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Departamento de Química, Biotecnologia e Engenharia de Bioprocessos Microbiologia Industrial Experimental - 2016/1 Profs.: Bruno Xavier / Katialaine

Relatório de Aula Prática

Título: Metabolismo de Saccharomyces cerevisiae

Átila Josué Pereira Rodrigo Felipe Cano Stephanny Cristyne Eroles Shimada Tiago Hernane Honório Nunes

Ouro Branco, Junho de 2016

RESUMO O metabolismo da Saccharomyces cerevisiae é afetado por diversos fatores, de forma a resultar diversas respostas fisiológicas e como consequencia a produção de diferentes metabólitos. Por este motivo é necessário que se tenha um conhecimento da atuação destes fatores no meio para que se possa assim obter um controle mais efetivo nas atividades que venha a se realizar com o microrganismo. No presente experimento, avaliou-se efeito da concentração de sal no comportamento S. cerevisiae por meio da fermentação em estado sólido. O perfil de fermentação foi avaliado através da quantidade de gás carbônico produzido pela levedura, chegando -se portanto aos seguintes resultados: inibição do crescimento microbiano, redução da produtividade de etanol e acúmulo de glicerol, quando em altas concentração do sal. Conforme enunciado pela literatura estes fenômenos decorreram possivelmente pelo efeito inibidor do cloreto de sódio nas enzimas piruvato carboxilase e etanol desidrogenase.

1. INTRODUÇÃO Saccharomyces cerevisiae é considerado como o microrganismo eucarioto mais estudado atualmente. Devido a sua não patogenicidade e sua suscetibilidade à modificações genéticas através da técnica de DNA recombinante, S. cerevisiae assumiu um significativo potencial biotecnológico na produção de alimentos e bebidas, bem como na indústria farmacêutica (OSTERGAARD; OLSSON; NIELSEN, 2000). S. cerevisiae é uma levedura anaeróbia facultativa, portanto, o seu modo de aplicação e a seleção adequada do meio de cultivo são considerações importantes para obter o estado fisiológico desejado. De modo geral, substrato, fonte de hidrogênio, pH, saís minerais e outros aditivos são parâmetros que influenciam tanto crescimento da biomassa quanto no rendimento do bioproduto em questão (NEVES, 2003). Na fermentação da massa de pão por S. cerevisiae, glicose e frutose, esta oriunda da hidrólise da sacarose pela enzima invertase, são as principais fontes de carbono do meio, e são convertidos aos produtos de fermentação no interior na célula. A concentração máxima de açúcares no meio é de 15 % m/v, pois assim há açucar suficiente para inibir seletivamente a respiração celular e induzir a fermentação alcoólica sem promover um aumento expressivo na pressão osmótica da célula (Laboratório de Biologia Molecular e Biotecnologia de Leveduras – UFSC, 2012). Não menos importante, a concentração de saís no meio é um fator que promove redução do crescimento celular quando em altas concentrações, uma vez a da atividade da água é minimizada (RODRIGUES; SANT'ANNA, 2001).

Para tanto, o presente estudo tem por objetivo avaliar o metabolismo da Saccharomyces cerevisiae através de variações na concentração de extrato de levedura, sal e sacarose. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Homogenizou-se farinha de trigo em água destilada na proporção xx e a massa obtida foi levada ao repouso por 30 minutos. Em seguida, fracionou-se a massa em pequenos pedaços de aproximadamente 25 g. As amostras foram colocadas dentro de pequenos balões de latex e adicionou-se em cada balão sua respectiva quantidade de sal, sacarose e extrato de levedura, segundo o planejamento abaixo. A massa de cada amostra foi registrado e os balões foram colocados na estufa à 40 °C por 48 horas. Após o cozimento da massa de pão, furou-se o balão de modo a liberar todo o gás retido nele e a massa da amostra foi registrada. 3. RESULTADOS O experimento não obteve sucesso, provavelmente devido a erro dos manipuladores, não sendo possível o levantamento de resultados plausíveis que se alinhem ao esperado na literatura. Ressalta-se que as amostras não se apresentavam intactas, não conferindo confiabilidade para utilização dos resultados. Logo a discussão e conclusão a seguir serão baseadas serão baseados nos estudos desenvolvidos por Chia-Jenn Wei e colaboradores (1982), em que avaliaram o efeito da concentração de cloreto de sódio na fermentação alcoólica de leveduras de panificação (Saccharomyces cerevisiae). Os resultados obtidos pelos autores estão representados pelas curvas abaixo.

a)

b)

Figura 1. Efeito dos níveis de NaCl no crescimento micriobiano (a) e na produtividade de etanol (b) (WEI; TANNER; MALANEY, 1982).

Como observado, houve um descréscimo tanto no crescimento de biomassa de levedura quanto na produção de etanol com o aumento do nível de NaCl do meio. 4. DISCUSSÕES Conforme Chia-Jenn Wei e colaboradores (1982), os efeitos da concentração de NaCl em meios semi-sólidos apresentaram-se essencialmente semelhantes aos efeitos em meio líquido. Com o aumento da concentração de NaCl, observou-se: o decréscimo no crescimento da levedura, o alongamento da fase lag da curva de crescimento da biomassa, a redução do rendimento de etanol e do transporte de açúcar, e o aumento da produção de glicerol (WEI; TANNER; MALANEY, 1982). A literatura demonstrou quatro possíveis explicações que justificam os fenômenos observados. Dentre as duas primeiras, destacam-se os efeitos fisiológicos de estresse osmótico e de toxicidade dos íons no crescimento da levedura, pois inibem o metabolismo fermentativo do organismo quando em altas concentrações. A terceira explicação enuncia o efeito inibitório na ação da piruvato carboxilase da levedura. Quando em altas concentrações de sais, o acúmulo de acetaldeido é minimizado e, consequentemente, o mesmo é observado na produção de etanol. Na ausência de acetaldeído, faz-se uso de outro aceptor final de hidrogênio para oxidar o NADH oriundo do metabolismo da glicose através da via glicolítica. Nessa teoria, propõe-se que o fosfogliceraldeído é o aceptor substituto e a sua redução produz glicerol (WEI; TANNER; MALANEY, 1982). Por fim, a última teoria sugere que eletrólitos inibem a ação da álcool desidrogenase quando em presentes em altas concentrações provocando o decaimento na produtividade de álcool e o acúmulo de acetaldeído. 5. CONCLUSÃO Com as análises das variações das condições de cultivo, a fim de conhecer os resultados metabólicos variados, consideramos que a concentração de cloreto de sódio adicionado à massa é em grande parte responsável pela inibição da atividade metabólica da levedura Saccharomyces cerevisiae. Acredita-se, de acordo com a metodologia utilizada para o experimento e pela comparação com a literatura que se o mesmo tivesse obtido sucesso a principal característica que teria sido observado seria o não crescimento do microrganismo, resultando em pouca, ou nenhuma fermentação. Na produção de pães, o sal é responsável pela estrutura coesiva da massa, sendo necessário uma faixa variação de concentração, onde a levedura não sofra interferências inibitórias.

6. REFERÊNCIAS CASEY, R.; MOISER, N. S.; ADAMEC, J.; STOCKDALE, Z.; HO, N; SEDLAK, M. Effect of salts on the Co-fermentation of glucose and xylose by a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology for Biofuels, v. 83, n. 6, 2013. Laboratório de Biologia Molecular e Biotecnologia de Leveduras – UFSC, Metabolismo da

Sacarose

em

S.

cerevisiae.

Disponível

em:

. Acesso em: 30 maio. 2016. NEVES, L. C. M. Obtenção da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase utilizando 'Saccharomyces cerevisiae' W303-181. 2003. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Fermentações) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo,

2003.

Disponível

em:

. Acesso em: 2016-05-30 OSTERGAARD, S.; OLSSON, L.; NIELSEN, J. Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Lyngby, v. 64, n. 1, p. 34-50, 2000. RODRIGUES, A. M.; SANT'ANNA, E. S. Efeito do cloreto de sódio na produção de proteínas (Saccharomyces cerevisiae) em fermentação semi-sólida. Ciência & Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 21, n. 1, p. 57-62, 2001. WEI, C.; TANNER, R. D.; MALANEY, G. W. Effect of Sodium Chloride on Bakers' Yeast Growing in Gelatin. Applied and Environmental Microbiology, Tennessee, v. 43, n. 4, p. 757-763, 1982.