[Evaluation of biocidal properties of silver nanoparticles against cariogenic bacteria]

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 197 - 206

Ocena bakteriobójczej aktywności koloidalnego roztworu nanocząstek srebra w stosunku do bakterii próchnicotwórczych Evaluation of biocidal properties of silver nanoparticles against cariogenic bacteria Rafał Pokrowiecki1, Tomasz Zaręba2, Agnieszka Mielczarek4, Agnieszka Opalińska5, Jacek Wojnarowicz5, Marcin Majkowski6, Witold Łojkowski5, Stefan Tyski2,3 Szpital Kliniczny Dzieciątka Jezus w Warszawie, Zakład Antybiotyków i Mikrobiologii Narodowego Instytutu Leków w Warszawie 3 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w Warszawie 4 Zakład Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii - Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w Warszawie 5 Instytut Wysokich Ciśnień, PAN, Laboratorium Nanostruktur Dla Fotoniki i Nanomedycyny w Warszawie. 6 Prywatna Praktyka Lekarska 1

2

W ciągu ostatnich kilku lat pojawiło się wiele doniesień naukowych opisujących właściwości nanocząstek srebra polegających na hamowaniu przez nie wzrostu wielu szczepów bakterii, grzybów i wirusów. Wyniki badań szeregu autorów wskazują na zasadność zastosowania nanocząstek srebra w przemyśle medycznym, farmaceutycznym, spożywczym oraz odzieżowym w celu zmniejszenia ryzyka mikrobiologicznej kontaminacji produktów i nadania im miejscowych właściwości bakteriobójczych. Związki srebra stosowane są w stomatologii od wielu lat, lecz nie są wolne od działań niepożądanych. W przeprowadzonych badaniach wykazano, że nanocząstki srebra w postaci roztworu koloidalnego o średniej wielkości cząstek 67 nm i kształcie kulistym wykazują działanie bakteriobójcze w stosunku do próchnicotwórczych szczepów: S. mutans, S. sanduis, S. salivarius i S. mitis. Efekt działania zależy od czasu kontaktu i stężenia nanocząsteczek srebra. Słowa kluczowe: choroba próchnicowa, nanotechnologia, srebro, nanocząstki, bakterie próchnicotwórcze

198

R. Pokrowiecki i inni

Nr 3

ABSTRACT Introduction: Antimicrobial properties of silver nanoparticles (SNP’s) have been recently well evaluated, and now are being considered as excellent candidates for therapeutic purposes. It is confirmed, that various solutions of colloidal SNP’s possess significant antibacterial properties against such species as: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa even at low concentrations, although there have been so far only a few researches evaluating antimicrobial activity of SNP’s against cariogenic bacteria: Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius and Streptococcus mitis responsible for initiation of dental carries. Tooth decay is infectious disease an worldwide, which may occur in patients of every age. Nanotechnology creates a new approach of designing of medical devices preventing or reducing bacterial colonization. Methods: Colloidal silver solution (CSS) of concentration 350 ppm was used in this research. Nanoparticles size, shape and solution stability were evaluated. 16 strains of cariogenic bacteria, 4 isolates of each species: S. mutans, S. salivarius, S. sanguinis and S, mitis were obtained from plaque swabs of 7 patients treated for dental carries at Department of Conservative Dentistry, Medical University of Warsaw. MIC and MBC values for CSS’s were evaluated. Results: CSS used in this research is of good stability. No agglomeration or coalescence was observed during 24 hours of experiment. Silver nanoparticles were of round shape and had mean size of 67 nm. MIC values were: 12-25 ppm for S. salivarius, 25 ppm for S. sanguinis, 50-100 ppm for S. mitis and 50 ppm for S. mutans, while MBC values after 1 hour of bacterial contact with nanoparticles were 200-350 ppm for all cariogenic bacterial species. After 24 hours of contact MBC values were: 25-50 ppm for S. salivarius and S. sanguinis, 100-200 ppm for S. mitis and 200 ppm for S. mutans. Conclusions: Antimicrobial properties of CSS depend on nanoparticles concentration and interaction time with bacteria. The susceptibility of cariogenic oral streptococci to silver nanoparticles is diversified. Sufficient concentration which inhibited all cariogenic bacteria in our research was 200 ppm after long (24 hours) period of silver nanoparticles interaction with bacteria. Key words: dental carries, nanotechnology, silver, nanoparticles, cariogenic bacteria.

WSTĘP W związku ze stale rosnącą liczbą drobnoustrojów opornych na współcześnie stosowane antybiotyki oraz obserwowane niekiedy ich działania niepożądane, konieczne jest poszukiwanie nowych, rozwiązań w zakresie profilaktyki i leczenia zakażeń bakteryjnych (8, 12, 18). Dynamiczny rozwój nanotechnologii umożliwia wytwarzanie innowacyjnych rozwiązań w zakresie biochemii, farmacji, techniki i medycyny. Terminem „nano” można określić każdą cząstkę o wymiarach mniejszych niż 100 nm, w co najmniej jednym wymiarze. Takie materiały charakteryzują się odmiennymi właściwościami fizykochemicznymi niż ich odpowiedniki w skali makro, a nawet w mikroskali. W ostatnich latach dyskutowana jest

Nr 3

Bakteriobójcza aktywność nanocząstek srebra

199

potencjalna przydatność nanocząstek metali w profilaktyce zakażeń bakteryjnych (1, 21). Szczególne zainteresowanie wzbudziły nanocząstki srebra (AgNPs - silver nanoparticles). Wyniki badań różnych autorów wskazują, że AgNPs wykazują silne działanie bakteriobójcze nawet w bardzo niskich stężeniach. Ich aktywność przeciwdrobnoustrojowa jest tłumaczona wysoką reaktywnością wynikającą z małego rozmiaru cząstek oraz dużej powierzchni oddziaływania z komórką bakteryjną (2, 13). Nanocząstki srebra w różnej postaci wykazały efektywne działanie bójcze przeciwko takim patogenom jak Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis czy Pseudomonas aeruginosa. Działanie bakteriobójcze nanocząstek prawdopodobnie związane jest z mechanizmami niszczenia błony i ściany komórkowej, zakłóceniem hemostazy komórek bakteryjnych, destrukcyjnym oddziaływaniem na DNA oraz inaktywacją wielu białek (1, 13). Wielokierunkowe oddziaływanie nanocząstek utrudnia bakteriom wytworzenie mechanizmów lekooporności, jak ma to miejsce w przypadku antybiotyków. Fakt ten wydaje się być kluczowym argumentem przemawiającym za koniecznością prowadzenia dalszych badań w tym zakresie (7, 13, 15). Pomimo dużego zainteresowania nanocząstkami i ich aktywnością przeciwdrobnoustrojową dotychczas nie przeprowadzono odpowiednich badań nad możliwością wykorzystania nanocząstek srebra w stomatologii. Jak wiadomo, związki srebra w postaci azotanu srebra czy amalgamatu od lat stosowane są w leczeniu choroby próchnicowej zarówno u dzieci jak i u osób dorosłych. Wykazują one jednak wiele działań niepożądanych takich jak nieestetyczne przebarwienia zębów i przylegających tkanek miękkich, oparzenia błony śluzowej, a nawet działanie kancerogenne (17, 19). Próchnica zębów jest transmisyjną chorobą zakaźną twardych tkanek zęba i może dotyczyć pacjentów w każdym wieku. Mechanizm procesów próchnicotwórczych polega na demineralizacji części nieorganicznej szkliwa i zębiny a następnie proteolitycznym rozpadzie części organicznej. Nieleczona próchnica może prowadzić do zapaleń miazgi, a te z kolei do stanów zapalnych tkanek okołowierzchołkowych. Próchnica, w konsekwencji może być przyczyną poważnych powikłań ropnych oraz ostrych lub przewlekłych stanów zapalnych toczących się w kościach szczęk. Jednym z głównych czynników rozwoju, a następnie progresji choroby próchnicowej są bakterie obecne na powierzchni zębów w postaci biofilmu - płytki nazębnej (14, 20). Wśród wielu bakterii odpowiedzialnych za rozwój choroby próchnicowej dominują gatunki paciorkowców jamy ustnej takie jak: Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis oraz Streptococcus mitis. Celem przeprowadzonych badań było określenie właściwości bakteriobójczych nanocząstek srebra w postaci roztworu koloidalnego (CSS - colloidal silver solution) wobec wybranych szczepów paciorkowców próchnicotwórczych. MATERIAŁ I METODY Koloidalny roztwór nanocząstek srebra. Do badania wykorzystano otrzymany z Mennicy Polskiej S.A roztwór CSS o stężeniu 350 ppm oraz roztwory rozcieńczone w 0,9% NaCl w zakresie od 200 ppm do 6,25 ppm srebra. Badania mające na celu określenie właściwości otrzymanego roztworu przeprowadzono w Laboratorium Nanostruktur dla Fotoniki i Nanomedycyny Instytutu Wysokich Ciśnień PAN w Warszawie. Kształt oraz rozmiar nanocząsteczek w wyjściowym roztworze określono za pomocą skaningowego mikroskopu

200

R. Pokrowiecki i inni

Nr 3

elektronowego Zeiss ULTRA plus  (Carl Zeiss).  Pomiar wielkości nanocząstek przeprowadzono w analizatorze NTA NS500 (Nanosight). Stabilność otrzymanego roztworu oraz kolejnych jego rozcieńczeń wykonano za pomocą analizatora Turbiscan Lab (Formulaction). Bakterie próchnicotwórcze. Aktywność przeciwbakteryjną CSS oznaczano wobec bakterii odpowiadających za zmiany próchnicze zębów. W badaniach wykorzystano po 4 szczepy z gatunków S. mutans, S. salivarius, S. sanguinis oraz S, mitis wyizolowane w 2012 r. z materiału klinicznego tj. płytki nazębnej od 7 pacjentów stomatologicznych leczonych w Zakładzie Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, u których stwierdzono obecność co najmniej 2 aktywnych ognisk próchnicowych. Materiał kliniczny posiewano na podłoże Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej (BioMérieux) i inkubowano w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37oC przez 48h. Wyrosłe kolonie, które na podstawie preparatu mikroskopowego i morfologii na podłożu agarowym podejrzewano o przynależność do rodzaju Streptococcus identyfikowano za pomocą systemu VITEK 2 compakt (BioMérieux) w oparciu o cechy biochemiczne. Oznaczenie aktywności przeciwbakteryjnych nanocząstek srebra. Badania mikrobiologiczne zostały wykonane w Zakładzie Antybiotyków i Mikrobiologii Narodowego Instytutu Leków w Warszawie. Ze względu na brak znormalizowanej metodyki badania aktywności przeciwbakteryjnej związków srebra, na potrzeby badań zaadaptowano metody opisane w wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI tj. metodę dyfuzji z krążków bibułowych (DDT, disc difusion test) (3) oraz metody oznaczania najmniejszych stężeń związków hamujących wzrost drobnoustrojów (MIC, minimal inhibitory concentration) i oznaczenia najmniejszych stężeń bakteriobójczych (MBC, minimal bactericidal concentration) (4). W pierwszym etapie badań jałowe krążki bibułowe o średnicy 6 mm z naniesionym roztworem srebra koloidalnego w ilości odpowiadającej 35 ppm srebra nakładano na płytki z podłożem agarowym Mueller-Hinton z dodatkiem 5% krwinek baranich, z posianymi na ich powierzchnię szczepami paciorkowców zgodnie z metodą DDT. Płytki inkubowano w temperaturze 37oC w atmosferze 5% CO2 przez 24 h. Wpływ czasu kontaktu nanocząsteczek srebra z komórkami paciorkowców na wartość MIC oznaczono metodą seryjnych dwukrotnych rozcieńczeń wyjściowego CSS w 0,9% NaCl w zakresie od 200 ppm do 6,25 ppm srebra. Tak przygotowane szeregi rozcieńczonego roztworu srebra koloidalnego zaszczepiano bakteriami do końcowej gęstości komórek od 105 do 106 cfu/mL, a następnie inkubowano w temperaturze 25oC z jednoczesnym mieszaniem przy 400 obrotach/min na wytrząsarce horyzontalnej. W celu wyznaczenia wartości MBC po upływie godziny i po 24h z każdej probówki pobierano 0,1 mL i przenoszono na płytki z podłożem agarowym Columbia z dodatkiem 5% krwinek baranich (BioMérieux) i inkubowano w warunkach zwiększonej zawartości dwutlenku węgla. Równolegle metodą mikrorozcieńczeniową w płytkach titracyjnych z wykorzystaniem jako rozcieńczalnika pożywki płynnej z hydrolizatem kazeiny i soi (TSB, Haipha Dr. Müller GmbH) oznaczano wartości MIC. Przygotowane rozcieńczenia zaszczepiano inokulum zawierającym 104 cfu/ mL. Hamowanie wzrostu paciorkowców oceniano również w porównaniu do szczepów odniesienia Staphylococcus aureus ATCC 6538 i Escherichia coli ATCC 25922. Wszystkie oznaczenia wykonano w powtórzeniu.

Nr 3

Bakteriobójcza aktywność nanocząstek srebra

201

WYNIKI Właściwości i charakterystyka zastosowanego roztworu koloidalnego nanocząstek srebra. Badania wykonane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego Zeiss ULTRA plus  wykazały, że nanocząstki srebra mają kształt kulisty oraz tworzą układ polidyspersyjny (Ryc. 1). W celu dokładniejszej analizy rozmiaru oraz

Ryc.1.

Zdjęcie wykonane w skaningowym mikroskopie elektronowym przedstawiające stosowane w niniejszej pracy kuliste nanocząstki srebra zlokalizowane na papierowym sączku

dystrybucji rozkładu i koncentracji nanocząstek wykonano pomiar za pomocą analizatora NTA NS500, który umożliwia jednoczesny pomiar intensywności i średnicy cząstek, co zapewnia poprawną analizę mieszaniny cząstek układów polidyspersyjnych. Wielkość 80% nanocząsteczek srebra zawierała się w przedziale od 48 nm do 87 nm (D10-D90). Pomiar wykazał, że średnia wielkość nanocząstek wynosiła 67 nm. Zaledwie 12,38% nanocząstek posiadało rozmiar 50 nm lub mniejszy. Nie stwierdzono obecności nanocząstek poniżej 30 nm średnicy. Charakterystykę nanocząsteczek srebra w badanym roztworze CSS przedstawiono w tabeli I. Pomiar stabilności wyjściowego koloidalnego roztworu nanocząstek srebra został przeprowadzony w analizatorze Turbiscan Lab wykorzystującym metodę wielokrotnie rozproszonego światła (MLS - Multiple Light Scattering). Próbka zawierająca 40 mL CSS o stężeniu 350 ppm została poddana badaniu przez okres 24h. W badanej próbce określony został profil homogeniczności, koncentracja cząstek i średnia wielkość cząstek. Po okresie 24h nie zaobserwowano sedymentacji, koalescencji ani aglomeracji nanocząstek, co świadczyło o bardzo wysokiej stabilności roztworów. W zakresie przebadanych stężeń srebra, w wyjściowym CSS i przygotowanych rozcieńczeń, zaobserwowano jednolity wzrost transmitancji światła, co świadczy o zmianie zawartości aglomeratów w całej objętości danej próbki i związane jest z coraz większym rozcieńczeniem badanych próbek.

202

R. Pokrowiecki i inni

Nr 3

Tabela I. Charakterystyka nanocząstek srebra w badanym wyjściowym roztworze CSS przeprowadzona z użyciem analizatora NTA NS500. Wielkość cząstek Stężenie cząstek Procentowy udział Charakterystyka badanych (nm) (ppm) podwymiarowy nanocząstek srebra 10 0,000 0,00% Średnia wielkość: 67 nm 30 2,237 0,01% SD: 15 nm 50 28,882 12,38% Moda: 65 nm 70 46,894 63,28% D10: 48 nm 90 14,856 92,13% 110 2,542 98,77% D50: 65 nm 130 0,574 99,76% D90: 87 nm 150 0,062 99,99% Zawartość cząstek: 9,6 x 107 /mL 170 0,000 100,00%

Właściwości przeciwbakteryjne koloidalnego roztworu nanocząstek srebra. W badaniu aktywności przeciwbakteryjnej metodą krążkową nie stwierdzono obecności stref zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z nałożonym roztworem nanocząstek srebra wobec żadnego z wykorzystanych w badaniu szczepów. Obserwowano jedynie zmiany wyglądu pożywki bezpośrednio pod krążkiem bibułowym. Wyniki oznaczania przeżywalności komórek paciorkowców w czasie kontaktu z nanocząstkami srebra w różnych stężeniach przedstawiono w tabeli II. Stwierdzono, że przeżywalność komórek Tabela II. Wartości najmniejszego stężenia bakteriobójczego (MBC) badanych roztworów CSS w zależności od czasu kontaktu oraz wartość najniższego stężenia hamującego (MIC). Drobnoustrój Wartość MBC po Wartość MBC po Wartość MIC 1 godz. kontaktu 24 godz. kontaktu > 350 ppm 100 - 200 ppm 100 - 50 ppm Streptococcus mitis (n=4) > 350 ppm 200 ppm 50 ppm Streptococcus mutans (n=4) 200 - > 350 ppm 25 - 50 ppm 12 - 25 ppm Streptococcus salivarius (n=4) 200 - 350 ppm 25 - 50 ppm 25 ppm Streptococcus sanguis (n=4) > 350 ppm 100 ppm 100 ppm Staphylococcus aureus ATCC 6538 > 350 ppm 50 ppm 50 ppm Escherichia coli ATCC 25922

spada wraz z upływem czasu. W przypadku większości szczepów nie stwierdzono zmian w liczbie żywych komórek w czasie kontaktu trwającego jedną godzinę. W przeprowadzonym badaniu wykazano, że po pierwszej godzinie kontaktu efekt bakteriobójczy osiągano jedynie w stężeniach 200 ppm i 350 ppm nanocząsteczek srebra (Ryc. 2). Wartość MBC malała wraz z wydłużeniem czasu kontaktu do 24 godzin. Najbardziej wrażliwymi drobnoustrojami okazały się paciorkowce gatunków S. salivarius i S. sanguis. Efekt był jednak widoczny dopiero po 24 godzinach. Minimalne stężenia bakteriobójcze wobec tych drobnoustrojów osiągały wartości 25-50 ppm i były kilkukrotnie niższe od wartości MBC wobec szczepów S. mitis, S. mutans czy drobnoustrojów odniesienia E. coli i S. aureus. W ciągu godzinnego kontaktu dochodziło do inaktywowania jedynie komórek umieszczonych w wyjściowym roztworze o stężeniu 350 ppm srebra oraz roztworze rozcieńczonym do 200 ppm. Podobne zależności obserwowano dla wartości MIC.

Ryc.32. Wpływ czasu kontaktu komórek badanych szczepów bakterii z nanocząstkami srebra 203 Bakteriobójcza aktywność nanocząstek srebra Nr na wartość MBC

Streptococcus mitis

400 300 1h

200

24h

100 0 1

2

3

Stężenie AgNP (ppm)

Stężenie AgNP (ppm)

Streptococcus mutans 400 300

1h

200

24h

100 0 1

4

400 350 300 250 200 150 100 50 0

1h 24h

2

3

4

400 300 1h

200

24h

100 0 1

4

2

3

4

Nr szczepu

Nr szczepu

Ryc. 2.

3

Streptococcus sanguis Stężenie AgNP (ppm)

Stężenie AgNP (ppm)

Streptococcus salivarius

1

2

Nr szczepu

Nr szczepu

Wpływ czasu kontaktu komórek badanych szczepów bakterii z nanocząstkami srebra na wartość MBC

DYSKUSJA Bakteriobójcze właściwości nanocząstek srebra w postaci roztworów koloidalnych były badane przez kilku autorów (2, 9, 15). Mirzjani i wsp. (9) badając wpływ CSS na bakterie z gatunku S. aureus wskazali, że podstawowym mechanizmem działania nanocząstek srebra jest oddziaływanie z peptydoglikanem ściany komórkowej bakterii. Nanocząstki przyłączając się do ściany komórkowej zmieniają pierwszo- i drugorzędową strukturę peptydoglikanu wytwarzając pory, przez które do komórki wnika coraz więcej nanocząsteczek prowadząc tym samym do lizy komórki. Autorzy udowodnili również, że działanie bakteriobójcze jest zależne od czasu oddziaływania nanocząstek. Wraz z upływem czasu obserwowali wzrost poziomu kwasu muraminowego w środowisku, co świadczyło o postępującej destrukcji ściany komórkowej bakterii poddanych działaniu nanocząsteczek srebra. Wyniki ich badań, wskazujące na zależność właściwości bakteriobójczych od czasu są zgodne z wynikami innych autorów (15) oraz przeprowadzonymi badaniami własnymi. W naszych badaniach po okresie kontaktu wynoszącym 1 godzinę zahamowanie wzrostu wszystkich szczepów zostało osiągnięte jedynie przy 200 ppm oraz 350 ppm. Podobny efekt po 24 godzinach 14 kontaktu uzyskiwano już przy stężeniach 25-50 ppm srebra. Morones i wsp. (11) sugerują, że nanocząstki srebra po destrukcji ściany komórkowej oddziałują z DNA komórki prowadząc do zakłócenia jej prawidłowego metabolizmu. Feng i wsp. (6) proponują trzeci, równoległy mechanizm polegający na inaktywacji białek bak-

204

R. Pokrowiecki i inni

Nr 3

teryjnych przez jony srebra uwolnione podczas oddziaływania nanocząsteczek z grupami tiolowymi białek ściany komórkowej bakterii. Obecność jonów srebra znacznie zwiększa właściwości bakteriobójcze roztworu (5). Mirzjani i wsp. (9) udowodnili, że wraz ze zmniejszeniem rozmiaru nanocząstek zwiększa się ich aktywność bakteriobójcza. Nanocząstki o mniejszych rozmiarach mogą być stosowane w mniejszych stężeniach, co związane jest z ich większą reaktywnością (21). Nanocząstki srebra użyte w naszych badaniach charakteryzowały się średnią wielkością 67 nm. W 24 godzinnych badaniach ze szczepem wzorcowym S. aureus wartość MIC oznaczono na poziomie 100 ppm srebra. Użyty przez Mirjzani i wsp. CSS charakteryzował się wielkością nanocząsteczek srebra równą 17 nm, a uzyskane wartości MIC wynosiły 2-4 ppm. W naszych badaniach nie stwierdzono obecności nanocząstek o średnicy poniżej 30 nm. Istotny wpływ na właściwości bakteriobójcze nanocząstek ma również ich kształt. Jak dowodzą niektóre badania, cząstki o kształtach heksagonalnych, trójkątnych czy o kształtach nanorurek wykazywały skuteczniejsze działanie bakteriobójcze w porównaniu z cząstkami kulistymi ze względu na większą powierzchnię oddziaływania (16, 22). Użyte w naszych badaniach nanocząstki posiadały kształt kulisty. Użycie krążków bibułowych z nałożonym roztworem koloidalnego srebra nie potwierdziło przydatności metody dyfuzji do oznaczania przeciwbakteryjnej aktywności CSS. Metoda krążkowa przeznaczona jest do oznaczania aktywności związków rozpuszczalnych. Uzyskane wyniki odbiegają od wyników badań przeprowadzonych przez Petica i wsp. (15), w których wykazano obecność stref zahamowania wzrostu wokół krążków zawierających CSS w stężeniach do 35 ppm. Nanocząstki użyte w badaniu posiadały wymiary 10-30 nm i były znacznie mniejsze od tych wykorzystanych w badaniach własnych (średnia wartość 67 nm). Obserwowany w badaniach własnych brak stref zahamowania przy jednoczesnej zmianie wyglądu pożywki w miejscu bezpośredniego kontaktu sugerują, że ze względu na wielkość nanocząstek srebra w badanym roztworze koloidalnego srebra dyfuzja jest nieznaczna lub ilość nanocząstek srebra wynosząca 35 ppm w krążkach przygotowanych w laboratorium może być niewystarczająca do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Potwierdzeniem tego mogą być wartości MIC uzyskane w dalszych etapach badań. Innym argumentem tłumaczącym rozbieżność w wynikach badań jest metoda produkcji nanocząstek. Użyty w badaniu roztwór cechował się wyjątkowo wysoką stabilnością, która w przypadku nanokoloidów uzyskiwana jest poprzez dodatek stabilizatorów. Der-Chi i wsp. (5) twierdzą, że nanokoloidy z dużą zawartością stabilizatorów nie zawierają postaci jonowej srebra i charakteryzują się gorszymi właściwościami niż roztwory zawierające zarówno nanocząstki srebra jak i jony. Twierdzą oni również, że to właśnie srebro w postaci jonowej wpływa na właściwości bakteriobójcze. Jony obecne w roztworze mogą dyfundować do podłoża i tym może być tłumaczony fakt wystąpienia stref zahamowania w przypadku małych stężeń w badaniach innych autorów, i ich brak w badaniach własnych (5, 6, 9, 10, 11). WNIOSKI W przeprowadzonych badaniach wykazano, że nanocząstki srebra w postaci roztworu koloidalnego (CSS) o średniej wielkości cząstek 67 nm i kształcie kulistym wykazują działanie bakteriobójcze w stosunku do próchnicotwórczych szczepów rodzaju S. mutans,

Nr 3

Bakteriobójcza aktywność nanocząstek srebra

205

S.salivarius, S. salivarius i S. mitis. Dla uzyskania efektu przeciwbakteryjnego konieczny jest długotrwały kontakt drobnoustrojów z nanocząstkami srebra, na co wskazują wyniki badania przeżywalności komórek bakterii. Uzyskane wyniki wskazują, że efekt ten zależy również od koncentracji nanocząstek srebra i że nie działają one w jednakowym stopniu na wszystkie drobnoustroje. Uzyskane wyniki sugerują, że nanocząstki srebra mogą znaleźć potencjalne zastosowanie w zapobieganiu lub leczeniu choroby próchnicowej. PIŚMIENNICTWO 1. Chen X, Schluesener HJ. Nanosilver: A nanoproduct in medical application. Toxicology Letters 2008; 176: 1–12. 2. Cho KH, Park JE, Osaka T i inni. The study of antimicrobial activity and preservative effects of nanosilver ingredient. Electrochemica Acta 2005;51; 956–60. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard - 11th edition, Document M02-A11, 2012, Vol. 29, No1. 4. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically; Approved Standard - 9th edition, Document M07-A9, 2012, Vol. 32, No 2. 5. Der-Chi T, Kuo-Hsiung T , Chih-Yu L i inni. Colloidal silver fabrication using the spark discharge system and its antimicrobial effect on Staphylococcus aureus. Medical Engineering & Physics 2008; 30; 948–52. 6. Feng Q, Wu J, Chen G i inni. A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus, Journal of Biomedical Materials Research, 2000; 52; 662-8. 7. Gawlik J, Krawiecki M, Nowak M. Ocena zastosowania opatrunków z nanokrystalicznym srebrem w zapobieganiu miejscowej infekcji rany oparzeniowej. Zakażenia 2007; 3; 97-103. 8. Gleckman RA, Czachor JS. Antibiotic side effects. Semin Respir Crit Care Med 2000; 21: 53-60. 9. Mirzajani F, Ghassempour A, Aliahmadi A i inni. Antibacterial effect of silver nanoparticles on Staphylococcus aureus. Research in Microbiology 2011; 162: 542-9. 10. Mirzajani F, Ghassempour A, Aliahmad A i inni. Silver Nanoparticle - Peptidoglycan Cell Wall Interaction. Proceedings of the 31st European Peptide Symposium, European Peptide Society, 2010. 11. Morones JR, Elechiguerra JL, Camacho A i inni. The bactericidal effect of silver nanoparticles, Nanotechnology, 2005, 16; 2346-53. 12. Ogbolua DO, Dainid OA, Ogunledunb A i inni. High levels of multidrug resistance in clinical isolates of Gram-negative pathogens from Nigeria. International Journal of Antimicrobial Agents 2011; 37: 62–6. 13. Oleszkiewicz A, Korzekwa K, Bugia-Płoskońska G. Nanoczasteczki w biologii i medycynie. Laboratorium medyczne 2008; 5: 30- 3. 14. Peterson SN, Snesrud E, Liu J i inni. The dental plaque microbiome in health and disease. PLoS One. 2013; 8: 1-10. 15. Petica A, Gavriliu S, Lungua MC i inni. Colloidal silver solutions with antimicrobial properties. Materials Science and Engineering 2008; 152: 22–7. 16. Sadeghi B, Garmaroudi FS, Hashemi M i inni. Comparison of the anti-bacterial activity on the nanosilver shapes: Nanoparticles, nanorods and nanoplates. Advanced Powder Technology 2012; 23; 22–6. 17. Silver S, Phung Le T , Silver G. Silver as biocides in burn and wound dressings and bacterial resistance to silver compounds. J Ind Microbiol Biotechnol 2006; 33; 627–34.

206

R. Pokrowiecki i inni

Nr 3

18. Stryjewski E.M, Boucherc H.W. Gram-negative bloodstream infections. International Journal of Antimicrobial Agents 2009; 34: 21–5. 19. Szpringer-Nodzak M, Wochna-Sobańsk. Stomatologia wieku rozwojowego wyd. IV poprawione. ISBN 83-200-2774-8; 314-6. 20. Torlakovic L, Klepac-Ceraj V, Ogaard B i inni. Microbial community succession on developing lesions on human enamel. J Oral Microbiol 2012; 4; 1-7. 21. Wijnhoven SWP, Geertsma RE i inni. Nano-silver a review of available data and knowledge gaps in human and environmental risk assessment. Nanotoxicology 2009; 3: 109-38. 22. Wiley B, Sun Y, Mayers B i inni. Shape-Controlled Synthesis of Metal Nanostructures: The Case of Silver. Chemistry 2005; 11: 454-63. Otrzymano: 29 VIII 2013 r. Adres Autora: 00-725 Warszawa, ul. Chełmska 30/34, Narodowy Instytut Leków