MORFOMETRÍA GEOMÉTRICA: PRINCIPIOS TEÓRICOS Y MÉTODOS DE EMPLEO Nicolás Jaramillo-O. Profesor Asociado Instituto de Biología, Universidad de Antioquia Calle 62 # 52-59, SIU, laboratorio 620, Grupo de Biología y Control de Enfermedades Infecciosas Tel.: 57-4-2196521. Fax: 57-4-2196565 e-mail:
[email protected] Medellín, Colombia INDICE 1. Resumen 2. Palabras claves 3. Introducción 4. Variabilidad morfológica 5. Selección de puntos anatómicos y toma de datos 5.1. Puntos anatómicos de referencia, contornos 5.2. Homología 6. Análisis generalizado de Procrustes y la técnica de las deformaciones de placas delgadas 6.1. Visualización de las deformaciones de conformación 6.2. Uso de los pseudo-puntos anatómicos deslizantes (“Sliding semi-landmarks”) 6.3. ¿Qué hacer con las regiones curvas de la anatomía? 7. Análisis estadísticos (univariados y multivariados) 8. Alometrías 9. Asimetrías 10. Agradecimientos 11. Referencias 1. RESUMEN Uno de los objetivos principales en Biología es entender el origen, la naturaleza y las causas de cambio en los patrones de variación. El análisis cuantitativo de la variación fenotípica y sus relaciones con la ambiental, genética y aleatoria (o de origen desconocido) ayuda enormemente a alcanzar tal objetivo. La primera propiedad de los organismos que resalta a nuestra vista es su variabilidad morfológica. Un sinnúmero de factores biológicos y no-biológicos subyacen a tal variabilidad interactuando de un modo complejo para modelar los individuos, las poblaciones y las especies. Los factores biológicos son el producto de procesos micro- y macro-evolutivos interactuando con el ambiente. Es así como, el tamaño y la conformación morfológica resultan de la interacción entre los efectos maternos y la calidad de vida durante el desarrollo con las combinaciones genotípicas heredadas de los padres, en un marco genético dado por la historia evolutiva. Las poblaciones y especies, entonces,
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adquieren rasgos morfológicos propios que impactan de manera diferencial su biología y ecología. Cuantificar y analizar la variación morfológica que resulta de tales interacciones es el principal objetivo de la morfometría. Se complementa este objetivo con la cuantificación de la co-varianza entre la morfología y otras variables de origen genético, climático, geográfico, etc. Este es un capítulo introductorio para quienes desean conocer los principios teóricos de la morfometría geométrica y los métodos más usados para su aplicación. Para ello se presentan de manera muy sucinta las relaciones entre las técnicas morfométricas y los estudios de biología de las poblaciones, haciendo una breve reflexión sobre la variabilidad morfológica. Se enseñan las principales técnicas de adquisición y manejo de las mediciones. Se enseñan los métodos de procesamiento morfométrico, en particular el Análisis Generalizado de Procrustes, para obtener la variación de tamaño y la de conformación libre de la variación no-biológica. Finalmente se presentan los análisis estadísticos (univariados y multivariados) más útiles para comparar la variación morfométrica. Espero que a lo largo de todo el capítulo se logre dar a conocer los alcances (ecológicos, taxonómicos, evolutivos) de esta poderosa herramienta de análisis cuantitativo de la variación morfológica y se despierte la curiosidad y el interés por avanzar en su comprensión y aplicación a resolver problemas del orden biológico. 2. PALABRAS CLAVES: morfometría tradicional, morfometría geométrica, análisis multivariados, análisis generalizado de Procrustes, thin-plate spline, alometría, asimetrías. 3. INTRODUCCION Al comparar conjuntos de individuos pertenecientes a diferentes entornos espaciales, temporales o ecológicos, frecuentemente se detecta una variabilidad morfométrica importante. A causa de ello, el investigador se enfrenta a responder preguntas similares a las siguientes: 1) ¿Las diferencias observadas son debidas sólo a variación intra-específica o hay más de una especie involucrada? 2) Si resulta que la variación morfométrica observada es intra-específica (entre poblaciones) ¿habrá un sustrato genético que dé cuenta de tal variación? 3) ¿Cómo diferenciar la porción de variación morfométrica causada por factores ambientales de la porción que responde a la expresión del genoma subyacente? Las respuestas corresponden a los atributos biológicos del grupo de organismos bajo estudio, no de los individuos por separado, y se obtienen del análisis del conjunto de rasgos morfométricos. Las especies y poblaciones se pueden confundir entre sí cuando se estudian los caracteres individualmente; pero se tornan entidades propias cuando se consideran muchos caracteres en conjunto. La razón de ello estriba en que las fuerzas selectivas actúan sobre el conjunto de rasgos de la población. Tales fuerzas se manifestarán como la
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adaptación del grupo a la interacción entre los diversos factores internos y externos a los organismos. Los métodos morfométricos proveen al investigador de un conjunto de técnicas analíticas muy poderosas para cuantificar la variación morfológica y examinar los componentes genético y ambiental de los rasgos examinados. A partir de un conjunto de mediciones (variables continuas) los análisis permiten obtener nuevas variables que describen la conformación de una estructura biológica, la cual es libre de la variación no biológica (aquella relacionada con la escala, la posición y la orientación de la estructura morfológica en el espacio) y resulta de la historia evolutiva particular del conjunto de organismos que la comparten. Paralelamente, también se obtiene una estimación del tamaño, el cual podría ser explicado por factores fisiológicos ocurriendo durante la ontogenia o por adaptaciones acaecidas durante la historia evolutiva. El objetivo de los análisis es estudiar por separado la variación en la conformación y el tamaño, relacionando entre sí estos componentes morfométricos con el entorno interno y externo de las poblaciones, suponiendo que ambos son modificados por razones biológicas diferentes (Slice, 2005, 2007). Algunas manipulaciones experimentales apoyan y complementan la información proporcionada por las poblaciones naturales. Una de ellas consiste en eliminar la variación macro-ambiental creciendo los organismos en ambientes controlados, como es el caso de los insectarios. Las diferencias que persisten entre las medias poblacionales tienen probablemente un origen genético. Por el contrario, se puede eliminar la variación genética estudiando clones biológicos en ambientes heterogéneos. En este caso, las diferencias entre los clones se pueden atribuir a la variación ambiental. Otro método se basa en la selección artificial de ciertos caracteres ligados al valor adaptativo (fitness) y estudiar los cambios morfológicos correspondientes (por pleiotropía o ligamiento genético). La información procedente de la biología molecular (RAPDs, isoenzimas, microsatélites, etc.) y de parámetros ambientales (latitud, longitud, precipitación, temperatura, etc.) complementan los análisis morfométricos. La morfometría se ha beneficiado grandemente del desarrollo de las computadoras. Ahora es posible automatizar el proceso de toma de mediciones, la manipulación computarizada de grandes matrices de datos y los análisis multivariados con un despliegue de gráficas muy elaboradas. Todo esto no era accesible para la mayoría de los investigadores hace tan sólo 35 años. Con las herramientas anteriores la morfometría contribuye a dar respuesta a problemas de taxonomía y de biología evolutiva. Es entonces un objeto del conocimiento que puede ser importante para responder preguntas teóricas y aplicadas en Biología (Slice, 2005, 2007). Este capítulo pretende enseñar las bases teóricas y experimentales de la morfometría geométrica con la esperanza que logre despertar una curiosidad intelectual e investigativa, para que en el futuro nuestros biólogos puedan contribuir exitosamente a la dinámica de la investigación en este campo.
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4. LA VARIABILIDAD MORFOLÓGICA Y LA MORFOMETRÍA GEOMÉTRICA Actualmente, la moda, lo que llama la atención, parece ser la biología molecular. Aún la taxonomía tradicional, basada en caracteres morfológicos discretos, es cuestionada, en muchas ocasiones, por los resultados de la biología molecular. Muchos piensan que la mirada tradicional sobre la morfología (como lo hacen por ejemplo, los taxónomos) es tremendamente subjetiva. Si le añadimos un proceso de cuantificación al análisis morfológico, el asunto se vuelve un problema de estadística y ésta es mirada con recelo. Trabaja con promedios y varianzas, las cuales no son entidades físicas. Sus resultados son probabilidades; esto es, siempre está la posibilidad del error. Nunca hay certezas. Los taxónomos tradicionales y los biólogos moleculares trabajan con individuos, los identifican, y clasifican. Toman mediciones, cuentan estructuras, sacan proporciones para comparar pares de individuos y así afirmar sus clasificaciones. Para ellos el problema de la clasificación es una propiedad individual, no colectiva. Y eso está bien: cada individuo debe ser identificado y clasificado correctamente en su taxón. Otro asunto, es el problema de la realidad del taxón (del grupo cohesivo): ¿es una entidad natural? o ¿es una construcción imaginaria, producto de la necesidad de comunicación humana o de la satisfacción personal del taxónomo? Asumiendo que estamos ante una realidad natural, el problema de la clasificación pasa de ser individual a grupal. Cuando usamos las claves dicotómicas usuales ¿se toma en cuenta la variabilidad genotípica y fenotípica? No siempre. ¿Quién asegura que en los rangos descritos está contenida toda la variación del taxón en cuestión? La morfometría ha demostrado ser una buena herramienta para apoyar la taxonomía, tomando en consideración estas inquietudes. Reflexionemos un poco sobre la variabilidad. Miremos en primer lugar el aspecto estético: la belleza es muy subjetiva, pero probablemente estamos de acuerdo en que si ponemos al frente de muchas personas del común una imagen de un chimpancé, de una electroforesis de isoenzimas y de una secuencia de ADN y les pedimos que decidan cual es el objeto más bello, la mayoría escogerían al primero. Siempre nos maravilla la complejidad de un organismo, su incomprensible capacidad de acción e interacción. También es cierto que nuestra primera mirada al mundo; donde reconocemos por primera vez la variabilidad extraordinaria de la naturaleza, es desde lo morfológico. La ciencia actual se fundamenta en hipótesis. Sin embargo, muchos de los estudios científicos en nuestro medio se hacen sin hipótesis. Son descriptivos. Los morfólogos clásicos son fundamentalmente descriptivos. Dedicados muchos de ellos a hacer inventarios. Son los que llamamos naturalistas. Los que se preguntan ¿Qué hay? No los que se preguntan ¿por qué hay?, ¿cómo es que hay? ¿cómo es que no hay? Ahora es necesario hacer esas descripciones naturalistas en un contexto ecológico, incorporando tales preguntas. Sólo así podremos responder dichas preguntas y comprender las asombrosas variaciones naturales.
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Pero, en el contexto ecológico, cuando pasamos de la lista de inventarios al análisis de las relaciones del taxón de nuestro interés con otros taxones y con los elementos físicos del ambiente, nos enfrentamos a una gran dificultad: la complejidad biológica. Evidentemente un chimpancé es mucho más complejo que una isoenzima o que una secuencia de ADN. Sus relaciones con el entorno, con sus congéneres, con los otros organismos y con los factores no vivos de la naturaleza, su personalidad, su fisiología, su morfología, etc. tienen gran cantidad de partes constitutivas, tienen conectividad, tienen auto-organización, hay dependencia del contexto, hay dependencia histórica, hay jerarquías, y la razón por la cual los sistemas complejos son más difíciles de estudiar: son irreductibles, en el sentido que el organismo es la integración funcional de sus diferentes módulos constitutivos. Muchas de sus propiedades son emergentes; es decir, no se encuentran en los módulos aislados. Sólo después que se integran de manera funcionalmente coherente aparecen dichos atributos. Esto hace parte de los motivos por los cuales hay morfologías que se pueden imaginar pero que nunca veremos en la naturaleza. Por eso, para entender la posición de un grupo de organismos en la naturaleza y no sólo para darle un nombre que lo distinga de los demás, se requiere el aporte de muchas disciplinas biológicas. La taxonomía sistemática es una de ellas. Otras son: la paleobiología, la ecología, la biología molecular y la genética, la biología del comportamiento, la fisiología, la embriología y la morfometría. Lo que más resalta de la morfología es la variabilidad. La que tiene efectos evolutivos es aquella heredada vía el material genético. La expresión de este material interactúa con la variabilidad ambiental para dar origen a la diversidad fenotípica. El individuo adulto es el resultado de tal interacción que se presenta a lo largo de su desarrollo y que está limitada por reglas mecánicas que descartan las variaciones no funcionales. Entonces, detrás de la variabilidad hay factores biológicos y no biológicos. Un individuo tiene un tamaño que es producto, no sólo de su ambiente materno, de su ontogenia, de sus encuentros con parásitos, depredadores, etc. sino, además, de la combinación genética particular que fue heredada de sus padres. Las poblaciones, al igual que las especies, también tienen atributos de tamaño propios, los cuales están codificados en los alelos que portan. El tamaño de los individuos de una especie fluctúa en un rango especifico; propiedad que es muy utilizada por los taxónomos. Sin embargo, los extremos de la variación de tamaño de los taxones en muchas ocasiones se superponen. En estos casos es útil estudiar la variación de la conformación biológica (el aspecto, la configuración, la figura). Por ejemplo, consecuente con sus trayectorias evolutivas divergentes Rhodnius prolixus es una especie de tamaño pequeño en relación con R. pallescens, aunque los individuos más grandes de la última especie pueden ser de igual tamaño que los más pequeños de la primera. Pero, ambas especies exhiben además conformaciones corporales diferentes (Jaramillo & Caro-Riaño, 2005), todo lo cual podría estar involucrado en las diferentes capacidades como vectores de Trypanosoma cruzi, el hemoparásito causante de la enfermedad de Chagas.
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Probablemente el tamaño y la conformación no se pueden desligar en términos biológicos, en el sentido que cualquier alteración en el tamaño causa una alteración correspondiente en la conformación. Sin embargo, es factible suponer que ambos rasgos tienen bases genéticas propias y el peso que cada factor ambiental tiene en su expresión es diferente (Dujardin, 2008). Imagine que toma, a contraluz, sendas fotos de dos amigos. Las revela en el mismo formato y aunque sólo puede ver las siluetas de ambos aún puede distinguirlos, no por su tamaño pero si por su conformación corporal. Probablemente podamos tener resultados muy similares si comparamos, de igual modo, dos especies. En un caso difícil, quizás se nos ocurra recortar las siluetas y sobreponerlas para detectar las diferencias. Sin embargo, hay especies tan similares que esta habilidad es inútil. Necesitamos, entonces, alguna técnica analítica para develar las diferencias, muchas veces ocultas a la simple inspección visual. Siempre vamos a querer describirlas y buscar las explicaciones de tales diferencias. Esa técnica es la morfometría geométrica. La morfometría geométrica o el análisis cuantitativo de la relación entre la variación de la conformación biológica con la de origen genético, ambiental e inclusive aleatorio (o desconocido) ayuda enormemente a entender su naturaleza y la acción de los factores que alteran su distribución. Aunque la conformación y el tamaño responden a causas micro y macroevolutivas, existe un consenso de que la conformación es menos afectada por la variación ambiental (Dujardin, 2008; Caro-Riaño et al., 2009). Separar la variación de la conformación que es moldeada por factores biológicos de la variación de tamaño y de la causada por factores no biológicos es una gran posibilidad de la morfometría geométrica. La morfometría geométrica es, entonces, el estudio de la variación de las conformaciones biológicas y su covariación con otras variables (Adams et al., 2004; Rohlf and Marcus, 1993). La morfometría tradicional utiliza las distancias lineales entre dos puntos anatómicos, las cuales se traducen en el papel en cifras, perdiendo su relación con la forma biológica. Igual podrían ser datos tomados de mediciones económicas, de encuestas psicológicas o políticas, de objetos no biológicos, etc.; con ellas se pierde la orientación de las diferencias morfológicas. Por el contrario, la morfometría geométrica conserva a través de los diferentes procesos analíticos la posición espacial relativa de los puntos anatómicos, cuya unión da la configuración geométrica de los organismos. El proceso comienza seleccionado puntos sobre las estructuras biológicas, para luego convertirlos en coordenadas. En las coordenadas crudas está la información de la variación de la conformación biológica; pero, también están contenidas las diferencias causadas por la escala a la que fueron tomadas, la orientación y la posición espacial. De tal manera que en este estado no es posible estimar los cambios de la conformación ni la dirección de tales cambios. Una vez se procesan las coordenadas mediante la morfometría geométrica se puede estudiar la variación de la conformación biológica, libre de efectos artefactos, y su co-variación con otras variables.
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En la literatura se pueden encontrar ejemplos de la utilización de la morfometría geométrica para: (1) detectar y describir cuantitativamente la variación morfológica presente en las poblaciones, (2) investigar el origen y la naturaleza de la variabilidad morfológica, (3) investigar los factores que pueden alterar los patrones de variación morfológica, (4) apoyar la taxonomía, en particular en poblaciones de estatus taxonómico dudoso, (5) detectar patrones evolutivos y (6) apoyar los estudios filogenéticos. 5. LA TOMA DE DATOS EN MORFOMETRÍA GEOMÉTRICA 5.1. Puntos anatómicos de referencia, contornos La morfometría geométrica utiliza las coordenadas de ciertos puntos llamados “puntos homólogos” o mejor “puntos anatómicos de referencia” (PAR). Estos son puntos específicos, localizados de acuerdo a algún criterio, sobre una estructura biológica o una imagen de ella. En condiciones ideales, se tienen en cuenta criterios de importancia biológica, adaptativa, taxonómica y filogenética. Sin embargo, es muy poco frecuente la posibilidad de definir puntos con tales criterios. Se recurre, entonces, a reglas prácticas: puntos de fácil ubicación, ojalá situados en intersecciones de dos o más tejidos y presentes en todas las estructuras analizadas. Los PAR se pueden localizar sobre todo el cuerpo: cabezas, alas, patas, palpos, antenas y abdomen. Esta última estructura es la menos recomendada debido a los grandes cambios de forma causados por la alimentación. Las estructuras tridimensionales también pueden causar problemas de precisión cuando la toma de coordenadas se hace sobre imágenes en fotografías o dibujos hechos con la ayuda de cámara lúcida. En la actualidad existen en el mercado escáneres para estructuras tridimensionales y software para digitalizar los PAR sobre ellas; pero son muy costosas. Las estructuras planas son las que mejor se prestan para definir los puntos con los sistemas tradicionales: un estero-microscopio adaptado con “zoom”, cámara lúcida y cámara fotográfica digital y una computadora con el software apropiado para digitalizar los puntos. Tal vez esta es una de las razones por las cuales en triatominos, con frecuencia, se encuentra que las alas son más informativas que las cabezas. Fred Bookstein (Bookstein, 1990) clasificó los puntos en función de la facilidad para reconocerlos en cada estructura. Los de tipo I, son aquellos más fácilmente reconocibles y se encuentran en la conjunción o en la intersección de dos o más tejidos. Por ejemplo, las intersecciones de las nervaduras de las alas en insectos. Los de tipo II, son más difíciles de reconocer como homólogos (ver ítem 5.2); corresponden al extremo cóncavo o convexo de una curvatura. Fíjese, por ejemplo, en la porción más distal del ala de un insecto. Finalmente, los de tipo III, es muy probable que no sean homólogos. Corresponden a los puntos que separan los extremos de una estructura o que se localizan en uno de los extremos de una estructura que seguramente no es plana (Figura 1). Es importante, entonces, incluir para el análisis puntos de tipo I. Sin embargo, es posible que los otros tipos de puntos contengan una variabilidad de origen biológico, que puede no estar presente en los de tipo I y que no sería bueno desconocer. Por ello, es recomendable hacer análisis exploratorios con diferentes conjuntos de puntos, incluyendo algunos de tipo II, para identificar los más informativos. Nunca sobra decir, que una buena selección de puntos es fundamental para obtener resultados sólidos y confiables.
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Es importante considerar el número de puntos a escoger. Cada PAR contribuye a dos variables: una coordenada sobre el eje de las abcisas y otra sobre el de las ordenadas. El número de individuos del grupo más pequeño debe superar en, al menos dos veces, el número de variables, porque en los análisis estadísticos el error residual (varianza intragrupo) crece exponencialmente a medida que decrece el tamaño de la muestra con relación al número de variables. III
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Figura 1. Puntos anatómicos de referencia. Los puntos tipo I, II y III conllevan una información de calidad decreciente. Los de tipo III son informativos sólo en una dirección (una de las coordenadas no puede ser definida), por lo cual se llaman semi-puntos (semilandmarks en inglés). Estos pueden ser procesados por un algoritmo matemático que los desliza a lo largo de una tangente a la curva.
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El primer método geométrico hizo uso de los contornos de las estructuras. Los contornos se superponen y ajustan, de manera óptima mediante una función matemática que usualmente es el análisis de Fourier. Los coeficientes derivados del análisis se usan como variables de conformación para comparar las estructuras mediante análisis estadísticos multivariados. Este método no es el más usado ahora, porque no es fácil definir la correspondencia punto a punto de los puntos que definen los contornos; a pesar, de que los contornos como tales pueden considerarse homólogos para todos los especímenes. Existen en Internet varios programas computacionales de acceso gratuito para convertir los PAR ubicados sobre las imágenes en coordenadas cartesianas y en contornos. El más usado es el desarrollado por F. James Rohlf (Department of Ecology and Evolution, State University of New York, Stony Brook, NY): tpsDig. Este programa es actualizado frecuentemente y se puede bajar gratis de http://Life.Bio.SUNYSB.edu/morph/morph.html. También recomendamos el COOwin desarrollado por Jean Pierre Dujardin (IRD, Montpellier, Francia). Este programa se encuentra disponible gratuitamente en: http://www.mpl.ird.fr/morphometrics/ 5.2. Homología En morfometría geométrica se usa, frecuentemente, el término de puntos anatómicos homólogos para referirse a puntos que son fácilmente reconocibles en cada una de las estructuras biológicas analizadas. Sin embargo, tal connotación no tiene necesariamente un significado evolutivo. Es decir, los puntos no se escogen en función de haber derivado de un ancestro común reciente; aunque, en la mayoría de los casos, es muy probable que si lo sean. 6. ANÁLISIS GENERALIZADO DE PROCRUSTES Y LA TÉCNICA DE LAS DEFOMACIONES DE PLACAS DELGADAS (THIN-PLATE SPLINE) La morfometría, tradicional y geométrica, permiten detectar los primeros cambios generados por la estructuración geográfica y la “micro-evolución”. Además, permite estudiar de manera indirecta, sin costos elevados pero con resultados confiables y comparativos, los cambios ambientales y evolutivos que afectan al organismo. En los Triatominae la morfometría se ha utilizado en estudios de diferenciación geográfica (Harry et al., 1994; Casini et al., 1995; Dujardin et al., 1998b), diferenciación de poblaciones silvestres y domésticas (Dujardin et al., 1998a, 1997a, 1999b), re-infestación de viviendas (Dujardin et al., 1997b), tentativas de reconstrucción filogenética (Dujardin et al., 1999a), solución de problemas taxonómicos (Dos Santos et al., 2007; Gurgel-Goncalves et al., 2008; Matias et al., 2001; Villegas et al., 2002) y de preguntas evolutivas (Dujardin et al., 2009). La morfometría geométrica es una herramienta matemática con fundamentos biológicos, que ha demostrado ser muy efectiva para descomponer la variación que resulta fundamentalmente de la fisiología de los individuos y de la escala en que fueron hechas las mediciones (variación del tamaño), de aquella más estable, propia de la población y producto probablemente del componente genético (variación de la conformación) (Dujardin, 2008).
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El método se fundamenta en la superposición de cada individuo a una configuración “consenso”, la cual resume toda la variación geométrica presente en la muestra. Realmente, existen varios métodos para hacer la superposición, pero el más usado, por conveniente, es el algoritmo matemático llamado análisis generalizado de Procrustes1 (AGP) (Adams et al., 2004), en el cual las configuraciones geométricas se superponen de manera matemáticamente óptima utilizando el criterio de los mínimos cuadrados (Bookstein, 1991). El AGP elimina los efectos de la escala, la orientación y la posición de los objetos, consiguiendo cuantificar las desviaciones entre los puntos anatómicos de referencia (PAR) correspondientes. Tales desviaciones, libres de los efectos no biológicos, contienen toda la información sobre la variación biológica de las estructuras estudiadas y pueden ser usadas directamente para comparar grupos con la ayuda de análisis estadísticos multivariados (Adams et al., 2004). Previo al AGP se extrae un estimador de tamaño llamado “tamaño centroide” el cual se calcula como la raíz cuadrada de la suma de las distancias elevadas al cuadrado entre el centro de gravedad de cada figura (centroide) y los PAR que la definen. Si se tuvo buen cuidado de eliminar los efectos de la escala antes de convertir los PAR en coordenadas, es posible que la variación del tamaño centroide represente un fenómeno biológico real: las diferencias en la interacción de la expresión genética y de la fisiología de cada individuo. El AGP se puede dividir en tres grandes etapas (Figura 2). En primer lugar, los individuos o sus estructuras se ajustan por el tamaño al dividir las coordenadas por el tamaño centroide. Las configuraciones ajustadas se trasladan unas sobre otras y se superponen por sus centroides. Luego, se rotan (las configuraciones) tal que se alcance la suma mínima de las distancias al cuadrado entre cada PAR de cada individuo y una configuración consenso. La configuración consenso resulta de promediar los PAR de las dos primeras figuras superpuestas; luego se va actualizando por el ajuste de tamaño, la traslación y la rotación iterativa de cada una de las estructuras siguientes, hasta que se alcance la superposición óptima. Este proceso se da en un espacio multidimensional curvo llamado espacio de la conformación de Kendall (Kendall, 1984). La métrica de este espacio no permite usar las variables de conformación para hacer análisis estadísticos multivariados; para ello, es necesario interpolar una función matemática llamada “deformaciones de placas delgadas” (thin-plate spline) o “tps”. Con la ayuda de la función tps, se proyectan las configuraciones superpuestas sobre un hiperplano tangente a la configuración consenso. Tales proyecciones son matemáticamente divididas en componentes no-uniformes (también llamados “partial warp-scores”) y componentes uniformes. Estos son descriptores de las desviaciones de las configuraciones biológicas individuales a partir de la configuración consenso (Bookstein, 1991). En conjunto, los componentes no-uniformes y los uniformes son variables de la 1
Este nombre hace referencia a una leyenda griega que representó una de las acciones heroicas más importantes de Teseo. Procrustes era un bandido que asaltaba a los viajeros prometiéndoles una placentera noche de descanso en una cama muy especial ya que se ajustaba al tamaño de quien la usara. Lo que no les decía Procrustes a sus huéspedes era que el método de ajuste consistía en cortar las piernas a quienes las tenían muy largas o estirarlas a golpes de mazo a quienes las tenían muy cortas. Teseo, enfrentó a Procrustes y lo venció sometiéndolo a su mismo tratamiento.
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conformación y son usados como datos en análisis multivariados que tienen por objetivos detectar y/o comparar grupos de individuos (Adams and Funk, 1997). Los componentes uniformes representan estiramientos o comprensiones simples, lineales y totales de los especímenes, mientras que los componentes no-uniformes caracterizan cambios más complejos en conformación, patrones no lineales de deformación, tal que se pueden localizar en regiones pequeñas de las estructuras examinadas. En los primeros trabajos publicados se analizaban por separado estos componentes de la conformación; sin embargo, actualmente no se recomienda tal práctica ya que a causa de la integración morfológica que se da en el desarrollo, la conformación debe ser estudiada como un elemento único de la morfología. Los componentes uniformes y no-uniformes son sólo descomposiciones matemáticas de la función tps y aislados no tienen, necesariamente, una explicación biológica. En un sistema de coordenadas de dos dimensiones, se obtienen 2k – 4 variables de conformación; donde k es el número de puntos anatómicos de referencia. Se multiplica por dos ya que cada punto tiene dos coordenadas, una sobre el eje x y otra sobre el eje y. Se resta cuatro del producto porque durante el análisis se pierden dos “grados de libertad” al desplazar las configuraciones sobre los ejes x, y; se pierde uno al ajustar todas las configuraciones a un tamaño único y, finalmente, se pierde uno al rotarlas de manera óptima, tal que se minimiza la suma de las distancias (elevadas al cuadrado) entre los puntos anatómicos correspondientes. Por ejemplo, de ocho puntos anatómicos, correspondientes a 16 variables de coordenadas, se obtienen 12 variables de conformación. Una limitación del AGP es que las varianzas de los PAR deben ser estadísticamente homogéneas, pues de lo contrario (si uno o pocos PAR son mucho más variables que los otros) el algoritmo de los mínimos cuadrados tiende a dispersar la variación de esos PAR hacia los otros afectando las variables de conformación. Es lo que se llama el efecto Pinocho (Chapman, 1990). Existen programas computacionales para hacer el análisis generalizado de Procrustes. Dos buenas opciones son el tpsRelw y el MOGwin, desarrollados por F. James Rohlf (Department of Ecology and Evolution, State University of New York, Stony Brook, NY) y Jean Pierre Dujardin (Institut de Recherches pour le Développement, IRD, France), respectivamente. Este último programa grafica el ajuste a un tamaño único, la traslación sobre los centroides y la rotación para lograr la superposición óptima de las coordenadas alineadas, por lo cual resulta muy atractivo para el que se inicia en esta técnica. Ambos programas se pueden descargar de http://life.bio.sunysb.edu/morph/ y http://www.mpl.ird.fr/morphometrics/. 6.1. Visualización de las deformaciones de conformación La función tps es particularmente atractiva porque permite la descripción gráfica de la variación de conformación como deformaciones de rejillas (Figura 2D) o desplazamientos de vectores. La técnica de las deformaciones de placas delgadas (thin-plate spline) implementa rigurosamente el concepto de D’Arcy Thompson en las que una configuración
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geométrica se deforma a lo largo de una rejilla, al hacer coincidir cada uno de sus puntos anatómicos con los de la configuración consenso (Bookstein, 1991).
Figura 2. Secuencia esquemática del análisis generalizado de Procrustes. A. Los puntos anatómicos de referencia tomados sobre las estructuras biológicas se convierten en coordenadas. B. Mediante una serie iterativa de desplazamientos, ajustes de tamaño y rotaciones algebraicas se remueve de las coordenadas la variación no biológica, obteniéndose variables de conformación. C. La variación de la conformación se puede analizar mediante pruebas estadísticas multivariadas. D. Se reconstruye la configuración geométrica de los objetos biológicos, para analizar visualmente la magnitud y la orientación de la variación de conformación.
El programa tpsRelw, desarrollado por F. James Rohlf (http://life.bio.sunysb.edu/morph/), despliega la conformación anatómica correspondiente al valor de una variable independiente; por ejemplo, pertenencia a un sexo determinado o a un taxón particular. Se observan las deformaciones por la superposición de la configuración de interés sobre rejillas o por flechas que representan los desplazamientos vectoriales de cada PAR de la configuración de interés con respecto a la configuración consenso.
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6.2. Uso de los pseudo-puntos anatómicos deslizantes (“Sliding semi-landmarks”) Los puntos anatómicos utilizados usualmente para estudiar la variabilidad de la conformación de las estructuras biológicas difieren en la calidad de la información que ellos portan. Ya mencionamos que Bookstein (1991) definió tres clases o tipos. Para la morfometría geométrica que usa coordenadas, los tipos I y II son fácilmente localizados sobre las estructuras morfológicas y todas sus dimensiones son, en mayor o menor grado, biológicamente informativas. Pero, los puntos de tipo III contienen información significativa sólo en la línea que los conecta con la estructura remota de referencia (Figura 1). Entonces, estos puntos son “deficientes” y aparentemente no son útiles para los estudios que utilizan las técnicas de morfometría geométrica. Pero esta inutilidad deja por fuera de los estudios muchas de las partes anatómicas curvas. Los primeros métodos de morfometría geométrica, todavía relativamente populares, utilizan los contornos de las estructuras biológicas (outline methods) y por lo tanto incluyen las estructuras anatómicas curvas. El procedimiento consiste en delinear los contornos digitalizando series de puntos equidistantes y cercanos ente sí. Los contornos se superponen de manera matemáticamente óptima, utilizando algún tipo de análisis de Fourier, lo cual elimina la variación debida a la escala (el tamaño), la orientación y la posición espacial. Se obtienen al final, unas variables que se interpretan como variables de conformación biológica, libres de la variación no biológica, las cuales se pueden utilizar en comparaciones estadísticas mediante análisis multivariados. El problema con estos métodos es la falta de correspondencia anatómica entre los puntos digitalizados a lo largo de los contornos de las diferentes estructuras. Mientras el contorno de una estructura o región puede ser considerado homólogo a través de los especímenes, no es tan clara la homología de los puntos usados para muestrear tales curvas (Adams et al., 2004). Los métodos actuales de la morfometría geométrica (particularmente el análisis generalizado de Procrustes) utilizan coordenadas derivadas de puntos de tipo I y II para obtener variables de conformación de las estructuras biológicas, libres de la variación no biológica. Generalmente se evita utilizar puntos tipo III. 6.3. ¿Qué hacer con las regiones curvas de la anatomía? Bookstein (1997) propuso un nuevo método para analizar las regiones desprovistas de puntos tipo I y II, el cual se puede combinar con el AGP, convirtiéndose en una extensión del mismo. Se analizan, entonces, regiones más extensas e informativas de las estructuras biológicas. La denominación inglesa de tal método (sliding semilandmarks) se puede traducir como: “análisis de pseudo-puntos anatómicos deslizantes”. Consiste fundamentalmente en “relajar” la posición de algunos de los puntos situados sobre las líneas curvas de tal manera que se deslicen a lo largo de líneas tangentes a esos puntos. Los puntos que se relajan son los de tipo III, cuya definición incluye expresiones como “más distante que”, “más extremo que” y, por lo tanto, son informativos solo en la dirección que los separa de la estructura distante referida. Como son deficientes en una coordenada, se
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llaman, más apropiadamente, pseudo-puntos. Es de anotar que el método se vuelve muy impreciso en curvaturas muy pronunciadas, por lo que en estos casos es mejor tratar los puntos como de tipo II y no como pseudo-puntos. El método comienza con una selección conveniente de pseudo-puntos sobre las curvas de la estructura biológica. Los pseudo-puntos deben estar igualmente espaciados a lo largo de las curvas, tal que se obtenga, entre ellos, una correspondencia burda y su número debe ser igual para todos los objetos de la muestra. Es importante anotar que se deben definir verdaderos puntos de referencia (tipo I o II) entre los pseudo-puntos, con el fin de que al deslizar éstos sobre las tangentes, no se “salgan de los datos” (Figura 3).
Figura 3. Puntos anatómicos de referencia y pseudo-puntos sobre la cabeza de Lasioderma serricorne (Coleoptera). Los pseudo-puntos (X) deben encontrarse entre verdaderos puntos de referencia (O) para que al deslizarlos sobre las tangentes no se salgan fuera de los datos. El algoritmo básico utiliza sólo las coordenadas no deficientes de los pseudo-puntos, alternando el AGP con el relajamiento de los pseudo-puntos (Gunz et al., 2005). En cada caso se utiliza el criterio de los mínimos cuadrados; es decir, se minimiza la cantidad de cambio de conformación entre cada espécimen y la configuración promedio de Procrustes de todos los especímenes. Los programas computacionales de acceso libre por Internet: tpsRelw y tpsSpline incluyen los comandos necesarios para el análisis de pseudo-puntos deslizantes (F.J. Rohlf, Department of Ecology and Evolution, State University of New Cork, Stony Brook, NY. http://life.bio.sunysb.edu/morph/). El algoritmo básico se puede resumir en la siguiente secuencia:
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1) Para cada pseudo-punto se calculan tangentes respecto a los dos (pseudo) puntos vecinos. 2) Se relajan todos los especímenes contra el primero de ellos (se deslizan los pseudopuntos, a lo largo de las líneas tangentes, en direcciones opuestas desde su posición inicial. 3) Se computa la configuración promedio de Procrustes (se efectúa un AGP). 4) Se calculan nuevas tangentes. 5) Se relajan de nuevo todos los especímenes; pero esta vez, contra la configuración promedio de Procrustes. 6) Se iteran los pasos 4 a 7 hasta que se alcanza la convergencia (cuando el promedio no cambia más en cada iteración). 7) Al igual que con el AGP, al final se obtienen variables de conformación que se pueden analizar mediante los métodos convencionales de la estadística multivariada. El número de pseudo-puntos utilizados depende de la complejidad de la curva. Sin embargo, a mayor número se mejora la representación de la figura geométrica de interés. Gunz et al. (2005) sugieren hacer varios análisis sobre las mismas muestras, pero con diferente número de pseudo-puntos hasta encontrar el óptimo; es decir, cuando los pseudopuntos adicionales no agregan más información a la variación de la conformación. Es muy probable que el número óptimo de pseudo-puntos supere el de individuos, lo cual presenta un problema para los análisis estadísticos paramétricos. Pero hay una serie de análisis exploratorios válidos, al igual que métodos de aleatorización, útiles para hacer inferencias estadísticas. 7. LOS ANÁLISIS MULTIVARIADOS Sobre la matriz de variables de conformación se pueden efectuar análisis estadísticos multivariados con el objetivo de detectar grupos, verificar hipótesis relacionadas con la presencia de grupos definidos a priori o comparar las variaciones medias de la conformación entre ellos. Los análisis multivariados tradicionales tienen por objetivo representar los objetos (los individuos o las unidades taxonómicas operacionales) en un espacio de caracteres reducido, el cual es definido por los ejes de mayor variación; cada uno jerarquizado por la cantidad de variación que explica (Sorensen and Footit, 1992). Estos análisis se usan para reducir las dimensiones del conjunto de datos, eliminar las correlaciones entre caracteres, calcular los patrones de mayor variación y para ordenar los OTU en un nuevo espacio espacio multivariado. En general, los análisis multivariados se dividen entre aquellos que consideran la muestra total como un grupo conceptual único y los que utilizan particiones de la muestra total en dos o más grupos definidos a priori por el investigador. Los primeros son útiles para detectar subdivisiones de la meta-población; mientras que los segundos sirven para verificar la estructura de la meta-población en los grupos previamente definidos.
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Los análisis de ordenación pertenecientes al primer grupo, son básicamente exploratorios; no verifican hipótesis estadísticas. Son muy útiles porque permiten visualizar las ordenaciones de los individuos en el espacio multivariado de la conformación. Los más usados son el análisis de componentes principales y el análisis de agrupamiento jerárquico (análisis de cluster). Aunque es deseable la multi-normalidad de las variables, su falta no es catastrófica para estos análisis (Sorensen and Footit, 1992). Por su parte, los métodos que intentan visualizar las diferencias entre los grupos previamente definidos se basan en hipótesis y resultan en niveles de significancia que verifican o rechazan las diferencias de conformación promedio entre los grupos. El más usado es el análisis variado canónico, también llamado en muchos casos análisis discriminante. Este análisis junta en uno sólo el análisis de componentes principales, el análisis multivariado de varianza, manova, y el cálculo de funciones discriminantes. Desafortunadamente tiene sus límites: exige multinormalidad y homogeneidad de varianzas; además, de tamaños grandes de las muestras (el grupo más pequeño debe tener, al menos, el doble de individuos que de variables). A diferencia de las variables tradicionales medidas en longitudes, las variables de conformación derivadas del análisis generalizado de Procrustes (AGP), son libres de los efectos de la escala (el tamaño), la posición y orientación en el espacio y, además, son ortogonales. Esta diferencia es importante: los análisis multivariados sobre las variables de conformación, no proporcionarán información sobre las diferencias de tamaño entre individuos o entre grupos, ni sobre las variables individuales que más contribuyen a la variación total. En cambio, sirven para visualizar y verificar hipótesis estadísticas de las diferencias de conformación entre grupos. La primera exploración válida (casi obligatoria) es la de someter las variables de conformación al familiar análisis de componentes principales, que en el lenguaje de la morfometría geométrica se llama análisis de relative warps. Este análisis es una combinación linear de las variables de conformación para obtener nuevas variables que representan porciones progresivamente decrecientes de la variación original. Los dos o tres primeros relative warps representan la mayor porción de la variación de conformación (Rohlf, 1993); sobre ellos usualmente se proyectan los especímenes para explorar la formación de “nubes” de individuos de acuerdo con sus conformaciones (Figura 2C). Al calcular los relative warps, se ajusta el parámetro alfa (scaling parameter) a 0, tal como lo recomienda Rohlf (1993) para estudios taxonómicos. Un valor de 0 pondera por igual todas las variables de conformación tal que no se enfatizan ni las pequeñas ni las grandes diferencias en la escala de la conformación. Normalmente, lo primero que se hace después de un AGP es proyectar los individuos sobre los dos o tres primeros “relative warps” y analizar la estructuración de los grupos en este espacio multivariado de la conformación. Eventualmente se pueden utilizar tales ejes para hacer sobre ellos un análisis discriminante. Si el tamaño de la muestra es pequeño esta es una buena opción de análisis. Cuando hay muchos grupos las ordenaciones de los individuos sobre los “relative warps” puede ser algo confusa. En estos casos, probablemente, sea mejor optar por hacer un análisis de agrupación jerárquica (análisis de clúster). El método más usado es el de comparación por pares usando promedios aritméticos no-ponderados (UPGMA). Se
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recomienda explorar la estructura meta-poblacional haciendo un análisis que incluya todos los individuos y otro que use las medias aritméticas de las variables de conformación de cada grupo. Los resultados son dendrogramas, en los cuales se puede evaluar la distribución de los individuos y de los grupos de acuerdo con su similitud. Cuando se tienen suficientes individuos por grupo se puede hacer directamente un análisis discriminante sobre las variables de conformación. Con este análisis se verifica la igualdad de las medias multivariadas de la conformación y se ordenan los grupos en gráficas de dispersión, de acuerdo con la mayor separación posible entre ellos. Tal magnificación de la variación inter-grupos se hace minimizando la variación intra-grupos. Las distancias de Mahalanobis, calculadas en el análisis discriminante, señalan que tan distante se encuentra cada individuo de los centroides de cada grupo. Tal distancia discriminante se asocia a una probabilidad de pertenecer a un grupo. Es esta probabilidad la que tiene una utilidad taxonómica. Si los grupos están naturalmente bien definidos la probabilidad de reclasificación en su grupo original será alta. El análisis discriminante genera, además, unas funciones discriminantes que permiten a posteriori clasificar un individuo de origen desconocido en su grupo más probable. El programa computacional PADwin de acceso libre en Internet (Jean-Pierre Dujardin, Institut de Recherches pour le Développement, IRD, France; http://www.mpl.ird.fr/morphometrics/) tiene un comando que permite clasificar individuos de origen desconocido. Tiene, además, otro comando para reclasificar los individuos y evaluar la correspondencia entre la clasificación inicial hecha por el investigador y la predicción de pertenecer a un grupo, de acuerdo con la conformación biológica. Es una reclasificación que utiliza el método del “jacknife”; por lo que es más rigurosa que las efectuadas por otros programas. Una vez hemos evaluado la variación de conformación de nuestros grupos y determinado las posibles diferencias estadísticas entre ellos, es conveniente examinar si tales diferencias se asocian con la variación ambiental. Para ello, se pueden preparar matrices que contengan la información sobre temperatura, humedad relativa, precipitación, distancias geográficas, altitud, latitud y todas aquellas que el investigador estime que pueden estar relacionadas con la variación de la conformación. La prueba de Mantel es muy útil para estimar las posibles correlaciones. Las verificaciones estadísticas de las correlaciones se pueden hacer mediante permutaciones. Para las inferencias estadísticas, frecuentemente se usan pruebas basadas en permutaciones, las cuales no exigen las condiciones de las pruebas paramétricas. Grosso modo, hay dos situaciones donde se pueden utilizar permutaciones. En primer lugar cuando se quiere buscar la asociación entre la variación de conformación con otras variables. En este caso se tienen dos conjuntos de datos para los mismos especímenes; un conjunto es la matriz que contiene las variables de conformación y el otro puede ser la variación de tamaño o un conjunto de mediciones no morfométricas. Para evaluar la alometría se efectúa una regresión multivariada de la variación de conformación sobre la variación de tamaño (ver abajo, ítem 8); pero, para probar la hipótesis nula de que no hay un efecto alométrico significativo del tamaño sobre la conformación se permutan repetidamente las variables de conformación y cada matriz permutada se regresa nuevamente sobre el tamaño. El valor P
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(técnicamente el nivel alfa o nivel de significancia) de la asociación efectuada con los datos “reales” es, exactamente, la fracción de la distribución de las permutaciones que iguala o excede la estadística observada (Gunz et al., 2005). Una segunda situación se da cuando se quiere examinar la estructura misma de la matriz de conformación. Un gran número de problemas se pueden ver en términos de similitudes o disimilitudes (distancias) entre observaciones únicas o entre muestras de observaciones o entre poblaciones de observaciones. Por ejemplo, cuando se desea conocer si hay diferencias significativas entre la conformación de varios grupos de triatominos. En este caso, se calculan distancias (usualmente euclidianas, pero también pueden ser de Mahalanobis) entre los grupos. Se permuta varias veces la matriz de distancias y en cada ocasión se calcula una estadística que relacione la matriz “real” con la permutada (por ejemplo, mediante correlación múltiple o diferencias entre la medias de los grupos). Se acepta la hipótesis nula de no diferencias entre los grupos si la fracción de estadísticas que señalan una asociación entre los bloques de datos observados y los permutados igualan o superan un nivel de significancia convencional (v.gr. 0,05). Un programa de acceso libre en Internet, que incluye la mayoría de las funciones que se utilizan en morfometría tradicional y geométrica es el PAST (PAlaeontological STatistics), desarrollado por Øyvind Hammer D.A.T y Harperand P.D. Ryan. Se puede bajar de http://folk.uio.no/ohammer/past. PopTools es una adición versátil al popular programa Excel de Microsoft que facilita el análisis de modelos estocásticos tales como la prueba de Mantel y las simulaciones hechas mediante permutaciones. Se puede descargar gratuitamente de: http://www.cse.csiro.au/poptools/ 8. ALOMETRÍA La alometría se refiere a la velocidad de crecimiento relativa de una estructura biológica respecto a otra(s) o al organismo total. La alometría da cuenta de los cambios de conformación que derivan del cambio de tamaño; de tal manera que la conformación es dependiente del tamaño. Un caso particular es cuando la velocidad de crecimiento es la misma entre los caracteres en estudio; en el cual se llama isometría, pero este es un fenómeno raro en los seres vivos. Klingenberg (1996) reconoce tres clases de alometría: estática, ontogenética y evolutiva. La primera es el resultado de las dos últimas; se evalúa en individuos adultos pertenecientes al mismo grupo etario. La segunda se refiere a las diferencias de conformación que se van presentando a medida que el embrión crece hasta el adulto. La tercera comprende las diferencias de conformación morfológica que resultan de los diferentes modos de crecer que tienen los grupos con diferentes historias evolutivas. El análisis generalizado de Procrustes (AGP) remueve el efecto de la variación de tamaño (al dividir las coordenadas crudas por el tamaño centroide), pero no remueve ninguna variación de la conformación que pueda estar relacionada con la variación de tamaño. El tamaño centroide es, entonces, una variable isométrica. Si en las muestras hay alometría, esta no es removida, porque el AGP no remueve la variación de la conformación, sino que,
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por el contrario, la preserva mientras retira los efectos de la escala, de la orientación y de la posición. La presencia de alometría en la variación de la conformación, se detecta mediante análisis multivariados de regresión lineal. Las variables de conformación operan como variables dependientes, mientras que el estimador de tamaño (generalmente se usa el tamaño centroide) actúa como variable independiente. Algunos investigadores hacen una regresión lineal simple utilizando como variable dependiente el primer factor canónico (derivado del análisis discriminante sobre las variables de conformación) y como variable independiente el estimador de tamaño, tamaño centroide. Este procedimiento tiene la ventaja de poder visualizar la relación entre las variables de conformación y tamaño, mediante una gráfica bivariada de dispersión de puntos; pero, tiene el inconveniente que no recoge toda la variación de la conformación, ya que el primer factor canónico solo da cuenta de una porción de esta (aunque es la mayor). Es importante tener presente que la alometría que se detecta en este último procedimiento es la que responde por las diferencias de conformación entre grupos que resultan de la variación de tamaño; pero no da cuenta de la variación alométrica de conformación intra- e inter-grupo simultáneamente ya que el análisis discriminante elimina la variación intra-grupo para poder magnificar la inter-grupo. Una vez se detecta alometría es importante examinar si la variación de la conformación dentro de los grupos tiene la misma relación con la variable de tamaño; es decir, si los grupos presentan el mismo modo de crecer. Para ello, se hace un análisis multivariado de covarianzas (ancova) de dos vías, empleando los grupos y el tamaño centroide como variables independientes; mientras que las variables de conformación son las variables dependientes. Los análisis para detectar alometría se pueden hacer con los programas computacionales PAST (Øyvind Hammer D.A.T y Harperand P.D. Ryan) y tpsRegr (F. James Rohlf, Department of Ecology and Evolution, State University of New York, Stony Brook, NY) que se pueden bajar libremente desde las siguientes direcciones: http://folk.uio.no/ohammer/past; http://life.bio.sunysb.edu/morph/ 9. ASIMETRIAS Por último, es importante señalar una utilidad más del análisis de la morfometría geométrica: su capacidad de detectar alteraciones de la simetría. Las estructuras bilaterales, como las alas de los dípteros, tienen el mismo origen embrionario (discos imaginales) y genéticos y su desarrollo se da en el mismo ambiente, por lo cual cabría esperar que tuviesen una simetría perfecta. Pero, frecuentemente hay diferencias sutiles, que en la mayoría de las ocasiones no superan el 1% del tamaño promedio del rasgo. Tales asimetrías se han atribuido al ruido del desarrollo (diferencias aleatorias en la tasa de crecimiento celular, en las vías bioquímicas, en la distribución de las sustancias citoplasmáticas, etc.); pero, además a las perturbaciones durante el desarrollo (parasitismo, hambre, calidad del cuidado materno, etc.). Tales diferencias se reparten al azar entre los lados derecho e izquierdo de las estructuras bilaterales, generando una
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distribución cercana a la normal. Por eso se llaman asimetrías fluctuantes. Son, entonces, fundamentalmente de origen ambiental. Pero también hay asimetrías constantes, sistemáticas, donde un lado es consistentemente mayor que el otro. A éstas se le atribuyen orígenes genéticos y se llaman asimetrías direccionales. Finalmente hay asimetrías que no se distribuyen al azar entre los lados izquierdos y derechos, si no de una manera platicúrtica o bimodal; hay grupos de individuos con un lado sistemáticamente diferente del otro, mientras otros presentan el rasgo opuesto. Estas asimetrías pueden indicar la presencia de una estructuración de la población en grupos aislados; de no ser así, podría ser un rasgo particular con origen genético en unos casos y ambiental en otros. Un procedimiento detallado y bien aceptado para analizar las asimetrías en variables de conformación derivadas del AGP lo propusieron Klingenberg y McIntyre (1998). El programa computacional ASIwin desarrollado por Jean Pierre Dujardin y de libre acceso por Internet (Institut de Recherches pour le Développement, IRD, France; http://www.mpl.ird.fr/morphometrics), permite hacer análisis de asimetrías acorde con este procedimiento. 10. AGRADECIMIENTOS A la Dra. Harling Caro-Riaño por sus útiles correcciones y comentarios. 11. REFERENCIAS Adams DC., Funk DKJ. 1997. Morphometric inferences on sibling species and sexual dimorphism in Neochlamisus bebbianae leaf beetles: Multivariate applications of the thinplate splines. Systematic Biology. 46: 180-194. Adams DC., Rohlf FJ., Slice DE. 2004. Geometric Morphometrics: Ten Years of Progress Following the 'Revolution'. Italian Journal of Zoology. 71:5-16 Bookstein FL. 1990. Introduction to the Methods for Landmark data. In: Rohlf FJ., Bookstein FL. (eds.), Proceedings of the Michigan Morphometrics Workshop, pp. 216-225. The University of Michigan, Museum of Zoology, Special Publication No. 2. Ann Arbor, Michigan. Bookstein FL. 1991. Morphometric tools for landmark data: geometry and biology. Cambridge University Press, Cambridge. Bookstein FL. 1997. Landmark methods for forms without landmarks: Localizing group differences in outline shape. Medical Image Analysis 1:225-243. Caro-Riaño H, Jaramillo N, Dujardin JP. 2009. Growth changes in Rhodnius pallescens under simulated domestic, sylvatic conditions. Infection, Genetics and Evolution. 9: 162168.
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