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Chirale b-Aminosäuren sind gefragte Bausteine für Feinchemikalien und Pharmazeutika. Da es momentan keine wirtschaftliche Methode für deren chemische Synthese gibt, soll ein modifiziertes Hydantoinase/CarbamoylaseSystem für die biokatalytische Herstellung etabliert werden. Da für die Synthese von b-Aminosäuren Dihydrouracile als Substrat dienen, werden cyclische Amidasen mit der Fähigkeit, diese heterocyclischen Sechs-Ring-Systeme zu spalten, eingesetzt. Zunächst wurden ausgehend von Grundchemikalien einige aromatische Dihydrouracile chemisch synthetisiert. In Ganzzellbiotransformationen mit Wildstämmen, die cyclische Amidaseaktivität besitzen, wurden diese Substrate zur entsprechenden N-Carbamoyl-b-aminosäure hydrolysiert. Einige Stämme setzten dabei bevorzugt ein Enantiomer um. Mittels Biotransformationen mit Zellrohextrakten konnte gezeigt werden, dass diese Enantioselektivität
Abbildung. Möglicher modifizierter Hydantoinase-Prozess zur Synthese enantiomerenreiner b-Aminosäuren ausgehend von substituierten Dihydropyrimidinen. R-Aryl, (1) Aryl-substituiertes Dihydropyrimidin, (2) N-Carbamoyl-b-Aminosäure, (3) b-Aminosäure.
tatsächlich auf die Amidasen zurückzuführen ist und nicht dem Transport in die Zelle zuzuschreiben ist. Durch Identifikation der für die cyclische Amidase codierenden Gensequenz eines Isolats wurden die Voraussetzungen geschaffen, dieses Enzym rekombinant in E. coli zur Verfügung zu stellen. Ein Screening nach Carbamoylasen für die Folge-
reaktion zur b-Aminosäure wird durchgeführt. Ziel ist es, einen Ganzzellbiokatalysator zu entwickeln, der das cyclische Amidase/Carbamoylase-System für den effizienten Umsatz von aromatischen Dihydrouracilen zu enantiomerenreinen b-Aminosäuren ermöglicht.
V7.24
Kinetische Modellierung eines Zwei-Enzym-Systems zur Oxidation von Cholsäure M. Braun1) (E-Mail:
[email protected]), H. Link1), L. Liu2), R. Schmid2), A. Aigner3), D. Weuster-Botz1) 1) 2) 3)
Technische Universität München, Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, Boltzmannstraûe 15, D-85748 Garching, Germany Universität Stuttgart, Institut für Technische Biochemie, Allmandring 31, D-70569 Stuttgart, Germany PharmaZell GmbH, Rosenheimer Straûe 43, D-83064 Raubling, Germany
DOI: 10.1002/cite.201050267
Die Reduktion und Oxidation von Steroiden im Intestinaltrakt werden von mikrobiellen Hydroxysteroiddehydrogenasen (HSDH) katalysiert. Der Einsatz einer 12a-HSDH stellt eine Alternative zur chemischen Synthese von 12-Ketochenodesoxycholsäure dar. Zur NADP+Regeneration können Alkoholdehydrogenasen (ADH) eingesetzt werden. Die Identifikation von optimalen Reaktionsbedingungen in solchen komplexen biokatalytischen Systemen benötigt üblicherweise zeit- und kostenintensive
Experimente. Kinetische Modelle helfen, diesen Aufwand zu reduzieren. Es konnten für beide Enzyme mechanistische Modelle bestehend aus elf Parametern unter Beachtung des geordneten bi-bi Mechanismus mittels Verlaufskurven separat voneinander identifiziert werden, wobei hohe Substratkonzentrationen berücksichtigt wurden. Beide Modelle wurden kombiniert und validiert, wobei das kinetische Prozessmodell viele Reaktionsverläufe akkurat vorhersagen konnte. Anschlie-
ûend wurden die Prozessdaten zur Verbesserung des kombinierten Modells verwendet. Das kinetische Modell ist in der Lage, Prozessverläufe mit verschiedenen Ausgangskonzentrationen an Substraten, des Cofaktors und der Enzyme vorherzusagen. Eine Prozessoptimierung wurde in silico durchgeführt, wobei die Menge an benötigten Enzymen geschätzt wurde, die innerhalb einer vorgegebenen Prozesszeit zu Maximalumsätzen führt.
V7.25
Microwave-Assisted Biocatalysis Employing Glycosidases
M. Sc. C. Kamerke1) (E-Mail:
[email protected]), Dr.-Ing. A. Spieû2), Dr. rer. nat. M. Fioroni3), Univ.-Prof. Dr.-Ing. J. Büchs2), Univ.-Prof. Dr. rer. nat. U. Schwaneberg3), Univ.-Prof. Dr. rer. nat. L. Elling1) 1)
RWTH Aachen, Abteilung für Biotechnologie und Helmholtz-Institut für Biomedizinische Technik, Labor für Biomaterialien, Department of Biotechnology and Helmholtz-Institute for Biomedical EngineeringRWTH Aachen, Worringerweg 1, D-52056 Aachen, Germany RWTH Aachen, Biochemische Technik, Aachen, Germany 3) RWTH Aachen, Institut für Biotechnologie, Aachen, Germany 2)
DOI: 10.1002/cite.201050059
www.cit-journal.de
2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
Chemie Ingenieur Technik 2010, 82, No. 9
Chemie Ingenieur Technik
Die mesophile b-Galactosidase aus Bacillus circulans katalysiert den Transfer von Galaktose aus Laktose auf UDP-Glc oder UDP-GlcNAc. Ein Verlust der Produkte UDP-Laktose oder UDP-LacNAc durch Hydrolyse kann vermieden werden, indem diese Reaktion bei ±5 C durchgeführt wird, wodurch sich eine Verlängerung der Reaktionszeit ergibt [1]. Um die Produktausbeute zu maximieren, ist eine rationale Kombination verschiedener Reaktionsparameter wie Tempera-
7 Biotechnologie
tur, pH-Wert, Substratkonzentration und Enzymeigenschaften erforderlich. Die Auswirkung von Mikrowelleneinstrahlung wurde dabei bisher nur für wenige Reaktionen untersucht. Hier stellen wir die ersten Ergebnisse zum Einfluss der Mikrowelleneinstrahlung auf die synthetische und hydrolytische Reaktion der mesophilen b-Galactosidase aus Bacillus circulans vor. Die vorläufigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Produkthydrolyse
bereits bei mittleren Temperaturen unter Mikrowelleneinstrahlung verlangsamt ist, während sie unter thermischen Bedingungen sehr rasch verläuft. Mikrowelleneinstrahlung könnte daher das Potenzial besitzen, Produktverluste durch Hydrolyse zu minimieren. [1] A. Zervosen, Biol. Chem. 2001, 382, 299.
V7.26
Produktionsoptimierung industrieller Proteine mit der Sekretions-Toolbox Dr. C. Leggewie1) (E-Mail:
[email protected]), Dr. C. Degering1), Dr. M. Puls1), PD Dr. T. Eggert1) 1)
evocatal GmbH, Merowingerplatz 1a, D-40225 Düsseldorf, Germany
DOI: 10.1002/cite.201050415
Bei der bakteriellen Produktion von industriellen Proteinen ist es von groûem Vorteil, wenn diese in das Fermentationsmedium sekretiert werden. Hierdurch wird insbesondere die Aufreinigung erleichtert und macht den Gesamtprozess effizienter und konkurrenzfähiger. Ein Ansatzpunkt, die Sekretionseffizienz zu verbessern, ist der Austausch der für den Transport über die Bakterienmembran obligatorischen Signalsequenz. Es zeigte sich jedoch, dass nicht jede Signalsequenz für alle Proteine gleich gut geeignet ist, d. h., wenn
ein Protein mit einer bestimmten Signalsequenz gut sekretiert wird, so wird nicht zwangsläufig ein weiteres Zielprotein mit dieser Signalsequenz ebenso gut in den Kulturüberstand transloziert. Dieses Problem kann durch die randomisierte Fusion unterschiedlicher Signalsequenzen mit dem jeweiligen Zielprotein gelöst werden. Diese Technologie hat evocatal weiterentwickelt und verfügt über einen umfangreichen Pool von mehr als 600 Signalsequenzen aus verschiedensten Bakterien, die randomisiert auf die beste
Sekretionsleistung getestet werden können. Hiermit konnte gezeigt werden, dass die zufällige Fusion aller bei evocatal verfügbaren Signalsequenzen mit verschiedenen Zielproteinen jeweils andere ¹besteª Signalsequenzen herausfilterte. Mit Hilfe dieser Technologie konnte die Sekretionseffizienz für verschiedene industrielle Enzyme signifikant verbessert und auch in produktionsrelevanten Systemen erfolgreich angewendet werden.
V7.27
Reaktionskaskade für die Produktion von 2-Keto-L-Gulonsäure Dr. B. Osterath1), Dr. T. Kubitzki1) (E-Mail:
[email protected]), Prof. Dr. C. Wandrey1), Dr. S. Lütz1,2) 1) 2)
Forschungszentrum Jülich GmbH, Institut für Biotechnologie 2, D-52425 Jülich, Germany Novartis Institutes for BioMedical Research, CH-4002 Basel, Switzerland
DOI: 10.1002/cite.201050145
Das für die Lebensmittel-, Kosmetikund pharmazeutische Industrie benötigte Vitamin C (ca. 110 kt p.a.) wird überwiegend auf chemischem Wege hergestellt [1]. In den vergangenen Jahren erlangten die biotechnologischen Verfahren, die meist Vitamin C-Vorstufen produzieren, an Bedeutung. Diese Vorstufen lassen sich dann sehr einfach zu Vitamin C weiterverarbeiten.
Chemie Ingenieur Technik 2010, 82, No. 9
Wir haben einen kontinuierlichen zweistufigen Prozess für die Produktion von 2-Keto-L-Gulonsäure (2-KLG), einer Vitamin C-Vorstufe, aus Glucose entwickelt. Zuerst erfolgt die Oxidation von Glucose zu 2,5-Diketogluconat (2,5DKG) durch ruhende Gluconobacter oxydans-Zellen, anschlieûend wird 2,5-DKG durch 2,5-Diketo-D-Gluconatreduktase (2,5-DKGR) zu 2-KLG reduziert. Die Re-
aktions- und Prozessparameter wurden für beide Reaktionsschritte separat optimiert. So konnte für die erste Teilreaktion die Aktivität der ruhenden Zellen, die Ausbeute und die Raumzeitausbeute (RZA) im kontinuierlichen Rührkessel gesteigert werden. Die Reduktion wurde in einem Enzymmembranreaktor durchgeführt, um so die Cofaktorregenerierung zu ermöglichen. Durch an-
2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
www.cit-journal.de
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