Quim. Nova, Vol. 30, No. 7, 1597-1605, 2007
Isis Martins Figueiredo e Anita Jocelyne Marsaioli* Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP, Brasil
Artigo
MAPEAMENTO DAS INTERAÇÕES PROTEÍNA-LIGANTE ATRAVÉS DE TÉCNICAS DE RMN DE 1H UTILIZANDO DETECÇÃO DO LIGANTE
Recebido em 11/8/06; aceito em 16/2/07; publicado na web em 29/8/07
SCREENING PROTEIN-LIGAND INTERACTIONS USING 1H NMR TECHNIQUES FOR DETECTING THE LIGAND. NMR is a valuable screening tool for the binding of ligands to proteins providing structural information on both protein and ligands and is thus largely applied to drug-discovery. Among the recent NMR techniques to probe weak binding protein-ligand complexes we have critically evaluated the advantages and disadvantages of STD (Saturation Transfer Difference), WaterLOGSY (Water Ligand Observation with Gradient Spectroscopy), NOE pumping and DOSY-NOESY (Diffusion-Ordered NOESY) using a mixture of BSA (bovine serum albumin) plus salicylic acid, caffeine, citric acid, adipic acid and D-glucose. Keywords: NMR; protein-ligand interactions; bovine serum albumin.
INTRODUÇÃO Os fenômenos físico-químicos desencadeados pelas interações intermoleculares entre ligantes e receptores macromoleculares são a chave para o entendimento dos processos biológicos1. Neste contexto, a ressonância magnética nuclear (RMN) tornou-se a priori uma técnica poderosa no estudo de interações proteína-ligante, sendo capaz de detectar e quantificar as interações com alta sensibilidade sem o conhecimento prévio da função da proteína2. Entretanto, o monitoramento das interações através dos deslocamentos químicos das macromoléculas é difícil de ser analisado sem marcação isotópica. Isso faz com que o estudo das propriedades dos ligantes seja mais apreciado, pois, fornece espectros de RMN mais simplificados e resolvidos que os espectros das macromoléculas. Existem muitos métodos espectroscópicos para a observação do epitopo dos ligantes, como métodos baseados na relaxação3 T2 e transferência de NOE4. Entende-se por epitopo a superfície de contato macromolécula-ligante que pode ser mapeada através dos hidrogênios situados na interface. Os principais experimentos utilizados na obtenção do epitopo do ligante são o STD5,6 (“Saturation Transfer Difference”), WaterLOGSY7 (“Water Ligand Observation with Gradient Spectroscopy”) e NOE pumping8,9. Já o experimento de DOSY-NOESY (“Diffusion-Ordered” NOESY) permite a obtenção do epitopo da proteína. Portanto, estas técnicas fornecem informações complementares acerca das interações proteína/ligante. Este trabalho está voltado para o estudo das funções de proteínas através de suas interações com metabólitos celulares e xenobióticos, aplicando-se técnicas de RMN 1H e de transferência de NOE. O efeito overhauser nuclear (NOE) O NOE (Efeito Overhauser Nuclear) é definido como a mudança na área do sinal proveniente de um núcleo causada pela saturação do sinal de um segundo núcleo. Essa alteração resulta da transferência de polarização entre núcleos acoplados dipolarmente via mecanismos de relaxação spin-rede (T1). Estes experimentos *e-mail:
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têm a característica de “sondar” acoplamentos dipolares que são espectralmente “invisíveis” nas amostras líquidas, mas fornecem informações relevantes sobre os movimentos moleculares e distâncias intra e intermoleculares. A transferência de NOE intermolecular entre macromoléculas e moléculas pequenas foi originalmente observada e descrita há mais de 30 anos10,11, sendo aplicada na determinação estrutural de moléculas ligadas a receptores macromoleculares12,13. O NOE depende do tempo de correlação (τc) das moléculas ligadas e livres. Para pequenas moléculas (MM < 1000-2000) que se movimentam rapidamente (w0τc < 1), são observados NOE positivos com um aumento máximo de sinal de 50%. Para grandes moléculas com movimentos lentos (w0τc > 1), um NOE negativo máximo de –100% é observado14, Esquema 1a. Quando o produto w0τc ≅ 1, os efeitos de NOE são muito pequenos, praticamente nulos. Neste caso, experimentos com trava de spin (“spin-lock”) como ROESY15 (“Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy”) transpõem esta barreira, pois a relaxação cruzada é positiva para todos os valores do tempo de correlação rotacional, como mostrado no Esquema 1b. Na espectroscopia de RMN macromolecular, os NOEs são amplamente empregados na determinação dos sítios ativos de ligação através da transferência de magnetização receptor-ligante. Uma molécula pequena ligada a um receptor macromolecular comporta-se como parte da macromolécula, apresentando NOEs negativos e intensos. Entretanto, este efeito depende da velocidade de troca do equilíbrio. O “calcanhar de Aquiles” dos métodos de RMN para triagem de ligantes ativos é a dificuldade em detectar compostos fortemente ligados, que, por conseqüência, apresentam velocidades de dissociação lentas16. Esta limitação pode ser superada aplicando-se a técnica introduzida por Jahnke et al. utilizando competição pelo sítio ativo da proteína, em que um ligante fraco (repórter) é deslocado por um ligante forte. A vantagem desta metodologia é identificar um ligante em uma grande mistura de compostos e fornecer um Kd aproximado em um experimentos simples. O epitopo pode ser evidenciado a seguir, aplicando-se técnicas como STD e WaterLOGSY17,18. Dessa forma, para implementar e interpretar experimentos de triagem por RMN é necessário revisar alguns conceitos básicos
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Se o processo de troca for lento comparado à diferença de deslocamento químico (δ) entre os estados de ligante livre e ligado |δlivre - δcomplexado| dois conjuntos distintos de sinais serão observados, um para o ligante livre e outro para o ligante complexado. Entretanto, se o ligante se ligar ao receptor macromolecular com baixa afinidade, ou seja, no limite de troca rápida apenas um sinal A, δ é igual à média ponderada das populações de δAcomplexado e δAlivre (Δδ > kex), será observado; A = pcomplexado Acomplexado + plivre Alivre
(1)
sendo pcomplexado a razão populacional do ligante complexado à proteína e plivre a razão populacional de ligantes livres. A Equação 1 poderá ser aplicada somente se a troca química for rápida para escala de tempo da relaxação e do (δ) do sistema, ou seja, se koff for maior que |δlivre - δcomplexado| e maior que as constantes de relaxação (T1-1 ou T2-1) do complexo. Sob essas condições, as alterações dos sinais de RMN de Acomplexado, geradas durante o estado de Lcomplexado) serão transferidas para o estado de Llivre e vice-versa; esse processo de transferência será mediado pela rápida velocidade de troca Lcomplexado e Llivre durante o tempo t necessário para medir A. Então, se koff for maior que a velocidade da relaxação transversal T2-1 do complexo, a velocidade T2-1 de um ligante L em uma mistura de ligante L e receptor R será dada por: T2L-1 = pL,complexado T2-1L,complexado + pL,livre T2-1L,livre
Esquema 1. Dependência do NOE homonuclear entre hidrogênios em função do produto ωoτc, a) em função da relaxação longitudinal e b) em função da relaxação transversal ou T1ρ
sobre o equilíbrio de ligação, de forma a permitir uma melhor distinção entre princípios biológicos e físico-químicos a partir de novos desenvolvimentos na área da RMN. Os fenômenos de troca A natureza dinâmica dos processos de ligação entre ligante e receptor influencia os sinais nos espectros de RMN. Considerando o espectro de RMN do ligante no equilíbrio mostrado no Esquema 2 nota-se que quando a molécula pequena (L) se liga a um receptor macromolecular (R), L adquire propriedades de R e, conseqüentemente, as propriedades (RMN) serão alteradas.
(2)
As populações individuais de pL,complexado e pL,livre dependem de Kd e das concentrações de L e R (Figura 1). A partir da Equação 2 ficou evidente que o sinal do ligante, em uma mistura ligante-receptor em que T2 do receptor é curto, será observado se pL,livre » pL,complexado, ou seja, ligante em excesso em relação ao receptor ([L] » [R]). Nestas condições, se o sinal do complexo não é observado, os sinais do ligante livre fornecerão informações a respeito do epitopo do complexo19. Resumidamente, o efeito de transferência de NOE é melhor observado para sistemas com Kd ≈ 10-3 e 10-9 M (constantes de dissociação para complexos fracos), nas quais o koff é maior que T11 do complexo, por exemplo para T1 ≈ 10 ms o koff > 100 Hz. Para os sistemas em que a velocidade de dissociação é limitada pela difusão o kon será aproximadamente 108 M-1s-1 e para um Kd entre 10-3 e 10-9 M o koff será estimado entre 100 e 100.000.000 Hz. Equilíbrio químico entre várias espécies Na investigação do equilíbrio químico entre mais de duas espécies por RMN é necessário entender as etapas do equilíbrio químico competitivo que acontece nessas situações20. O caso mais simples é com dois ligantes L e I que competem pelo mesmo sítio de ligação do receptor R. Tomando L como o ligante previamente caracterizado e I como um novo ligante ou um “inibidor”, seus equilíbrios podem ser definidos usando Kd=[R][L]/ [RL] e KI=[R][I]/[RI]. O equilíbrio apropriado para esse sistema pode ser escrito da seguinte forma: (3)
Esquema 2. Alterações físicas e espectroscópicas resultantes da associação entre ligantes e macromoléculas. Kd - constante de dissociação; koff - constante de velocidade para dissociação do complexo R-L; k on - constante de velocidade para a formação do complexo R-L; [L] concentração do ligante; [R] concentração do receptor
A adição de I reduz [RL] através de um deslocamento competitivo. Usando os limites de IT=[IR]+[I] e RT=[R]+[RI]+[RL] fica possível definir a constante de dissociação aparente Kd, ap como: (4)
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Mapeamento das interações proteína-ligante através de técnicas de RMN de 1H
em que RT e LT são concentrações totais do receptor e do ligante, respectivamente. Como esperado, o fator (1+[I]/KI) deverá ser ≥ 1 e, desta forma, Kd,ap ≥ Kd. O incremento no valor da constante de dissociação reflete a redução dos sítios de ligação disponíveis de R pela interação competitiva de I. Se a constante de dissociação para o inibidor for conhecida, KI = [R][I]/[RI], torna-se possível estimar o Kd de L pela fração de troca causada por I. Para KI « Kd o inibidor I atuará deslocando L, para IT « LT. Desta forma, um inibidor pode ser um reagente muito útil, se I for um ligante específico e L for um ligante teste; este efeito poderá ser usado para identificar a especificidade do ligante teste. Adicionalmente, se L for um ligante especifico e I um ligante teste, este efeito poderá ser usado em experimentos de triagem por RMN para identificar previamente ligantes desconhecidos. Um outro aspecto importante seria como a troca química, dirigida pelo equilíbrio químico, modula os parâmetros de RMN dos ligantes livres e ligados e do receptor. A observação desses parâmetros modulados forma a base de todos os experimentos de triagem por RMN. Na prática, assume-se que os processos ocorrem sempre com troca rápida. Isso porque as condições experimentais para triagem por RMN são, normalmente, bem estabelecidas para troca rápida. Esses experimentos são, geralmente, realizados com a razão da concentração de ligante total vs receptor total, que tem que ser superior a 10 (LT/RT> 10) e ligantes fracamente associados que possuem um Kd > 100 μM. Os experimentos de triagem por RMN são, primariamente, baseados no 1H; conseqüentemente, kex excede a maioria das diferenças nas velocidades intrínsecas de relaxação de H e freqüências de precessão; isso fornece a garantia de que a troca química rápida é válida. Além disso, nessas condições os parâmetros de RMN se tornam simples médias entre os parâmetros dos ligantes e dos receptores. Existem diversas técnicas de RMN para estudar as interações proteína-ligante e serão discutidas aqui as metodologias que repousam no fenômeno de transferência de NOE para detectar e caracterizar ligantes ativos em misturas complexas. Métodos de RMN aplicados na detecção do ligante O experimento de STD21 (“Saturation Transfer Difference”) como o nome já diz consiste na diferença entre dois experimentos. No primeiro experimento (“on-resonance”), satura-se o receptor (proteína) via um trem de pulsos seletivos de rádio freqüência (rf). Esses pulsos são aplicados na freqüência de ressonância dos núcleos do receptor e não do ligante. A saturação propaga-se através dos hidrogênios do receptor via rede de interações dipolares intramoleculares H-H; esse processo chamado “difusão de spin” é eficiente devido a grande massa molecular do receptor. A saturação é transferida aos compostos ligados via relaxação cruzada intermolecular para a interface receptor-ligante. As pequenas moléculas dissociam-se do receptor, mas permanecem em um estado “saturado” devido aos seus longos tempos de T1 quando livres. Logo, realiza-se um segundo experimento (“off-resonance”) no qual um trem de pulsos de rf idêntico ao primeiro é aplicado fora da faixa de ressonância dos núcleos dos ligantes e do receptor. A subtração dos experimentos fornece um espectro com os sinais dos ligantes22,23. Nos experimentos “on-resonance” as proteínas são irradiadas em torno de -1,00 ppm, pois normalmente os ligantes não possuem sinais nessa região, enquanto as proteínas sim. Se os ligantes não possuem sinais na região aromática esta se torna uma região passível de irradiação. Pulsos seletivos são empregados nas irradiações de saturação dos sinais da proteína, pois estes devem ter sua posição de irradiação exatamente selecionada (Esquema 3).
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Esquema 3. a) Seqüência de pulsos do experimento de STD com uma seqüência adicional WATERGATE para eliminar o sinal residual do HDO. A subtração espectral é realizada depois de cada scan, através de ciclagem de fase. A freqüência do pulso seletivo é colocada ora em –0,4 ppm (“on resonance”) ora em 30 ppm (“off-resonance”); b) representação esquemática do experimento de STD. Quando a proteína se torna saturada, os ligantes que estão ligados a ela se tornam saturados também, através da transferência de NOE intermolecular
Os experimentos de STD são excelentes técnicas para determinação do epitopo e das constantes de ligação dos ligantes, informações estas de suma importância no desenvolvimento de novas drogas. A técnica de STD, desenvolvida por Mayer e Meyer21, representa um dos mais sensíveis e populares métodos de triagem de ligantes e foi inicialmente aplicada na verificação da atividade de ligação entre moléculas de carboidratos e aglutinina de gérmen de trigo (WGA) em solução. Apesar dos inúmeros trabalhos publicados recentemente utilizando o experimento de STD para detectar ligantes em potencial, esta metodologia é inadequada quando receptor e ligantes apresentam sinais nas mesmas regiões do espectro, como no caso de proteínas (R) e polipeptídeos (L) ou DNA (R) e polinucleotídeos (L). Por isso, uma variação do experimento de STD, o WaterLOGSY, foi proposto a fim de identificar um ligante ligado à proteína através de moléculas de H2O usadas como repórteres. O experimento de WaterLOGSY transfere parcialmente a magnetização a partir da água via complexo proteína-ligante para o ligante livre (Esquema 4)16,24. Neste experimento, os sinais dos compostos não ligados aparecem com fase oposta e tendem a ser menos intensos que os sinais dos ligantes que interagem com a proteína. Baseados em muitas observações experimentais, Dalvit e colaboradores25 desenvolveram um experimento que usa o volume de água para detectar a interação entre ligantes e proteína. Essa técnica obteve sucesso no estudo do mapeamento da ligação de dez ligantes de baixa massa molecular (na concentração de 100 μM cada) a uma kinase-2 dependente de ciclina (cdk2, 34 kDa, concentração 10 μM), sendo especialmente útil para complexos em que os participantes são fortemente hidratados, portanto, nesta técnica existe uma clara discriminação entre as moléculas livres e ligadas à proteína. Outro experimento utilizado na triagem de ligantes que interagem com macromoléculas é o NOE “pumping”, que utiliza um filtro de difusão para eliminar os sinais dos ligantes livres na mistura enquanto preserva os sinais do receptor macromolecular, seguido por um tempo de mistura da seqüência NOESY-1D que permite a difusão de spin através de caminhos de relaxação a partir da proteína para os ligantes (Esquema 5). A macromolécula complexada funcio-
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Esquema 4. a) Seqüência de pulsos do experimento de WaterLOGSY. O sinal da água é seletivamente invertido em varreduras alternadas de pulsos de 90° e deslocamentos de fase dos pulsos seletivos de 180°. A transferência de magnetização da água invertida, tanto para os ligantes livres como ligados, ocorre durante o Tinv; b) mecanismos de transferência de magnetização fundamentais do WaterLOGSY. A transferência de magnetização a partir da água para os ligantes ocorre via hidrogênios lábeis do receptor dentro e fora do sítio ativo. As bolinhas azuis indicam as moléculas de água invertidas. Somente os ligantes ligados experimentam ambos tipos de transferência de magnetização
Esquema 5. a) Seqüência de pulsos do experimento de NOE pumping. As barras finas e grossas representam os pulsos de 90° e 180°, respectivamente; b) representação esquemática mostrando a ligação reversível do ligante (L) ao receptor (R) para formar o complexo RL. Os ligantes livres em solução têm seus sinais eliminados pelo filtro de difusão (D). Os caminhos de relaxação, a partir da proteína para o ligante, tornam-se visíveis durante o τm
na como um reservatório de polarização para os seus ligantes. Após a dissociação do complexo, os ligantes que sofreram transferência de magnetização apresentam alteração da amplitude dos seus sinais, efeito NOE, a qual perdura mais que na macromolécula devido aos longos tempos de T1 das moléculas pequenas no estado livre. Para demonstrar a eficiência deste método, Chen e Shapiro8,9 analisaram uma mistura de albumina humana (HSA) e possíveis ligantes como ácido salicílico, ácido ascórbico e a D-glucose, demonstrando que apenas o ácido salicílico interagia com a proteína.
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Uma variação deste experimento é o NOE “pumping” reverso (RNP), que consiste do experimento de NOE “pumping” acrescido de um filtro (CPMG-T2). A avaliação da mistura de HSA e ácidos graxos lineares permitiu evidenciar o ligante ativo na mistura e a maior interação da macromolécula com os ácidos graxos de cadeia mais longa indicando que existe uma resposta espectral maior para os ácidos graxos de cadeia mais longa. O método de NOE “pumping” é pouco sensível se comparado aos experimentos de STD e WaterLOGSY, consumindo um tempo de máquina pelo menos 5 vezes maior. Em princípio, os NOEs intermoleculares que ocorrem entre um ligante e um receptor macromolecular permitem a determinação dos pontos de interação da proteína e do ligante (epitopo) e, portanto, a orientação do ligante no sítio ativo da proteína. Recentemente, o 2D-DOSY26 (“diffusion-ordered spectroscopy”) que usa gradientes de campo pulsados para medir coeficientes de difusão ganhou popularidade, possibilitando a medida exata e não invasiva dos coeficientes de difusão de componentes isolados em misturas complexas. Uma extensão do experimento de DOSY foi proposta e denominada de DOSY-NOESY (“diffusion-ordered NOESY”) por Gorenstein e Gozansky27. O DOSY-NOESY não mede os coeficientes de difusão, mas aplica a difusão molecular no estudo de misturas complexas ou de moléculas em equilíbrio dinâmico entre os estados ligados e livres. É importante que os componentes do sistema apresentem coeficientes de difusão significantemente diferentes para que os NOEs possam ser resolvidos baseados nas velocidades de difusão. Se a velocidade de troca for lenta para a escala de tempo da RMN, as correlações de NOE serão separadas pelos respectivos coeficientes de difusão. Contudo, se a velocidade for de moderada a rápida, os NOEs a partir do complexo terão um coeficiente de difusão aparente baseado na velocidade de troca. Teoricamente, a única exigência para o uso do DOSY-NOESY é a capacidade de separar os coeficientes de difusão entre as espécies de interesse do resto do sistema químico (Esquema 6).
Esquema 6. Seqüência de pulsos do experimento de DOSY-NOESY. Este experimento é uma junção da seqüência STE com a seqüência de NOESY. Os tempos t1 e τm são os tempos de evolução e de mistura, respectivamente
A base para determinação da razão de ligação é que os coeficientes de difusão se alterem pela interação com o receptor. Em um equilíbrio rápido, a Equação 5 descreve o quanto a magnitude da magnetização (I) é afetada pela força do gradiente no experimento de difusão28. (5) em que, K = γδg, γ é a razão magnetogírica, δ é a largura do pulso de difusão, g é a força do gradiente, I0 é a intensidade do sinal quando g = 0, D é o coeficiente de difusão e Δ é o tempo no qual a difusão é monitorada. No experimento de DOSY-NOESY, a intensidade do sinal obtida pela transferência de NOE é determinada pela porção DOSY
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Mapeamento das interações proteína-ligante através de técnicas de RMN de 1H
da seqüência. A Equação 3 pode ser reescrita de forma que a inclinação da reta determinada pela ln[I(K)] (intensidade do sinal) versus g2 (força do gradiente) seja proporcional ao coeficiente de difusão da espécie de interesse. Tashiro e colaboradores29 aplicaram a seqüência de pulsos DOSYNOESY para verificar a interação entre os hidrogênios aromáticos do ácido salicílico e a região alifática da albumina de soro humano (HSA). Este experimento, diferentemente dos outros citados anteriormente, fornece também o epitopo da macromolécula, ou seja, além de mostrar quais hidrogênios da molécula pequena estão envolvidos na interação ainda mostra qual porção da proteína interage com o ligante, sem necessidade de marcação isotópica. Entretanto, é um método que consome em torno de 10 vezes mais de tempo de máquina que os outros experimentos citados anteriormente. Vários critérios devem ser considerados para a escolha do método certo para identificar e caracterizar o ligante através da espectroscopia de RMN. A Tabela 1 é sumário de alguns desses métodos2. RESULTADOS E DISCUSSÃO A parte introdutória deste artigo apresentou as quatro metodologias mais utilizadas nos estudos de interação receptorligante. Entretanto, a literatura é escassa, ou melhor, inexistente com relação a uma análise comparativa destas técnicas utilizando uma mesma amostra. Portanto, este trabalho teve como objetivo principal comparar os resultados obtidos aplicando estas quatro técnicas a uma amostra modelo de albumina de soro bovino (BSA) na presença de ácido adípico, ácido cítrico, cafeína, D-glucose e ácido salicílico. Essas moléculas pequenas foram utilizadas como modelos de metabólitos celulares, pois é conhecido que estas apresentam afinidade com as proteínas do sangue, com exceção da Dglucose que foi usada como controle negativo. Neste estudo, as concentrações das macromoléculas não foram variadas. Mudanças na concentração da proteína podem aumentar a viscosidade da solução se comparada à concentração do ligante, resultando em mudanças nos coeficientes de difusão do ligante independente da interação proteína/ligante. Foram realizados três experimentos modelos: 1) com 90 μM de BSA (concentração determinada por UV) e uma mistura de ligantes, chamada de mistura 1, contendo 9,84 mM de ácido salicílico (1), 10,2 mM de cafeína (2), 10,5 mM de ácido cítrico (3), 10,4 mM de ácido adípico (4) e 10,0 mM de D-glucose (5) em tampão fosfato (pH = 7) em 99,9% de D2O; 2) com 90 μM de BSA e uma mistura, chamada de mistura 2, contendo 10,9 mM de (1) e 10,3 mM de (5) em tampão fosfato (pH = 7) em 99,9% de D2O e 3)
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com 90 μM de BSA e uma outra mistura, chamada de mistura 3, contendo 10,2 mM de (2) e 10,3 mM de (5) em tampão fosfato (pH = 7) em 99,9% de D2O. Estes experimentos permitiram, além da otimização dos parâmetros experimentais, a investigação do equilíbrio químico competitivo entre mais de duas espécies por RMN. Uma primeira avaliação da interação entre os ligantes e BSA já pode ser feita através do espectro RMN de 1H observando a variação dos deslocamentos químicos (δ) dos ligantes da mistura 1 na ausência e na presença de BSA. O δ0 observado no espectro dos ligantes na presença da BSA é a média ponderada dos δ do ligante nos estados livre e ligado, como mostrado na Equação 6. δ0 = (δL x fL) + (δB x fB)
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em que, fL e fB são as frações molares dos ligantes livres e ligados. Além disso, o pequeno alargamento dos sinais dos ligantes (1) e (2) na presença de BSA e não a duplicação dos sinais é outro indicativo de que a interação acontece em um regime de troca rápida. Os números sobre as estruturas abaixo representam os δH dos respectivos sinais na presença de BSA e os números em vermelho representam as ΔδH dos sinais na presença e na ausência de BSA, Esquema 7. Foram realizados experimentos de difusão aplicando a seqüência de pulsos DBPPSTE30 e os valores de Kd para os ligantes nas misturas 1 e 2 puderam ser calculados a partir da Equação 7, como mostrado na Tabela 2.
Esquema 7. Os números sobre as estruturas acima representam os δH dos respectivos sinais na presença de BSA e os números em vermelho representam as ∆δH dos sinais na presença e na ausência de BSA
Tabela 1. Técnicas de RMN para identificação e caracterização de ligantes
Proteínas (>30 kDa) Proteínas (
