqueleto 99.
90,93
. Há inclusive, relatos na
literatura de que ela pode se destinar não só
A via endocítica dependente de ARF6 tem
para endossomos, como nas vias dependentes
sido descrita como uma das principais vias
de clatrina e caveolina, mas também para o retí-
independente de clatrina e caveolina
culo endoplasmático e/ou para o complexo de
pois para esta via tem sido demonstrado a
Golgi. Entretanto, ainda há grande discussão
internalização de diversos substratos com
sobre qual o destino final das vesículas CLIC/
várias atividades celulares distintas, tais como
63,100,101
,
155
Ferreira L.A.B., Radaic A. , Pugliese G.O. , Valentini M.B. , Oliveira M.R. , Jesus Correio M.B.
Figura 1. Principais vias de endocitose de nanopartículas em células eucarióticas. A etapa inicial representa principais vias de endocitose usadas para o estudo da internalização de partículas, que tem como consequência a formação de vesículas intracelulares - fagocitose, macropinocitose, endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolina e endocitose clatrina e caveolina independentes (flotilina e Glic-Glec). A segunda etapa representa a via clássica de tráfego intracelular que envolve o processamento das nanopartículas a partir do amadurecimento do endossomo precoce, com destino à degradação lisossomal do material endocitado.
proteínas CD59 ligada a GPI, enzima carboxi-
dade,102–106. A super-expressão de ARF6 resulta
peptidase E, receptor metabotrópico de gluta-
na produção de ondulações na membrana e
mato 7, proteína E de adesão dependente de
induz macropinocitose
cálcio (E-caderina), integrinas e proteínas
internalização aparenta ser distinto das estru-
do complexo principal de histocompatibili-
turas encontradas na via CLIC/GEEC 11,99.
156
103
. Esse aparato de
Acta Farmacêutica Portuguesa, 2014, vol. 3, n. 2
A endocitose dependente de ARF6 aparenta
O mecanismo da via é semelhante ao da
ser independente de dinamina e seus endos-
Cdc42
somos podem se comunicar com comparti-
mente, porém já foi demonstrado que são
mentos positivos com transferrina, endossomos
mecanismos distintos, pois algumas proteínas
positivos para Rab-5, o canal de potássio Kir3-4
chaves desta via, como a própria RhoA, a dina-
e a via de reciclagem dependente de ARF6
,
mina e os receptores de Interleucina-2γ (sem
através da qual grande parte das proteínas
as quais esta via é inibida), não estão presentes
endocitadas podem voltar à membrana plasmá-
para a via Cdc42 11,27,67,89,91,109,111.
11,106
tica .
(CLIC/GEEC)
explicitado
anterior-
Essa via, quando ativa, provoca o recruta-
99
Nesse caso, o modo de formação vesicular
mento de receptores de interleucinas-2γ através
proposto é similar ao descrito para CLIC/GEEC.
da formação de microdomínios lipídicos
Arf6 ativa a enzima fosfatidilinositol 4-fosfato
Neste ponto, a retirada de esfingolipídios e
5-quinase que é responsável por gerar mais
colesterol interrompe a internalização11,68,111.
fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato. Então, Arf6, se
Inicialmente, há curvatura da membrana ou
liga ao Fosfaditilinositol 4, 5-bifosfato produ-
vesículas iniciais, que são mediadas primaria-
zido, modificando a estrutura da membrana
mente por carreadores ou proteínas que auxi-
99
,
113
.
e recruta proteínas membranares para o sítio
liam na sua formação
em questão. Arf6 também se liga e ativa fosfo-
vesículas se fundem, então, formando um
lipase D, enzima que hidrolisa fosfatidilcolinas
compartimento endossomal enriquecido com
em ácido fosfatídico, provocando perturbações
domínios lipídicos e os receptores. Após isso,
na membrana plasmática
. Todas essas
a proteína RhoA sinaliza para a modificação
modificações facilitam a formação da inva-
do citoesqueleto, gerando a invaginação na
ginação e das vesículas
99,107–110
26
. Essas curvaturas/
. Por último, Arf6
membrana plasmática. As invaginações depen-
modula e modifica as fibras de actina, formando
dentes de RhoA se mostram uniformes e com
a invaginação e a vesícula endocitária
tamanhos entre 50-100 nm
99
99
.
26
. Até o presente
Apesar da vasta gama de produtos interna-
momento, a dinamina aparenta ser necessária
lizados por essa via e a sua importância celular,
para a cisão de invaginação, transformando-a
ainda é necessário identificar as proteínas
numa vesícula endossômica 11,111–113.
diretamente ligadas com a Arf6 e auxiliam na modulação da via
Iversen et al. (2012)60 demonstrou que a
. Até o momento, não foi
internalização de quantum dots associados
encontrado relatos de internalização de nano-
com ricina acontece de forma independente
materiais através esta via.
de RhoA60 e dependente de CAM
99
114,115
. Isso
ressalta que ainda são necessários novos Endocitose mediada por RhoA
estudos para elucidar não só o mecanismo de
A função da proteína RhoA está atrelada
operação da via dependente de RhoA, assim
à reorganização do citoesqueleto e polimeri-
como outras proteínas correlatas 26, o que pode
zação de actina 111. Encontra-se associada com a
auxiliar na aplicação desta via como forma de
regulação e controle de vesículas revestidas de
internalização de nanomateriais.
clatrina em células HeLa, inibindo a internalização quando ativadas, assim como a estimu-
O QUE ACONTECE COM OS NANOMATERIAIS
lação e perturbações na membrana plasmática
DEPOIS QUE ENTRAM NAS CÉLULAS?
112
e está intimamente ligada com a internalização de receptores de interleucina-2ß
113
.
Como discutido anteriormente, o material endocitado encontra-se confinado em uma
157
Ferreira L.A.B., Radaic A. , Pugliese G.O. , Valentini M.B. , Oliveira M.R. , Jesus Correio M.B.
vesícula lipoproteica no citoplasma. Portanto,
escapar do endossomo. Isso pode ser alcançado
essa vesícula é constituída de uma porção
através da funcionalização do nanomaterial,
da membrana plasmática, bem como consti-
que pode desempenhar um importante papel
tuintes do meio externo confinados em uma
na reorientação da partícula para subcompar-
vesícula intracelular (Figura 1). Através de
timentos celulares específicos. A alteração de
uma série de eventos de fusão e fissão, seu
carga de superfície é uma das alternativas para
conteúdo passa por um processo de maturação
escapar do lisossomo, promovendo a interação
que envolve a diminuição do pH no lúmen da
direta das nanopartículas com a membrana
vesícula e a fusão com endossomos tardios até,
endossomal devido à inversão seletiva da carga
por fim, chegar aos lisossomos, onde ocorre a
de superfície (aniônica para catiônica)
degradação do material endocitado. É impor-
funcionalização com uma amina na superfície
tante ressaltar que diferentes modelos foram
da partícula é um exemplo que pode auxiliar
propostos para explicar como o material endoci-
na liberação do material endocitado através de
tado passa de endossomo a lisossomo. Há pelo
um evento denominado “esponja de prótons¨
menos quatro teorias, i. maturação, ii. vesicular,
que, através da protonação da amina (pK ≈ 6)
iii. transferência de conteúdo (kiss-and-run) e
no ambiente ácido do endolisossomo, leva a um
iv. modelo híbrido, que podem explicar esse
influxo de íons de cloro e de água, promovendo
processo, a discussão a fundo dessas teorias
um desequilíbrio osmótico, propicia o inchaço
foge do escopo dessa revisão (para maiores
do endolisossomo, pode levar a uma desor-
detalhes ver
). Entretanto essa é uma área
ganização momentânea da membrana endos-
em pleno desenvolvimento e os conhecimentos
somal e consequente liberação do conteúdo do
gerados por ela terá impactos significativos no
endossomo
transporte intracelular de nanomateriais. A
do endossomo inclui a conjugação de nano-
rota clássica (endossomo precoce, endossomo
partículas com proteínas fusogênicas como a
tardio, lisossomos) não é a única via de tráfego
melitina, que propicia a fusão de lipídios de
intracelular para os materiais endocitados. Esse
membrana entre duas vesículas opostas, aproxi-
processo depende de diversos fatores como a
mando proteínas e lipídeos de membrana e leva
natureza química das nanopartículas, além de
a uma fusão do conteúdo luminal sem lise28,127.
essas propriedades a distribuição intracelular
Outra estratégia interessante é a utilização
de nanopartículas é dependente da linhagem
de moléculas fotossensíveis, pois a radiação
celular estudada e também de tempo de expo-
eletromagnética pode provocar a libertação
sição e das linhagens celulares 119–122.
dessas moléculas endocitadas para o citoplasma
116–118
125,126
125
. A
. Outra estratégia para escapar
A acidez e a presença de uma variedade
e contidas nas vesículas. Nesse processo, as
de enzimas líticas fazem dos lisossomos uma
membranas endossomais são altamente danifi-
estação de degradação de materiais endocitado,
cadas pela utilização fotossensibilizadores anfi-
uma vez que a degradação lisossomal é uma das
fílicos e o resultado é a subsequente libertação
maiores barreiras para as estratégicas terapêu-
das nanopartículas aprisionadas para o citosol,
ticas intracelulares
como observado para a liberação de LDL intra-
9,10,123,124
. Como a maioria
das aplicações de nanotecnologia não tem
celular de nanopartículas lipoproteicas 128.
como objetivo o lisossomo, com exceção do
Após o escape lisossômico, muitas estraté-
tratamento de algumas disfunções lisossomais
gias também são utilizadas para determinar o
como a doença de Niemann-Pick, é necessário
destino final de um nanopartícula. As nanopar-
que o as terapias se valham de estratégias para
tículas podem se direcionar para diversas orga-
158
Acta Farmacêutica Portuguesa, 2014, vol. 3, n. 2
Figura 2. Principais proteínas residentes e marcadores de organelas no tráfego de nanopartículas. A figura ilustra alguns exemplos de proteínas utilizadas para o estudo dos destinos intracelulares de nanopartículas - Endossomos precoces: Rab4, Rab5, e EEA1; Endossomo tardio: Rab7; Lisossomos: Lamp1 e Lamp2; Endossomo de reciclagem: Rab11; Exossomos: CD63 e Hsc70; Complexo de Golgi: Giantina, GM130 e TGN38; Retículo endoplasmático: Calnexina.
nelas e isso dependerá de sua estabilidade frente
para determinar a promoção de suas aplica-
a degradação lisossomal
ções131. O conhecimento do destino intrace-
físico-químicas
10,129
, características 130
lular de nanopartículas é muito importante na
e afinidade nanopartícula-organela . O destino
avaliação do efeito citotóxico, ou então, para o
intracelular de uma nanopartícula pode ser de
diagnóstico e terapia de diversas enfermidades.
modo específico (nanopartícula-organela alvo),
Para estudar esse processo de tráfego intrace-
ou então de modo inespecífico para diversas
lular ou mesmo o destino intracelular de um
organelas simultaneamente, por exemplo o
nanomaterial, diversos marcadores de orga-
núcleo, complexo de Golgi, retículos endo-
nelas ou estruturas vem sendo desenvolvidas.
plasmáticos, mitocôndria, entre outros
.
A Figura 2 resume os alvos desses marcadores.
Os estudos que visam investigar o tráfico
Essas estratégias utilizam-se de proteínas resi-
intracelular de nanopartículas são essenciais
dentes ou marcadores de organelas, como
119
, tempo de internalização 28
28,130
159
Ferreira L.A.B., Radaic A. , Pugliese G.O. , Valentini M.B. , Oliveira M.R. , Jesus Correio M.B.
Rab4, Rab5, e EEA1 para endossomos precoces;
internalizadas por mais de uma via (por ex.
Rab7 para endossomos tardios; Rab11 para
clatrina e caveolina) o que pode resultar em
endossomos de reciclagem; CD63 e Hsc70 para
respostas biológicas distintas, uma vez que uma
exossomos; Giantina, GM130 e TGN38 para
via pode levar a uma degradação mais eficiente.
complexo de Golgi, Calnexina para retículo
Esses fatores devem ser levados em conside-
endoplasmático e Lamp1 e Lamp2 para lisos-
ração no estudo da interação das nanopartículas
somos. Geralmente são empregadas técnicas
com o ambiente celular. Essa é uma área multi-
de microscopia (de fluorescência, eletrônica,
disciplinar que apesar de não ser completa-
de força atômica), principalmente microscopia
mente compreendida atualmente está em pleno
confocal, para a colocalização de organelas e
desenvolvimento, bem como as técnicas e ferra-
nanomateriais, para assim traçar o caminho
mentas utilizadas nessa área, da qual espera-se
percorrido nas células.
no futuro próximo grandes descobertas e uma importante contribuição para uma aplicação
CONSIDERAÇÕES FINAIS
segura e eficiente de nanomateriais.
A produção de nanomateriais vem se tornando cada vez mais expressiva, portanto, concomitantemente há uma crescente preo-
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Na maioria das vezes, as nanopartículas são
160
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