REVISTA BRASILEIRA DE TOXICOLOGIA BRAZILIAN JOURNAL OF TOXICOLOGY
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Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.2 (2008) 93-96
Investigação da citotoxicidade e mutagenicidade do hipocolesteremiante sinvastatina em células de ratos wistar e de Allium cepa L. Ana Paula Peron1,2*, Joice Felipes2, Alinne Clair Soares de Oliveira1, Veronica Elisa Pimenta Vicentini2 1
Faculdade de Apucarana, Departamento de Ciências Biológicas, Apucarana, PR, Brasil. 2Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Biologia Celular e Genética, Maringá, Paraná, Brasil.
ABSTRACT
Investigation of the cytotoxicity and mutagenicity of simvastatin hypocholesteremiant in cells of wistar rats and Allium cepa L. In the field of pharmacological research is important to assess the potential cytotoxic and/or mutagenic widely of synthetic drugs prescribed. Due to intense use by the population of the drug simvastatin (Zocor) for the reduction of cholesterol, this study aimed to evaluate the cytotoxicity and mutagenicity of this drug in bone marrow cells of Wistar rats treated in vivo, via gavage, in acute treatment, in concentrations of 0.0015, 0015 and 0.15 mg/mL, and in root meristematic cells of Allium cepa L., in concentrations of 0.10, 10.0 and 100.0 mg/mL. In the two-test system used, the tested concentrations of simvastatin did not cause statistically significant changes by the chi-square test, the rate of cell division, showed no cytotoxic activity. In the animal test system, the Zocor, in concentrations evaluated, caused no significant increase in chromosomal alterations, not present, therefore, mutagenic effects, in this type and form of treatment, and concentrations evaluated. The results obtained in this work serve to aggregate data for work done with other systems-test, for assessing the effect of simvastatin on cellular level. Keywords: synvastatin, cytotoxicity, clastogenicity, animal test-system, vegetal test-system
INTRODUÇÃO As estatinas são os fármacos mais usados para o tratamento das hiperlipidemias, em prevenção primária e secundária, com o propósito de diminuir os níveis de lipoproteínas plasmáticas ricas em colesterol e assim, reduzir os riscos de doenças coronarianas. Estes efeitos são resultantes da atividade inibidora das estatinas sobre a enzima HMG-CoA (hidroximetil glutaril coenzima A) redutase, com a propriedade de bloquear a conversão do substrato HMGCoA em ácido mevalônico, inibindo os primeiros passos da biossíntese do colesterol (1). Atualmente, seis estatinas são empregadas clinicamente, listadas a seguir juntamente com os seus nomes comerciais: lovastatina (Mevacor), pravasatina (Pravacol),
Autor correspondente. Endereço para correspondência: Av. Raposo Tavares, nº 350. CEP 87250-000 - Peabiru - PR - Brasil. Tel.: (+55 44) 8809-6370. E-mail:
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sinvastatina (Zocor), fluvastaina (Lescol), atorvastatina (Lipitor) e rosuvastatina (Crestor) (2). A sinvastatina (Zocor) é um inibidor da redutase HMGCoA, sendo indicada para pacientes com hiperlipidemia. Este medicamento reduz os níveis do “mal” colesterol (LDLcolesterol) e aumenta os níveis do “bom” colesterol (HDLcolesterol). Atua diminuindo a produção de colesterol pelo fígado e também, aumenta a remoção de colesterol da corrente sangüínea (3). A sinvastatina é bem tolerada, com boa margem de segurança, durante a utilização prolongada (4,5). Estes mesmos autores ainda ressaltam que um efeito colateral decorrente do uso deste medicamento está relacionado à ação hepatotóxica, com possível aumento das enzimas aspartato e alanina transaminases. As mutações e as alterações no processo de divisão celular podem ocorrer pelo efeito de agentes potencialmente mutagênicos como os fármacos naturais ou sintéticos (6). Pesquisas avaliando a ação em nível celular da sinvastatina já foram realizadas, mas ainda são poucos os dados disponibilizados na literatura sobre a ação citotóxica e clastogênica deste medicamento. Portanto, em função do potencial terapêutico do Zocor aliado a ampla recomendação
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médica do mesmo a pacientes hipercolesterêmicos, torna-se relevante uma maior investigação da ação deste fármaco em nível celular. Assim, o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos citotóxico e clastogênico da sinvastatina Zocor, utilizando como sistemas-teste as células de medula óssea de ratos Wistar e as meristemáticas de raiz de Allium cepa.
MATERIALE MÉTODOS Sinvastatina - Zocor A sinvastatina [CH3CH2C(CH3)2CO2-], com nome comercial de Zocor, é um medicamento do Laboratório Norvatis Pharma e pertence a um grupo de fármacos conhecidos como hipocolesteremiantes. É apresentado sob a forma de comprimidos revestidos nas concentrações de 5, 10, 20 e 40 mg. A concentração de Zocor que a população normalmente faz uso é de 10 mg/dia, sendo o tempo de uso definido pelo médico (7). Sistema Teste Animal Os ratos Wistar, Rattus norvegicus, procederam do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá, com aproximadamente 100g de peso corpóreo (pc), sendo animais jovens, com cerca de 35 dias. Foram usados seis animais, três machos e três fêmeas, para cada grupo controle e tratamento. Os ratos foram tratados in vivo, via gavagem, com 1mL da solução/100g pc, por 24h, caracterizando um tratamento agudo. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa em Animais da Universidade Estadual de Maringá (Protocolo 15/2007). Para comparação e validação dos resultados foram utilizados dois controles. Para o controle negativo foi administrado aos animais somente água (1 mL/100g pc), via gavagem, por 24h. No controle positivo foi utilizada a ciclofosfamida, uma substância comprovadamente clastogênica (5,0 mg/1 mL água/100g pc), via intraperitoneal, por 24h. A concentração extrapolada para o rato foi de 0,15 mg, sendo avaliada mais duas concentrações, dez e cem vezes mais diluídas, respectivamente, 0,015 mg e 0,0015 mg, em 1 mL de água administradas por 100g de pc do animal. A via de administração usada no tratamento dos ratos com a sinvastatina foi a gavagem, ou via oral, que se aproxima mais com a forma de ingestão do medicamento, feita pelo homem, sofrendo formas similares de digestão e de metabolização. Uma hora e meia, antes do sacrifício foi injetado nos animais 0,5 mL/100g pc de colchicina 0,16%. A técnica usada para obtenção das lâminas foi a de Ford e Hamerton (8), com modificações. Foram calculados os índices mitóticos de 5.000 células por sexo, totalizando 10.000 células por grupo. A análise das lâminas foi feita em microscópio óptico, em teste “cego”, com objetiva de 100X, de imersão. Para a análise cromossômica metafásica, foi avaliado o aparecimento de alterações, sendo analisadas 100 metáfases por animal, totalizando 600 por grupo
controle e tratamento. O cálculo estatístico foi feito pelo teste do Qui-quadrado (α=0,05). Sistema Teste Vegetal Segundo Grisola e Takahashi (9), o sistema de Allium cepa tem boa correlação com o sistema teste de mamíferos, indicando o uso desse sistema como uma alternativa para o monitoramento do potencial genotóxico de vários compostos químico, como por exemplo, o de medicamentos. Para a realização deste estudo, as cebolas (Allium cepa) de tamanho mais ou menos uniforme, foram adquiridas de uma fonte comercial e colocadas para enraizar em frascos com água, à temperatura ambiente (25ºC), com aeração, até obtenção de raízes com cerca de 1 a 1,5cm de comprimento. Antes de cada tratamento, algumas raízes, de cada cebola, foram coletadas e fixadas para servirem de controle do próprio bulbo (0h). Em seguida, estas cebolas foram colocadas nas soluções tratamento por 24h. Após este tempo, mais algumas raízes, foram retiradas e fixadas. As raízes restantes foram lavadas e os bulbos novamente colocados em água, para recuperar de eventuais danos ocorridos, por 24h, sendo as raízes restantes retiradas e fixadas. Foi utilizada a concentração de 0,10 mg/mL e mais outras duas, cem e mil vezes mais concentradas, 10 e 100 mg/mL, respectivamente. Foi realizado um grupo controle negativo, sem tratamento, onde as raízes permaneceram em água e foram colhidas amostragens nos mesmos tempos dos grupos tratamentos. As raízes das cebolas foram preparadas pela reação de Feulgen e coradas com o reativo de Schiff (10). As lâminas foram analisadas utilizando microscópio óptico com objetiva de 40X. Foram avaliadas 1.000 células por bulbo, totalizando 5.000 células por grupo controle, tratamento e recuperação. Foram avaliadas alterações na estrutura dos cromossomos e na morfologia celular e calculados os índices de divisão celular. Para a análise estatística foi feito o teste do Qui-quadrado (α=0,05).
RESULTADOS Os resultados observados na Tabela 1, para o IM e número de alterações cromossômicas para as três concentrações da sinvastatina, em ratos Wistar, não foram estatisticamente diferentes, em relação aos controles. A Tabela 2, os IM obtidos para as concentrações da sinvastatina, neste sistema-teste, não foram estatisticamente diferentes quando comparados aos índices de divisão celular dos seus respectivos controles e recuperações. Também não foram significativamente diferentes dos IM do grupo controle negativo, nos respectivos tempos de amostragens.
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO Nas células de medula óssea de ratos Wistar, conforme indicado na tabela 01, após os tratamentos, via gavagem,
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Tabela 1. Índices mitóticos (IM) médios e número e tipos de alterações cromossômicas, obtidos para os diferentes grupos controles e tratados com sinvastatina, em ratos Wistar. Grupo Controle/ IM Número de Tratamento Médio % metáfases alteradas (%)
Total de Alteração/ Alterações (%) Metafase Altereda
Tipos de Alterações Gap
Quebra Outras
Ct
ct
fa
1,0 1,3
06
02 46
27
1,0 1,0 1,0
03 01 01
01 04 02
-
CONTROLE -
1,34 1,32
CO CO+
02 (0,3) 59 (9,8)
02 (0,3) 79 (13,2) TRATAMENTO
SI [1] SI [2] SI [3]
1,24 0,47 1,06
04 (0,7) 05 (0,8) 03 (0,5)
04 (0,7) 05 (0,8) 03 (0,5)
IM de 10.000 células/ grupo, 600 metáfases analisadas/ grupo. Co-: água, Co+: ciclofosfamida, SI=sinvastatina: [1]=0,0015; [2]=0,015; [3]=0,15 mg/mL. ct: cromatídico, fa: fragmento acêntrico.
Tabela 2. Índices mitóticos (IM) médios obtidos para os grupos controles, tratados com sinvastatina e recuperação, em células de raiz de Allium cepa L. Grupo Controle/ Tratamento
Tempos de Amostragens Co-0h
Tr-24h
Re-24h
9,3
9,9
9,9 9,3 9,1
9,7 9,7 9,7
CONTROLE -
CO
9,7 TRATAMENTO
SI [1] SI [2] SI [3]
9,8 9,5 9,5
IM de 5.000 células/ grupo, Co-0h: Controle, Tr-24h: Tratamento, Re-24h: Recuperação, CO-: água, SI=sinvastatina: [1]=0,10; [2]=10,0; [3]=100,0 mg/mL.
com as três concentrações do medicamento sinvastatina (Zocor), foi verificado que apenas a segunda concentração (0,015 mg/mL) causou uma diminuição no índice de divisão celular, mas esse resultado não foi estatisticamente significativo pelo teste estatístico do qui-quadrado. O tratamento com as outras duas concentrações apresentaram índices mitóticos semelhantes aos obtidos para os controles positivo e negativo. Portanto, estes tratamentos não apresentaram efeitos citotóxicos. As três concentrações do medicamento também não causaram efeito clastogênico, estatisticamente significativo, neste tipo, tempo e forma de tratamento, em células de medula óssea de ratos Wistar. Para o sistema teste vegetal, utilizando as células meristemáticas de raiz de Allium cepa L., também não foi
observado ação citotóxica, estatisticamente significativa, deste fármaco nas três concentrações avaliadas, na comparação entre elas, na comparação com o seu respectivo controle (0h) e recuperação (24h), e na comparação com os respectivos tempos de amostragens do controle negativo (Tabela 2). Também não foram observadas alterações cromossômicas e nem morfológicas celulares nestas células no tipo, tempo e forma de tratamento usado. Conforme já relatado, ainda não são muitos os estudos sobre a ação da sinvastatina em nível celular. Porém, a maioria das avaliações com a sinvastatina já realizadas e disponibilizadas na literatura, demonstraram atividade mutagênica e clastogênica deste medicamento em nível celular. Em um estudo realizado por Pernice et al. (11), foi avaliado o efeito da exposição de sinvastatina e seu efeito direto sobre o DNA em cultura de linfócitos de pacientes com aterosclerose, e verificaram a presença de quebras cromatídicas significativas. Imaeda et al. (12) avaliaram o efeito protetor da sinvastina em cultura de bactérias Salmonella typhimurim exposta ao estresse ao oxigênio. Esses pesquisadores observaram que nas culturas sem a ação da sinvastatina, as quebras da molécula de DNA desses organismos eram menos frequentes, do que aquelas que estavam sobre a ação deste medicamento. Em outro estudo, Robinson et al. (13) verificaram que a sinvastatina acelerou o processo de divisão celular em tumores de fígado em ratos. Em outros trabalhos realizados, foram encontrados resultados diferentes aos dos trabalhos citados acima. Lam e Cao (14) relataram que o uso de estatinas em geral, incluindo a sinvastatina, pode reduzir o crescimento de vários tipos de câncer em roedores e estes mesmos pesquisadores afirmam que as estatinas podem agir como agentes anticancerígenos. Ciaravino et al. (15) verificaram a ausência da ação mutagênica e clastogênica do fármaco sinvastatina em cultura de bactérias
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e em células de mamíferos em cultura in vitro. Esses resultados corroboram aos obtidos nesse trabalho de não citotoxicidade e clastogenicidade da sinvastatina. Em vista dos resultados obtidos nesse trabalho associados aos resultados da literatura, sobre a ação citotóxica e mutagênica do Zocor, conclui-se que pesquisas adicionais devem der realizadas. O resultado de poucos sistemas-teste não deve ser tomado como definitivo, sugerindo-se então realizar o estudo da ação da sinvastatina em nível celular em sistemas-teste diferentes e com processos de metabolização diferentes.
2.
3.
4. 5.
RESUMO No campo das investigações farmacológicas é importante avaliar o potencial citotóxico e/ou mutagênico de medicamentos sintéticos amplamente prescritos. Devido ao intenso uso pela população do fármaco sinvastatina (Zocor) para a redução do colesterol, este trabalho teve por objetivo avaliar a citotoxicidade e a mutagenicidade deste medicamento em células de medula óssea de Ratos Wistar, tratados in vivo, via gavagem, em tratamento agudo, nas concentrações de 0,0015; 0,015 e 0,15 mg/mL, e em células meristemáticas de raiz de Allium cepa L., nas concentrações de 0,10; 10,0 e 100,0 mg/mL. Nos dois sistemas-teste utilizados, as concentrações testadas da sinvastatina não causaram mudanças, estatisticamente significativas, pelo teste do qui-quadrado, no índice de divisão celular, não apresentando ação citotóxica. No sistema teste animal, o Zocor, nas concentrações avaliadas, não causou aumento significativo das alterações cromossômicas, não apresentando, portanto, efeito mutagênico, neste tipo e forma de tratamento, e nas concentrações avaliadas. Os resultados obtidos neste trabalho servirão para agregar dados a trabalhos feitos, com outros sistemas-teste, referentes à avaliação da ação da sinvastatina em nível celular.
6.
7. 8.
9.
10.
11.
12.
13. Unitermos: sinvastatina, citotoxicidade, clastogenicidade, sistema-teste animal, sistema-teste vegetal 14. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 15. 1.
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