Métodos para editar o genoma - CRISPR

Apresentação de Biologia Molecular:

MÉTODOS PARA EDITAR O GENOMA (14.12.15)

Por:

Mariana Valério

Joana Pereira

André da Silva

Filme GATTACA, 1997, de Andrew Niccol

“Interessa-me muito mais que percebam os conceitos do que pormenores tecnicistas.” Profª Margarida

“Interessa-me mais passar-vos noções básicas do que dados enciclopédicos. Para isso, temos já livros e computadores." André

Anotações em rede de regulação

No zoo de Lisboa.

DNA

RNA

Proteína

DNA

RNA

Proteína

siRNA

Difícil para DNAanimais.

Respostas RNAimunitárias.

Off-targets.

DNA Só para transcritos.

siRNA

Não silenciar. Proteína

RNases.

RNA

Silenciar pouco.

Proteína €€€.

Só para perdas de função.

Risco in vivo.

Beethoven 9 - Chicago Symphony Orchestra, Maestro Riccardo Muti

Corte

Edição Rudin et al., 1989; Plessis et al., 1992; Rouet et al., 1994; Choulika et al., 1995; Bibikova et al., 2001; Bibikova et al., 2003

Nuclease

Nucleases:

12-18 nt Nuclease Dedos de Zinco

ZFN

30-40 nt Nuclease efetor pseudoativador de transcrição

TALEN

“A maioria dos esquemas de dedos de zinco são a preto e branco.” Dr. Feng Zhang, MIT

Yi Chuan et al., (2014) Production of GHR doubleallelic knockout Bama pig by TALENs, CG, 36(9): 903-11.

“no futuro, os clientes poderão escolher a cor e o padrão do pelo”

CRISPR-CAS

Nuclease

Interação

Alvo (nt)

Corte

ZFN

Prot-DNA

12 até 18

1

TALEN

Prot-DNA

30 até 40

1

CRISPR-Cas

RNA-DNA

20+3

2

“muito bioquímicos” Profª Margarida

“Assisti a dois enormes desenvolvimentos desde que estou em Ciência: CRISPR e PCR.” Publicações com CRISPR-Cas

John Schimenti, geneticista, Cornell University, New York.

CRISPR-Cas

DNA

20 nt RNA

DNA Bactéria

? RNA

DNA Alvo (virus)

CRISPR-Cas PAM

DNA

20 nt RNA

1º, Planeamento

2º, Compras:

• Nuclease Cas Plasmídeo ~57€.

• RNA-guia Plasmídeo ~27€.

• Oligo

Entrega: • Plasmídeo • Vírus

Entrega: • •

mRNA Complexo ribonucleoproteico

John A Zuris et al.; (2015) Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient proteinbased genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology 33, 73–80.

“Isto democratizou a tecnologia para que todos a possam usar. É uma enorme revolução." James Haber, biólogo molecular, Brandeis University, Massachusetts.

reparação dependente de homologia

junção não homóloga

Mario Capecchi

Sir Martin Evans

Oliver Smithies

“Com o CRISPR-Cas, temos animais transgénicos em 3 semanas em vez de 2 anos.” Dr. Feng Zhang, MIT

reparação dependente de homologia

junção não homóloga

Futuro Presente No laboratório

“Podíamos ter preparado mais alvos...”

• Multiplexing •

Le Cong et al; Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems; Science 15 February 2013: Vol. 339 no. 6121 pp. 819-823

•

George Curch; et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9, Science 15 February 2013: Vol. 339 no. 6121 pp. 823-826

•

Jaenisch R. et al; One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering, Cell. 2013 May 9;153(4):910-8.

• Nicking •

William C Skarnes et al; (2014) Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects; Nature Methods 11, pp. 399–402

•

Le Cong et al; Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems; Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23

• Regulação (CRISPRi) •

Gilbert et al., (2013); Qi et al., (2013)

• Imagiologia •

Huang B. et al.; Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System, Cell. 2013 Dec 19;155(7):1479-91

>50% bactérias e >90% arqueas têm locais CRISPR Zetsche et al.; Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71

Futuro Presente No laboratório Na agricultura

• Novos transgénicos. • Qual destes é o resultado de transgénicos?

ou

Futuro Presente No laboratório Na agricultura No ambiente

• Gene drive

George Church; Oye, K. A. et al.; (2014) Science 345, 626–628.

Valentino Gantz; Ethan Bier; (2015) Science 348, 442-444.

“Transmitiu-se a ele próprio à geração seguinte com 97% de eficiência”!

“invasão do genoma”.

“a universidade deu luz verde à experiência na condição de que

cumprissem certas medidas de segurança, como por exemplo: as moscas eram mantidas em 3 camadas de tubos e caixas e o laboratório trancado atrás de 5 portas com abertura por impressão digital.” “O que vai literalmente agora espalharse não são as moscas mutantes, mas o protocolo deles.” George Church, Harvard

Futuro Presente No laboratório Na agricultura No ambiente Na saúde • “editing out desease” • H. Yin et al., (2014) Nat. Biotechnol. 32, 551. "Quando alguém diz que não consegue imaginar algo e depois acontece, a pessoa deve ficar envergonhada pela sua falta de imaginação." George Church, Harvard

“A edição do genoma por CRISPR-Cas9 é possível em animais adultos e tem potencial para uma futura correção de doenças genéticas em humanos.”

“Terá ultimamanete um papel na terapêutica humana.” James Wilson, geneticista, University of Philadelphia

"Veremos, certamente, aplicações clínicas desta tecnologia nos próximos 10 anos.” Jennifer Doudna, bioquímica, University of California

Futuro Presente No laboratório Na agricultura No ambiente Na saúde •

“Breve história da terapia génica: exemplos de sucesso e desaires.”

Terapia Génica •

Hemofilia [Nathwani AC, et al.; N Engl J Med. 2014 Nov 20;371(21):1994-2004.]

•

Fibrose quística

•

HIV

dose do vetor adenovírus resultou numa

•

Cancro [Couzin-Frankel, 2013]

melhoria clínica. No acompanhamento de 3

“Em 10 pacientes com hemofilia severa, uma

anos, não foram reportados efeitos tóxicos.”

•

Edição de embriões [Liang, P. et al.; (2015) Protein Cell 6, 363–372]

(Bio)ética

Primeiro…

Sondagem aos alunos de BM de 2015 n = 64 5 alíneas

1 - Ter o seu DNA lido de forma gratuita através de uma amostra de saliva.

Contra Não sabe A favor

Contra

Contra

Não sabe

Não sabe

A favor

A favor

2 - Modificar o seu DNA para eliminar uma certa doença.

Contra Não sabe A favor

Contra

Contra

Não sabe

Não sabe

A favor

A favor

3 - Modificar o seu DNA para melhorar alguma característica.

Contra Não sabe A favor

Contra

Contra

Não sabe

Não sabe

A favor

A favor

4 - Modificar o DNA dum filho seu para eliminar uma certa doença.

Contra Não sabe A favor

Contra

Contra

Não sabe

Não sabe

A favor

A favor Contra Não sabe A favor

Pew Research Center

5 - Modificar o DNA dum filho seu para melhorar alguma característica.

Contra Não sabe A favor

Contra

Contra

Não sabe

Não sabe

A favor

A favor Contra Não sabe A favor

Pew Research Center

Conclusões: • População bastante aberta a modificações para eliminar alguma doença mas não para melhorar alguma característica. • Os americanos estão menos dispostos a mexer nos bebés para tratar doenças do que nós mas mais dispostos a melhorar características nos bebés do que nós. • Rapazes dizem mais que sim e raparigas dizem mais que não.

Lenta

Insensível Evolução Natural Natural Aleatória

"Injusta" Evolução Natural Rápida

Sensível Evolução Natural Artificial Racional

"Justa"

? “Ah, isso tem químicos!”

Lenta

Insensível Evolução Natural Natural Aleatória

"Injusta" Evolução Natural Rápida

Sensível Evolução Natural Artificial Racional

"Justa"

3 opções: • ↓Homem • ↑Homem, ↓intervenção do Homem • ↑Homem, ↑ intervenção do Homem

E agora!?

• Problemas técnicos? • Problemas éticos e sociais? • Tretas?

CIÊNCIA

“Voar ensina-nos a ultrapassar o medo com o conhecimento.” Oliver Smithies

terminus a quo (limite a partir do qual)

1ª Lei de Murphy: “Se algo pode correr mal, correrá mal.”

Obrigado. Mariana Valério

Joana Pereira

André da Silva

Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic, Repeats repetição

espaçador

Clustered, Regularly Interspaced, Short Palindromic, Repeats repetição

espaçador

CRISPR-asociated

Doença do envelhecimento Tentação de melhorar não é nova. Por exemplo, no século XIX, quando se descobriu que os testículos tinham qualquer coisa que trazia virilidade ao Homem, criaram-se injeções miracolosas. • Foi comercializado: “Spermine”! Era o cogumelo do tempo da altura, mas muito mais conceituado, por incrível que pareça. Entre os clientes estavam Freud [Fróide] e o poeta W. B. Yeats [eits] que ganhou um nobel e depois das injeções produziu os seus melhores poemas.

• Criou-se todo um negócio à volta disto. Por exemplo, havia uma empresa chamada Electro Medical Doctors que dava injeções de água destilada por 25$. (Homeopatia da altura…) • Na verdade, todo este rejuvenescimento não passava de placebo. (Freud percebeu isso.)

W. B. YEATS

SIGMUND FREUD

POETA

NEUROLOGISTA

“(…) os estudos de genética, a-pesar-de não terem ainda atingido a segurança que há a esperar, contribuíram já em muito para o aperfeiçoamento das espécies animais e vegetais, tendo já o Homem a possibilidade, em certos casos prática, em todos teórica, de modificar à sua vontade os seres vivos” “(…) sendo certo, no entanto, que a fase experimental em que ainda nos encontramos pode dar origem a acidentes, que são muito lamentáveis, mas que nada provam quanto ao valor fundamental dos processos empregados.” Agostinho da Silva, Alimentação humana, 1942.

"O poder da Ciência para o bem e para o mal tem perturbado outros espíritos para além dos nossos." "Não existe doutrina mais ameaçadora e degradante do que a ideia visionária de que podemos de qualquer maneira por de lado a responsabilidade pelas decisões da nossa sociedade, passando-a para alguns cientistas revestidos duma magia especial." "Aquilo que um cientista faz é composto de dois interesses: o da sua época e o seu próprio. Todavia, não são as necessidades da época que dão ao cientista individual o seu sentido de prazer e de aventura e aquela emoção que o leva a trabalhar até altas horas da noite quando todos os outros abandonam o trabalho por volta das 5. (...) O cientista encontra-se pessoalmente absorvido no seu trabalho, tal como o artista. O sentido de exploração é tanto urgente como maravilhoso.“ Jacob Bronowski, Ciência e alores humanos, 1956.