Hemoglobinopatia Korle-Bu [β73(E17)Asp→Asn]. Primeros casos descritos en España

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NOTA CLÍNICA Hemoglobinopatía Korle-Bu [β73(E17)Asp→Asn]. Primeros casos descritos en España

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Paloma Ropero, Ana Villegas y Fernando A. González Servicio de Hematología y Hemoterapia. Hospital Clínico San Carlos. Madrid. España.

FUNDAMENTO Y OBJETIVO: La hemoglobina Korle-Bu [β73(E17)Asp→Asn], también conocida como hemoglobina GACCRA, es relativamente frecuente en el África subsahariana, sobre todo en población de color. El interés de este trabajo no sólo ha sido confirmar que la hemoglobina Korle-Bu es una variante estructural cuya mutación se localiza molecularmente en el CD73 (GAT→AAT), sino que además la caracterización se ha llevado a cabo en los primeros casos encontrados en la población española, donde ser portador de hemoglobinas del África subsahariana es muy poco habitual. PACIENTES Y MÉTODO: Se ha estudiado a 2 familias (4 sujetos) procedentes de la misma área geográfica por presentar hemoglobinas anómalas durante un programa de escrutinio de hemoglobinopatías en donantes de sangre del Hospital Clínico San Carlos de Madrid. La variante estructural de hemoglobina se ha estudiado mediante métodos electroforéticos y mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de intercambio iónico; las cadenas de globina se han separado con HPLC de fase inversa. La identificación de la variante estructural se ha llevado a cabo con una secuenciación automática del gen β. RESULTADOS: Tanto en el estudio electroforético de hemoglobinas como en la HPLC de intercambio iónico se observó una hemoglobina anómala. Dicha variante estructural resultó ser de cadena β cuando por HPLC de fase inversa se separaron 3 picos βX, βA y α. En todos los sujetos la presión de oxígeno necesaria para que la hemoglobina presente un 50% de saturación estaba aumentada. En todos los casos la caracterización molecular mediante secuenciación del gen β identificó la variante estructural con la hemoglobina Korle-Bu [β73(E17)Asp→Asn]. CONCLUSIONES: La verdadera importancia de esta variante estructural de hemoglobina es su posible asociación con la hemoglobina C o con la S, ya que, aunque por sí sola no presenta una clínica llamativa, su posible asociación con otras alteraciones como las talasemias u otras hemoglobinopatías puede agravar el cuadro clínico. Es de enorme importancia su caracterización genética para el diagnóstico temprano de las formas graves. Palabras clave: Hemoglobinopatías. HPLC. Secuenciación. Hemoglobina Korle-Bu.

Hemoglobin Korle-Bu [β73(E17)Asp → Asn]. First cases described in Spain BACKGROUND AND OBJETIVE: Hemoblobin Korle-Bu [β73(E17)Asp→Asn], also known as hemoglobin GACCRA, is frequent in African colour population. The interest of this work has been confirmed that hemoglobin Korle-Bu is a structural variant which mutation is located in the CD73 (GAT→AAT) of the exon 2 of β gene and that this characterises has been made in the first cases found in Spanish population. Where to be carrier of African hemoglobins is less frequent. PATIENTS AND METHOD: Two unrelated families (4 subjects) from the same geographical area were studied because all of them shown an abnormal hemoglobin during a screening program of hemoglobinopathies in blood donors. Electrophoretic methods and ion exchange HPLC studied this hemoglobin. Globin chains are studied by reverse phase HPLC. Automatic sequencing carried out the molecular study. RESULTS: In the electrophoretic study and by ion exchange HPLC was observed an abnormal hemoglobin. The study of globin chains by reverse phase HPLC revealed the presence of three peaks βX, βA y α. In all the cases, the P50 was increased. The molecular study by sequencing revealed the substitution GAT→AAT in the codon 73 of β gene globin. This variant of haemoglobin is named hemoglobin Korle-Bu [β73(E17)Asp→Asn]. CONCLUSIONS: This hemoglobin variant becomes important when it is associated with hemoglobin S or C because, although it is not associated with a clinical picture severe, when this hemoglobin is associated with another kind of alterations of hemoglobin molecule (thalassemias or hemoglobinopathies) the clinical could be more severe. So, it is important its genetic characterization for the diagnoses of the serious forms. Key words: Hemoglobinopathies. HPLC. Sequentiation. Hemoglobin Korle-Bu.

La hemoglobina Korle-Bu [β73(E17) Asp→Asn], también conocida como hemoglobina GACCRA1,2, fue descrita, pero no caracterizada molecularmente, por primera vez en 1968 en una familia de Ghana3,4, lugar donde la enfermedad es relativamente frecuente, sobre todo en población de color. Desde entonces esta variante ha seguido detectándose en el continente africano5,6, aunque se han descrito los primeros casos en países americanos como México y Costa Rica7-9 y en algunas ocasiones ha aparecido asociada a las hemoglobinas C2,10 y S3,11. En este trabajo se presentan los primeros casos descritos en España y en Europa de hemoglobina Korle-Bu, así como la caracterización molecular de la mutación que la causa. Pacientes y método Durante un programa de escrutinio de hemoglobinopatías llevado a cabo en donantes de sangre del Hospital Clínico San Carlos de Madrid, se estudió a 2 familias procedentes de la misma área geográfica (Madrid) y no relacionadas entre sí (4 sujetos) por presentar hemoglobinas anómalas. Las sangres se recogieron en ácido etilendiaminotetraacético-K3 y los datos hematológicos se determinaron por impedancia eléctrica en un contador de células automático (Coulter STKS). La hemoglobina A2 se determinó por cromatografía de intercambio iónico, la cuantificación de la hemoglobina F se hizo siguiendo el método de Betke y los estudios de funcionalidad se llevaron a cabo en un hemoanalizador (HemoxAnalyzer TCS Medical Products Co., Huntington Valley, PA, EE.UU.). El estudio de las hemoglobinas se efectuó mediante electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino (pH, 8,6), isoelectroenfoque en gel de poliacrilamida (pH, 5,5-8,5) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de intercambio iónico; el estudio de las cadenas se realizó mediante HPLC de fase inversa. Para el estudio molecular fue precisa la extracción del ADN genómico procedente de los leucocitos de sangre periférica12. Se amplificó el gen β usando oligonucleótidos previamente descritos13. Dicho gen se secuenció automáticamente en un ABI PrismTM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems, Foster City, AC, EE.UU.) y la secuencia se analizó en un ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Resultados

Correspondencia: Dra. A. Villegas. Servicio de Hematología y Hemoterapia. Hospital Clínico San Carlos. Prof. Martín Lagos, s/n. 28040 Madrid. España. Recibido el 6-4-2004; aceptado para su publicación el 20-5-2004.

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Med Clin (Barc) 2004;123(7):260-1

Los datos hematológicos quedan recogidos en la tabla 1. En el estudio electroforético de hemoglobinas en acetato de celulosa (pH, 8,6) e isoelectroenfoque (pH, 5,5-8,5) se observó una hemoglobina anómala que emigraba más anódicamente que la hemoglobina A, comportamiento que coincidía con la sustitución de un aminoácido ácido 38

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por uno básico. Por HPLC de intercambio iónico se procedió a la elución de una hemoglobina desconocida (hemoglobina X) por detrás de la hemoglobina A (fig. 1a), constituyendo la hemoglobina X el 40% del total de las hemoglobinas (tabla 1). En el estudio de las cadenas de globina mediante HPLC de fase inversa, se separaron 3 picos, uno anómalo (βX), que apareció por delante de la cadena βA, y por último la cadena α (fig. 1b). En el estudio funcional de dicha hemoglobina se determinó la presión de oxígeno necesaria para que la hemoglobina presente un 50% de saturación, que en todos los casos estaba aumentada (aproximadamente 29 mmHg, frente a un control de 26 mmHg). En todos los casos se caracterizó molecularmente, mediante secuenciación del gen β, la mutación responsable de la variante estructural. Se localizó una sustitución de G→A en el codón 73 del segundo exón del gen β, donde la sustitución GAT→AAT condiciona el cambio de Asp→Asn en la posición 73 de la cadena de globina, variante que se conoce como hemoglobina Korle-Bu (fig. 1c).

a

20.00

b Grupo Hemo

α

mU

βA βX 0.00

–5.00 0.00

10.00

20.00 30.00 Minutos

40.00

50.00

Secuencia directa Secuencia inversa

c

Discusión Identificar los defectos genéticos es una de las aplicaciones más interesantes que las nuevas técnicas de biología molecular pueden ofrecer a la medicina. El interés de este trabajo no sólo ha sido confirmar que la hemoglobina Korle-Bu es una variante estructural cuya mutación se localiza molecularmente en el CD73 (GAT→AAT), sino que además esta caracterización se ha llevado a cabo en los primeros casos encontrados en la población española, donde ser portador de hemoglobinas del África subsahariana es muy poco habitual. Los individuos heterocigotos portadores de la hemoglobina Korle-Bu de ambas familias no llevan asociados cambios hematológicos significativos y en ninguno de los casos los valores de hemoglobina anómala superaron el 50%. La verdadera importancia de esta variante estructural de hemoglobina es su TABLA 1 Datos hematológicos I1a

I1b

II1b

Sexo Varón Mujer Varón RBC (×1012/l) 4,1 4,4 4,6 Hemoglobina (g/dl) 12,1 13,1 12,4 Hematocrito (%) 35,3 37,7 35,5 VCM (fl) 85,1 85,7 77,6 HCM (pg) 29,2 19,8 27,2 Reticulocitos (%) 0,8 0,9 1,4 Hemoglobina (%) 49,6 54,6 54,2 Hemoglobina A2 (%) 4,3 2,2 2,6 Hemoglobina F (%) 1,1 0 2 Hemoglobina X (%) 45 43,2 41,2 P50 (mmHg) 28,5 29 29,5

II2b

Varón 4,2 11,9 33,7 80,6 28,5 1,2 53,5 2,7 2 41,8 29

RBC: recuento de glóbulos rojos; VCM: volumen corpuscular medio; HCM: hemoglobina corpuscular media; P50: presión de oxígeno necesaria para que la hemoglobina presente un 50% de saturación.

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Fig. 1. a) Separación de hemoglobinas mediante cromatografía líquida de alta resolución de intercambio iónico; b) separación de cadenas de globina mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa, y c) hemoglobina Korle-Bu [β73(E17)Asp→Asn]. Secuencia nucleotídica del gen β globina donde la sustitución en el codón 73 T→C está indicada.

posible asociación con las hemoglobinas C o S. Así, cuando el individuo es doble heterocigoto para las hemoglobinas Korle-Bu y C, presenta microcitosis y aumento de la viscosidad sanguínea, probablemente debido a la presencia de la hemoglobina C10; en cambio, cuando se encuentra asociada a una hemoglobina S, en lugar de agravarse el cuadro clínico y cursar como una anemia de células falciformes, presentaría un rasgo drepanocítico con escasa expresión fenotípica y sin una clínica significativa3. La hemoglobina Korle-Bu es una variante muy frecuente en África y, dada la gran corriente migratoria que viene observándose en los últimos años en España, su correcta identificación y caracterización nos va a permitir el diagnóstico de dicha hemoglobinopatía, sobre todo en la población procedente de países africanos, para instaurar así un tratamiento adecuado en los casos más graves en los que pueda presentarse asociada a otro tipo de alteración de la molécula de la hemoglobina (talasemia o hemoglobinopatía). REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Huisman THJ, Carver MFH, Efremov GD. A syllabus of human haemoglobin variants. 2nd ed. Augusta, GA: The Sickle Cell Anaemia Foundation, 1998. Disponible en: http://globin.cse.psu.edu 2. Vukelja SJ. Haemoglobin Korle-Bu (G-ACCRA) in combinations with hemoglobin C. Am J Hematol 1993;42:412.

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