ENRAIZAMENTO in vitro DO PORTA-ENXERTO DE Prunus SP. ‘BARRIER’ EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ÁCIDO INDOL-3-BUTÍRICO (AIB) E DO MEIO MURASHIGE & SKOOG (MS) In vitro ROOTING OF Prunus SP. ROOTSTOCK ‘BARRIER’IN DIFFERENT INDOL BUTYRIC ACID (IBA) AND MURASHIGE & SKOOG MEDIUM CONCENTRATIONS (MS) 1
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COUTO, Marcelo ; WAGNER JÚNIOR, Américo ; QUEZADA, Alberto C. RESUMO Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência do ácido indol-3-butírico (AIB) no enraizamento “in vitro” do porta-enxerto de Prunus sp. ‘Barrier’, utilizando diferentes concentrações de sais do meio ‘MS’ (MURASHIGE & SKOOG, 1962). Foi utilizado o delineamento experimental em blocos casualizados com quatro repetições, sendo cada parcela constituída por um frasco contendo quatro explantes, num esquema fatorial 3 x 5, sendo o fator meio cultura com os níveis (MS, 1/2 MS e 3/4 MS) e concentrações de AIB com os níveis (0,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0 µM). Aos 34 dias após a instalação foram avaliadas as características porcentagem de enraizamento, número de raízes, de calos e comprimento de raízes. Os melhores resultados foram obtidos com a utilização de 10 µM de AIB, sendo que as diferentes concentrações de sais do meio ‘MS’ não influenciaram no enraizamento do porta-enxerto de pessegueiro ‘Barrier’. Palavras-chave: Prunus.
Micropropagação,
AIB,
Auxina,
Pêssego,
INTRODUÇÃO O porta-enxerto ‘Barrier’ é um híbrido entre Prunus davidiana e P. persica, originário da Itália. Possui um sistema radicular forte e profundo. Adapta-se bem a vários tipos de solo, inclusive em situação de replantio. É tolerante a asfixia radicular, assim como a nematóides do gênero Meloidogyne (FELIPE, 1994). O processo de propagação sexuada, para obtenção de porta-enxertos, tem como principal desvantagem à diversidade genética devido à alta segregação que pode levar à variabilidade no crescimento e na performance da cultivar copa (ALMEHDI & PARFITT, 1986). Desta forma, a micropropagação representa uma excelente ferramenta para obtenção de porta-enxertos clonais. No enraizamento in vitro, a regeneração das raízes ocorre em meio artificial sob condições assépticas, a partir de explantes, possibilitando assim, a manutenção das características genéticas idênticas as da planta mãe (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). O uso de auxinas na cultura de tecidos tem como finalidade atuar na expansão e elongamento celular, bem como na divisão celular com reflexos no enraizamento. Fazem-se referências que o ácido naftaleno acético (ANA) parece ser a auxina mais eficaz para estimular o enraizamento in vitro, cujas concentrações adequadas variam entre 0,1 a 1,0 -1 (KRIKORIAN, 1991). Para GRATTAPAGLIA & mg L
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MACHADO (1998), as auxinas mais utilizadas são o ácido indol-3-butírico (AIB), ácido naftaleno acético (ANA) e o ácido indol acético (AIA). O uso de outras substâncias de crescimento não é necessário, podendo ser prejudicial à multiplicação. Segundo ANTONELLI & CHIARIOTTI (1988) no enraizamento in vitro do pessegueiro existe uma forte resposta do genótipo ao meio, devido às diferentes exigências nos níveis hormonais. Os meios de cultura constituídos de altas concentrações de sais inibem todas as fases do enraizamento, principalmente o crescimento das raízes, mesmo com a presença de auxinas. Várias concentrações de sais são utilizadas no enraizamento 1 1 1 in vitro, sendo mais usuais as diluições de /2, /3 e /4 da concentração salina do meio ‘MS’ (MURASHIGE & SKOOG, 1962; ZIMMERMAN & BROOME, 1982; DRUART et al. 1982; ANDERSON, 1984; VALLES & BOXUS, 1987). O ideal é buscar um meio e uma condição física que permitam o transcorrer normal das etapas de enraizamento, ocorrendo a indução in vitro, diferenciação e o alongamento no substrato de transplantio. Também é importante o aspecto econômico, através da redução no período de enraizamento in vitro, o que pode levar ao melhor desenvolvimento do sistema radicular (ZIMMERMMAN & FORDHAM, 1985). Este trabalho teve como objetivo avaliar a influência do AIB no enraizamento in vitro do porta-enxerto de Prunus sp. ‘Barrier’, utilizando diferentes concentrações de sais do meio ‘MS’.
MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos, da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Centro de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado (Embrapa – CPACT), Pelotas - RS (latitude de 32°45’ Sul, longitude de 52°30’ Oeste e altitude de 220 metros), em maio de 2002. Foram utilizados explantes do porta-enxerto ‘Barrier’ (Prunus davidiana x P. persica) micropropagados in vitro. O 2 material foi multiplicado em meio /3 MS (MURASHIGE & -1 SKOOG, 1962), contendo 0,3 mg L de BAP, acrescido de -1 -1 tiamina 0,5 mg L , piridoxina 0,5 mg L , ácido nicotínico 1,0 -1 -1 -1 mg L , glicínia 2,0 mgL , ácido cítrico 0,5 mg L , ácido -1 -1 -1 ascórbico 10 mg L , mio-inositol 100 mg L , agar 6,0 g L e -1 sacarose 30 g L . O pH foi ajustado para 5,8. Os explantes permaneceram neste meio por 35 dias, quando então
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Eng° Agr°, Mestrando em Agronomia – Fruticultura de Clima Temperado. FAEM/UFPel. Pelotas – RS. Bolsista CAPES. e-mail:
[email protected]; 2 Eng° Agr°, Doutor. Pesquisador convênio IICA/EMBRAPA. e-mail:
[email protected] (Recebido para Publicação em 22/10/2002, Aprovado em 13/10/2003) R. bras. Agrociência, v. 9, n. 4, p. 367-370, out-dez, 2003
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apresentaram tamanho adequado para enraizamento (10 a 15 mm). Foram inoculados quatro explantes em frascos de 250 ml, contendo 40 ml do meio de cultura MS nas concentrações 1 3 /2, /4 e 1, combinadas com cinco concentrações de ácido indol-3-butírico (AIB) (0,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0 µM), acrescidos -1 -1 de piridoxina 1,0 mg L , tiamina 10 mgL , ácido ascórbico 10 -1 -1 -1 mg L , ácido nicotínico 1,0 mg L , mio-inositol 500 mg L , -1 -1 agar 6,0 g L , sacarose 30 g L . O pH foi ajustado para 5,8 antes da colocação do agar. Após a inoculação, os explantes foram transferidos para sala de crescimento sob condições controladas, com -2 -1 intensidade luminosa de 20 µ Em s , fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25±2ºC. O delineamento experimental utilizado foi em blocos casualizados com quatro repetições, sendo cada unidade experimental constituída por um frasco contendo quatro explantes, num esquema fatorial 3 x 5, sendo o fator meio de 1 3 cultura com os níveis (MS, /2 MS e /4 MS) e concentrações de AIB com os níveis (0,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0 µM). Aos 34 dias após a instalação, foram avaliadas as seguintes variáveis: porcentagem de enraizamento (transformado para arc sen x / 100 ); número de calos e de raízes formados (transformados para log (x + 1) e x + 1 , respectivamente), e comprimento das raízes. Os dados foram avaliados através da análise de variância e comparação de médias pelo teste de Duncan (α = 0,05), sendo que todas as análises correspondentes foram efetuadas através de programa SANEST (Sistema de Análise Estatística para Microcomputadores (ZONTA & MACHADO, 1984).
RESULTADOS E DISCUSSÃO Pode-se observar que, com a adição de auxinas ao meio de cultura, houve aumentos na porcentagem de enraizamento dos explantes do porta-enxerto híbrido de pessegueiro ‘Barrier’ (Figura 1). a b c d
ZIMMERMAN & FORDHAM (1985) observaram que a ausência completa de sais MS para indução de enraizamento é utilizada, com sucesso, em macieira, em meio simples de sacarose e auxina, verificando-se uma tendência de aumentar a sua taxa com a redução desses sais, o que não foi observado neste trabalho. As diferentes concentrações salinas do meio MS não influenciaram no enraizamento do porta-enxerto ‘Barrier’, entretanto, as maiores concentrações de auxinas estimularam a formação de raízes. DANTAS et al. (2000) verificaram um melhor enraizamento em amoreira (Rubus sp.), utilizando concentrações mais baixas dos sais de MS, apresentando 1 melhor porcentagem (75%) em meio com /4 de sais de MS. Na presença de auxinas, as altas concentrações de sais inibiram todas as fases de enraizamento. Este fato não foi comprovado no enraizamento do porta-enxerto ‘Barrier’. HARADA & MURAI (1996) adicionaram 1 µM de ANA ao meio WPM e obtiveram 64,5% de enraizamento em Prunus mume, ao passo que a maior porcentagem de enraizamento deste porta-enxerto foi de 33,33% na presença de 5 µM de AIB. Utilizando ANA, esses autores verificaram que o maior número de raízes (3,0) foi obtido com a concentração de 10 µM e com a mesma concentração de AIB apenas uma raiz se formou. Esta variação de resposta foi verificada neste trabalho, no qual os melhores resultados de enraizamento foram obtidos a 10 µM de AIB, variação esta corroborada por PARFITT & ALMEHDI (1986) e ANTONELLI & CHIARIOTTI (1988) no enraizamento do pessegueiro. Os melhores resultados para a variável número de raízes foram obtidos nas concentrações mais elevadas de AIB (10 µM), sendo superior estatisticamente aos demais. As maiores quantidades médias de raízes (2,94) foram obtidas com os explantes inoculados em meio de cultura com 10 µM de AIB (Figura 2). c
b
a
d
e e
Figura 1 - Porcentagem média de enraizamento em explantes do porta-enxerto híbrido de pessegueiro ‘Barrier’, sob diferentes concentrações de AIB. Colunas seguidas de mesma letra, não diferem entre si, pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. O porta-enxerto ‘Barrier’ respondeu positivamente ao aumento das concentrações de AIB. Os melhores resultados foram obtidos nos níveis mais elevados de AIB, sendo que a concentração de 10 µM foi superior às demais.
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Figura 2 – Número médio de raízes primárias em explantes do porta-enxerto híbrido de pessegueiro ‘Barrier’, sob diferentes concentrações de AIB. Colunas seguidas de mesma letra, não diferem entre si, pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. Resultados semelhantes foram obtidos por SCZEPANSKI (2001) testando três concentrações de ANA e AIB e duas concentrações de sais do meio MS durante o enraizamento in vitro do porta-enxerto de ameixeira ‘Mirabolano’ (Prunus cerasifera), onde foram obtidas a maior quantidade de raízes (1,64) e maior crescimento das mesmas, 2 -1 usando /3 dos sais de MS e 0,5 m L de AIB. Assim verificouse que o uso de auxinas no meio de cultura foi determinante
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na formação de raízes, pois nos tratamentos sem a presença dessas substâncias, os explantes não apresentaram raízes. ZIMMERMAN (1984); ZANOL & FORTES (1995); PASQUAL & LOPES (1991) concluíram que concentrações entre 2,0 a 5,0 µM de AIB são importantes para indução das raízes em porta-enxertos do gênero Prunus. Já HASEGAWA (1980) demonstrou que existe um efeito de interação entre auxinas e concentrações de sais de MS, os quais podem aumentar significativamente o número de raízes. Este efeito não foi comprovado no enraizamento do portaenxerto ‘Barrier’, onde a interação entre concentrações de MS e AIB, não foi significativa estatisticamente. Neste trabalho, observou-se que, na ausência de AIB, nos diferentes meios de cultura, não houve a formação de calos. Entretanto, as concentrações mais elevadas dos sais de MS e de AIB (10,0 µM) estimularam a maior formação de calos. Segundo JAMES (1993), as auxinas estão associadas à diferenciação celular que pode dar origem aos primórdios
radiculares, todavia, após esta fase, inibem a elongação celular e provocam a proliferação desordenada de células formando calos. Assim como o tipo e a concentração das substâncias de crescimento utilizadas, o meio de cultura também pode influenciar no enraizamento in vitro das plantas. Neste trabalho, observou-se uma maior influência das diferentes concentrações de AIB no enraizamento in vitro das plântulas de ‘Barrier’ do que propriamente o meio de cultura. Entretanto, na variável número de calos formados, ocorreram também influências dos diferentes meios de cultura utilizados (Tabela 2). O sucesso de enraizamento não depende apenas do percentual de enraizamento obtido, mas também do número e da qualidade das raízes formadas (SCZEPANSKI, 2001). Pode se observar na Figura 3, o padrão de qualidade dos explantes de “Barrier” enraizados em diferentes níveis de meio ‘MS’, com diferentes concentrações de AIB.
Tabela 1 - Efeito de diferentes concentrações de sais do meio MS e de AIB na formação de calos no enraizamento in vitro do portaenxerto híbrido de pessegueiro ‘Barrier’. Meios/AIB 0,0 µM 2,5 µM 5,0 µM 7,5 µM 10,0 µM MS 0,0 a E 0,61 a D 2,53 a C 3,36 a B 3,60 a A 3 /4 MS 0,0 a E 0,44 b D 1,37 b C 1,68 b B 3,09 b A 1 /2 MS 0,0 a E 0,32 c D 0,83 c C 1,65 c B 2,36 c A Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas não diferem entre si, pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade. rooting; number of roots and length of roots; callus formation. Best results of rooting were achieved for rooting of rootstock ‘Barrier’, with 10 µM of IBA. The different salt concentrations of ‘MS’ medium did not influence the rooting. Key words: Micropropagation, IBA, Auxin, Peach, Prunus.
REFERÊNCIAS
Figura 3 –
Padrão dos explantes do porta-enxerto de pessegueiro Barrier, após 34 dias em meios de enraizamento com diferentes concentrações de AIB.
CONCLUSÃO As diferentes concentrações de sais do meio ‘MS’ não influenciam no enraizamento do porta-enxerto ‘Barrier’. Os melhores resultados de enraizamento são obtidos com a utilização de 10 µM de AIB nos diferentes meio de cultura. ABSTRACT The purpose of this work was to evaluate the effect of índole-3butyric acid (IBA) in the “in vitro” rooting of peach rootstock ‘Barrier’ (Prunus sp.), using several concentrations of ‘MS’ (MURASHIGE & SKOOG, 1962) medium salts. The experiment was designed in a completely randomized block with four replications, where each plot was constituted of one flask, with four explants, in a 3 x 5 factorial design,
the factors being salts concentrations with levels (MS, 1/2 MS e 3/4 MS) and IBA concentrations (0.0; 2.5; 5.0; 7.5 e 10.0 µM). After 34 days of installation, the following parameters were evaluated: percentage of
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