Níveis de óxido nítrico e alterações hematológicas em viajantes frequentemente expostos a Plasmodium falciparum

Instituto de Higiene e Medicina Tropical – CMDT/UCDT/LCPT Universidade do Algarve – FCT

Relatório de Estágio da licenciatura em Bioquímica

Karina P. de Sousa

Orientadores:

Prof. Dr. Luís Távora Tavira (IHMT) Profª. Dra. Maria José Castro (UAlg)

Níveis de óxido nítrico e alterações hematológicas em viajantes frequentemente expostos a Plasmodium falciparum

Lisboa, Janeiro de 2007.

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

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Declaração

O conteúdo deste relatório é da exclusiva responsabilidade da autora.

A autora:

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“A scientist in his laboratory is not only a technician: he is also a child placed before natural phenomena which impress him like a fairy tale.”

Marie Curie

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Agradecimentos Em primeiro lugar, aos meus Pais: ao meu Pai por me ensinar a procurar e a fazer sempre as perguntas certas; e à minha Mãe por me ensinar a acreditar em mim mesma e a nunca desistir de perseguir os meus sonhos. Sem vocês nunca teria chegado a ser o que sou hoje, e sem a vossa coragem nunca saberia que a Vida é aquilo que fazemos dela!

Depois, à minha irmã por me dar o exemplo real do princípio da “acção e reacção”! Com o teu entusiasmo mostraste-me como ser mais forte, um bocadinho mais sábia, e também uma pessoa mais completa!

Às minhas (super-)amigas e amigos, e especialmente às minhas “irmãs de coração”,

por acreditarem naquilo que eu posso vir a ser e a instigarem-me a sê-lo

realmente. Sem vocês, muitas coisas não teriam tido o sabor que tiveram... nem fariam muito sentido!...

A todos os professores que ao longo do meu percurso académico puderam ver em mim uma parte do Futuro e investiram a sua vontade em ensinar-me “umas coisitas” muito úteis!... E um agradecimento muito especial aos professores Luís Tavira (IHMT), Maria José Castro (UAlg) e Marcelo Silva (IST), por me orientarem neste estágio (que foi uma fonte inesgotável de aprendizagem, em todos os sentidos!), às técnicas Ana Paula Maduro e Laura Cravo, e ainda às auxiliares Rosa Guedes e Formosa Figueiredo, pela amizade e disponibilidade que sempre me demonstraram! E ainda ao restante pessoal do IHMT que sempre e desde logo me fez sentir como parte da equipa!…

E por último mas não menos importante, quero agradecer a todas as pessoas especiais e maravilhosas que fazem parte da minha vida e ajudaram a fazer de mim o que eu sou hoje... vocês sabem quem são!

Um grande...

... Obrigada !

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Abreviaturas utilizadas µL – microlitro (x10-6 litros) Ab/Abs – Anticorpo(s) Ag/Ags – Antigénio(s) AP – (Alkaline Phosphatase) Fosfatase alcalina DNA – (Desoxirybonucleic acid) Ácido Desoxirribonucleico EDTA – (Ethylene diamine tetra-acetate) Ácido etilenodiaminotetraacético ELISA – Enzyme-linked immunosorbent assay HGB - Hemoglobina HLA – Complexo de histocompatibilidade humano IFN-γ – Interferão gama IgG/E/A/M – Imunoglobulinas G, E, A e M IL1 – Interleucina 1 M – moles de soluto por litro de solução MCHC – Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média NED – N-1-naftiletilenodiamina dihidrocloreto Nm – nanómetros (10-9 metros) NO – (nitric oxide) Óxido nítrico NO2– – nitrito NOS – (nitric oxide synthase) óxido nítrico sintase PLT - Plaquetas PCR – (polymerase chain reaction) reacção em cadeia da polimerase

P. falciparum – Plasmodium falciparum P. vivax – Plasmodium vivax ROS – (reactive oxigen species) espécies reactivas de oxigénio Rpm – rotações por minuto t½ – tempo de meia vida TNF – (Tumor necrosis factor) Factor de necrose tumoral WBC - (white blood cells) Leucócitos WHO – (World Health Organization) Organização Mundial de Saúde

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Resumo A malária é uma infecção parasítica que, apesar de ser relativamente incomum nos países desenvolvidos (onde os casos de malária são importados), permanece uma das mais prevalentes doenças a nível mundial. Para os viajantes que visitam zonas endémicas para a malária, as medidas de protecção pessoal e a conformidade com a quimioprofilaxia adequada podem reduzir significativamente o risco de infecção, porém a avaliação e diagnóstico rápido e eficaz dos viajantes sintomáticos e a instituição de medicamentos anti-maláricos adequados são factores indispensáveis para a situação clínica dos pacientes. Este estudo teve como objectivos a avaliação da resposta hematológica e o nível de óxido nítrico produzido como resposta à infecção por P. falciparum bem como a verificação destes parâmetros como indicadores fiáveis da infecção. Através dos resultados obtidos, é possível concluir que os dois factores hematológicos mais prevalentes na infecção clínica por P. falciparum são a ocorrência de trombocitopénia e de hipocromia eritrocítica. Além disso, mostrámos que o óxido nítrico é um marcador clínico da infecção malárica mas não pode ser considerado como indicador para a severidade da doença, além de não parecer constituir um factor de protecção contra a malária.

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Abstract Malaria is a mosquito-borne parasitic infection of global importance. Although relatively uncommon in developed countries (where the disease occurs mainly in travellers who have returned from endemic regions), it remains one of the most prevalent human infection worldwide. For travellers to malaria-endemic regions, personal protective measures and appropriate chemoprophylaxis can significantly reduce the risk of infection, however the prompt evaluation and diagnosis of the symptomatic traveller, and the institution of an appropriate antimalarial therapy are essential for the clinical outcomes of infected patients. This study aimed to evaluate the hematological response and the nitric oxide production as a reaction to infection, and to verify if any of these indexes could be a realiable marker for P. falciparum infection. From the analysis of the results, we conclude that the two strongest predictors of clinical infection by P. falciparum are the occurrence of thrombocytopenia and erythrocitic hypochromia. Moreover, the results from nitric oxide tests on different study groups showed that individuals with microscopically-detectable infections have a 6 fold production of nitric oxide when compared to both malaria-naïve and malaria-immune subjects; this leads us to infer that nitric oxide is in fact a clinical marker for malarial infection but that it is not an indicator of the severity of the disease since no correlation could be found between nitric oxide production and parasitemia. Moreover, nitric oxide doesn’t seem to have a protective role against P. falciparum infection.

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Fundamentação A malária, um dos mais sérios problemas globais de saúde pública, é uma doença infecciosa causada por protozoários do género Plasmodium. Dados da Organização Mundial da Saúde mostram que o impacto desta doença sobre as populações humanas põe em risco cerca de 40% da população mundial em mais de 90 países, causando a ocorrência de 300 a 500 milhões de novos casos anuais com uma média de um milhão de mortes. Representa ainda um risco elevado para viajantes e migrantes, levando ao aparecimento de casos de malária em áreas não endémicas. O melhor conhecimento sobre os indicadores biológicos de infecção por P. falciparum (nomeadamente os indicadores hematocitométricos) pode possibilitar diagnóstico e tratamento rápidos, diminuindo a morbilidade e mortalidade associadas à infecção em populações não imunes.

Enquadramento do estágio Instituto de Higiene e Medicina Tropical O Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT) foi criado em 24 de Abril de 1902 por Carta de Lei do Rei D. Carlos, sendo nessa altura denominado por Escola de Medicina Tropical. Até 1980, altura em que foi integrado como unidade orgânica da Universidade Nova de Lisboa com a denominação actual, e apesar de Fig.i – fachada do IHMT (fonte: www.icp.ucl.ac.be)

passar

instalações,

por

diversas

manteve-se

tutelas,

sempre

fiel

designações aos

e

mesmos

propósitos de desenvolvimento do conhecimento científico dos problemas de saúde ligados ao meio tropical. Factores como a qualidade científica no âmbito do ensino pósgraduado,

na

investigação,

e

ainda

pelo

contributo

na

cooperação

para

o

desenvolvimento da saúde nos PALOP, Brasil e Timor-Leste, têm sido fundamentais para o reconhecimento que o IHMT tem merecido, nacional e internacionalmente. No seu

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programa de formação, o IHMT desenvolve esforços para ser uma referência científica no espaço lusófono e responder às necessidades dos Países de língua portuguesa, procurando aprofundar novas temáticas e especializações necessárias no mundo actual. O IHMT desenvolve investigação em vários domínios das Ciências Biomédicas (Biologia Molecular, Microbiologia, Parasitologia, Entomologia, Imunologia), com ênfase em tópicos relacionados com a Medicina Tropical e em áreas de saúde consideradas problemáticas nos países em desenvolvimento. No intercâmbio com outras Instituições de Ensino Superior, de Investigação e de Cooperação, Nacionais e Internacionais, o IHMT prossegue a sua política de relações de cooperação e de trabalho com diferentes Instituições Nacionais, através de protocolos, e com Instituições e Organizações Internacionais, nomeadamente as Escolas de Medicina Tropical Europeias, as Instituições de Saúde e de Ensino dos PALOP, a Organização Mundial de Saúde a União Europeia, o Banco Mundial, entre outros.

Laboratório Central de Patologia Tropical A Divisão Clínica tem a seu cargo, entre outros, a consulta a refugiados (no âmbito do protocolo entre o IHMT e o Conselho Português para Refugiados), um serviço de consultas tanto para o diagnóstico de patologias tropicais como para aconselhamento aos viajantes, serviços de vacinação e “check-up” pós-viagem. Estas diferentes consultas são efectuadas por médicos especialistas em doenças infecciosas e medicina tropical; a “consulta de viajantes” fornece medicação preventiva (profilaxia) da malária e administra várias vacinas de acordo com o Programa Internacional de Vacinação. É o Laboratório Central de Patologia Tropical do IHMT que fornece o suporte laboratorial para as análises requeridas pelos médicos das consultas supracitadas, podendo também efectuar análises solicitadas por hospitais ou ainda directamente

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pelos pacientes que procurem o serviço. O Laboratório também colabora em estudos de epidemiologia das doenças transmissíveis em populações migrantes (projecto Epi-Migra, financiado pela Fundação Calouste Gulbenkian) mantendo uma rede de consulta e diagnóstico, em conjunto com parceiros não estatais e estatais. Foi através deste projecto que nasceu este estágio e este relatório que é o resultado de vários meses de trabalho com uma equipa profissional, dinâmica e empenhada. Assim, pode dizer-se que o Laboratório Central providencia suporte ao ensino e investigação desenvolvidas na Unidade de Clínica e, no âmbito das suas competências, presta serviço assistencial à comunidade, no campo das análises clínicas, bem como às outras Unidades do IHMT, com relevância para as Consultas do IHMT.

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Índice Pág. Agradecimentos …………………………………………………………………………………………….

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Abreviaturas …………………………………………………………………………………………………

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Resumo ……………………………………………………………………………………………………….

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Abstract ……………………………………………………………………………………………………….

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Fundamentação …………………………………………………………………………………………….

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Enquadramento do estágio Instituto de Higiene e Medicina Tropical ………………………………………………..

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Laboratório Central de Patologia Tropical ………………………………………………

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1. Introdução 1.1 – Malária e P. falciparum ………………………………………………………………..

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1.2 – Quimioprofilaxia da malária…………………………………………………………..

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1.3 – Diagnóstico da malária ………………………………………………………………..

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1.3.1 – Testes de diagnóstico ………………………………………………………

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1.3.1.1 – O método ELISA ………………………………………………..

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1.4 – Imunidade natural à malária ………………………………………………………..

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1.4.1 – Diversidade genética do hospedeiro …………………………………..

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1.4.2 – O papel do NO na imunidade adquirida ……………………………..

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1.4.2.1 – Determinação de NO em pacientes maláricos ……….

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1.4.3 – Imunidade humoral ………………………………………………………….

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2. Procedimento Experimental 2.1 – Obtenção de amostras .……………………………………………………………….

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2.2 – Parasitologia e hematologia …………………………………………………………

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2.3 – Serologia ……………………………………………………………………………………

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2.4 – Determinação de NO sérico 2.4.1 – Preparação da curva de calibração …………………………………….

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2.4.2 – Determinação dos níveis de NO …………………………………………

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3. Resultados 3.1 – Distribuição demográfica de dados clínicos ……………………………………

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3.1.1 – Indivíduos infectados com P. falciparum …………………………….

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3.1.2 – Indivíduos não-infectados com P. falciparum ………………………

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3.1.3 – Indivíduos não-expostos a P. falciparum …………………………….

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3.2 – Informação clínica dos pacientes ……………………………………………….…

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3.3 – Resultados Hematológicos ………………………………………………..………..

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3.4 – Relação entre parasitémia e parâmetros hematocitométricos ………….

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3.6 – Níveis séricos de óxido nítrico ………………………………………………………

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4. Discussão …………………………………………………………………………………………………

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5. Conclusão ……………….………………………………………………………………………………..

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6. Perspectivas Futuras ….………………………………………………………………………………

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7. Bibliografia ……………………………………………………………………………………………….

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8. Glossário …………………………………………………………………………………………………..

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9. Anexos ……………………………………………………………………………………………………..

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1. Introdução 1.1 – Malária e Plasmodium falciparum A malária é, actualmente, uma das doenças com maior prevalência no Mundo, causando cerca de 3000 mortes diárias (Giha et al; 2005). Em 2004, contavam-se 107 países ainda afectados pela malária, abrangendo um total de 3.2 biliões de pessoas. As actuais estimativas apontam para um número anual global de 350 a 650 milhões de novos casos da doença (figura 1).

Fig. 1 – Distribuição geográfica Mundial da malária e número de pessoas infectadas presentemente pela doença (fonte: Wellcome Trust em http://medphoto.wellcome.ac.uk).

Pensa-se que esta doença tenha surgido na pré-história, provavelmente no continente Africano, e que tenha acompanhado a saga migratória do ser humano (Dutra, 2001). Existem referências a febres sazonais em textos religiosos e médicos bastante antigos entre os assírios, chineses e indianos, que relacionavam a doença à punição de deuses e à presença de maus espíritos (Dutra, 2001). No século V a.C., Hipócrates foi o primeiro médico a descartar a superstição, relacionando a doença às estações do ano ou aos

locais

frequentados

pelos

doentes.

Também

foi

o

primeiro

a

descrever

detalhadamente o quadro clínico da malária e algumas das suas complicações (Dutra, 2001; Oaks Jr. et al; 1991).

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Durante quase 1500 anos, pouco foi acrescentado ao conhecimento sobre a doença ou o seu tratamento. No século XVII, porém, missionários jesuítas observaram populações indígenas da América do Sul a utilizar a casca de uma árvore nativa, chamada Chinchona (Cinchona officinalis, Linneaus 1753), para o tratamento de alguns tipos de febre. O uso deste remédio rapidamente se vulgarizou na Europa e passou a ser conhecido como "pó dos jesuítas" (Dutra, 2001), até que o seu princípio activo, o quinino,

Estrutura Química do Quinino

Fig. 2 e a estrutura química do quinino, extraído da casca da árvore e usado pelos índios para curar a malária. (fonte: http://www.mhhe.com/biosci/pae/botany/botany_map/articles/article_08.html)

foi isolado em 1820 (figura 2). Cerca de um século mais tarde, a doença recebeu o nome italiano de "mal aire", que significa “mau ar” ou “ar insalubre”, dado que nessa época se acreditava que a enfermidade era causada pelas emanações provenientes dos pântanos (Dutra, 2001). Somente no final do século XIX, quando bacteriologistas e patologistas começaram a debruçar-se sobre as causas de diversas doenças infecciosas, bem como a estudar o papel dos insectos na transmissão de algumas dessas doenças, é que o conhecimento sobre a malária passou por um período de importantes descobertas: em 1880, o médico do exército francês Charles Alphonse Laveran, trabalhando na Argélia, foi o primeiro a observar e descrever parasitas da malária no interior de glóbulos vermelhos humanos. Em 1897, o médico britânico Ronald Ross, trabalhando na Índia, tornou possível a elucidação do modo de transmissão da doença, encontrando formas do parasita da malária no

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interior de um mosquito que havia picado um portador da enfermidade. O quadro completo do ciclo de desenvolvimento do parasita da malária foi, porém, obtido posteriormente graças aos investigadores italianos Amico Bignami, Giuseppe Bastianelli e Batista Grassi, em estudos realizados entre 1898 e 1899 (Dutra, 2001; Oaks Jr. et al; 1991). Foram as dificuldades no fornecimento do quinino durante a Primeira Guerra Mundial que estimularam investigadores alemães para a obtenção de antimaláricos sintéticos, culminando esta pesquisa com o desenvolvimento da cloroquina, em 1934 (Dutra, 2001). Grandes esforços são ainda hoje investidos no desenvolvimento de vacinas ou de drogas dirigidas especificamente ao parasita, isto é, ao Plasmodium falciparum, o agente da forma mais severa da malária. Este parasita, porém, mantém-se em rápida evolução e mutação, tanto antigénica como na resistência às drogas. Por trás desta evolução há um rearranjo rápido dos elementos modulares repetitivos dos seus genes, que geram novos fenótipos de protecção e resistência (Rich et al; 2000). A forma de P. falciparum (figuras 3 e 4) que se encontra na corrente sanguínea humana – merozoíto – é haplóide. Algumas destas formas diferenciam-se em gametócitos, que podem ser ingeridos pelo mosquito (uma fêmea do género Anopheles)

Fig. 3

Fig. 4 - Malária: por A. J. Knell para a Wellcome Trust

Fig. 3 – Aspecto dos merozoítos no interior dos glóbulos vermelhos (fotografia obtida a partir de microscopia óptica, ampliação 1000x), visíveis através da coloração de Giemsa. Fig. 4 – Multiplicação dos merozoítos no interior dos eritrócitos. (a) Os merozoítos provenientes do tecido hepático invadem os eritrócitos; (b) a cada 2 ou 3 dias um novo ciclo de crescimento está completo; (c) ruptura do esquizonte e infecção de novos eritrócitos. (fonte: Wellcome Trust em http://medphoto.wellcome.ac.uk)

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na sua refeição sanguínea. Os gametócitos fundem-se no estômago do mosquito e originam diplóides transientes, que sofrem meiose para se transformarem em novas formas infecciosas (haplóides) chamadas esporozoítos, migrando posteriormente para as glândulas salivares do mosquito. Os esporozoítos são por sua vez inoculados num novo hospedeiro através da picada do mosquito (Rich et al; 2000; Oaks Jr. et al; 1991). Em 30 minutos, os esporozoítos viajam pela corrente sanguínea até ao fígado, onde formam esquizontes (formas semelhantes a quistos) e se multiplicam. As formas contidas no esquizonte maduro são merozoítos prontos a serem libertados na corrente sanguínea do hospedeiro. Em seguida os merozoítos são novamente libertados na corrente sanguínea, e infectam então os eritrócitos (figura 4). É nesta fase que o paciente manifesta os sintomas clínicos da doença: anemia, febre, mal-estar e falta de apetite, dores de cabeça, dores musculares, cansaço e calafrios, intensa sudorese, aumento do tamanho do fígado e do baço (hepatoesplenomegalia) e distúrbios gastrointestinais. É igualmente nesta fase que a análise microscópica do sangue do paciente revela a infecção. No interior dos eritrócitos, os parasitas – então trofozoítos – consomem a hemoglobina e multiplicam-se, podendo surgir glóbulos vermelhos multiparasitados. Este ciclo de desenvolvimento encontra-se resumido na figura 5. As infecções com Plasmodium falciparum progridem muito rapidamente: cerca de 48 horas podem ser suficientes para se evoluir dos primeiros sintomas até ao coma, enquanto que a esperança média de vida para crianças infectadas, segundo alguns estudos, pode ser de apenas 3 dias (Oaks Jr. et al; 1991). O quadro clínico de um paciente infectado com P. falciparum pode evoluir rapidamente para distúrbios da coagulação sanguínea, choque, insuficiências renal, hepática e adrenal, convulsões, delírio, anemia hemolítica, distúrbios do equilíbrio hidroelectrolítico, hipoglicémia, disritmias cardíacas, encefalopatia aguda e edema pulmonar. As formas graves de malária

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estão relacionadas à parasitémia elevada, isto é, parasitémias superiores a 2 % dos eritrócitos em circulação, tendo já sido verificadas parasitémias acima dos 30 % (Cavalcante, 1999).

Fig. 5 – Ciclo de desenvolvimento do parasita Plasmodium. (fonte: http://phil.cdc.gov/phil)

1.2 – Quimioprofilaxia da Malária Em Portugal, apesar da existência do mosquito do género Anopheles, a malária foi erradicada em 1958, pelo que os casos da doença são esporádicos e importados (Pina, 1999). No entanto, viajantes ou visitantes não-imunes que se desloquem até zonas endémicas para a malária encontram-se em risco de contrair e desenvolver a forma mais severa e complicada da doença, pelo que devem seguir um regime preventivo de drogas anti-maláricas. No passado, a quimioprofilaxia baseada na cloroquina era eficiente e segura, sendo recomendada para todas as pessoas em risco de contrair a doença. No entanto, a propagação de estirpes de P. falciparum e P. vivax resistentes à cloroquina tem

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diminuído a eficácia deste medicamento e as alternativas actualmente ao dispor apresentam alguma toxicidade (Oaks Jr. et al; 1991), o que agrava o problema. Actualmente, a instituição da quimioprofilaxia assenta em três pontos fundamentais: 1) Conhecimento dos antimaláricos: na quimioprofilaxia da malária podem utilizar-se, genericamente, cinco fármacos: a cloroquina, a mefloquina, o proguanil, a doxiciclina, e a combinação atavaquona/proguanil. Na prática, na maioria dos casos, a

Áreas onde ocorre transmissão de malária (alto/baixo) Resistência à cloroquina Resistência a sulfadoxina-pirimetamina Resistência à mefloquina Zonas livres de malária

Fig. 6 – Zonas endémicas para a malária e resistência do P. falciparum às diferentes drogas. (Fonte: WHO, “World Malaria Report 2005”)

escolha estabelece-se entre a cloroquina e a mefloquina, dependendo da área geográfica da viagem (Pina, 1999). 2) Conhecimento das áreas endémicas e das áreas de cloroquino-resistência: a Organização Mundial de Saúde (World Health Organization, WHO) disponibiliza, regularmente, os mapas das áreas endémicas (figura 6), com recomendações relativas à quimioprofilaxia da malária. As zonas endémicas são divididas consoante o risco de transmissão da malária. Nas zonas com maior risco de transmissão a necessidade de quimioprofilaxia é impreterível. Nestas zonas, o fármaco de primeira escolha é a mefloquina, uma vez que existem resistências conhecidas à cloroquina. A resistência à

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mefloquina é ainda, felizmente, um problema restrito a algumas áreas do globo, como as zonas rurais fronteiriças do Cambodja, Myanmar e Tailândia, onde a profilaxia deve ser realizada com doxiciclina (Pina, 1999). 3) Adaptação da quimioprofilaxia às características do viajante: a quimioprofilaxia tem de ser adaptada no caso das grávidas, das crianças, das pessoas com estadias prolongadas (mais de um mês) no destino da sua viagem, ou das pessoas que viajam frequentemente para áreas de risco. A malária contraída durante a gravidez aumenta o risco de morte materna, de morte neonatal, de aborto espontâneo e de nados-mortos, pelo que a grávida deve ser vivamente aconselhada a não viajar para áreas endémicas, excepto em caso de absoluta necessidade (Pina, 1999). Actualmente, ainda não existe uma quimiprofilaxia absolutamente incontestável. Por esta razão, é importante que tanto os pacientes como os médicos tenham consciência que nenhum regime é completamente eficaz ou infalível, e que o diagnóstico rápido e tratamento adequado são de extrema importância no combate à doença. Viajantes provenientes de áreas endémicas para a malária, e que contraem a doença apesar de seguirem o regime quimioprofiláctico recomendado, podem revelar a propagação de resistência a uma dada droga anti-malárica. Todavia, uma vez que tanto os níveis de exposição como o grau de imunidade para a doença são diferentes dos da população local, estes indicadores poderão não ser totalmente seguros em relação à formulação de políticas de tratamento nacionais em áreas endémicas. A capacidade de determinação da sensibilidade local de cada parasita a diferentes drogas é importante; os ensaios in vitro, que medem o crescimento do parasita em concentrações crescentes de uma droga, são comummente usados no teste a novas drogas anti-maláricas. Os resultados, contudo, correlacionam-se fracamente com os mesmos resultados in vivo, em especial porque no ensaio laboratorial não se pode inserir a componente específica de cada paciente, tal como diferenças no metabolismo

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ou níveis de imunidade, factores que podem influenciar a sensibilidade às drogas utilizadas (Oaks Jr. et al; 1991). Uma opção a considerar em termos do controlo local da propagação da malária é a quimioprofilaxia intensa administrada em segmentos da população em maior risco de contrair a doença. Estes programas fracassaram, no passado, devido ao fornecimento irregular das drogas necessárias e da dificuldade em fazer a população seguir o regime aconselhado (Oaks Jr. et al; 1991). Porém, se estes obstáculos forem ultrapassados, a quimioprofilaxia poderá ser eficaz, nomeadamente nas camadas mais jovens da população. Serão necessários ainda estudos que relacionem a quimiossupressão da malária com a aquisição da imunidade natural à doença e com a evolução da resistência às drogas a fim de se implementar uma política de quimioprofilaxia mais eficaz.

1.3 – Diagnóstico da Malária Uma vez que os sintomas da malária podem confundir-se com os sintomas de outras doenças, o diagnóstico baseado apenas nos sintomas clínicos não é fiável (Oaks Jr.

et al; 1991). Se existem evidências da doença (como parasitas no sangue do paciente), particularmente em indivíduos não-imunes, a progressão da doença deve ser evitada de forma rápida e eficaz através de terapia apropriada. Alternativamente, se a causa da doença não é clara, outras explicações para os sintomas devem ser consideradas a fim de que o tratamento adequado possa ser iniciado rapidamente e o uso de drogas anti-maláricas potencialmente tóxicas possa ser evitado. Assim, o desenvolvimento de novos testes de diagnóstico, rápidos, eficazes e que produzam resultados inequívocos é muito importante. Um teste de diagnóstico tem como principal objectivo auxiliar os técnicos de saúde (quaisquer que sejam as condições em que estejam a trabalhar) a seleccionar o

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tratamento mais adequado para os pacientes. Deverá igualmente ser capaz de diferenciar correctamente indivíduos infectados e indivíduos não-infectados, sendo a validade do método determinada pelas suas sensibilidade e especificidade (Oaks Jr. et al; 1991). A sensibilidade de um teste indica a probabilidade do resultado ser positivo quando a amostra testada pertence efectivamente a um indivíduo infectado. À medida que a sensibilidade do teste aumenta, o número de falsos negativos (indivíduos que estão infectados mas cuja análise retorna negativa) diminui. Por sua vez, a especificidade de um teste indica a probabilidade de um indivíduo ter um resultado negativo quando a amostra testada não está infectada. À medida que a especificidade aumenta, os falsos positivos (indivíduos incorrectamente classificados como estando infectados) diminui. Pode dizer-se portanto que um teste altamente sensível é bastante preciso a identificar indivíduos infectados, enquanto que um teste muito específico identifica com precisão indivíduos que não estão infectados (Oaks Jr. et al; 1991).

1.3.1 – Testes de diagnóstico Actualmente, o teste mais comum para o diagnóstico da malária é o exame microscópico do sangue do paciente. A presença de parasitas, identificados pela sua

morfologia

característica,

é

considerada prova definitiva de infecção. Para a observação microscópica, duas Fig. 7 – Esfregaço e gota espessa preparados a partir de sangue recolhido por punção venosa (Fonte: WHO).

gotas de sangue são colocadas em

lâminas de observação; uma produz um esfregaço e a outra é deixada a secar e forma a chamada “gota espessa” (figura 7). As células presentes no esfregaço são fixadas quimicamente à lâmina e coradas, a fim de facilitar a detecção dos parasitas. A gota espessa permite ao técnico procurar parasitas num volume maior de sangue, o que

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aumenta a sensibilidade do teste. Assim, o esfregaço (que preserva as morfologias do glóbulo vermelho e do parasita) é usado para quantificar e identificar os parasitas a nível da espécie, enquanto que a gota espessa permite uma verificação mais rápida da presença de parasitas no sangue do paciente. São necessários pelo menos 100 a 200 campos de observação na gota espessa para excluir com segurança a presença do parasita. Apesar de a microscopia ser um método tremendamente comum e uma ferramenta de diagnóstico muito útil, contém algumas desvantagens: o custo do material (lâminas e reagentes) é baixo, porém é necessário um investimento substancialmente maior para a aquisição e manutenção dos microscópios e treino dos técnicos. Além disso, em países em vias de desenvolvimento, poucos são os centros de saúde capazes de suportar microscópios em perfeito estado de funcionamento. Portanto, há necessidade de técnicas alternativas à microscopia como meio de diagnóstico para a malária. A identificação de genes e antigénios do parasita são a base de potenciais novos testes de diagnóstico, que utilizem anticorpos monoclonais ou técnicas de DNA recombinante. Estes testes deverão detectar antigénios ou sequências de ácidos nucleicos específicas do parasita, em limites de detecção iguais ou superiores aos proporcionados pela microscopia (Oaks Jr. et al; 1991). Desde o princípio da década de 80 que se encontram descritas técnicas imunológicas que detectam antigénios de Plasmodium (Oaks Jr. et al; 1991). Estes testes são especialmente úteis em centros de saúde onde não seja possível proceder a técnicas de microscopia, ou como forma de comprovar a infecção. Os alvos antigénicos ideais para testes imunológicos são aqueles que não persistem no sangue após a eliminação do parasita, são abundantes no sangue durante a infecção – a fim de maximizar a sensibilidade do teste – e são específicos para a espécie,

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

sem

qualquer

reacção

cruzada

com

antigénios

do

hospedeiro

ou

de

outros

microorganismos (WHO, 1988). Testes imunológicos experimentais que detectam antigénios do parasita da malária baseiam-se na competição e na captura de antigénios, em ensaios do tipo ELISA (enzyme - linked immunosorbent assay) e RIA (radioimmunoassay). Estas duas técnicas podem detectar densidades muito reduzidas de eritrócitos parasitados (cerca de 0.001 a 0.01%, o equivalente a 50 a 500 parasitas por microlitro de sangue, respectivamente). Contudo, a técnica de radioimunoensaio (RIA) utiliza radioisótopos que são dispendiosos, têm tempos de meia-vida curtos e são potencialmente perigosos, pelo que a utilização deste teste torna-se impraticável para um uso clínico rotineiro. Novas tecnologias que amplificam sequências de DNA poderão ser de grande utilidade no diagnóstico da malária. A técnica de PCR (polymerase chain reaction) é um bom exemplo. Contudo, esta técnica requer cerca de 3 a 4 horas para fornecer um resultado, e tanto o aparelho como os reagentes são relativamente dispendiosos. Também se colocam os problemas de contaminação com ácidos nucleicos estranhos à amostra. Por tudo isto, esta técnica deverá ser ainda bastante melhorada antes de poder ser contada como um teste rápido para o diagnóstico da malária. As técnicas de PCR têm sido utilizadas para identificar infecções de malária com primers de DNA específicos para

P. falciparum e P. vivax. Estas sequências poderão potencialmente ser usadas para diagnóstico clínico, identificação do parasita a nível da espécie e determinação da resistência a algumas drogas. Porém, a menos que os resultados providenciados por esta técnica possam ser correlacionados com a parasitémia, o PCR poderá não ser a melhor escolha em áreas onde a malária é endémica e a maioria dos habitantes apresenta algum nível de parasitémia sem manifestar os sintomas clínicos da doença.

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1.3.1.1 – O método ELISA O método ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) é um imunoensaio enzimático de fase sólida que detecta e amplifica a reacção entre um antigénio e um anticorpo. Este método foi aplicado pela primeira vez em 1982 (Osório, 2005). Existem dois tipos de testes ELISA: o directo e o indirecto; enquanto que o primeiro detecta a presença de antigénios (Ag), o segundo detecta a presença de anticorpos (Ab) (figuras 8a e 8b).

Fig. 8a: Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA directo. 1- Ag ligado a Ab específico adsorvido a poços de placas de microtitulação, com posterior adição de um segundo Ab específico, ligado a uma enzima (E); 2- ligação do segundo Ab ao Ag; 3- adição do substrato incolor (S) da enzima e produção do produto (P) colorido. (fonte: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/elisa/diagram_Ag.html)

Fig. 8b: Esquema de um resultado positivo de um teste de ELISA indirecto. 1- Ab ligado a Ag específico adsorvido a poços de placas de microtitulação, com posterior adição de um anti-anticorpo ligado a uma enzima (E); Noanti-anticorpo teste directo, um3-anticorpo específico é adsorvido à superfície poços(P) decolorido. 2- ligação do ao Ab; adição do substrato incolor (S) da enzima e produção dos do produto (fonte: http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/elisa/diagram_Ab.html)

No teste directo, um anticorpo específico é adsorvido à superfície dos poços de placas de microtitulação, aos quais posteriormente é adicionada a amostra que contém o antigénio a ser detectado. Após um período de incubação, adiciona-se um segundo anticorpo específico para o antigénio em estudo, encontrando-se este segundo anticorpo covalentemente ligado a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) que converte um substrato incolor num produto com cor. Por fim, adiciona-se o substrato. Se o anticorpo

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ligado à enzima se ligar, por sua vez, ao antigénio (no poço), ocorre actividade enzimática, podendo esta ser detectada por uma alteração de cor (Osório, 2005). O princípio teórico do teste de ELISA indirecto é semelhante ao do teste directo. No entanto, neste teste pretende-se efectuar a detecção de anticorpos, pelo que se adsorve à superfície dos poços de placas de microtitulação um antigénio específico. Posteriormente, é adicionada a amostra que contém o anticorpo a ser detectado. É utilizada a mesma enzima do método anterior, estando neste caso ligada a um segundo antigénio específico. A detecção da ligação anticorpo-antigénio é efectuada do mesmo modo que para o ELISA directo (Osório, 2005). Já foi demonstrado (Oliveira et al; 2000; Osório, 2005) que este método apresenta diversas vantagens, sendo destacados os seguintes aspectos: (i) Especificidade: com a utilização de anticorpos monoclonais é possível obter uma boa minimização das reacções cruzadas; (ii) Sensibilidade: o sistema de amplificação enzimática pode assegurar à metodologia uma sensibilidade elevada, visto que podem ser obtidos limites de determinação inferiores a 0,5 ng/g; (iii) Rapidez: a análise pode ser efectuada em cerca de 30 minutos; (iv) Facilidade de uso: o teste de ELISA é relativamente simples, podendo ser efectuado em condições reduzidas de tempo e de trabalho; e (v) Custos: em função da rapidez e facilidade de uso, o custo do teste de ELISA é considerado relativamente baixo, em comparação com as técnicas convencionais. Apesar dos custos da produção de anticorpos serem elevados, apenas uma pequena quantidade é utilizada em cada ensaio, fazendo com que o custo por teste seja significativamente reduzido (Oliveira et al; 2000).

1.4 – Imunidade natural à malária Indivíduos que vivem em zonas endémicas para a malária adquirem um certo grau de imunidade aos sintomas clínicos da doença após repetidas exposições ao parasita, mantendo porém níveis detectáveis de parasitémia em circulação (John et al; 2003;

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Bereczky, 2005). Essa imunidade adquirida é porém limitada, e diminui aquando da interrupção da exposição ao parasita, dependendo também da idade do paciente – imigrantes ou visitantes adultos que se desloquem para zonas endémicas tornam-se menos susceptíveis à malária mais rapidamente que as crianças nas mesmas condições (Bereczky, 2005). Assim, supõe-se que a imunidade adquirida se desenvolve lentamente com a idade e as repetidas infecções (em zonas endémicas). Durante os primeiros meses de vida, as crianças estão protegidas contra a doença devido à transmissão intra-uterina de anticorpos produzidos pela progenitora (Bereczky, 2005); cerca de 6 meses mais tarde, perdem essa protecção e a exposição crescente ao parasita resulta em casos de malária severos, com uma elevada taxa de mortalidade; aproximadamente 6 anos depois, as crianças já apresentam um considerável grau de imunidade que se manifesta por menos episódios clínicos da doença, menores parasitémias e respostas imunes mais específicas (Bereczky, 2005). Ao atingir a idade adulta, raramente estes indivíduos experimentam episódios clínicos. Porém, durante a gravidez as mulheres são muito susceptíveis de contrair formas severas de malária, sendo comum a ocorrência de complicações fetais e crianças com baixo peso à nascença. Esta elevada susceptibilidade é mais pronunciada durante a primeira gravidez, talvez pelo facto de haver sequestro de parasitas na placenta (Bereczky, 2005).

1.4.1 – Diversidade genética do hospedeiro As diferentes espécies de Plasmodium têm existido ao longo da história evolutiva da Humanidade (Bereczky, 2005). Uma vez que as infecções possuíam um efeito significativo sobre a mortalidade de juvenis em idades anteriores à de reprodução, a malária exerceu uma pressão selectiva muito forte sobre o genoma humano (Rich e Ayala, 2000; Bereczky, 2005).

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Desordens hereditárias que envolvem a hemoglobina (por exemplo, talassémias e anemias falciformes), tal como os polimorfismos associados com a regulação da actividade do enzima glucose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD), com a regulação da banda 3 eritrocítica (responsável pela integridade dos eritrócitos), ou com a regulação da expressão dos antigénios de Duffy à superfície dos glóbulos vermelhos mostraram conferir um certo grau de protecção contra a malária (Bereczky, 2005). Vários estudos indicam que a imunidade natural contra a malária é, pelo menos em parte, regulada geneticamente. As regiões cromossómicas 5q31-q33, que contém os genes que codificam para as interleucinas IL-4, IL-9 e IL-13, são críticas nesse processo (Bereczky, 2005). Similarmente, a resistência ou susceptibilidade à malária clínica está associada com diversos polimorfismos imunogenéticos, tais como: nos haplotipos HLA I e II, na molécula de adesão intercelular ICAM-1, no receptor do complemento 1 (CR-1), na proteína de ligação à manose (MBP), e no factor alfa de necrose tumoral (TNF-α) (Bereczky, 2005). Para o desenvolvimento de uma resposta imune específica é necessário uma interacção entre células apresentadoras de antigénios, linfócitos B e linfócitos T. Destas interacções participam moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (HLA), receptores de linfócitos T e B e anticorpos. Se as moléculas de HLA não forem capazes de reconhecer ou apresentar correctamente os antigénios às células T, não se desenvolverá uma resposta imune específica (ou seja, não haverá produção de anticorpos nem respostas celulares). Contrariamente à situação da maioria das infecções virais e bacterianas, na malária a resposta imune protectora não é particularmente efectiva (Ferreira da Cruz, 1996). Várias parecem ser as causas: a estrutura dos antigénios parasitários e sua considerável diversidade dificulta a resposta imune influenciando a sobrevivência do parasita e a transmissão ao vector; a libertação de exo-antígenos e/ou mediadores

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

celulares produzidos em resposta ao parasita modulam a resposta imune tornando-a menos

eficiente

(imunodepressão,

activação

policlonal,

produção

de

auto

e

heteroanticorpos, hipergamaglobulinémia) e a localização intracelular do parasita, pela ausência de moléculas de HLA no eritrócito, concorrem para que estes proporcionem um meio relativamente favorável ao crescimento do plasmódio. A habilidade do Plasmodium falciparum e de outros parasitas da malária em mostrar diversidade antigénica entre diferentes isolados (devido ao polimorfismo de genes alelos) ou de sofrer variação antigénica no decurso de uma infecção (selecção clonal ou regulação génica parasitárias), demonstram também a capacidade de escape deste parasita à resposta imune e sua grande adaptabilidade ao hospedeiro vertebrado (Ferreira da Cruz, 1996).

1.4.2 – O papel do óxido nítrico na imunidade adquirida Até à descoberta, em 1987, de que o óxido nítrico (NO) é produzido em células de mamífero (Clarck et al; 2004), o NO era considerado apenas um poluente resultante da combustão de motores. Aquando da sua introdução na área da imunologia, era simplesmente definido como: “ o NO é um produto dos macrófagos activados por citoquinas e/ou compostos microbianos, deriva do aminoácido L-arginina pela actividade do enzima NOS (nitric oxide synthase) e tem funções tumoricidas e anti-microbianas,

in vivo e in vitro ” (Bogdan, 2001). Actualmente, e apesar desta definição simplista ainda ser aceite, sabe-se que o NO desempenha um papel muito mais complexo no sistema imunitário e também que possui uma grande importância na sinalização celular (Clarck et al; 2004). Sabe-se igualmente que existem não uma, mas três isoformas do enzima capaz de produzir NO biológico: nNOS (neuronal nitric oxide synthase), eNOS (endothelial nitric oxide synthase) e iNOS (induced nitric oxide synthase) (Bogdan, 2001), sendo as duas primeiras

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constitutivas e reguladas primariamente pelo fluxo de cálcio (e subsequente ligação da calmodulina) local, e a última não-constitutiva e capaz de operar independentemente da concentração local de cálcio (Bogdan, 2001). Todas estas isoformas operam por todo o sistema imunitário, não ficando restritas ao seu local de produção, e todas catalizam a mesma reacção: a conversão da L-arginina e oxigénio molecular para N-hidroxo-L-arginina e em seguida para citrulina e NO (figura 9), com a colaboração de cinco cofactores (FMN, FAD, heme, calmodulina e tetrahidrobiopterina) e dois catiões divalentes (cálcio e ferro); diferem, contudo, na forma como são reguladas, na amplitude e

Fig. 9 – Síntese do óxido nítrico. (fonte: Cayman Chemical Technologies)

duração da produção de NO, e na sua distribuição pelas células e tecidos (Bogdan, 2001). O óxido nítrico pode ser produzido por todas as células do sistema imunitário (células dendríticas, células NK, mastócitos e todos os fagócitos) bem como por outros tipos de células envolvidos em respostas imunitárias (células endoteliais, células epiteliais, células do tecido muscular liso, fibroblastos, queratinócitos, condrócitos, hepatócitos, células mesangiais e células de Schawnn) (Bogdan, 2001). Possui efeitos não apenas tumoricidas e anti-microbianas – como referido na definição original de 1987 – mas também contribui para a imunopatologia (causando necrose ou fibrose parenquimatosas) (Bogdan, 2001), supressão de anti-inflamatórios, modulação da produção e função de

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

citoquinas, quimoquinas e factores de crescimento e ainda tem efeitos sobre a indução e diferenciação das células TH (Bogdan, 2001). Em doenças infecciosas, o óxido nítrico possui um largo espectro de actividades; no caso da malária, o NO produzido no interior do vector (o mosquito Anopheles), desempenha não só funções de protecção contra o parasita Plasmodium, como facilita a refeição sanguínea do mosquito devido à ligação desta molécula a proteínas salivares (nitroforinas), o que tem o efeito de dilatar os vasos sanguíneos e antagonizar a resposta hemostática do hospedeiro humano durante a refeição sanguínea do mosquito (Bogdan, 2001). Apesar de os mecanismos moleculares efectivamente responsáveis pela imunidade naturalmente adquirida contra a malária se encontrarem ainda por clarificar, a produção de NO parece ser um importante marcador e potencial mediador da severidade da doença (Keller et al; 2004). O papel homeostático do NO em casos severos de malária foi confirmado por estudos em crianças residentes no Gabão, Tanzânia e Papua Nova Guiné, que eram tolerantes à malária e possuíam níveis bastante levados de óxido nítrico em circulação. Em todas estas crianças, em especial nas da Tanzânia, foi observado também um elevado nível de iNOS produzido por macrófagos no sangue periférico, sendo estes resultados

observados

também

nas

populações

adultas

correspondentes.

Estas

observações estão de acordo com a elevada frequência de pacientes assintomáticos que se encontram por toda a África (Clarck et al; 2004). Outro exemplo do papel homeostático do óxido nítrico em relação a malária provocada por P. falciparum é a sua capacidade de inibir a adesão de eritrócitos parasitados ao endotélio vascular (Clarck et al; 2004). Esta adesão é necessária para a maximização da produção de TNF (tumor necrosis factor) e logo, para o desenvolvimento da doença. Da mesma forma, a capacidade homeostática do NO está envolvida nos fenómenos de imunossupressão que acompanham os episódios de malária. Os

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

macrófagos podem suprimir os linfócitos-T na sua vizinhança através da produção de NO (Clarck et al; 2004), o que pode explicar a raridade de doenças auto-imunes em regiões do globo onde a malária é hiperendémica. A persistência de elevados níveis de óxido nítrico no sangue até à idade adulta, em pacientes com elevadas parasitémias mas sem manifestações clínicas da doença, suporta esta hipótese uma vez que estas doenças autoimunes são raras não apenas em crianças mas também em adultos, nas regiões hiperendémicas.

1.4.2.1 – Determinação dos níveis de NO em pacientes maláricos Devido aos problemas que a medição directa dos níveis de óxido nítrico levanta, a medição de nitritos e nitratos totais (produtos da clivagem enzimática do NO) é habitualmente usada para monitorizar a síntese de NO por enzimas, células em cultura ou organismos. Métodos baseados na quimioluminescência podem ser utilizados nesta medição, com resultados bastante satisfatórios; no entanto, o nitrito – um dos produtos estáveis e não-voláteis da decomposição do óxido nítrico – também pode ser medido por métodos colorimétricos (método de Griess), que apesar de serem menos sensíveis, são muito mais simples e não requerem equipamento especializado. Os métodos colorimétricos realizados em placas de microtitulação, aumentam a velocidade, precisão e rendimento da técnica, além de serem necessários menores volumes de amostras do que no caso da técnica de quimioluminescência. A reacção de Griess (esquematizada na figura 10) consiste na diazonização que foi originalmente descrita por Griess em 1879, baseando-se este método na reacção química entre a sulfanilamida e o NED (N-1-naftiletilenodiamina dihidrocloreto) em meio ácido, sendo possível detectar nitrito numa variedade de matrizes líquidas, experimentais ou biológicas, tais como plasma, soro, urina ou meio de cultura, sendo a sensibilidade

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

dependente da matriz a testar, e o limite de detecção de 2.5 mM (125 pmol) (Promega, 2006).

Fig.10 - Química da reacção de Griess para a detecção de nitrito/nitrato em amostras biológicas (fonte: Promega). Nota: NED significa N-1-naptiletilenodiamina dihidrocloreto.

O método de Griess serve-se da lei de Lambert-Beer para determinar a concentração de nitrito nas amostras, tendo em conta que esta lei estabelece a proporcionalidade entre a absorvância (ou densidade óptica) de uma solução, a um determinado comprimento de onda, e a sua concentração, segundo a equação:

Abs = log (I0/I) = ε l c

onde Abs é a absorvência, I0 e I representam a intensidade de luz incidida e a intensidade de luz transmitida, respectivamente; ε é o coeficiente de extinção molar (mol-1cm-1dm3) (específico para cada solução e comprimento de onda), l é o percurso óptico (normalmente 1cm) e c é a concentração da solução em estudo (mol/dm3).

1.4.3 – Imunidade humoral Os primeiros antigénios a serem apresentados ao sistema imunitário do hospedeiro durante o início de uma invasão por Plasmodium falciparum são as moléculas

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

à superfície do esporozoíto, expressas brevemente após a inoculação pelo vector anofelino. Durante algumas horas, o sistema imunitário do hospedeiro infectado poderá produzir anticorpos de combate à infecção, antes mesmo de o parasita invadir o fígado e passar à fase de merozoíto (Jelinek et al; 1998). Em pessoas que vivem em zonas endémicas para a malária, a prevalência e o nível de anticorpos contra os esporozoítos estão relacionados com a taxa de inoculação entomológica (Jelinek et al; 1998; Luty et al; 2005). Porém, parece certo afirmar que indivíduos com altos níveis de anticorpos anti-plasmódio em circulação não desenvolvem os sintomas clínicos da malária (Jelinek et al; 1998; Conway et al; 2000), que estão relacionados com a multiplicação assexuada do parasita no interior dos eritrócitos (Egan

et al; 1995). Estudos epidemiológicos em áreas holoendémicas para a malária mostraram que anticorpos citofílicos (como IgG1 e IgG3) – ou seja, imunoglobulinas capazes de se ligar a receptores celulares – estão associados com a imunidade natural à malária, enquanto que os isotipos não-citofílicos (IgG2, IgG4 e IgM) predominam em indivíduos não-imunes (Braga et al; 2002; Cavanagh et al; 2004). Inclusivamente, as subclasses citofílicas parecem proteger mais eficazmente contra a fase pré-eritrocítica da malária do que as subclasses não-citofílicas. Para os antigénios sanguíneos da fase assexuada da doença, as subclasses IgG1 e IgG3 podem interagir com péptidos à superfície dos glóbulos vermelhos infectados e aumentar a inibição do crescimento parasitológico através de um mecanismo dependente de anticorpos e mediado por monócitos (John et

al; 2003). Os anticorpos IgG3 têm curta duração (t½ = 7 dias), pelo que altos níveis desta imunoglobulina no sangue de indivíduos imunes requerem a sua produção contínua com o fim de assegurar uma concentração suficiente de anticorpo que permita uma acção eficaz (Cavanagh et al; 2004). A interacção entre o sistema imunitário do hospedeiro e o parasita varia de acordo com – entre outros factores – o grau de endemia; mesmo em áreas de alta endemicidade

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para a malária, a aquisição de imunidade natural requer entre 10 a 15 anos de exposição ininterrupta ao parasita (devido ao polimorfismo antigénico característico do P.

falciparum) (Braga et al; 2002; Giha et al; 2005), e diversos episódios comprovados de doença clínica (Giha et al; 2005). A aquisição de imunidade é portanto lenta, podendo mesmo nunca chegar a ser completa como fica comprovado pela existência de episódios esporádicos da doença em residentes de áreas altamente endémicas (Oaks Jr. et al; 1991; Giha et al; 2005). Anticorpos como IgG3 ou IgG1 poderão intervir na aquisição natural de imunidade à malária através de diferentes mecanismos, incluindo a inibição da infecção primária por aglutinação e/ou opsonização dos merozoítos, a aglutinação dos parasitas no interior dos eritrócitos, ou a inibição celular mediada pelos monócitos (Cavanagh et al; 2004). Uma vez que a imunidade à infecção por P. falciparum pode ser transferida passivamente através do soro (Wang et al; 2001), é possível que anticorpos contra a fase sanguínea assexuada do parasita possam desempenhar um papel importante na imunidade do paciente, juntamente com a imunidade mediada celularmente (Braga et al; 2002). Associações entre os níveis de anticorpos específicos para o parasita e a severidade da doença também foram demonstradas (Luty et al; 2000), tal como baixos níveis de anticorpos na fase aguda da infecção podem relacionar-se directamente com o número de parasitas na fase sanguínea (Luty et al; 2000). Da mesma forma, sabe-se que os parasitas de Plasmodium (em particular os seus antigénios ou produtos de excreção) após a quimioterapêutica levam a um acréscimo transitório dos níveis de IgG contra o número de parasitas totais (Luty et al; 2000). Isto poderá significar que respostas mais fracas de IgG observadas em pacientes afectados com a forma mais severa da malária poderá reflectir um estado de tolerância imunológica para os antigénios do parasita.

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A identificação de alvos antigénicos destas potenciais respostas humorais (isto é, via

anticorpos)

após

uma

infecção

pode

ajudar

à

compreensão

da

relação

parasita-hospedeiro e providenciar informação relevante para a pesquisa de possíveis antigénios a utilizar numa vacina contra a malária (Wang et al; 2001).

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2. Procedimento Experimental

2.1 – Obtenção de amostras As 138 amostras de sangue (com um volume de 5 mL) foram obtidas por punção venosa e colhidas após consentimento oral dos pacientes, que se dirigiram à consulta do serviço de Clínica das Doenças Tropicais do Instituto de Higiene e Medicina Tropical de Lisboa, entre Novembro de 2005 e Dezembro de 2006. Todos as amostras são provenientes de indivíduos com idade superior a 18 anos.

2.2 – Parasitologia e Hematologia De cada amostra (i.e., do sangue de cada paciente) são preparadas duas lâminas: um esfregaço e uma gota espessa (segundo as indicações da WHO), e é obtido o hemograma (num analisador automático Sysmex® K-1000, Emílio de Azevedo Campos) a partir do sangue fresco, inteiro, colocado num tubo com EDTA 1 mg/mL. Devidamente identificadas, as lâminas são secas, o esfregaço é fixado com metanol e em seguida ambas as lâminas são coradas durante 20 minutos segundo o método de Giemsa (20 gotas de corante em 10 mL de água tamponada, pH = 7.2). Passado esse tempo, o excesso de corante é retirado sob um fio de água e as lâminas são deixadas a secar ao ar durante 5 minutos; em seguida, são observadas por microscopia óptica, numa ampliação de 1000x, num microscópio Leitz Biomed® (LaboControle Lda). Utiliza-se a gota para diagnóstico qualitativo de malária, e o esfregaço para identificação da espécie de Plasmodium e determinação do número de parasitas por cada 200 leucócitos; este número é depois convertido para número de parasitas por microlitro de sangue (WHO, 1985).

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2.3 – Serologia O soro necessário para as determinações é obtido por centrifugação. O sangue é recolhido para um tubo seco, sem anticoagulante, onde sofre uma retracção de aproximadamente 1 hora, numa estufa a 37º C. Após esse tempo, o sangue é centrifugado (10 minutos a 3500 rpm, numa centrífuga Heraeus® Labofuge 200 [CertiLab Portugal]), sendo o soro imediatamente transferido para tubos eppendorf devidamente identificados. As amostras séricas são guardadas a -80º C até à sua utilização.

2.4 – Determinação dos níveis de NO séricos

2.4.1 – Preparação da curva de calibração Preparou-se 1 mL de uma solução aquosa de nitrito 100 µM. Designaram-se 24 poços (3 colunas) das placas de microtitulação (Maxisorp,

Fig. 11 – Disposição de reagentes padrão para a determinação da curva de calibração do método de Griess (fonte: Promega)

Nunc A/S) para a determinação da curva de calibração. Em cada poço das filas B a H (figura 11) foram colocados 50 µL de água destilada, e na fila A foram colocados 100 µL da solução de nitrito 100 µM. Imediatamente a seguir, efectuaram-se 6 diluições seriais (1:2) em triplicado de forma a obter as concentrações de nitrito indicadas na

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

figura 13 (100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13 e 1.56 µM), não tendo sido adicionado nenhum nitrito à última fila de poços (fila H). Dessa forma, o volume final de cada poço é de 50 µL e a concentração de nitrito varia entre 0 e 100 µM.

2.4.2 – Determinação dos níveis de NO pela reacção de Griess Clarificaram-se as amostras de resíduos celulares ou materiais insolúveis por centrifugação (Heraeus® Labofuge Pico, CertiLab Portugal) a 1300 rpm, 5 minutos antes do ensaio. As placas de microtitulação (Maxisorp, Nunc A/S) são preenchidas segundo o mesmo esquema descrito na figura 13. Todas as amostras foram colocadas em duplicado a fim de se determinar o desvio-padrão de cada teste. Adicionaram-se 50 µL de cada amostra sérica a cada poço, aos quais foi adicionado imediatamente 50 µL da solução de sulfanilamida1. Em seguida incubaram-se as placas durante 10 minutos à temperatura ambiente, protegidas da luz; após esse tempo foram adicionados 50 µL da solução de NED2 a todos os poços e incubou-se durante mais 10 minutos, protegidas da luz. Após esta segunda incubação, mediu-se a absorvância a 570 nm (microplate

reader Dynatech® MR7000 [Dynatech]), e determinaram-se as concentrações de nitrito em cada amostra através da curva de calibração, utilizando a lei de Lambert-Beer, como descrito na secção 3.6 de Resultados.

1, 2 – As composições das soluções utilizadas encontram-se no anexo A1.

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3. Resultados 3.1 – Distribuição demográfica de dados clínicos Todas as amostras foram obtidas a partir de voluntários, com idade superior a 18 anos, que se dirigiram ao serviço clínico do IHMT, entre Novembro de 2005 e Janeiro de 2007. Para cada indivíduo foi obtida uma história clínica e epidemiológica. Esta permitiu a classificação do total de amostras (n = 138) em três conjuntos de pacientes de acordo com o seu grau de exposição e/ou contágio com P. falciparum, da seguinte forma:

−

Indivíduos infectados com P. falciparum, segundo os critérios de diagnóstico já referidos: Grupo 1 (n = 13);

−

Indivíduos com estadia em zona endémica e sem infecção aparente: Grupo 2 (n =100);

e −

Indivíduos não-expostos a P. falciparum (grupo de controlo negativo): Grupo 3 (n= 25).

Adoptando esta classificação, temos as seguintes médias:

- Grupo 1 Mulheres 46%

5

4

2

2

0

Homens 54%

< 30

[30 - 39] [40 - 49] [50 - 59]

> 60

inte r valos e tários

Figura 12.1 – distribuição etária e sexual dos pacientes infectados com P. falciparum (n= 13).

27

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

- Grupo 2

homens 70%

31 25 21 12

mulheres 30%

60

intervalos etários

Figura 12.2 – distribuição etária e sexual dos indivíduos com estadia em zona endémica para P. falciparum (n=100).

- Grupo 3 12

Mulheres; 64%

4

4 3

Homens; 36%

2 < 30

[30 - 39] [40 - 49] [50 - 59]

> 60

intervalos etários

Figura 12.3 – distribuiçtária e sexual dos pacientes não-expostos a P. falciparum (n=25).

Distribuição por Grupo de Estudo Grupo 2 n = 100; 73%

Grupo 3; n = 25; 18%

Grupo 1; n = 13; 9%

Viajantes n = 93

Imigrantes n=7

Figura 13 – Distribuição da população (n=138) por grupos de estudo.

28

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

3.2 – Informação clínica dos pacientes As informações clínicas presentes nos quadros seguintes (tabelas 1, 2 e 3) referem-se aos seguintes parâmetros: presença ou ausência de sintomas clínicos, resultado do hemograma (em relação aos níveis de hemoglobina, concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), plaquetas e leucócitos) e parasitémia total. O diagnóstico ou despiste de malária foi sempre efectuado no Laboratório Central de Patologia Tropical do Instituto de Higiene e Medicina Tropical de Lisboa. Para os pacientes imigrantes de países endémicos para a malária foram também efectuados despistes para dengue, sífilis, hepatites, HIV, parasitoses intestinais e infecções urinárias.

3.2.1 – Pacientes infectados com P. falciparum Neste grupo incluem-se as amostras provenientes de indivíduos que se encontravam, na altura da colheita, clinicamente infectados com P. falciparum. Tabela 1 – Resumo das informações clínicas de pacientes infectados com P. falciparum (n=13). Nº de entrada (referência)

Género e idade

Sintomas clínicos

Hemoglobina (g/dL)

Hemograma MCHC Plaquetas (g/dL) (x103/µL)

Leucócitos (x103/µL)

Parasitémia (por µL de sangue)

1109-2 M 42 + 12.9 33.5 191 5.4 3240 trofozoítos 0302-1 F 25 + 10.8 35.2 297 5.2 993 gametócitos 1302-2 F 25 + 10.6 32.9 141 4.5 50 gametócitos 1204-5 M 56 + 10.1 37.2 145 8.1 19900 trofozoítos 0404-1 M 55 + 12.3 33.7 464 6.3 9234 gametócitos 1105-6 F 20 + 10.9 33.4 147 7.0 280 trofozoítos 1205-3 F 49 + 14.8 33.1 160 2.3 46 trofozoítos 1505-2 F 49 + 14.8 34.0 179 3.7 5 trofozoítos 1107-2 M 45 + 8.1 34.5 90 4.5 540 trofozoítos 2507-1 M 34 + 14.2 34.5 159 7.4 3996 trofozoítos 2707-1 F 30 + 9.6 31.2 209 7.4 10804 trof + 1036 gam. 0109-2 M 26 + 15.3 35.6 158 4.7 4371 trofozoítos 2812-3 M 41 + 12.8 34.6 122 7.8 3354 trofozoítos média ------12.0 34.1 195 5.5 ---referência ------[13 ; 16] [35 ; 40] [162 ; 220] [6 ; 7] ---Notas: 1) O símbolo (+) na coluna “sintomas clínicos” indica a sua presença, o símbolo (-) indica a sua ausência. 2) Os valores de referência para os níveis de hemoglobina no sangue humano são: 14 a 18 g/dL (homem) e 12 a 16 g/dL (mulher); os valores indicados na tabela referem-se à média destas referências entre homens e mulheres. 3) A letra F refere-se aos pacientes de sexo feminino e a letra M refere-se aos de sexo masculino.

3.2.2 – Viajantes com estadia em zonas endémicas Neste grupo incluem-se as amostras provenientes de indivíduos que estiveram em zonas endémicas para a malária provocada pelo parasita P. falciparum, mas que não contraíram a doença.

29

Tabela 2 – Resumo das informações clínicas de pacientes com estadia em zonas endémicas para P. falciparum e sem infecção aparente (n=100). Nº de entrada (referência)

Género e idade

Sintomas clínicos

1209-1 1810-1 2505-3 1410-1 2110-5 0601-3 0702-3 0702-4 1402-1 1402-2 1402-4 1602-1 2002-3 0103-5 0103-6 0203-1 0203-2 0603-2 0703-1 0703-4 0703-5 0803-1 0803-2 0903-3 1003-3 1003-4 1103-3 1503-3 1603-4 1703-1 2003-1 2103-1 2103-2 2203-1 2303-2 2703-44 3003-3 3003-4 3103-6 3003-7 0304-2 0304-5 0404-3 0604-1 0704-2 1004-45 2004-2 2104-3 2404-46 2604-3

M 37 F 68 F 30 M 43 F 82 M 49 M 36 M 28 M 51 F 54 M 32 F 29 M 46 F 50 M 30 M 53 M 53 F 54 F 41 M 37 M 44 M 29 M 37 F 32 F 50 M 27 M 31 M 48 M 42 M 61 F 42 M 61 M 30 M 55 M 30 M 24 F 54 F 33 F 39 F 54 F 29 M 45 F 48 M 37 F 30 M 21 M 47 M 57 M 36 M 37

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

Hemoglobina (g/dL) 16.3 13.4 14.2 15.8 14.2 14.6 15 16.2 14.8 12.8 14.0 14.2 16 12.3 16.5 14.3 15.5 13.5 13.3 15.6 14.3 14.5 15.4 12.0 13.7 14.3 15.9 13.2 14.0 14.3 14.3 15.5 15.0 13.5 15.8 14.3 12.4 12.2 10.0 13.4 15.5 15.4 8.1 15.7 12.9 15.6 14.3 14.9 13.5 16.2

Hemograma MCHC Plaquetas (g/dL) (x103/µL) 35.1 34.9 34.5 34.9 34.7 34.8 36.1 36.7 34.4 33.8 34.5 35.1 34.5 33.3 34.2 34.0 36.1 33.7 33.7 34.2 33.8 34.5 34.4 35.5 34.7 32.7 35.9 32.4 35.0 34.9 32.4 35.6 35.5 36.1 36.7 35.0 34.1 34.0 35.6 31.2 36.6 35.7 32.0 35.5 36.0 35.8 35.4 34.7 34.1 34.9

251 387 239 170 240 297 257 203 150 259 250 173 244 136 241 453 329 259 134 201 292 282 271 219 303 222 221 240 245 259 164 130 244 233 224 221 249 290 565 180 197 165 137 212 231 201 170 224 182 135

Leucócitos (x106/µL)

Parasitémia (por µL de sangue)

6.1 7.3 7.5 6.4 7.6 16.2 9.0 7.9 3.8 4.3 10.5 7.0 8.2 7.6 5.4 10.0 8.1 10.6 8.2 6.9 5.2 5.4 14.2 6.6 7.8 7.7 7.7 6.6 8.3 8.4 6.7 9.1 9.1 8.1 6.8 3.3 5.0 10.8 6.3 10.2 12.9 6.7 4.1 19.1 8.6 3.4 2.5 4.8 3.6 11.0

s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s s/s

2604-4 M 47 15.8 34.2 260 8.6 s/s 0905-1 M 51 13.5 34.6 287 8.5 s/s 0905-2 M 52 + 16.0 33.7 219 8.5 s/s 0905-3 F 37 + 12.7 32.6 186 6.5 s/s 0905-4 M 43 15.3 34.4 238 10.2 s/s 0905-6 M 43 + 15.2 35.8 204 6.0 s/s 1005-1 M 30 + 13.9 36.4 189 5.0 s/s 1005-47 M 29 15.5 34.1 141 3.4 s/s 1105-2 M 75 14.5 34.9 208 7.9 s/s 1205-1 M 50 13.9 35.2 195 6.5 s/s 1205-2 F 61 + 14.0 34.6 112 7.7 s/s 1505-48 M 36 14.3 34.0 224 6.6 s/s 1605-3 F 55 12.6 34.2 349 8.3 s/s 1605-4 M 51 13.4 34.6 151 7.6 s/s 1705-1 M 43 15.5 35.3 240 8.5 s/s 1705-49 M 42 11.3 33.3 76 6.5 s/s 2205-3 M 47 10.5 34.8 193 5.5 s/s 2205-4 M 32 + 15.4 35.2 311 8.3 s/s 2305-1 M 59 17.0 34.5 466 11.3 s/s 2405-1 F 30 + 13.3 33.0 270 9.2 s/s 2405-2 M 68 16.5 32.6 184 10.7 s/s 2405-4 F 21 13.2 35.3 189 5.4 s/s 2505-2 M 37 15.6 34.5 451 10.6 s/s 2505-4 M 26 17.1 34.9 249 7.9 s/s 2505-5 M 43 5.4 34.2 28 8.3 s/s 2605-1 M 29 14.0 35.0 245 5.7 s/s 2905-8 F 37 12.4 32.9 232 6.4 s/s 3005-1 F 29 12.3 33.6 250 5.1 s/s 3005-2 F 38 12.4 35.2 299 10.0 s/s 3105-4 M 35 16.0 37.8 307 6.8 s/s 0106-1 M 35 + 15.8 37.2 321 6.6 s/s 0206-2 M 48 12.7 34.0 333 8.3 s/s 0206-3 M 37 15.2 35.2 439 9.0 s/s 0206-5 M 64 12.8 32.4 287 6.5 s/s 0706-2 M 51 14.1 34.6 219 7.1 s/s 0706-3 M 66 14.9 33.6 191 6.8 s/s 0706-5 M 44 14.8 35.2 207 4.0 s/s 1406-3 M 44 13.8 34.8 376 9.6 s/s 1906-2 F 44 10.8 33.9 227 4.6 s/s 2706-3 M 58 + 14.0 34.5 235 7.6 s/s 2706-4 M 48 15.5 36.1 214 8.5 s/s 2706-5 M 51 + 13.4 33.3 477 11.0 s/s 0407-1 M 69 + 10.5 34.3 262 6.5 s/s 0507-1 F 36 14.4 35.6 287 17.7 s/s 0507-2 M 44 + 14.8 35.1 186 5.8 s/s 0507-50 M 34 13.7 36.1 182 5.2 s/s 0607-1 F 61 + 12.0 33.5 158 5.8 s/s 0607-2 M 51 + 14.3 34.5 117 3.6 s/s 1107-3 F 30 13.6 34.6 222 8.1 s/s 1307-1 M 43 8.1 34.8 101 4.5 s/s média ------14.0 34.7 238 7.7 ---referência ------[13 ; 16] [35;40] [162; 220] [6 ; 7] ---Notas: 1) O símbolo (+) na coluna “sintomas clínicos” indica a sua presença, o símbolo (-) indica a sua ausência. 2) Os valores de referência para os níveis de hemoglobina no sangue humano são: 14 a 18 g/dL (homem) e 12 a 16 g/dL (mulher); os valores indicados na tabela referem-se à média destas referências entre homens e mulheres. 3) A letra F refere-se aos pacientes de sexo feminino e a letra M refere-se aos de sexo masculino. 4) O símbolo s/s na coluna “Parasitémia” significa “sem significado”.

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

3.2.3 – Pacientes não-expostos a P. falciparum Neste grupo de controlo negativo incluem-se as amostras provenientes de indivíduos saudáveis da população portuguesa, e nunca expostos ao parasita

P. falciparum. Tabela 3 – Resumo de informações clínicas de pacientes não-expostos a P.falciparum (n=25). Nº de entrada (referência)

Género e idade

Sintomas clínicos

Hemoglobina (g/dL)

Hemograma MCHC Plaquetas (g/dL) (x103/µL)

Leucócitos (x103/µL)

Parasitémia (por µL de sangue)

3003-1 F 44 s/s 13.2 35.7 159 6.1 s/s 3003-2 F 25 s/s 13.4 34.7 409 12.1 s/s 3003-5 F 58 s/s 12.9 34.3 266 12.2 s/s 1704-3 F 54 s/s 14.7 34.4 203 6.3 s/s 2104-6 M 52 s/s 14.5 34.8 259 8.4 s/s 2104-7 M 45 s/s 14.4 34.6 258 8.6 s/s 0205-2 F 25 s/s 15.0 34.7 260 8.4 s/s 0305-8 M 31 s/s 15.6 35.5 193 1.,3 s/s 0405-8 F 28 s/s 13.2 34.7 250 8.5 s/s 0805-2 M 45 s/s 16.3 34.5 237 11.9 s/s 0905-8 F 61 s/s 15.0 35.1 256 7.7 s/s 1105-7 F 30 s/s 13.3 33.5 270 5.7 s/s 1205-8 M 50 s/s 17.1 33.9 193 8.1 s/s 1505-5 F 21 s/s 12.9 35.1 262 7.1 s/s 1505-6 F 22 s/s 12.4 34.9 273 9.4 s/s 1505-7 F 28 s/s 13.8 34.7 300 9.2 s/s 1505-8 M 23 s/s 15.3 36.0 227 8.6 s/s 2205-2 F 72 s/s 12.3 34.4 238 5.4 s/s 2405-5 M 22 s/s 15.3 33.6 218 9.5 s/s 2807-6 F 39 s/s 13.1 34.4 191 4.5 s/s 2108-1 F 26 s/s 12.5 35.4 358 8.3 s/s 0109-5 M 23 s/s 16.4 31.6 236 6.4 s/s 0501-5 F 33 s/s 12.4 34.1 262 6.1 s/s 0501-6 F 22 s/s 11.6 34.9 243 5.9 s/s 0501-7 F 22 s/s 13.1 34.2 143 6.3 s/s média 14.1 34.7 247 8.0 ---------referência ------[13 ; 16] [35 ; 40] [162 ; 220] [6 ; 7] ---Notas: 1) Os valores de referência para os níveis de hemoglobina no sangue humano são: 14 a 18 g/dL (homem) e 12 a 16 g/dL (mulher); os valores indicados na tabela referem-se à média destas referências entre homens e mulheres. 2) A letra F refere-se aos pacientes de sexo feminino e a letra M refere-se aos de sexo masculino. 3) O símbolo s/s significa “sem significado”.

3.3 – Resultados Hematológicos Os resultados hematológicos obtidos a partir dos grupos de estudo acima definidos encontram-se coligidos na figura 14. A partir desta, é possível verificar diversas alterações hematocitométricas; de facto, os indivíduos infectados com P. falciparum (grupo 1) apresentam os valores hematimétricos menos elevados entre os três grupos de estudo (figura 14). Verificam-se reduções de 14 % para os valores de hemoglobina, 23 % para a contagem de plaquetas,

31

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

2 % para os níveis de MCHC e 29 % no número de leucócitos entre o grupo 1 e o grupo 3.

250

247

238 200 189 150 100 50

12,1

34,1 5,7

14

34,6 7,6

14,1 34,7

8

0 Grupo 1

Grupo 2

Hemoglobina (g/dL) MCHC (g/dL)

Grupo 3 Plaquetas (x10e3/µL) Leucócitos (x10e3/µL)

Figura 14 – Valores médios de hemoglobina, plaquetas, MCHC e leucócitos para cada grupo de estudo.

Considerando as seguintes definições do CDC (American Center for Disease

Control and Prevention), - Anemia: redução do número de eritrócitos em circulação ou da quantidade de hemoglobina normais [hgb < 12 g/dL (homens) ou < 10 g/dL (mulheres)]; - Leucocitose: aumento do número total normal de leucócitos (> 10x103 / µL); - Leucopénia: diminuição do número total normal de leucócitos (< 5x103 / µL); - Trombocitopénia: diminuição do número normal de plaquetas (< 160x103 / µL ); - Hipocromia: redução da coloração do eritrócitos (aumento da palidez central das hemácias) devido à deficiência de hemoglobina. A hipocromia pode reflectir-se numa redução do MCHC (< 35 g/dL);

é possível coligir os resultados dos hemogramas de todas as amostras, obtendo-se os gráficos representados nas figuras 15 a 18.

32

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

Percentagem de casos

80

78

70

72 62

60

58

50 40

38

30 20

23

10

27 6

0

13

8

4

0 Anemia

Trombocitopénia Grupo 1

Leucopénia

Grupo 2

Hipocromia

Grupo 3

Figura 15 – Comparação de percentagens de ocorrência de deficiências hematológicas entre os diferentes grupos de estudo.

Percentagens decasos

40 35

38

30 25 20 15 10

13

5

13

13

0

4

0 Leucopénia Grupo 1

Leucocitose Grupo 2

Grupo 3

Figura 16 – Comparação de percentagens de ocorrência de leucopénia e leucocitose entre os três grupos de estudo.

Os indivíduos infectados com P. falciparum apresentam, entre os grupos estudados e como seria de prever, os valores hematimétricos menos elevados entre os três grupos de estudo (figura 14). Considerámos uma amostra como trombocitopénica quando o hemograma acusava valores inferiores a 160x103 plaquetas por microlitro de sangue. Observou-se que 62 % dos indivíduos do grupo 1 apresentavam este défice plaquetário, sendo que 8 % destes tinham uma contagem plaquetária inferior a 100.000/µL.

33

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

Definimos como anémicos os indivíduos com hemoglobina inferior a 12 g/dL (homens) ou 10 g/dL (mulheres). Com estes critérios, verificou-se que 23 % dos indivíduos do grupo 1 estavam nestas condições, contra apenas 6 % de indivíduos anémicos no grupo 2. Para o grupo de controlo negativo não foram registados casos de anemia (figura 15). Em relação à ocorrência de disfunções leucocitárias, verificou-se (figura 16) uma maior prevalência de casos de leucopénia (contagem leucocitária inferior a 5x103 por microlitro de sangue) do que de leucocitose (contagem leucocitária superior a 10x103 por microlitro de sangue) no total das amostras analisadas. De facto, foram verificados 18 casos de leucopénia dispersos pelos três grupos (com maior incidência no grupo 1, onde 38 % das amostras estavam nestas condições). Nenhuma das amostras do grupo 1 apresentou leucocitose; contudo, contrariamente ao esperado, 13 % das amostras do grupo de controlo negativo mostraram uma contagem leucocitária superior a 10x103 glóbulos por microlitro de sangue. No grupo 2, verificou-se a existência de 3 casos severos de leucocitose, com contagens superiores a 15x103 leucócitos por microlitro de sangue. Outro índice hematimétrico importante é a concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), que indica a concentração de hemoglobina no interior do eritrócito. Como a coloração da hemácia depende da quantidade de hemoglobina no seu interior, elas podem ser classificadas em hipocrómicas (MCHC < 35 g/dL), hipercrómicas (MCHC > 40 g/dL) ou normocrómicas (MCHC entre 35 e 40 g/dL). Com esta classificação, obtiveram-se os resultados esquematizados na figura 17. Contrariamente ao esperado, apenas 28 % das amostras do grupo de controlo negativo são normocrómicas enquanto que 42 % das amostras de indivíduos expostos a

P. falciparum estão nas mesmas condições.

34

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária Indíce MCHC - Grupo 1

Indíce MCHC - Grupo 2

85%

58%

0% hipocromicas

normocromicas

42%

0%

15%

hipocromicas

hipercromicas

normocromicas

hipercromicas

Indíce MCHC - Total

Indíce MCHC - Grupo 3

72%

63%

37%

0%

0% hipocromicas

28% normocromicas

hipercromicas

hipocromicas

normocromicas

hipercromicas

Figura 17 – Proporções entre os diferentes valores de MCHC para os 3 grupos de estudo e respectiva classificação. O valor de referência para o indíce MCHC no sangue humano é de 35 a 40 g/dL.

Igualmente de salientar é o facto de o grupo 1 mais uma vez apresentar os níveis mais baixos de MCHC, tal como aconteceu com os parâmetros hematimétricos apresentados anteriormente. Resumindo as deficiências hematológicas encontradas neste estudo para o grupo de indivíduos infectados com P. falciparum, temos os seguintes resultados (figura 18):

Percentagem de casos

80

78

70 60

62

50 40 30 20

31 23

10 0 Anemia

Trombocitopénia

Leucopénia

Hipocromia

Figura 18 – Comparação de percentagens de ocorrência de deficiências hematológicas no grupo de indivíduos infectados com P. falciparum.

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

Com esta figura é possível verificar que os factores preditivos mais fortes (neste estudo e com este grupo de amostras) para a positividade de infecção por Plasmodium

falciparum são a ocorrência de trombocitopénia e de hipocromia eritrocitária. Segundo os dados da figura 20, deficiências plaquetárias e no MCHC ocorrem mais frequentemente aquando da infecção por P. falciparum, enquanto que a anemia e a leucopénia ocorrem menos vezes; em média, por cada 100 casos de infecção por P. falciparum, 27 apresentam anemia e/ou leucopénia e 70 apresentam trombocitopénia e/ou hipocromia.

3.4 – Relação entre parasitémia e parâmetros hematológicos A fim de verificar uma possível relação entre parasitémia e os diferentes parâmetros hematológicos aqui abordados, efectuaram-se as seguintes representações gráficas (figura 19): Parasitemia vs Plt

20000 15000 R2

10000

= 0,0662

5000 0 5

7

9

11

13

15

Parasitémia (parasitas por µL)

Parasitémia (parasitas por µL)

Parasitemia vs Hgb 20000 15000

R2 = 0,0448 10000 5000 0

17

0

100

[Hgb] (g/dL)

15000 2

R = 0,3977

5000 0 2

4

6

leucócitos (x10e3)

8

10

Parasitémia (parasitas por µL)

Parasitémia (parasitas por µL)

20000

0

400

500

Parasitemia vs MCHC

Parasitemia vs WBC

10000

200 300 Plaquetas (x10e3)

20000 15000 R2 = 0,1185

10000 5000 0 30

31

32

33

34

35

36

37

38

MCHC

Fig. 19 – Interdependência entre parasitémia e os parâmetros hematológicos associados com as alterações provocadas por P. falciparum.

36

Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

3.6 – Níveis séricos de óxido nítrico A partir das leituras realizadas com o leitor de microplacas Dynatech MR7000® (Dynatech), obtém-se a seguinte recta de calibração:

Absorvância

2,5 2 1,5 y = 0,0192x + 0,0846 R2 = 0,9962

1 0,5 0 0

15 30 45 60 75 90 105 Concentração de NO padrão (µM)

120

Fig. 20 – Recta de calibração média para as medições de NO, segundo o método de Griess.

Da equação da recta de calibração (figura 20): y = 0,0192x + 0,0846 retira-se o valor de ε, que corresponde ao valor associado a x, ou seja, 0,0192. Assim, temos a seguinte relação entre a absorvância e a concentração de nitrito nas amostras analisadas: Abs = 0,0192 c + 0,0846

onde Abs corresponde à absorvância medida pelo leitor de microplacas e c corresponde à concentração de nitrito que queremos determinar. Procedendo da mesma forma para cada um dos grupos de estudo, obtiveram-se os seguintes resultados:

Tabela 4 – resultados das rectas de calibração para cada grupo de estudo. Correlação Equação de trabalho Equação da Recta (R2) (concentração da amostra) Grupo 1 y = 0.0114x + 0.0511 0.9982 C = (Abs - 0.0511) / 0.0114 Grupo 2 y = 0.0192x + 0.0846 0.9962 C = (Abs - 0.0846) / 0.0192 Grupo 3 y = 0.0151x + 0.0698 0.9976 C = (Abs - 0.0698) / 0.0151

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

Sendo a média geral dos níveis do óxido nítrico encontrados:

6

5,925

[NO] (µM)

5 4 3 2 1,683

1,472

1 0 Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

Fig.21 – Valores médios de NO sérico em cada grupo de estudo.

Note-se que os indivíduos infectados com P. falciparum apresentam, em média, seis

vezes

mais

óxido

nítrico

em

circulação

em

relação

a

indivíduos

não-

-infectados com o parasita (figura 21). Os grupos 2 e 3 não apresentam disparidade significativa nos níveis de óxido nítrico em circulação. Podemos confrontar a produção de óxido nítrico de cada grupo com os intervalos

Produção média de NO (µM)

etários incluídos neste estudo (figura 22):

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 < 30

30-39

40-49

50-59

>60

intervalos etários

Grupo 1

Grupo 2

Grupo 3

Fig.22 – Relação entre os níveis séricos de óxido nítrico e o intervalo etário para cada grupo de estudo.

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A relação entre a parasitémia (nos pacientes do grupo 1, i.e., infectados com P. falciparum) e o nível sérico de óxido nítrico é dada por (figura 23):

Parasitemia vs NO Parasitémia (parasitas por µL)

20000 R2 = 0,1248 15000

10000

5000

0 0

2

4

6 8 [NO] (µM)

10

12

14

Fig. 23 – Relação entre os níveis de NO sérico (µM) e parasitémia em pacientes infectados com P. falciparum.

É ainda possível avaliar a relação entre os níveis de NO e os diferentes valores hematológicos para cada grupo de estudo (figura 24): 40

300 250

30 200

25 20

150

15

Plt

MCHC, Hgb, WBC, NO

35

100

10 50

5 0

Grupo 1

Grupo 3

Grupo 2 [NO]

WBC

Hgb

MCHC

0

Plt

Fig. 24 – Relação entre os níveis séricos de óxido nítrico (µM) e os diferentes parâmetros hematológicos para cada grupo de estudo. NOTA: MCHC = concentração de hemoglobina corpuscular média (g/dL); Hgb = hemoglobina (g/dL); WBC = leucócitos (x103/µL); NO = óxido nítrico (µM); Plt = plaquetas (x103/µL).

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4. Discussão Das quatro espécies de parasitas da malária que infectam o Homem, o

Plasmodium falciparum é a mais patogénica (Ranjit et al; 2005; Dromigny et al; 2005), podendo produzir diversas manifestações clínicas, umas com maior gravidade do que outras. O resultado da infecção com este protozoário depende de vários factores, como a densidade parasitária, a acumulação de diferentes clones do parasita, e o seu factor de virulência; este factor é um componente intrínseco da cascata bioquímica de acontecimentos que conduzem à manifestação mais severa da malária (Ranjit et al; 2005). Para responder aos objectivos deste trabalho, foram efectuados diversos testes. O primeiro e mais básico é o hemograma, um dos exames complementares de diagnóstico mais frequentemente utilizado e considerado fundamental no estudo da função hematológica. As alterações hematológicas associadas à infecção por P. falciparum encontram-se bem documentadas, mas alterações mais específicas podem acontecer devido a factores como endemicidade, hemoglobinopatias, condições nutricionais, factores demográficos e imunidade adquirida (Erhart et al; 2004). No diagnóstico da malária, a avaliação dos valores hematimétricos fornecidos pelo hemograma revela habitualmente anemia e trombocitopénia, o que é corroborado pelos dados encontrados neste estudo (figuras 15 e 18). Porém, é necessário notar que a presença de anemia e de trombocitopénia não são uma regra para o diagnóstico de malária, visto que muitos factores podem influenciar estas duas variáveis. Estas conclusões já foram obtidas por outros estudos (Erhart et al; 2004; Richards et al; 2004) e confirmam os resultados aqui obtidos. Duas possíveis causas para a anemia que se verifica na infecção malárica são o aumento da hemólise e a inibição da eritropoiese (Erhart et al; 2004). Porém, a destruição de eritrócitos parasitados não é suficiente para explicar a anemia que, em

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casos severos de malária, pode ser muito grave (Gyan et al; 2004). Assim, a destruição de eritrócitos não-infectados deve estar envolvida no desenvolvimento da anemia, podendo esta destruição dever-se à activação de macrófagos no baço, à hemólise imunomediada ou ao stress oxidativo nos eritrócitos (Erhart et al; 2004; Gyan et al; 2004). Este stress oxidativo pode ser explicado por duas hipóteses; a primeira, é que o óxido nítrico pode interferir com os grupos heme da cadeia de transferência de electrões nos eritrócitos, resultando em hemólise (Gyan et al; 2002); a segunda, é a possível alteração da superfície dos eritrócitos em consequência da exposição a espécies reactivas de oxigénio (ROS), nomeadamente o óxido nítrico, através do peroxinitrito – que se sabe ser capaz de modificar quimicamente a actividade biológica de polipéptidos (Gyan et al; 2002). Porém, é necessário referir que estudos recentes (Sobolewsky et al; 2005) mostram que a hemoglobina libertada no ciclo assexual do P. falciparum pode limitar a biodisponibilidade de NO durante a doença malárica, visto que a hemoglobina é um poderoso scavenger de óxido nítrico. Os efeitos da falta de NO em circulação podem incluir vasoconstrição e falhas na perfusão sanguínea (ambos factores importantes para a sobrevivência dos organismos). As anemias observadas neste estudo, contudo, não podem ser consideradas graves – excepto num indivíduo do grupo 2 (número de entrada: 2505-5), que apresentava uma concentração de hemoglobina de 5.4 g/dL – o que poderá ser reflexo de menores prevalências de anemias subjacentes, de melhores condições nutricionais e de maior e melhor acesso a tratamento por parte dos indivíduos que participaram neste estudo, sendo as discrepâncias em relação a outros estudos sobre a anemia provocada por P. falciparum (que relatam uma diminuição acentuada nos níveis de hemoglobina aquando da infecção pelo parasita) explicadas pela etiologia multifactorial da anemia. A comparação entre indivíduos do grupo 1 e do grupo 3 mostram uma queda de 15 % na concentração de hemoglobina, o que está de acordo com a literatura sobre a

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anemia causada por P. falciparum (Erhart et al; 2004; Gyan et al; 2004; Richards et al; 1998). A comparação ilustrada na figura 15 mostra o aumento da incidência de casos de anemia em 23 % e 6 % para os grupos 1 e 2, respectivamente, em relação ao grupo de controlo (grupo 3), onde não foi registado qualquer caso de anemia. No que respeita aos resultados obtidos para as disfunções trombocíticas, vários estudos sugerem que a trombocitémia é o factor preditivo mais forte entre os parâmetros hematimétricos analisados neste estudo (Erhart et al; 2004; Gyan et al; 2004; Richards et

al; 1998). De facto, os resultados aqui obtidos apontam para uma maior prevalência de trombocitopénia do que de anemia ou leucopénia (figura 18). Estes dados vêm em concordância com os estudos referidos anteriormente. Os mecanismos subjacentes à patogénese da trombocitopénia relacionada com malária incluem provavelmente fenómenos de coagulação intravascular disseminada, remoção excessiva de plaquetas pelo sistema retículo-endotelial, fagocitose de plaquetas e produção de anticorpos IgG anti-plaquetas (Wickramasinghe e Abdalla 2000; Jaff et al; 1985; Kelton et al; 1983). Outra hipótese a referir e que se sabe ter influência no aparecimento da trombocitopénia são carências nutricionais, nomeadamente em vitamina B12 e em folato (Smith, 2006). Quanto aos resultados obtidos para as disfunções leucocitárias, verificámos que a contagem de glóbulos brancos é inferior em indivíduos infectados com P. falciparum do que em indivíduos não-infectados e também inferiores às contagens para indivíduos não-expostos (figura 14). A variabilidade em termos de contagens leucocitárias aqui verificada não é inesperada, dado o enorme número de factores envolvidos; por exemplo, mesmo com o número reduzido de amostras estudadas, a variação observada pode ser reflexo do “timing” da colheita e a correspondente situação clínica da infecção. No início da investigação sobre a malária, foram publicados estudos (Marchiafava e Bignami 1894;

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Deaderick 1909)3 que referiam que o número de leucócitos se reduzia ao mínimo na mesma altura em que a febre tem início e a infecção se torna detectável por microscopia. Outra explicação para o facto de os indivíduos do grupo 2, que não estavam infectados por P. falciparum, apresentarem uma contagem de leucócitos 10 % inferior em relação aos indivíduos do grupo de controlo poderá ser a adesão à quimioprofilaxia, visto que segundo Stürchler et al; (1987), indivíduos que seguissem o regime quimioprofiláctico utilizando amodiaquina, cloroquina ou pirimetamina experimentavam uma redução do número de glóbulos brancos em circulação quando comparados com indivíduos que não seguiam a quimioprofilaxia, sendo a redução leucocitária especialmente acentuada em relação aos linfócitos. Um outro estudo (Brinker e Beitz 2002) reporta os mesmos efeitos quando a quimiprofilaxia é feita com quinino. Neste estudo 12 % dos indivíduos do grupo 2 seguiram o regime profiláctico com quinino (6 %) ou mefloquina (6 %) e do total de amostras do grupo, 13 % foram consideradas leucocitopénicas (contagem leucocitária inferior a 5x103 por microlitro de sangue). Apesar de não terem sido calculadas as fórmulas leucocitárias – número de glóbulos brancos num milímetro cúbico de sangue, com a percentagem dos diversos tipos de leucócitos – para os diferentes grupos de estudo, durante a observação dos esfregaços foi possível confirmar a existência de linfocitopénia. A prevalência de leucopénia e ausência relativa de leucocitose no universo de amostras aqui estudadas põe em causa uma das explicações acima referidas para a ocorrência de trombocitopénia: uma das explicações avançadas por alguns autores é a ocorrência de fagocitose de plaquetas; porém, o facto de 38 % das amostras serem leucopénicas é um argumento contra essa hipótese, não podendo assim a fagocitose de plaquetas ser a principal explicação para a trombocitopénia aqui verificada.

3 – Segundo referência de McKenzie et al; em “White blood cell count and malaria”, The Journal of Infectious Diseases, 192 (2005)

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Em relação aos valores de hemoglobina corpuscular média (MCHC), verificou-se para o grupo 1 que 85 % das amostras são consideradas hipocrómicas (figura 17), o que está de acordo com o esperado, visto que o Plasmodium falciparum consome a hemoglobina no interior dos eritrócitos. Quanto ao grupo 2, observa-se que 58 % das amostras são classificadas hipocrómicas (figura 17), podendo este valor ser explicado se levarmos em linha de conta que um certo nível de ferropénia constitui um factor de protecção contra P. falciparum (Nyakeriga et al; 2004) e que os indivíduos deste grupo estiveram expostos ao protozoário mas não contraíram malária. Não podemos excluir o facto de talvez alguns indivíduos deste grupo não terem sido sequer picados pelo vector da doença – a fêmea do mosquito Anopheles – mas esse controlo, dadas as características deste estudo, não é possível. É sabido que algumas características genéticas e mesmo algumas deficiências congénitas constituem factores de protecção contra a malária. Tal como referido sob o ponto 4.4) na Introdução, desordens hereditárias da hemoglobina (por exemplo, talassémias e anemias falciformes), bem como os polimorfismos associados com a regulação da actividade do enzima 6GPD, com a regulação da banda 3 eritrocítica (responsável pela integridade das hemácias), ou com a regulação da expressão dos antigénios de Duffy à superfície dos glóbulos vermelhos, mostraram conferir um certo grau de protecção contra a malária (Bereczky, 2005). Nenhum destes controlos foi efectuado nas amostras analisadas, porém o exame microscópico não revelou a existência quer de formas pronunciadas de poiquilocitose (número exagerado de eritrócitos com formas anormais), quer de intensa anisocitose (aumento excessivo da variabilidade do tamanho dos eritrócitos). Para o grupo 3, foram consideradas hipocrómicas 72 % das amostras (figura 17). Este valor é elevado em relação ao esperado, uma vez que o grupo 3 constitui o grupo de controlo negativo, fornecendo amostras que deveriam encontrar-se sempre dentro dos

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intervalos de normalidade para todas as variáveis testadas. É possível que alguns dos indivíduos deste grupo estivessem no início de outras patologias menores (gripe, constipação ou alergias) aquando da colheita de sangue, o que influenciaria não apenas os valores hematimétricos como também os níveis de óxido nítrico em circulação. De acordo com os resultados apresentados e discutidos acima, é possível inferir-se que, entre os parâmetros hematimétricos analisados – valores de hemoglobina, índice de MCHC, níveis de plaquetas e número de leucócitos – os dois factores preditivos mais fortes (mais uma vez, neste estudo e com este grupo de amostras) para a positividade de infecção por Plasmodium falciparum são a ocorrência de trombocitopénia e de hipocromia eritrocitária. As deficiências hematimétricas coligidas na figura 18, mostram claramente esta

relação,

porquanto

as

deficiências

plaquetárias

e

no

MCHC

ocorrem

aproximadamente 70 % das vezes em que há infecção por P. falciparum enquanto que a anemia e a leucopénia ocorrem aproximadamente 30 % das vezes. Recorde-se que é necessário salvaguardar o facto de que o grupo de amostras analisado é relativamente pequeno e bastante heterogéneo e que portanto estas conclusões são válidas para este estudo e que outras investigações mais específicas seriam necessárias para aprofundar o conhecimento das relações entre os diferentes parâmetros hematimétricos e a ocorrência de infecções com o parasita da malária. Sabemos efectivamente que no decurso da infecção por P. falciparum a hemácia rebenta para libertar novos merozoítos, e que a hemoglobina clivada é lançada para a corrente sanguínea. Isso leva-nos a sugerir que essa libertação poderá possivelmente provocar uma diminuição dos níveis de NO em circulação, visto que a hemoglobina é um

scavenger de NO (Sobolewsky et al; 2005). Este poderá ser um dos factores que influenciam a relação entre óxido nítrico e parasitémia, visto que pelos resultados aqui obtidos (figura 32), esta não é uma relação linear simples e envolve decerto muitas variáveis. Outra destas variáveis poderá ser a concentração de haptoglobina, uma

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proteína plasmática de fase aguda, capaz de capturar a hemoglobina libertada aquando da hemólise eritrocitária, decorrente tanto de situações não-patológicas como de episódios de malária (Bienzle et al; 2005). De facto, verifica-se que em zonas endémicas para a malária é frequente observarem-se situações de hipo- e ahaptoglobinémia, apesar de não parecer haver relação em casos severos da doença entre anemias severas e hiperparasitémias, sendo antes essas anemias o reflexo de infecções crónicas ou de infecções recorrentes (Bienzle et al; 2005). A inflamação que é desencadeada pelo organismo do hospedeiro em resposta à infecção por P. falciparum é fundamentalmente uma resposta inespecífica, apesar de ser na prática controlada por agentes específicos (pelos linfócitos). A inflamação que se verifica em estados patológicos, nomeadamente na doença malárica, é desencadeada por mediadores químicos – bradicinina, histamina – que sensibilizam os receptores da dor, produzem vasodilatação local e atraem fagócitos (principalmente neutrófilos). Estas células produzem radicais livres, formas altamente reactivas de oxigénio (ROS), que são tóxicas não apenas para o parasita mas também para as próprias células do hospedeiro. Um aumento nos níveis de ROS leva a stress oxidativo causando a alteração de lípidos, ácidos nucleicos e proteínas do organismo do hospedeiro (Cornejo-Garcia et al; 2006). Assim, é necessário que haja um equilíbrio entre a acção anti-parasitária do NO, que idealmente resulta na eliminação de parasitas, e os efeitos citotóxicos do NO, que resultam na destruição do tecido do hospedeiro, para que este se encontre beneficiado. Ou seja, se a produção de óxido nítrico não for finamente controlada, então poderá haver um aumento de morbidade; se por outro lado o hospedeiro não produzir níveis adequados de óxido nítrico, o número de parasitas aumenta exponencialmente levando a um aumento da mortalidade. A comparação entre os níveis de óxido nítrico nas amostras séricas dos três grupos de estudo (figura 21) mostra uma concentração de NO aproximadamente seis

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vezes mais elevada em pacientes clinicamente infectados com P. falciparum quando comparados com os pacientes classificados nos outros dois grupos. Isto sugere que o aumento dos níveis de óxido nítrico em circulação é de facto um marcador clínico das infecções clinicamente detectáveis de P. falciparum. Se o nível de NO em circulação aumenta, deveria haver uma diminuição na produção de plaquetas (Sobolewski et al; 2005), o que se verifica para os pacientes do grupo 1, que apresentam simultaneamente os valores de NO mais elevados e o menor número de plaquetas – bem como de hemoglobina e de hemoglobina corpuscular média. Visto que durante a infecção por P. falciparum existe um incremento substancial dos níveis de NO em circulação, então parece lógico afirmar que a actividade dos enzimas que produzem o óxido nítrico também se encontra aumentada. Tendo em conta que a actividade das três isoformas de NOS requer a presença (entre outros) dos cofactores Ca2+ e calmodulina (Bogdan 2001), então será de esperar que o cálcio presente no organismo seja direccionado para estas funções como forma de combater a infecção parasitária, o que também pode ser uma explicação possível para a extrema miastenia e hipotonia muscular referida pelos doentes com malária. No geral, os indivíduos dos grupos 2 e 3 mostraram, em média, níveis muito semelhantes de NO sérico. Porém 45 % das amostras do grupo 3 apresentaram níveis de NO superiores a 1,7 µM (valor de referência para classificação negativo/positivo) enquanto que apenas 20 % das amostras do grupo 2 estavam nessas condições. Isso poderá significar que indivíduos imunes a P. falciparum (uma vez que os resultados para a presença de antigénios deste parasita foram positivos, não tendo sido possível detectar parasitémia microscopicamente) podem ter adquirido mecanismos de regulação mais precisos para o controlo de NO em circulação, razão pela qual 80% dessas amostras continham valores hematológicos considerados normais segundo os respectivos intervalos de referência. Da mesma forma, verificámos que indivíduos com parasitémias

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

indetectáveis por microscopia (portanto classificados no grupo 2) não produziram níveis de NO que pudessem ser associados com infecção por P. falciparum, visto que as concentrações deste metabolito neste grupo de estudo se assemelham às concentrações detectadas para o grupo de controlo negativo (grupo 3) e não ao grupo de controlo positivo (grupo 1), com parasitémias detectáveis microscopicamente como relatado nos resultados. Dessa forma, é possível que a concentração de NO detectada no grupo 2 esteja de alguma forma associada à protecção contra o P. falciparum que tem sido referida em diversos estudos. O facto de não ter sido possível encontrar uma variação significativa das concentrações de óxido nítrico em circulação entre os grupos 2 e 3, poderá também ser um indício de que indivíduos expostos a P. falciparum não produzem NO imediatamente após a inoculação dos esporozoítos pelo mosquito Anopheles. De facto, alguns estudos (Brunet 2001; James, 1995) sugerem que o NO intervém na resposta ao Plasmodium através da mediação do extermínio intrahepático dos parasitas. De acordo com o facto de os esporozoítos injectados pelo vector entomológico na corrente sanguínea do hospedeiro humano sofrerem maturação no fígado, então parece razoável inferir que não deverá haver um incremento na produção de óxido nítrico nas fases iniciais da infecção. É preciso ter em conta que a produção excessiva de NO também é tóxica não apenas para os parasitas mas também para as células do próprio organismo do hospedeiro (Brunet, 2001); assim, é possível que os sintomas da doença possam ser atenuados pelo extermínio do número limitado de parasitas intrahepáticos nas fases recentes da infecção, anteriores ao desenvolvimento da fase eritrocítica (Brunet, 2001). O facto de os indivíduos do grupo de controlo apresentarem níveis de NO em circulação muito semelhantes aos dos indivíduos do grupo 2 poderá também sugerir que o valor médio para a concentração de NO sérico no grupo 3 é a concentração basal média biológica (e não patológica) deste metabolito. É sabido que os efeitos da falta de NO em

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

circulação podem incluir vasoconstrição e falhas na perfusão sanguínea (ambos factores importantes para a sobrevivência dos organismos), pelo que não se esperaria encontrar um nível basal nulo (ou quase nulo) desta molécula em qualquer grupo de estudo; no entanto, 52 % das amostras do grupo 2 estavam nestas condições. Tais resultados não significam que esses indivíduos não possuíam óxido nítrico em circulação mas sim que a concentração de NO sérico nestes indivíduos se encontra abaixo do limite de detecção do método utilizado para as medições. O parasita P. falciparum pode ser controlado (in vitro) por nitrito, nitrato e nitrotióis, o que sugere o papel protector do NO em infecções malárias. Contudo o resultado das nossas observações aponta em outra direcção, visto que não encontrámos nenhuma relação entre o número de parasitas e os níveis de óxido nítrico no sangue (figura 23), sugerindo que esta relação não é linear e que muitos outros factores poderão estar envolvidos no balanço entre a produção de NO e o controlo da infecção. Relativamente à correlação entre os níveis séricos de NO e a hemoglobina para cada grupo de estudo (figura 24), é possível afirmar que parece existir uma relação de proporcionalidade inversa entre estas duas variáveis, o que está de acordo com estudos anteriores (Keller et al; 2004) que postulam que o óxido nítrico participa na patogénese da malária por ser capaz de inibir a eritropoiese. No entanto é necessário ter em conta o facto de que pode não haver uma relação simples do tipo causa/efeito entre a concentração de óxido nítrico e os parâmetros hematológicos aqui estudados, sendo mais provável que um grande número de variáveis bioquímicas e genéticas estejam envolvidas nessa relação. Neste estudo, verificou-se que os indivíduos frequentemente em contacto com

P. falciparum e desenvolveram um certo grau de imunidade em relação a este parasita (ou seja, indivíduos classificados no grupo 2) não possuem níveis de NO muito elevados em circulação e que esses níveis não variam substancialmente com a idade, em oposição

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

aos indivíduos do grupo de controlo negativo, para os quais se observa uma grande variação nos níveis de NO sérico com a idade. É necessário recordar que todas as amostras testadas neste estudo são provenientes de indivíduos com idade não-inferior a 18 anos. Outros estudos (Cramer et

al; 2005; Kremsner et al; 1996) respeitantes aos níveis de NO sérico em crianças referem que níveis crescentes de óxido nítrico estão associados com a diminuição da parasitémia mas apenas em crianças, diminuindo essa associação em idades mais avançadas e, eventualmente, revertendo-se. De acordo com os conceitos actuais de estratégia imunodefensiva infantil, isto pode ser o reflexo da tendência em eliminar rapidamente os parasitas enquanto os mecanismos imunitários específicos não estão bem desenvolvidos, podendo o NO contribuir para este mecanismo de defesa contra o P. falciparum (Cramer

et al; 2005). Em relação a intervalos etários superiores, como os considerados neste estudo (figura 22), podemos sugerir que as diferentes variáveis que influenciam a concentração de NO sérico têm de ser levadas em conta ao considerar-se o papel do óxido nítrico na defesa imunitária contra a malária, nomeadamente estados de malnutrição (Cramer et al; 2005), variação individual da produção de NO pelos macrófagos, células endoteliais e/ou hepatócitos nos diferentes grupos etários (Anstey et

al; 1999) e a actividade da haptoglobina (Bienzle et al; 2005). Tomando em consideração todos os factores respeitantes aos níveis de óxido nítrico, podemos concluir que o NO é de facto um marcador clínico para a infecção malárica mas não pode ser utilizado como indicador da severidade da doença, além de não constituir um factor de protecção contra a doença.

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5. Conclusão

O aumento das deslocações para áreas endémicas, a falta de imunidade, o uso inadequado de medidas profilácticas, a crescente resistência dos plasmódios aos medicamentos antimaláricos, do mosquito vector a vários insecticidas, e o atraso no diagnóstico e terapêutica da doença, são factores que têm contribuído para um aumento dos casos de importação de malária com formas graves e por vezes fatais (Dromigny et

al; 2005). Verificou-se com este estudo que os dois factores com maior carácter preditivo em relação à infecção por P. falciparum são a ocorrência de trombocitopénia e de hipocromia eritrocítica. Além disso, os testes realizados ao nível de óxido nítrico em circulação nos diferentes grupos de estudo mostrou que indivíduos infectados com P. falciparum quintuplicam a produção de NO, tanto em relação a indivíduos não-imunes à malária como em relação a indivíduos que já adquiriram um certo grau de protecção contra a doença, o que também nos leva a inferir que o NO não constitui factor de protecção contra a malária.

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6. Perspectivas Futuras

Actualmente, pouco se sabe sobre os aspectos estruturais de diversas proteínas ligadas à imunidade naturalmente adquirida contra a malária. Assim, futuramente, seria interessante expandir os estudos efectuados neste trabalho para as restantes espécies de

Plasmodium e ainda proceder a estudos relativos a função e bioquímica de algumas dessas proteínas, visto que estes estudos podem vir a revelar novos alvos para tratamento da malária ou mesmo potenciais vacinas contra a doença. Em termos de alívio dos sintomas da malária, e lembrando que os medicamentos actualmente disponíveis no mercado possuem ainda infelizmente vários efeitos secundários adversos, este estudo sugere que talvez fosse possível minorar os sintomas clínicos da doença através de terapia com vista a minimizar a síntese de citoquinas inflamatórias como IL-1, TNF e IFN-γ e ainda, de forma certamente mais eficaz, combatendo o P. falciparum nas fases iniciais da infecção, ou seja, na fase hepática do ciclo de vida do parasita. Mais de um século após Charles Laveran ter descoberto o parasita P. falciparum no interior dos eritrócitos, muito trabalho existe ainda à frente dos investigadores. Com a sequenciação completa do genoma do Plasmodium, cabe agora aos cientistas de todo o Mundo usar essa informação de forma imaginativa e inovadora, de forma a pôr um ponto final numa doença que tem acompanhado a história da Humanidade.

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Karina P. de Sousa – resposta hematológica e níveis de NO em viajantes frequentemente expostos à malária

8. Glossário As definições seguintes estão de acordo com as fornecidas pelo American Center

for Disease Control and Prevention (CDC). Anemia: Redução do número de eritrócitos em circulação ou da quantidade de hemoglobina normais.

Anopheles: Género de mosquito responsável pela transmissão da malária aos seres humanos. Anticorpo: Proteína sérica especializada (imunoglobulina ou gama-globulina), produzida por linfócitos B no sangue em resposta à exposição do organismo a corpos estranhos (antigénios). Os anticorpos ligam-se especificamente aos antigénios que induziram a resposta imune. Antigénio: Qualquer substância que estimule o sistema imunitário a produzir anticorpos. Os antigénios podem ser bactérias, vírus ou parasitas. Célula B (linfócito B): Leucócitos produzidos na medula óssea ou no baço. As células B são as únicas que produzem anticorpos. Cura clínica: Eliminação dos sintomas da malária, por vezes sem que haja completa eliminação de todos os parasitas. Dispneia: Respiração complicada e superficial. Endémico/a: Região onde a doença ocorre numa base consistente e contínua. Epidémico/a: Ocorrência de um número superior ao normal de casos de uma dada doença numa determinada área ou entre um grupo específico de pessoas num certo período de tempo. Esporozoíto: Fase do ciclo de vida do parasita da malária. Os esporozoítos são produzidos no interior do mosquito e migram para as suas glândulas salivares. Podem assim ser inoculados no hospedeiro humano quando o mosquito se alimenta do sangue deste. No hospedeiro humano, os esporozoítos invadem os hepatócitos, onde se desenvolvem. Esquizogonia: Fase reprodutiva assexuada do parasita da malária. Nos eritrócitos, a esquizogonia permite que um único trofozoíto se desenvolva para numerosos merozoítos. Um processo semelhante ocorre nos hepatócitos. Esquizonte: Forma desenvolvida do parasita da malária que contém muitos merozoítos. Os esquizontes encontram-se nas fases eritrocítica e exoeritrocítica da doença. Fase eritrocítica: A fase do ciclo de vida do parasita da malária onde este se desenvolve nos glóbulos vermelhos. Esta fase é a causa dos sintomas clínicos da doença.

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Fase exoeritrocítica: A fase do ciclo de vida do parasita da malária onde este se desenvolve nos hepatócitos. Esta fase não provoca sintomas evidentes da doença. Gametócito: A fase sexuada do parasita da malária. Os gametócitos masculinos (microgametócitos) e os gametócitos femininos (macrogametócitos) encontram-se no interior de eritrócitos em circulação. Se ingeridos por um mosquito fêmea do género Anopheles, dão início à reprodução sexuada que começa na fase extrínseca (esporogónica) do ciclo de vida do parasita, que se desenrola no interior do mosquito. Homeostase: é a propriedade dum sistema aberto, seres vivos especialmente, de regular o seu ambiente interno de modo a manter uma condição estável, mediante múltiplos ajustes de equilíbrio dinâmico controlados por mecanismos de regulação interrelacionados. A homeostase é uma das características fundamentais dos seres vivos. É a manutenção do ambiente interno dentro de limites toleráveis. Imunidade: Protecção gerada pelo sistema imunitário do organismo, em resposta a episódios anteriores de malária, resultando na capacidade de controlar ou diminuir a intensidade de novos ataques do parasita. Imunização: Processo ou procedimento através do qual um indivíduo é tornado imune ou resistente a uma determinada doença. Este termo é habitualmente confundido com os termos “vacinação” e “inoculação”, apesar de a inoculação nem sempre resultar na aquisição de imunidade. Infecção: Invasão de um organismo por um corpo patogénico como bactérias, vírus ou parasitas. Linfócito: Leucócito com um núcleo arredondado e de grande tamanho, e citoplasma reduzido. Alguns tipos especializados de linfócitos produzem anticorpos. Malária cerebral: É uma complicação da infecção por Plasmodium falciparum na qual os eritrócitos parasitados obstruem a circulação do sangue nos capilares cerebrais, levando frequentemente ao coma e à morte. Malária importada: Quando a doença é trazida de outras áreas geográficas. Merozoíto: Célula derivada do desenvolvimento assexuado do ciclo de vida do parasita da malária. As fases eritrocítica e exoeritrocítica da doença produzem parasitas que se desenvolvem para esquizontes que contém muitos merozoítos. Quando os esquizontes maturam, eles e a células hospedeira sofrem uma ruptura e os merozoítos são libertados para a corrente sanguínea, onde infectam novos glóbulos vermelhos. Oócisto: Fase do ciclo de vida do parasita da malária, os oócistos são quistos arredondados localizados na parede externa do estômago dos mosquitos. Os esporozoítos desenvolvem-se no interior dos oócistos. Quando maturos, os oócistos libertam os esporozoítos, que migram para as glândulas salivares do mosquito, podendo ser inoculados no hospedeiro humano. Parasitémia: Presença de parasitas no sangue. Este termo também pode ser usado para exprimir a quantidade de parasitas (por exemplo, “uma parasitémia de 2%").

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Período de incubação: Intervalo de tempo entre a infecção por um microrganismo e o desenvolvimento ou aparecimento dos sintomas da doença. Na malária, o período de incubação é de 7 a 40 dias. Polimórfico/a: Significa, literalmente, “ter mais que uma forma”. Em termos genéticos, é a existência de diversas variantes (alelos) de um determinado gene que ocorrem simultaneamente numa população. Quimioprofilaxia: Ingestão de drogas anti-maláricas como forma de prevenir a doença. Resistência: Capacidade de um organismo para desenvolver estirpes que não são afectadas por determinadas substâncias que normalmente seriam uma ameaça à sua existência. O parasita da malária desenvolveu estirpes resistentes a certas drogas como a cloroquina. O mosquito Anopheles desenvolveu estirpes que resistem ao DDT e outros insecticidas. Tratamento Presumptivo: Tratamento de casos clinicamente suspeitos de malária, anteriormente à realização de testes de diagnóstico que comprovem a doença. Trofozoíto/a: Uma forma de desenvolvimento no ciclo de vida do parasita da malária. Após os merozoítos invadirem os eritrócitos, transformam-se em trofozoítos; por sua vez os trofozoítos transformam-se em esquizontes. Vector: Um organismo (por exemplo, o mosquito Anopheles) que transmite um agente infeccioso (por exemplo, parasites da malária) de um hospedeiro para outro (por exemplo, humanos).

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Anexos

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A1 – Composição das soluções:

- Solução de NED 0.1% N-1-naftiletilenodiamina dihidrocloreto em água destilada

- Solução nitrito padrão: 0.1 M nitrito de sódio em água destilada

- Solução de Sulfanilamida 1% sulfanilamida em 5% ácido fosfórico

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A2 – Calibrações e controlos de qualidade A calibração dos aparelhos utilizados serve como ajuste do sistema analítico e faz parte do conjunto das acções desenvolvidas para cumprir os requisitos de qualidade das análises efectuadas. Em muitos casos, quando possível, são utilizados calibradores multiparamétricos, por terem uma boa razão qualidade/custo e a sua utilização ser fácil e rápida.

- Calibração do contador hematológico automático Na calibração do aparelho coulter Sysmex® K-1000 (Emílio de Azevedo Campos), foi utilizado o calibrador multiparamétrico Eightcheck-3WP. Este calibrador é fornecido sob a forma de sangue total. Na tabela 5 estão indicadas as contagens de leucócitos e eritrócitos, concentração de hemoglobina, MCHC e contagem de plaquetas, entre outros parâmetros, no sangue padrão fornecido pelo fabricante (Emílio de Azevedo, SA).

Tabela 5 – Parâmetros quantificados no sangue padrão de calibração do lote em uso (dados fornecidos pelo fabricante).

Parâmetro

Média

Desvio – padrão

Leucócitos (x103/µL)

6.2

0.6

Eritrócitos (x106/µL)

4.55

0.2

Hemoglobina (g/dL)

13.2

0.7

Hematócrito (%)

38.7

3.1

Volume corpuscular médio (MCV) (fL) Hemoglobina corpuscular média (MCH) (pg) Concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC) (g/dL)

85.1

5.1

29

1.7

34.1

2.4

Plaquetas (x103/µL)

187

28

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- Calibração do leitor de microplacas Dynatech MR7000 A calibração do equipamento utilizado na leitura das microplacas de ELISA é efectuada com a medição de duas soluções-padrão, a partir das quais o equipamento utiliza os resultados para determinar automaticamente os coeficientes da curva de calibração (Dynatech Laboratories, Inc.).

- Calibração do método de Griess para a determinação do óxido nítrico Para a calibração do método de Griess utilizado para a medição do óxido nítrico sérico, foram efectuadas curvas de calibração para cada ensaio e em cada placa de microtitulação.

Figura 25. Curvas de calibração para o método de Griess em diferentes matrizes (fonte: Promega).

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