Lago Barcia et al. (2014) Presencia de Obama marmorata (Schultze & Müller, 1856) (Geoplaninae, Geoplanidae, Continenticola, Tricladida, Platyhelmintha) en la península Ibérica. Primer registro de este género para Europa

PRESENCIA DE OBAMA MARMORATA (SCHULTZE & MÜLLER, 1856) (GEOPLANINAE, GEOPLANIDAE, CONTINENTICOLA, TRICLADIDA, PLATYHELMINTHA) EN LA PENÍNSULA IBÉRICA. PRIMER REGISTRO DE ESTE GÉNERO PARA EUROPA. Domingo Lago Barcia1, Fernando Ángel Fernández-Álvarez1, Lisandro Negrete2, Francisco Brusa2, Cristina Damborenea2, Carolina Noreña1. 1Museo

Nacional de Ciencias Naturales (CSIC), 2Facultad de Ciencias Naturales y Museo de La Plata (UNLP)

Introducción El género Obama presenta una distribución neotropical, al igual que el resto de géneros de la subfamilia Geoplaninae. Hasta la fecha, no existen registros de geoplanines naturales fuera del continente Americano, y en su caso, siempre se trata de especies introducidas como es el caso de 1 ejemplar de Paraba multicolor (Graff, 1899) Carbayo et al. 2013, citado por primera y única vez en Hamburgo, Alemania, en 1901 (Kraepelin 1901). Siete ejemplares de Obama marmorata (Schultze & Müller, 1857) Carbayo et al. 2013 (Fig. 1) fueron encontrados en un jardín del pueblo asturiano Muros de Nalón (Fig. 2). Tras su captura se contactó con Viveros La Lloba (Piedras Blancas, Asturias), la empresa que surte de plantas el jardín donde se detectaron por primera vez. Amablemente, los operarios de la citada empresa accedieron a ser entrevistados y aportaron cinco nuevos ejemplares que también fueron incluidos en el análisis. Esta especie se considera originaria de Blumenau, Estado de Santa Catarina (Catharina), en Brasil (Schultze & Müller, 1857). Obama marmorata es una especie asociada a plantas tropicales o semitropicales y se trata de una especie introducida artificialmente por el hombre, pero que tiene limitada su expansión a la de su hábitat (hojarasca y suelo). El hallazgo de estos ejemplares sugiere la posibilidad de que se trate de una especie introducida con cierto potencial de colonización, debido a que se han encontrado ejemplares maduros sexualmente, con cocones (Fig. 1), y juveniles de diferentes tamaños. En este trabajo se cita por primera vez la subfamilia Geoplaninae y el género Obama dentro de la Península Ibérica y por segunda vez esta subfamilia (Geoplaninae) y primera vez este género (Obama) para Europa.

Objetivos 1)

La comparación entre los ejemplares de Obama marmorata encontrados en la península ibérica y los individuos de América del Sur, donde esta especie es autóctona (Fig. 5).

2)

Testar la utilidad del DNA barcoding en la caracterización molecular de este grupo taxonómico y, por tanto, su uso futuro en el descubrimiento de nuevas invasiones biológicas.

3)

Aportar datos biológicos sobre la introducción de O. marmorata en la Península Ibérica.

Material y Métodos

Fig. 1. Vista dorsal de región posterior de un ejemplar Asturiano de Obama marmorata (GEO2). Cocón señalado con una flecha roja. GEO1 GEO2 GEO3 GEO4 GEO5 GEO6 GEO7 GEO8 GEO9 GEO10 GEO11 GEO12 GEO13 GEO14 GEO15 GEO16 GEO17 GEO18 GEO19 GEO20 GEO21 GEO22 GEO23 GEO24 GEO25 GEO26 GEO27 GEO28 GEO29 GEO30 GEO31 GEO32 GEO33 GEO34 GEO35 GEO36 GEO37 GEO38 GEO39 GEO40 GEO41 GEO42 GEO43 GEO44 GEO45 GEO46

Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Obama marmorata Bipalium kewense

ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón.

Tras la captura, los ejemplares fueron sacrificados con agua hirviendo. De cada ejemplar se destinó sendas porciones de tejido para la extracción de ADN y su estudio morfológico. La parte destinada a su estudio histológico fue fijada en líquido de Bouin, tras lo cual se trasladó a etanol 70%. Posteriormente se deshidrataron progresivamente, para finalmente embeberlos en paraplast. Se realizaron cortes seriados en el plano sagital de los individuos con un grosor de 7µm que fueron teñidos con AZAN (método tricrómico de tinción). Los cortes seriados obtenidos se utilizaron para hacer una reconstrucción del aparato reproductor y compararlo con las reconstrucciones halladas en la literatura relacionada (Fig. 5). Después de este primer análisis morfológico y confirmar la determinación de las especies encontradas en Asturias se realizó una revisión bibliográfica de O. marmorata y de su distribución actual que comprende las regiones de Blumenau, Estado de Santa Catarina (Catharina), Brasil y Rio do Têsto (Pommerode), Santa Catarina, Brasil. Se realizó un análisis morfológico para el cual se construyó una matríz morfológica que incluía 20 taxones con representantes de distintos géneros de la subfamilia Geoplaninae (incluyendo las O. marmorata Asturianas) y usando a Geoplana quagga Marcus 1951 como grupo externo. Se utilizaron 36 caracteres de morfología externa tanto como interna. El análisis se realizó el programa PAUP para generar un árbol filogenético de distancias mediante búsquedas heurísticas, realizando 100 replicas, complementadas con TBR (por las siglas inglesas de Tree Bisection Reconnection). La fracción de tejido destinada a la extracción de ADN fue fijada en etanol absoluto. Se utilizó un total de 12 ejemplares. La extracción del ADN se realizó utilizando el método del fenol-cloroformo. Se amplificaron 324 pares de bases del gen mitocondrial citocromo oxidasa I (COI), utilizando los primers PrLCOI (Sanna et al. 2009) y COIprb2 (Bessho et al. 1992). Tras la secuenciación y edición de las secuencias, éstas se alinearon con otras secuencias procedentes del artículo de Carbayo et al. (2013). Se seleccionaron aquellas secuencias de aquellos géneros escindidos de Geoplana Stimpson, 1857, siguiendo el criterio del citado artículo. El modelo evolutivo que mejor se ajusta a los datos resultó ser GTR+G, según el criterio de Akaike (AIC; Akaike, 1974) seleccionado mediante la plataforma online FINDMODEL (http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/findmodel/findmodel.html). Se realizó un análisis de Máxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML) mediante búsquedas heurísticas, complementadas con TBR. El soporte de los nodos fue evaluado a través de métodos de bootstrap (Felsenstein, 1985), con 1000 pseudorréplicas. Para llevar a cabo dicho análisis se utilizó el programa PHYML (Guindon & Gascuel, 2003) a través de la plataforma South of France Bioinformatics Platform (http://www.atgc-montpellier.fr/). Además, se realizó un análisis de la divergencia no corregida a nivel intra- e interespecífico, utilizando el programa MEGA 4.0.2 (Tamura et al., 2007). Fig. 2 Mapa de Muros de Nalón y de Viveros la Lloba (Piedras Blancas, Asturias) ubicado en la costa norte de la península ibérica

ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Viveros La Lloba, Blancas. ASTURIAS: Viveros La Lloba, Blancas. ASTURIAS: Viveros La Lloba, Blancas. ASTURIAS: Viveros La Lloba, Blancas. ASTURIAS: Viveros La Lloba, Blancas. BUENOS AIRES: Vivero Kato

Piedras Piedras Piedras Piedras Piedras

BUENOS AIRES: Vivero Kato BUENOS AIRES: Vivero Kato BUENOS AIRES:Vivero Ferrari BUENOS AIRES:Vivero Ferrari BUENOS AIRES:Vivero Ferrari BUENOS AIRES: Vivero Zoológico BUENOS AIRES: Vivero Zoológico BUENOS AIRES: Vivero Zoológico BUENOS AIRES: Valeria del Mar BUENOS AIRES: Valeria del Mar BUENOS AIRES: Valeria del Mar BUENOS AIRES: Los Toldos BUENOS AIRES: Los Toldos BUENOS AIRES: Los Toldos

Fig. 3. Árbol filogenético obtenido mediante un análisis de ML. Los valores bajo las ramas representan los porcentajes de bootstrap, representándose sólo los valores superiores a 60%. Las ramas del árbol han sido coloreadas de distinto color en función del género al que pertenecen en base a la nomenclatura definida por Carbayo et al. (2013).

Fig.4. Consenso estricto de los árboles hallados mediante un análisis de distancias, obtenidos del análisis de la matriz morfológica.

Resultados

Fig. 5. Tres esquemas del aparato copulador de Obama marmorata. Esquema superior, espécimen de Asturias (Lago/Noreña). Esquema del medio, espécimen de Argentina(Lisandro Negrete). Esquema de abajo, espécimen de Brasil (Froehlich, 1959).

BUENOS AIRES: Isla Paulino

Los esquemas realizados de los aparatos copuladores de los ejemplares se pueden ver en la Fig. 5. La única diferencia observable entre los ejemplares argentinos y brasileros con respecto a los asturianos es que estos últimos presentan una mayor cantidad de pliegues del atrio masculino. El árbol filogenético realizado con datos morfológicos (Fig. 4) muestra que GEO01 se encuentra en un mismo clado junto a las otras especies de Obama incluidas en el análisis (a excepción de O. burmeisteri). Como grupo hermano de nuestra GEO01, tenemos el clado formado por O. josefi Carbayo y Leal-Zanchet, 2000 y O. ficki Amaral y Leal-Zanchet, 2012. El árbol filogenético generado a partir de la información molecular se puede observar en la figura 3. Los doce ejemplares Asturianos secuenciados (representados por la imagen de O. marmorata) aparecen en el mismo clado, lo que demuestra que son individuos de la misma especie. Como puede observarse, la especie con la que se agrupan es con Obama sp. 6 de Carbayo et al. (2013), si bien dicha relación no recibe un buen soporte estadístico. Se analizó la divergencia no corregida a nivel intra- e interespecífico (Fig 6) de todos los taxones. A nivel intraespecífico, la divergencia media varía desde 0 a 1,2% (media=0,34%). A nivel interespecífico, las divergencias tienen un rango del 3,2% al 14,4%, siendo la media 9,21%. Como muestra la figura 6, entre los niveles de divergencia intra- e interespecífica se puede identificar un barcoding gap, lo cual indicaría un aislamiento reproductivo y, por tanto, la presencia de distintas especies biológicas o Unidades Taxonómicas Operativas (UTOs). Sin embargo, la divergencia entre los haplotipos de 4 especies (Geoplana vaginuloides (Darwin, 1844); Imbira goetschi sensu Marcus, 1951; Matuxia tuxaua (Froehlich, 1951); y Obama carinata (Riester, 1938)) supera el nivel de divergencia intraespecífica máxima observado en el resto de los taxones (niveles de divergencia desde el 4,3 al 8,3%). En este trabajo se consideran miembros de distintas especies, lo que sugiere la presencia de especies crípticas. Esta visión se ve reforzada por la presencia de parafilia de G. vaginuloides con respecto a G. chita Froehlich, 1956, también observada en el análisis multiloci de Carbayo et al. (2013).

BUENOS AIRES: Isla Paulino

Discusión

BUENOS AIRES: Nueve de Julio BUENOS AIRES: Nueve de Julio BUENOS AIRES: Nueve de Julio BUENOS AIRES: Isla Martín García BUENOS AIRES: Isla Martín García BUENOS AIRES: Isla Martín García

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Fig. 6. Gráfico mostrando las distancias no corregidas a nivel intra- e interespecífico. La presencia de un barcoding gap está señalada con una flecha roja. Acudir al texto para más detalles.

BUENOS AIRES: Parque Pereyra Iraola BUENOS AIRES: Parque Pereyra Iraola BUENOS AIRES: Parque Pereyra Iraola CORDOBA

)

CORDOBA ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón. ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón.

Agradecimientos Los autores agradecen a Ángel Manuel Fernández Valdés el aporte de ejemplares de O. marmorata y B. kewense de Muros de Nalón; así como a Viveros La Lloba por el aporte de información y ejemplares de O. marmorata de Piedras Blancas. Éste estudio fue financiado por el proyecto CGL2011-29916.

ASTURIAS: Reborio, Muros de Nalón.

Listado de especies con su correspondiente código y la localidad de la captura.

Imágenes de Obama marmorata. Imagen izquierda, O. marmorata Argentina (foto Lisandro Negrete), imagen derecha, O. marmorata Asturias (foto: F. A. Fernández-Álvarez).

FINANCIAMENTO

Obama marmorata se trata de una especie neotropical cuya presencia es documentada por vez primera en Europa. Los primeros ejemplares aparecieron en un jardín de la localidad asturiana de Muros de Nalón. Tras la aparición de los mismos, los autores del presente trabajo se pusieron en contacto con Viveros La Lloba (Piedras Blancas, Asturias; a 6,6 Km de distancia en línea recta y con numerosos accidentes geográficos y carreteras entre ambas localidades). Según los operarios de dicha empresa, este animal lleva viéndose en el vivero desde al menos unos 3-4 años, apareciendo bajo macetas en zonas húmedas. Además de la presencia de O. marmorata, han avistado ejemplares de Bipalium kewense Moseley, 1878, cuya presencia ha sido confirmada en el mismo jardín, donde los ejemplares de O. marmorata aparecieron de por gás primera vez. La presencia de ambas especies en ambas localidades refuerza la idea de que viajaron desde el vivero al Reservatório (arenito) jardín a través de las macetas donde se comercializa la especie, bien sea en forma de individuo adulto o de cocón. Si bien en el vivero desde donde parece que se dispersan los ejemplares no comercializa directamente con Latinoamérica, si que importa plantas de otras regiones de la península Ibérica y de Europa, de modo que se espera que O. marmorata esté distribuida por otras partes del continente. Esta idea se ve reforzada con el hecho de que esta especie ya se está reproduciendo en la península Ibérica, como revela la presencia de cocones y de juveniles en los muestreos . Cuando una nueva especie alóctona es detectada en un determinado territorio, es de crucial importancia averiguar cuáles son sus relaciones con otros organismos para averiguar cómo puede afectar a la fauna local. Todos los ejemplares del jardín de Rocha Muros de Nalón, a excepción(xisto de uno que apareció entre hojarasca, se encontraron dentro de dos arquetas. Dichos geradora ejemplares aparecieron en distintas fechas y su eliminación parecía afectar a la cantidad de cochinillas de la humedad (isópodos del suborden Oniscidea Latreille, 1802), si bien no se realizaron estudios cuantitativos ni se observó ningún evento de depredación de forma directa. Lo que sí se observó directamente fue la depredación sobre una lombriz de tierra (Fig. 7A) y sobre un caracol (Fig. 7B). Interacciones entre distintas presas y depredadores entre la fauna en las regiones invadidas han sido previamente registradas en especies de Bipalium (ejemplo: Ducey et al., 1999). El DNA barcoding permite la asignación molecular de ejemplares a especies previamente secuenciadas, siempre y cuando haya una buena representación de secuencias para ese grupo taxonómico en las bases de datos internacionales. En concreto, la familia Geoplanidae está bastante bien representada en Genbank desde el trabajo de Carbayo et al. (2013). En este trabajo se ha testado si el locus mitocondrial COI podría ser utilizado con éxito en este grupo taxonómico, obteniéndose buenos resultados al observarse la presencia de un barcoding gap fácilmente reconocible (Fig. 6). Esto abre la puerta al uso del DNA barcoding como herramienta de identificación de geoplánidos y en la caracterización de invasiones biológicas.

Bibliografía

Fig. 7 Presas de O. marmorata. A) Ejemplar de Lumbricus terrestris Linnaeus, 1758 cuya región cefálica ha sido parcialmente digerida (cabeza de flecha negra) junto al ejemplar juvenil que se la estaba comiendo (cabeza de flecha blanca); barra de escala: 1 cm. B) Mucosidad expulsada por un ejemplar adulto de O. marmorata en la que se observa el fragmento de una concha de un pulmonado terrestre (señalado); barra de escala no disponible.

·Akaike, H. (1974) A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control, 19(6), 716–723. ·Carbayo, F., Álvarez-Presas, M., Olivares, C. T., Marques, F. P. L., Froehlich, E. M. & Riutort, M. (2013) Molecular phylogeny of Geoplaninae (Platyhelminthes) challenges current classification: proposal of taxonomic actions. Zoologica Scripta, 42, 508–528. · Ducey, P. K., Messere, M., Lapoint, K. & Noce, S. (1999). Lumbricid prey and potential herpetofaunal predators of the invading terrestrial flatworm Bipalium adventitium (Turbellaria: Tricladida: Terricola). The American Midland Naturalist Journal, 141, 305–314. · Felsenstein, J. (1985) Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution, 39, 783-791. · Guindon, S. & Gascuel, O. (2003) PhyML: A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biology, 52(5), 696-704. · Kraepelin, K. (1901) Ueber die durch den Schiffverkehr in Hamburg eingeschleppten Tiere. Jahrb. Hamburg. Wiss. Anstalte, 18: 185-209. Hamburg 1901. · Schultze, M. & Müller, F. (1857) Beiträge zur Kenntnis der Landplanarien, nach Mithheilungen des Dr. Fritz Müller in Brasilien und nach eigenen Untersuchungen von Dr. Max Schultze. Abteilung Naturische Gesellschaft Halle, 4, 61–74. ·Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. & Kumar, S. (2007) MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 24, 1596–1599.